專利名稱：：谷紅注射液治療肺癌的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體地說涉及谷紅注射液在制備治療肺癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：專利文獻(xiàn)CN20040086213公開了將紅花和乙酰谷酰胺按照特定比例進(jìn)行組配，進(jìn)一步對紅花提取制備紅花提取液后與乙酰谷酰胺制得可用藥物進(jìn)行臨床應(yīng)用的報(bào)導(dǎo)；CN20040086213文獻(xiàn)中重點(diǎn)提到了該發(fā)明具有活血化瘀、改善腦代謝及腦功能作用，可作為制備治療閉塞性腦血管疾病，肝昏迷、偏癱、神經(jīng)外科手術(shù)等引起的昏迷、癱瘓及智力減退、記憶力障礙等疾病藥物方面的應(yīng)用；也可用于制備治療冠心病、脈管炎等疾病藥物方面的應(yīng)用。依據(jù)CN20040086213專利技術(shù)生產(chǎn)的谷紅注射液，是阿爾貝拉醫(yī)藥(中國)有限公司產(chǎn)品。谷紅注射液為乙酰谷酰胺和紅花提取物制成的滅菌水溶液。谷紅注射液用法用量為靜脈滴注，一次5-20m1.用5%或者10%葡萄糖注射液或0.90/o氯化鈉注射液250500ml稀釋后應(yīng)用，一日一次.10-15天為一療程。谷紅注射液的功能主治為用于治療腦血管疾病和腦供血不足，腦血栓，腦栓塞及腦出血恢復(fù)期肝病，神經(jīng)外科手術(shù)等引起的意識功能低下，智力減退，記憶力障礙等.還可以用于治療冠心病，脈管炎等。谷紅注射液已經(jīng)成為了心腦血管系統(tǒng)疾病的常用藥物。但谷紅注射液用于治療肺癌藥物的應(yīng)用尚未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供依據(jù)專利文獻(xiàn)CN20040086213制備的谷紅注射液的新用途。上迷的谷紅注射液在制備治療肺癌藥物中的應(yīng)用。上述的谷紅注射液常規(guī)的用藥方法和劑量是靜脈滴注，一次5ml-20ml，用5%或10%葡萄糖注射液250ml-500ml稀釋后緩慢滴注，一日一次，10-15天為一療程。谷紅注射液臨床上用于發(fā)揮活血化瘀、改善腦代謝及腦功能作用，可作為制備治療閉塞性腦血管疾病，肝昏迷、偏癱、神經(jīng)外科手術(shù)等引起的昏迷、癱瘓及智力減退、記憶力障礙等疾病藥物方面的應(yīng)用；也可用于制備治療冠心病、脈管炎等疾病藥物方面的應(yīng)用。發(fā)明人通過大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)谷紅注射液可以用于制備治療肺癌細(xì)胞的藥物，尤其是對高轉(zhuǎn)移人肺癌(PGCL3)，具有全方面的殺滅作用，在臨床上也驗(yàn)證了谷紅注射液對肺癌的治療作用。具體實(shí)施方式下面用實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步描述本發(fā)明，有利于對本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)、效果更好的了解,但所迷實(shí)驗(yàn)例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例1本研究探討谷紅注射液對高轉(zhuǎn)移人肺癌(PGCL3)細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響。1材料與方法1.1細(xì)胞抹和主要試劑克隆化高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞癌細(xì)胞(PGCL3);RPMI-1640培養(yǎng)基是GIBCO公司產(chǎn)品；層粘連蛋白(LN)、纖粘連蛋白(FN)和基底膜膠(matrigel);澳乙啶、吖咬橙和Na-GBZ-l-Ly-sine-p-nitrophenylester為SIGMA公司產(chǎn)品，谷紅注射液是阿爾貝拉醫(yī)藥(中國)有限公司產(chǎn)品，為便于研究，將谷紅注射液冷凍干燥得到無定型粉末(以下簡稱"藥物")用于實(shí)驗(yàn)研究，TUNEL-POD試劑盒為武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品。1.2細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理PGCL3細(xì)/i^種于含10%小牛血清pH7.4的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37匸、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至指數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。藥物經(jīng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)和增殖抑制試驗(yàn)確定藥物濃度為2.5mg/L和5.0mg/L,設(shè)兩個(gè)濃度的藥物處理組和一個(gè)對照組，每組3瓶，每瓶接種1x105個(gè)細(xì)胞，接種24h后加藥。1.3細(xì)胞增殖抑制率測定和軟瓊脂集落形成試驗(yàn)2.5~5.0mg/L,藥物處理96h，收集細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=(對照組細(xì)胞數(shù)-藥物組細(xì)胞數(shù))/組細(xì)胞數(shù)x100%。軟瓊脂集落形成試驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行。1.4侵襲試驗(yàn)參照Albini等"所用方法，將作為化李趨化物的NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清液0.2ml加入Boyden小室的下室，在上下室之間用孔徑8mm的聚碳酸酯微孔濾膜分開，該膜預(yù)先鋪上Madrigel溶液50pH含Matrigel120yg)，并在37C聚合30min以重建基底膜。將各組已處理96h的細(xì)胞收集后分別加入上室，每室加0.5ml(含5x104-細(xì)胞)，在37t:、5%0)2培養(yǎng)箱孵育6h后取出濾膜，擦去未穿過的細(xì)胞，固定后經(jīng)Giemsa染色，計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)。1.5運(yùn)動試驗(yàn)參照Kantor等12所用方法，除用7.5mg/mlFN代替Matrigel溶液鋪膜以促進(jìn)細(xì)胞粘著于膜上外，其余操作步驟和計(jì)數(shù)方法與侵襲試驗(yàn)相同。1.6粘附試驗(yàn)在參照Kumagai等人[3所用的方法上進(jìn)行改良，將各組處理96h的細(xì)胞制無血清RPMI-1640的細(xì)胞懸液，接種于已包被LN的96孔板的孔內(nèi)，每孔含LN10Hg，每孔加0.2ml細(xì)胞懸液(含1000個(gè)細(xì)胞)置37匸、5%C02培養(yǎng)箱孵育60min后，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，棄去未粘附的細(xì)胞，PBS輕洗2次，鏡下計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞，計(jì)算粘附百分率。1.7組織蛋白酶B(CB)活性測定用酶動力學(xué)方法測定。取各組藥物處理24h后換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，取上清液100u1加激活液(舍0.03M二硫蘇糖醇和0.03MEDTA-NA2溶液)200iJl,搖勻，25t:放置15min使酶激活；加入3ml反應(yīng)緩沖液(含0.003MEDTA-NA2的0.025MpH5.1醋酸緩沖液)，混勻，加底物N+千氧羰基-L-賴氨酰對硝基苯酯溶液1000u1(5mg/L的DMSO溶液)，立刻混勻后每隔lmin測AA326nm值，至反應(yīng)變慢為止，然后進(jìn)行酶活性計(jì)算。酶活性單位是25t:、pH5.1的條件下，每分鐘水解lpmol/L底物為一個(gè)酶活性單位(U)。U=(AA326nm測-厶A326nm空白)/7.58x10懇3。1.8細(xì)胞凋亡測定檢測細(xì)胞凋亡的吖啶橙(AO)-澳乙啶(EB)熒光雙染法按Zhi-Jun等W的方法進(jìn)行，TUNELDNA片段末端標(biāo)記法按武漢博士德生物工程公司TUNEL-POD試劑盒說明書方法進(jìn)行。1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS軟件進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1藥物對PGCL3細(xì)胞增殖的影響2.5、3.5、4.5、5.5和6.5mg藥物處理96h，PGCL3細(xì)胞增殖抑制率分別為29.6%、43.2%，54.5°/。，84.1%和97.3%，經(jīng)計(jì)算，藥物的ICso為4.07mg/L，以下分別選取5.0mg/L的藥物作為實(shí)驗(yàn)濃度。2.2藥物對PGCL3細(xì)胞軟瓊脂集落形成能力的影響2.5mg/L、5.0mg/L，藥物處理4dPGCL3細(xì)胞軟瓊脂集落形成數(shù)均低于對照組(P<0.05)，見表l。2.3藥物對PGCL3細(xì)胞侵襲能力的影響2.5mg/L、5.0mg/L藥物處理4d后對PGCL3細(xì)胞的穿膜侵襲能力均有顯著抑制作用(P<0.05和P<0.001)且具有濃度依賴性。上述濃度藥物處理2h，細(xì)胞的侵襲能力無明顯改變(P>0.05),見表2、3。2.4藥物對PGCL3細(xì)胞運(yùn)動能力和粘附能力的影響藥物處理96h,觀察PGCL3細(xì)胞的穿膜運(yùn)動能力和粘附能力，可見藥物處理組的穿膜運(yùn)動能力和粘附能力均顯著下降，(PO.001)且具有濃度依賴性，見表4、2.5藥物對PGCL3細(xì)胞分泌組織蛋白酶B(CB)的影響PGCL3細(xì)胞經(jīng)藥物處理72h后換無血清培液培養(yǎng)24h,培養(yǎng)液上清中組織蛋白酶B活性測定結(jié)果，藥物處理組細(xì)胞分泌的CB活性顯著降低(PO.001)，見表6。2.6藥物誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡的作用藥物處理PGCL3細(xì)胞48h，AO/EB焚光雙染法和TUNEL法測定細(xì)胞竭亡率，結(jié)果可見藥物處理使PGCL3細(xì)胞凋亡率明顯增加(PO.05和P<0.001)，見表7。表l谷紅注射液對肺癌細(xì)胞集落形成能力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2谷紅注射液對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3谷紅注射液處理2h對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表4谷紅注射液對肺癌細(xì)胞運(yùn)動能力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表5谷紅注射液對肺癌細(xì)胞粘附能力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表6谷紅注射液對肺癌細(xì)胞分泌CB活性的影響組別CB活性(u/ml)與對照組比較對照組5.0±1.32.5mg/L3.6±1.0P<0.055.0mg/L3.4±1.2P<0.05表7谷紅注射液對PGCL3細(xì)胞凋亡的影響組別細(xì)胞凋亡率(％)AO/EB法TUNEL法對照組4.48±0.968.20±1.902.5mg/L7.38±0.83A14.76±3.52*5.0mg/L11.47±1.08*22.91±5.31*T測試，AP<0.05，*PO.013討論4^研究發(fā)現(xiàn)谷紅注射液既有抑制PGCL3細(xì)胞增殖作用，又有抗侵襲和誘導(dǎo)凋亡作用。本研究結(jié)果顯示谷紅注射液能明顯抑制PGCL3人肺癌細(xì)胞增殖，其機(jī)理之一可能是誘導(dǎo)癌細(xì)胞惡性表型逆轉(zhuǎn)，^研究還證明谷紅注射液使PGCL3細(xì)胞軟瓊脂集落形成率顯著下降，通常認(rèn)為癌細(xì)胞在半固體瓊脂上形成集落的多少與其惡性程度呈正相關(guān)。另一方面由于谷紅注射液有誘導(dǎo)PGCL3細(xì)胞凋亡而使其細(xì)胞數(shù)量減少.細(xì)胞凋亡是遵循一定程序的生理性細(xì)胞死亡，其形態(tài)特征是以細(xì)胞核的變化為先導(dǎo)，早期出現(xiàn)核固縮，最后細(xì)胞碎裂成凋亡小體；細(xì)胞凋亡的生化特征是Ca2、MgW依賴的核酸內(nèi)切酶激活使DNA斷裂，^研究用反映細(xì)胞凋亡形態(tài)特征的AO/EB熒光雙染法和高靈敏度特異反映細(xì)胞凋亡生化特征一一DNA聚合酶介導(dǎo)的原位缺口平移法、TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL法)探測DNA的斷裂，證明該藥物有誘導(dǎo)PGCL3細(xì)胞凋亡的作用，這可能是細(xì)胞增殖抑制機(jī)理的另一方面。癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多因素、多基因的發(fā)展過程。從分子水平可將這種過程人為分成三步粘附，腫瘤細(xì)胞與胞外基質(zhì)中層粘連蛋白(LN和纖維連接蛋白(FN)相粘附；趨化運(yùn)動，腫瘤細(xì)胞沿著趨化劑的濃度梯度遷移；降解，即腫瘤細(xì)胞釋放各種水解酶類(組織蛋白酶B等)，破壞其粘附部位的組織，使腫瘤細(xì)胞得以向縱深移動遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移。在此過程中，細(xì)胞粘附，細(xì)胞外基質(zhì)降解以及細(xì)胞運(yùn)動是轉(zhuǎn)移能否發(fā)生的決定環(huán)節(jié)。組織蛋白酶B與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)，惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，其組織蛋白酶B活性顯著增加，且轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的增加更明顯。藥物體外抗侵襲作用尚未見報(bào)道，本研究采用Albini等人用天然基底膜膠重建基底膜的模型(腫瘤細(xì)胞體外侵襲模型)進(jìn)行腫瘤細(xì)胞侵襲定量實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)藥物具有明顯抑制PGCL3細(xì)胞侵襲的作用。為了探討其抗侵襲的機(jī)理，本研究對癌細(xì)胞侵襲的三個(gè)基本環(huán)節(jié)一一粘附、運(yùn)動和降解進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，上述濃度藥物處理后，PGCL3細(xì)胞對層粘連蛋白的粘附能力、趨化運(yùn)動能力和組織蛋白酶B的分泌均顯著下降，并呈量效關(guān)系?？梢姽燃t注射液抗PGCL3細(xì)胞侵襲的作用是多方面的，即侵襲作用的機(jī)理包括粘附、運(yùn)動和降解能力的抑制，而不是對某一環(huán)節(jié)的阻斷作用。Lotan5總結(jié)維曱類(含維甲酸)抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，認(rèn)為是由于促進(jìn)惡性細(xì)胞分化，從而抑制參與侵襲的蛋白酶的產(chǎn)生，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和新血管的生成等。以上研究均表明，細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑對侵襲作用的各個(gè)環(huán)節(jié)都呈抑制作用，而不是對個(gè)別環(huán)節(jié)的阻斷作用。谷紅注射液抗PGCL3細(xì)胞侵襲的作用也具有上述細(xì)胞分化謙導(dǎo)劑抗侵襲作用的特點(diǎn)，說明其抗侵襲作用機(jī)理也是由于細(xì)胞分化所致。本研究用谷紅注射液處理PGCL3細(xì)胞2h后PGCL3細(xì)胞侵襲能力沒有影響，也說明該藥物不直接阻斷肺癌細(xì)胞的侵襲過程，只有較長時(shí)間的處理才表現(xiàn)抗侵襲作用，因?yàn)榧?xì)胞分化需要經(jīng)歷復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控的歷程。從本研究發(fā)現(xiàn)的該藥抗侵襲作用特點(diǎn)和軟瓊脂集落形成率變化情況，說明谷紅注射液的抗侵襲作用可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞惡性表型逆轉(zhuǎn)即誘導(dǎo)細(xì)胞分化而實(shí)現(xiàn)的。因此，通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化來抑制肺癌細(xì)胞的侵襲，似乎是比較合理的對策。參考文獻(xiàn)[l]AlbiniA，IwamotoY，KleinmamHK，etal.Arapidinvitroassayforquantitatingtheinvasionpotentialoftumorcells[J〗，CancerRes;1987，47(12):3239-1973.[2]KantorJO，MccormickB，steegPS,etal，Inhibitionofcellmotilityafternm23transfectionofhumanandmurinetumorcells[J].CancerRes:1993，53(9):1971-1973.[3]KumagaiH，TajimaM，UenoY，EffectofcyclicRGDpeptideoncelladhesionand加mormetastasis[J]，BiochemBiophysResComm，1991，177(l):74-82.[4]Zhi-JunY，SriranganathanN，VaughtT，etal,Adye-basedlympho-cyteproliferationassaythatpermitsmultipleimmunologicalanalyses:mRNA，cytogentic，apoptosis，andimmuno-phenotypingStudies[J]，JImmunolMethods，1997,210(1):25-39.[5]LotanR，Retinoidsasmodulatorsoftumorcellsinvasionandmetasta-sis[J.SetninCancerBiol,l991,2(3):197-208.實(shí)驗(yàn)例2治療一例小細(xì)胞肺癌病例劉某，男，53歲，無即往腫瘤發(fā)病，B超檢查肝膽?yīng)M脾雙腎未見明顯異常。CT診斷報(bào)告:胸壁皮下軟組織層次結(jié)構(gòu)清晰，未見腫脹、積氣或腫塊。左肺上葉支氣管周圍見邊界邊界不清軟組織塊影圍繞，左肺上葉支氣管受壓變窄，遠(yuǎn)端肺組織容積縮小、實(shí)變?？v隔內(nèi)未見明確腫大淋巴結(jié)影。心臟大小及形態(tài)無特殊，心包腔內(nèi)無積液，所見脈管粗細(xì)均勻，未見異常改變。支氣管鏡檢查喉會厭會厭披裂皺襞披裂隆凸、披裂間隙聲帶(-)氣管(-)氣管隆凸銳利、動態(tài)好肺支氣管右肺(-)左肺左上葉舌支新生物/壞死物阻塞，并有活動性出血，左下葉基底支開口外側(cè)壁外壓性狹窄。肺活檢擠壓組織中見部分異型細(xì)胞，診斷為小細(xì)胞肺癌。治療方法化療，順鉑+紫杉醇，做2周期(2x21天)，化療中結(jié)合谷紅注射液靜脈滴注，一次5ml-20ml，用5%或10%葡萄糖注射液250ml-500ml稀釋后緩慢滴注，一日一次，15天為一療程，間歇10天后再進(jìn)行一個(gè)療程。病人止痛藥減量，體質(zhì)恢復(fù)較好，病人存活期已經(jīng)超過18個(gè)月。權(quán)利要求1.谷紅注射液在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于藥物用途，具體公開了谷紅注射液的新用途。通過大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證，確認(rèn)谷紅注射液在制備治療肺癌藥物方面的應(yīng)用有良好前景。文檔編號A61P35/00GK101120959SQ200610109289公開日2008年2月13日申請日期2006年8月8日優(yōu)先權(quán)日2006年8月8日發(fā)明者張玉梅申請人:阿爾貝拉醫(yī)藥(中國)有限公司