專利名稱：一種攜人分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及一種與人分子佐劑hC3d3交聯(lián)的避孕疫苗，即hCG e-hC3d3融合蛋白避孕疫苗。
背景技術(shù)：
人絨毛膜促性腺激素(hCG)是由胎盤(pán)合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，其 主要的生理功能是延長(zhǎng)黃體壽命，使之增大成為妊娠黃體，增加甾體激素的分泌以 維持妊娠。hCG是妊娠期暫時(shí)出現(xiàn)的一種特異性激素，己有研究證實(shí)，中和hCG的生 物學(xué)活性可以在不干擾其它生殖生物學(xué)功能的情況下中止妊娠，因此hCG成為避孕疫苗設(shè)計(jì)中最理想的靶抗原?；趆CG結(jié)構(gòu)中e亞基的特異性，以hcce為基礎(chǔ)的合成 肽疫苗已經(jīng)進(jìn)入了n期臨床實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hCGe避孕疫苗具有可喜的應(yīng)用前景，但免疫效果個(gè)體之間的差異性和目前僅有的80%的避孕效果距臨床應(yīng)用相距甚遠(yuǎn)。因此，如何顯著增強(qiáng)其具有抗生育作用的體液免疫效應(yīng)，減弱有可能導(dǎo)致生殖系自身免疫損傷的細(xì)胞免疫效應(yīng)已成為hCGe避孕疫苗的研究目標(biāo)。為了打破機(jī)體對(duì) hCGe這個(gè)小分子自身抗原的免疫耐受，以往研究中大多采用白喉類毒素(DT)或破 傷風(fēng)類毒素(TT)作為載體增強(qiáng)其免疫原性，但DT和TT卻存在著載體介導(dǎo)的表位抑制 效應(yīng)。在哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)中，C3d是補(bǔ)體C3的最后裂解產(chǎn)物之一，它與B細(xì)胞和濾泡樹(shù) 突狀細(xì)胞(FDC)上的受體(CR2， CD21)的相互作用對(duì)于正常體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和維 持至關(guān)重要。1996年Dempsy首次報(bào)道C3d是一個(gè)能顯著增強(qiáng)體液免疫效力的分子佐 劑，將C3d與抗原融合形成的C3d-抗原復(fù)合物能使抗原的免疫原性增強(qiáng)1000 10000 倍。此后，許多研究證實(shí)C3d是一個(gè)具有巨大潛能的疫苗佐劑。Thomas D. Greeri等報(bào)
道把膜結(jié)合形式的三個(gè)拷貝C3d (mC3d3)與流感病毒血凝素(HA)相聯(lián)形成的mHA-C3d3 DNA疫苗和Mitchell JA等把分泌形式的三個(gè)拷貝C3d(sC3d3)與麻疹病毒血凝素(H) 相聯(lián)形成的sH-C3d3 DNA疫苗在保護(hù)性免疫的出現(xiàn)、抗體親和力的成熟和中和滴度方 面都明顯強(qiáng)于HA和H。最近他們采用了相似的方法把I型人類免疫缺陷病毒包膜表面 蛋白(HIV-lgpl20)融合到了C3d3的羧基端，并在嚙齒類動(dòng)物中再次驗(yàn)證了C3d3增 強(qiáng)體液免疫效應(yīng)的能力。對(duì)于hCGe避孕疫苗而言，決定其避孕效果的是體液免疫效 力，而非細(xì)胞免疫。細(xì)胞免疫不僅沒(méi)有中和hCG0生物學(xué)活性的能力，在一定程度上 還存在著導(dǎo)致生殖系耙細(xì)胞自身免疫損傷的危險(xiǎn)。因此，用基因工程技術(shù)研制hCG e避孕疫苗，并顯著增強(qiáng)其具有抗生育作用的Th2型及體液免疫效應(yīng)，減弱Thl型及 CTL效應(yīng)是hCG P避孕疫苗的研究目標(biāo)。以往的研究,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了hCGe與3個(gè)拷貝C3d分子的真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3- hCGP-C3d3，所得到的融合蛋白經(jīng)鑒定證實(shí)既具有CD21分子結(jié)合活性，也 具有hCGe抗原性。在以上研究基礎(chǔ)上，將hCGP-C3d3cDNA構(gòu)建入表達(dá)效率更高的真 核載體pCMV4，通過(guò)對(duì)BALB/c小鼠的基因免疫，顯示分子佐劑C3d3使hCGe的免疫原性 增強(qiáng)了200多倍，并實(shí)現(xiàn)了免疫效應(yīng)從Thl型細(xì)胞免疫向Th2型體液免疫偏倚。由于基 因疫苗在宿主細(xì)胞中的表達(dá)限制和基因疫苗在與宿主細(xì)胞基因組整合過(guò)程中，有可 能激活原癌基因或破壞抑癌基因，理論上存在著致癌的危險(xiǎn)性。因此，體外表達(dá)、 純化hCGP-C3d3融合蛋白，制備基因工程疫苗，并針對(duì)此融合蛋白研究hCGe-C3d3 疫苗的免疫效應(yīng)、抗生育效果及其作用機(jī)理將更為合理、安全。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種高效、穩(wěn)定、廉價(jià)的與人分子佐劑C3d3交聯(lián)的hCGP -hC3d3融合蛋白避孕疫苗。本發(fā)明的另一 目的是提供一種制備hCG e -hC3d3融合蛋白的方法。本發(fā)明避孕疫苗含有與人分子佐劑C3d3交聯(lián)的hCG f3 -hC3d3融合蛋白，通過(guò)下述 方法制備選用真核表達(dá)載體pCI，構(gòu)建帶有純化標(biāo)簽的hCGP-hC3d3融合蛋白和hCGp蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，即pCI-6His-hCGP—hC3d3，通過(guò)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0) 系統(tǒng)中獲得高效表達(dá)，經(jīng)鑒定、純化得高純度目的蛋白融合蛋白hCGB-hC3d3。本發(fā)明制備所述的避孕疫苗包括下述步驟-1. hC3d基因克隆及構(gòu)建重組pCI-gs-signal-6His-hCGP 、 pCI-gs - signal-6His -hCGP -hC3d3真核表達(dá)質(zhì)粒;2. 目的蛋白表達(dá),鑒定、純化；3. hCGP-C3d3促進(jìn)B細(xì)胞表達(dá)CD86及CD80分子；4. hCG0-C3d3促進(jìn)共培養(yǎng)的PBMC、 B+T細(xì)胞CD86、 CD80、 CD154、 CD25分子表達(dá);5. hCGp-C3d3促進(jìn)共培養(yǎng)的PBMC、 B+T細(xì)胞分泌IL-2 ;本發(fā)明選用真核表達(dá)載體pCI，分別構(gòu)建帶有6個(gè)組氨酸(6His)純化標(biāo)簽的hCG e-hC3d3融合蛋白和hCGP蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，即pCI-6His-hCGe—hC3d3。本發(fā) 明克隆了人源C3d (hC3d)，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒；實(shí)現(xiàn)了在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0) 系統(tǒng)中獲得融合蛋白hCG P -hC3d3高效表達(dá)。經(jīng)鑒定、純化得到較高純度的目的蛋白。 通過(guò)體外剌激人PBMC，證實(shí)人分子佐劑hC3d3增強(qiáng)hCGe蛋白疫苗體液免疫效力和抗 生育潛能。較現(xiàn)有技術(shù)，其抗生育效果及其作用機(jī)理將更為合理、安全。


圖l是pCI-gs-signal-6His-hCGe 、pCI-gs-signal-6His-hCG e-hC3d3真核表達(dá) 質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。圖2是pCI-gs-signa卜6His-hCGe 、 pCI-gs-signal-6His-hCG e-hC3d3真核表 達(dá)載體酶切鑒定圖其中1: X-Hind III Marker; 2: pCI-gs-signal-6His-hCG P-hC3d3; 3: p Cl-gs-signal-6His-hCGP ; 4: pCI-gs-signal-6His-hCGP -hC3d3 /EcoR I; 5: pCI-gs-sigrml-6His-hCGP/EcoR I 圖3是Western blotting分析pCI-gs-signal-6His-hCG P-hC3d3及pCI-gs-signal-6His-hCGe表達(dá)產(chǎn)物，其中1, 3:Biotinylated Protein Ladder; 2: There are three protein bands of 136Ka (hCGe -hC3d3)， 100 KDa (hCGP -hC3d2)， 64 KDa (hCGP -hC3d); 4: One protein band of hCGP (24 KDa)。圖4是Raji細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定pCI-gs-signal-6His-hCG P -hC3d3及 pCI-gs-signal-6His-hCGP表達(dá)產(chǎn)物。圖5:人外周血免疫活性細(xì)胞CD80、 CD86、 CD154、 CD25的表達(dá),其中* P〈0. 05 and **P〈0. 01。圖6: PBMC經(jīng)不同濃度抗原刺激48h培養(yǎng)上清IL-2產(chǎn)量，其中* P〈0. 05 and **P〈0. 01 。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l1) hC3d基因克隆及構(gòu)建重組pCI-gs -signal-6His-hCGP 、 pCI-gs -signal -6His - hCGP -hC3d3真核表達(dá)質(zhì)粒用PCR擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的hC3d片段，結(jié)果顯示一條約0.9K b大小的片段。測(cè) 序結(jié)果與目的基因片段完全一致。通過(guò)酶切、連接反應(yīng)后得質(zhì)粒pCI-gs -signal-6His-hCGP 、 pCI-gs -signal-6His-hCGP-hC3d3(圖l)。酶切結(jié)果(圖2) 證實(shí)構(gòu)建正確。2)目的蛋白表達(dá)，鑒定、純化脂質(zhì)體法介導(dǎo)二種pCI-gs-signal-6His-hCG0 、 pCI-gs-signal-6His -hCGP -hC3d3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0細(xì)胞。通過(guò)篩選分別獲得高表達(dá)克隆。經(jīng)培養(yǎng)24h、 48h、 72h 后，pCI-gs-signal-6His-hCG0高表達(dá)克隆培養(yǎng)上清目的蛋白hCGP的產(chǎn)量分別為 11155、 24337、 45057mlu/ml/1 X 10'cells;而pCI-gs-signal-6His-hCG P-hC3d3的
高表達(dá)克隆培養(yǎng)上清重組蛋白hCGe-hC3d3產(chǎn)量分別為523.36 、 716.07、 1140mIu/ml/lX105cell。Western bloUing分析顯示，pCI-gs-signal-6His-hCG P -hC3d3陽(yáng)性克隆的表達(dá) 產(chǎn)物為三條帶，分子量大小分別相當(dāng)于約為136Ka、 100 KDa、 64 KDa (圖3a)。 pCI-gs-signa1-6His-hCGP陽(yáng)性克隆表達(dá)產(chǎn)物分子量約為24KDa (圖3b) 。 Raji細(xì)胞 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，pC-gs-signal-6His-hCG 0 -hC3d3陽(yáng)性克隆表達(dá)產(chǎn)物可使 Raji細(xì)胞膜呈陽(yáng)性著色(圖4a);而pCI-gs-signa1-6His-hCGP陽(yáng)性克隆表達(dá)產(chǎn)物 則不能使Raji細(xì)胞膜著色(圖3b)。在非變性條件下，用His. Bind柱下一步純化pCI-gs-signal-6His-hCGP陽(yáng)性克 隆培養(yǎng)上清收獲hCGe蛋白，純化產(chǎn)物具有較高純度。pCI-gs -signal-6His-hCG P -hC3d3陽(yáng)性克隆培養(yǎng)上清的金屬螯合親和層析的純化產(chǎn)物為含 有三種不同分子量136KDa、 100KDa、 64KDa的混合物。根據(jù)分子量大小的差異，應(yīng)用 S印hadex G150 column進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析分離出136Ka的hCGP -hC3d3融合蛋白，所 述產(chǎn)物具有較高純度。3) hCG 0 -C3d3促進(jìn)B細(xì)胞表達(dá)CD86及CD80分子磁珠陰性分離的8細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定其純度達(dá)76%。經(jīng)hCGP -C3d3蛋白刺激 后，CD86+細(xì)胞表為70. 55%±29.32，與其他各組比較均有顯著性差異(P<0.05)。 CD80+細(xì)胞為32.64W土13.53，與對(duì)照組及hCG P組比較但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 在加入CD21Ab情況下，貝IJCD86+細(xì)胞降為15. 15%±8. 38，與其他各組比較均無(wú)顯著 性差異(P 〉0.05)。經(jīng)PWM刺激培養(yǎng)后，CD80+細(xì)胞62.96W土23. 56,與其他各組比 較均有顯著性差異(P〈0. 05)。結(jié)果表明，hCGP-hC3d3蛋白明顯增強(qiáng)B細(xì)胞表面CD86 分子的表達(dá)；而PWM則對(duì)B細(xì)胞CD80分子起升調(diào)節(jié)作用。4) hCGP-C3d3促進(jìn)共培養(yǎng)的PBMC、 B+T細(xì)胞CD86、 CD80、 CD154、 CD25分子表達(dá)在T與B細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，hCGP-hC3d3蛋白亦明顯升調(diào)B細(xì)胞表面CD86分子的 表達(dá)(P<0.05) , CD21Ab可阻斷此種升調(diào)節(jié)作用；而PWM主要增強(qiáng)B細(xì)胞CD80分子表 達(dá)。 經(jīng)hCGP-C3d3和PWM刺激后，CD154+細(xì)胞、CD25+細(xì)胞明顯增加，與hCGP及對(duì)照 組比較均有顯著性差異(P〈0. 05)。若在hCG 6 -C3d3培養(yǎng)中加入CD21Ab,則〔0154+ 細(xì)胞、CD25+細(xì)胞減少，與單獨(dú)hCGP刺激及對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(P〉0.05)。 以上結(jié)果提示，hCGp-hC3d3蛋白及PWM能明顯增強(qiáng)T細(xì)胞表面CD154、 CD25分子的表 達(dá)(圖5)。5) hCGe-C3d3促進(jìn)共培養(yǎng)的PBMC、 B+T細(xì)胞分泌IL-2用l nM 、 10nM、 100nM 1000 nM hCG e 、 hCGP-hC3d3、 PWD與PBMC、 B+T細(xì)胞共 培養(yǎng)，取48h培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA檢測(cè)T細(xì)胞活化后IL-2分泌水平。結(jié)果顯示，hCG0 刺激組僅在100nM濃度時(shí)檢測(cè)到微量IL-2 (32.5±6.89);而用hCG P -hC3d3、 PWM 處理后，IL-2含量明顯升高，與hCGP處理組及對(duì)照組比較有顯著性差異(P〈0.05); PWM處理組較其他各組IL-2水平顯著升高(P<0. 01)(圖6)。
權(quán)利要求
1、一種攜人分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗，其特征在于含有與人分子佐劑C3d3交聯(lián)的hCGβ-hC3d3融合蛋白，通過(guò)下述方法制備選用真核表達(dá)載體pCI，構(gòu)建帶有純化標(biāo)簽的hCGβ-hC3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)動(dòng)物宿主表達(dá)系統(tǒng)獲得高效表達(dá)，經(jīng)鑒定、純化得高純度目的蛋白，包括下述步驟1)hC3d基因克隆及構(gòu)建重組pCI-gs-signal-6His-hCGβ、pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3真核表達(dá)質(zhì)粒；2)表達(dá)，鑒定、純化目的蛋白融合蛋白hCGβ-hC3d3；3)hCGβ-C3d3促進(jìn)B細(xì)胞表達(dá)CD86及CD80分子；4)hCGβ-C3d3促進(jìn)共培養(yǎng)的PBMC、B+T細(xì)胞CD86、CD80、CD154、CD25分子表達(dá)；5)hCGβ-C3d3促進(jìn)共培養(yǎng)的PBMC、B+T細(xì)胞分泌IL-2。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜人分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗，其特征在于所述 的融合蛋白在氨基端加上6個(gè)組氨酸純化標(biāo)簽。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜人分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗，其特征在于所述 的有hCGP-hC3d3融合蛋白其分子量為136Ka 。
4、 、根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜人分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗，其特征在于所述 的動(dòng)物宿主表達(dá)系統(tǒng)是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及一種與人分子佐劑hC3d3交聯(lián)的避孕疫苗，即hCGβ-hC3d3融合蛋白避孕疫苗。本發(fā)明選用真核表達(dá)載體pCI，構(gòu)建帶有純化標(biāo)簽的hCGβ-hC3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)動(dòng)物宿主獲得高效表達(dá)，經(jīng)鑒定、純化得高純度目的蛋白，通過(guò)體外刺激人PBMC實(shí)驗(yàn)，證實(shí)人分子佐劑hC3d3增強(qiáng)hCGβ蛋白疫苗體液免疫效力和抗生育潛能。較現(xiàn)有技術(shù)，其抗生育效果及其作用機(jī)理將更為合理、安全。
文檔編號(hào)A61K39/39GK101161287SQ20061011709
公開(kāi)日2008年4月16日 申請(qǐng)日期2006年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月12日
發(fā)明者李大金 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院