專利名稱：：用于rna干擾的寡核苷酸及其生物學(xué)應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)RNA干擾有用的新的雙鏈寡核苷酸(dsON)，還涉及將它們應(yīng)用于遞送寡核苷酸到培養(yǎng)的真核細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行生物學(xué)和治療性應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：RNA干擾(RNAi)是現(xiàn)在在早期基因功能水平即mRNA水平上進(jìn)行基因沉默的技術(shù)(Fireetal，1999;Tuschletal.，1999)。該技術(shù)提供序列特異性的mRNA降解和蛋白質(zhì)生成抑制(Yangetal，2000，Zamoreetal，2000，Hammondetal,2000，Parrish2000)。RNAi是高效的，因?yàn)槠涫强深A(yù)先設(shè)計(jì)的有活性的dsRNA(siRNA,用于小的干擾RM)和耙向mRNA。當(dāng)siRNA雙鏈通過用載體轉(zhuǎn)染并^皮遞送到細(xì)胞質(zhì)時(shí)，RNAi在多種哺乳細(xì)胞中顯示出有效地沉默內(nèi)源性和外源性基因(Elbashiretal，2001)。介導(dǎo)RNAi所需的傳統(tǒng)dsRNA的結(jié)構(gòu)特征表明優(yōu)選具有19-25個(gè)核普酸(參見專利WO0244321，WO01/075164A3,EP20010985833)，特別是19-23個(gè)核苷酸長度的短dsRNA在哺乳細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中有RNAi活性(Parrishetal.，2000;Elbashiretal.，2001;Tuschl，2001)。短的19-25個(gè)核苷酸(當(dāng)堿基配對(duì)并且?guī)в形磁鋵?duì)的3，突出端)擔(dān)當(dāng)著指導(dǎo)序列特異性mRM降解的作用。當(dāng)兩端均是平末端(O個(gè)核苷酸突出端)或當(dāng)1條鏈?zhǔn)瞧侥┒藭r(shí)，有可能觀察到RNAi。即使siRNA未配對(duì)的突出端的序列對(duì)靶目標(biāo)RNA的裂解不是關(guān)鍵的，但3，突出端的存在對(duì)優(yōu)化RNAi和siRNA的穩(wěn)定性顯示出關(guān)鍵性。優(yōu)選地，至少一條鏈具有1-5個(gè)核苷酸的3，突出端，特別是1-3個(gè)核苷酸的3，突出端。該RNA鏈優(yōu)選具有3，-羥基基團(tuán)和優(yōu)選在5，末端包含磷酸基團(tuán)，沒有5，突出端。最有效的短dsRNA包含配對(duì)的各有21個(gè)核苷酸的2條鏈，這樣使l-3個(gè)，特別是2核苷酸的3，突出端呈現(xiàn)在dsRNA的兩個(gè)末端(Elbashiretal.，2001)。RNA雙鏈的長度顯示出可以被延長到27-28聚體(Siolasetal.，2005;Kimetal.，2005)，且可以耐受多種化學(xué)和/或骨架修飾(Kurreck,2003)。RNAi的成功依賴于兩點(diǎn)雙鏈RNA的長度、序列、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞遞送的載體。與反義核苷酸或核酶技術(shù)相比較，靶mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于siRNA進(jìn)行基因沉默不是一個(gè)很強(qiáng)的限制因素。對(duì)于給定的mRNA靶，多種siRNA序列可能是有效的。因而，siRNA雙鏈的穩(wěn)定性和生物學(xué)利用度以及遞送到細(xì)胞中的dsRNA數(shù)量依然是有效沉默的限制因素，而不是siRNA對(duì)靶的易接近性。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用相同的遞送系統(tǒng)進(jìn)行導(dǎo)入時(shí)，和傳統(tǒng)的短dsRNA獲得的結(jié)果相比較，具有能使雙鏈寡核苷酸互相粘合的特定結(jié)構(gòu)特征的dsON在真核細(xì)胞中具有高的RNA干擾活性和能夠提供更高的基因沉默效率。由于能夠更好地耐受降解，更長的寡核苷酸比傳統(tǒng)的短dsRNA展示更高的穩(wěn)定性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)就是提供新的組合物，該組合物包含dsON,當(dāng)被導(dǎo)入到哺乳細(xì)胞中時(shí)所述dsON是RNAi的序列特異的介導(dǎo)者。進(jìn)而本發(fā)明描述了dsON進(jìn)行基因沉默的好處，該dsON包含能介導(dǎo)1個(gè)或多個(gè)靼基因的序列特異性RNA干擾的多個(gè)拷貝的短dsON。本發(fā)明還涉及基于合成載體的多種轉(zhuǎn)染遞送系統(tǒng)以及它們?cè)谏飳W(xué)上的應(yīng)用。本發(fā)明的組合物包含具有序列或長度相同或不同的雙鏈寡核苷酸，所述寡核苷酸具有序列3'線...N卜艮..N,，其中-3'Ni...N/'是19-28聚體的雙鏈寡核苷酸序列的一半，其互補(bǔ)于存在于活細(xì)胞中的靶核苷酸序列，和」'Nl.，U'是3-50聚體的突出端序列，其允許所述雙鏈寡核苷酸寡聚化。所述組合物所優(yōu)選的dsON很方便地具有19-21個(gè)核苷酸的序列3'Ni...Nj5',和/或包含5至8個(gè)核苷酸的序列3'N..Ni'。如實(shí)施例所表明的，當(dāng)堿基與未配對(duì)的3，突出端配對(duì)并在長dsON中寡聚化時(shí)，短dsON作為序列特異性的mRNA降解的指導(dǎo)者發(fā)揮作用。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，序列3'N,...N"'可能對(duì)降解是穩(wěn)定的，例如對(duì)核酸酶的降解沒有顯著的活性損失。適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定基團(tuán)選自被修飾的類似物例如脫氧核糖核苷酸取代的嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸，和/或修飾的核苷酸類似物例如糖或骨架修飾的核苷酸或脫氧核糖核苷酸。在另外的實(shí)施方案中，任選地與任一前述特征的組合，本發(fā)明的該組合物包含至少一種在一個(gè)或兩個(gè)5，末端帶有5，磷酸或羥基的dsON。在根據(jù)本發(fā)明的組合物的dsON中，寡核苷酸序列含有脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸類似物(VermaandEckstein,1998)、例如甲基膦酸酯(Mi1ler，1991)、磷酰二胺嗎啉，石克代磷酸酯(ZonandGeiser,1991)、PM(JepsonandWengel，2004)、LNA、2，烷基核苷酸類似物(Kurreck，2003)。有效的病毒或非病毒載體在把寡核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞中是有用的。病毒遞送系統(tǒng)依然遭受著在臨床條件下的免疫原性及潛在的危險(xiǎn)性。相反，用合成系統(tǒng)的核苷酸轉(zhuǎn)染是通用的方法，該方法顯示出適應(yīng)性且沒有免疫原性。非病毒載體的寡核苷酸轉(zhuǎn)染對(duì)將dsON遞送到細(xì)胞質(zhì)是有用的。目前非病毒載體主要基于陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，例如Oligofectamin、TRANSIT-TKO、UpofectAmine2000、SiGuide、RNAiFect、或jetSi、或者基于陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，例如Superfect、jetPEI或X-T國Gene。本發(fā)明因而也涉及轉(zhuǎn)染組合物，該組合物包含至少一種例如如前定義的寡核苷酸組合物和轉(zhuǎn)染試劑或制劑。該轉(zhuǎn)染試劑或制劑更具體地是非病毒遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)適合于把dsON導(dǎo)入活細(xì)胞中，并且釋放dsON以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)RNAi。非病毒載體系統(tǒng)有利地包含陽離子脂質(zhì)或聚合物或以肽為基礎(chǔ)的遞送試劑。該非病毒載體系統(tǒng)是這樣的制劑，其包含至少遞送試劑和其它組分，該組分使制劑穩(wěn)定，靶向細(xì)胞、組織或器官，或增大轉(zhuǎn)染效率。在導(dǎo)入細(xì)胞前，當(dāng)和轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合時(shí)，分子間的相互作用促進(jìn)了短dsON的寡聚化，其中分子間的相互作用是由于3，突出端-3，突出端的相互作用或者使用能與dsON3，突出端相作用的連接子。有多種連接子可以使用，例如包含互補(bǔ)于能夠介導(dǎo)RNAi的dsON的3，突出端的核苷酸序列的寡核苷酸。其它的連接子可以是i)具有末端寡聚化結(jié)構(gòu)域的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，該末端寡聚化結(jié)構(gòu)域識(shí)別介導(dǎo)RNAi的dsON的3，突出端；ii)在每條鏈的末端具有5，-或3，-突出端的短雙鏈核酸，5，-或3，-突出端能夠識(shí)別介導(dǎo)RNAi的dsON3，突出端。連接子也可以是介導(dǎo)序列特異性或非特異性RNAi的一種或幾種dsON(或者多種dsON)，并含有與通過RNAi介導(dǎo)基因沉默的dsON3，突出端相作用的突出端。本發(fā)明還涉及到制備例如上述定義的寡核苷酸組合物的方法，所述方法包括-通過化學(xué)或酶催化途徑合成具有如上定義的序列3X...N/'和3乂...Nw"的寡核苷酸鏈;-退火由此獲得的合成的寡核苷酸。根據(jù)本實(shí)施方案，所述方法進(jìn)一步包含在所述寡核苷酸退火步驟之后加入連接子，所述連接子具有互補(bǔ)于序列3、..U'的核苷酸序列末端。所述連接子被方便地選自寡核苷酸、單鏈寡核苷酸、發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)、具有3，或5，突出端的短雙鏈核苷酸、雙鏈寡核苷酸。所述連接子選自脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸類似物。本發(fā)明還涉及在體外和體內(nèi)抑制基因表達(dá)的方法，其包括使用例如如上定義的寡核苷酸組合物或轉(zhuǎn)染組合物。所述組合物和方法對(duì)治療應(yīng)用是特別有用的，所述治療應(yīng)用例如治療癌癥、如膀胱癌(Urban-Kleinetal.，2004)、前列腺癌(Paletal.，2005)或白血病(Guanelal..2005);或病毒性感染，比如HIV、肝炎病毒或傳染性病毒感染(Geetal.，2004)。本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)將在如下給出并參考圖1至圖7，其分別如下展示。圖1:通過復(fù)合兩種主要分類的轉(zhuǎn)染試劑代表物的傳統(tǒng)的siRNA雙鏈進(jìn)行的RM干擾，兩種主要的轉(zhuǎn)染試劑是陽離子脂質(zhì)為基礎(chǔ)的和以聚合物為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)染試劑(分別是jetSi-ENDO和jetPEI)。細(xì)胞混合有jetSi-ENDOTM及jetPEITM的GL3LucsiRNA(SEQN。1)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)GL3熒光素酶基因的A549-GL3Luc，以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染試劑的效果。在24小時(shí)(a)和48小時(shí)(b)溫育期后測(cè)定熒光素酶基因的表達(dá)。通過使用商品化試劑盒(Promega)對(duì)細(xì)胞裂解物的熒火蟲熒光素酶的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估。作為非特異性對(duì)照，和GL2熒光素酶序列匹配的siRNA(SEQN。2)以同樣條件被轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，并通過對(duì)細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化的非轉(zhuǎn)染AS49-GL3Luc細(xì)胞的內(nèi)源性熒光素酶水平對(duì)GL3熒光酶沉默效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖2:通過復(fù)合有陽離子聚合物遞送試劑jetPEI的(dA)5-GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。3)雙鏈進(jìn)行RNA干擾。A549-GL3Luc細(xì)胞被轉(zhuǎn)染，在溫育24小時(shí)(a)和48小時(shí)(b)的時(shí)間后測(cè)定焚光素酶基因的表達(dá)。用標(biāo)準(zhǔn)的GL3LucsiRNA(SEQN。1)作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，通過被細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化的非轉(zhuǎn)染A549-GL3Luc細(xì)胞的內(nèi)源性熒光素酶水平對(duì)熒光酶沉默效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖3:通過(dA)廣GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。3)雙鏈介導(dǎo)序列特異性RM干擾進(jìn)行的RNA干擾。A549-GL3Luc細(xì)胞被復(fù)合有jetPEI的下述雙鏈轉(zhuǎn)染，(dA)「GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。3)(在(dA)「GL3Luc-(dT)5位置9突變的序列(dA)「GL3Luc-(dT)5MutdsRM(SEQN。4))和(dA)廣GL2Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。5)的雙鏈。溫育48小時(shí)后測(cè)定焚光素酶基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，通過對(duì)細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化的非轉(zhuǎn)染A549-GL3Luc細(xì)胞的內(nèi)源性熒光素酶水平對(duì)熒光酶沉默效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖4:具有能誘導(dǎo)它們分子間寡聚化的3，突出端的雙鏈RNA當(dāng)和jetPE尸復(fù)合時(shí)介導(dǎo)高的GL3熒光素酶沉默。用與jetPEI復(fù)合的(dA)5-GL3Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。3)和(dA)「GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。7)的雙鏈轉(zhuǎn)染A549-GL3Luc細(xì)胞。在48小時(shí)溫育期后測(cè)定熒光素酶基因表達(dá)。由于雙鏈RM不能通過它們的3，突出端促進(jìn)它們分子間寡聚化，(dT)5-GL3Luc-(dT)sdsRM(SEQN。6)和(dT)8-GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。8)的雙鏈在與用jetPElTM的相同條件下被轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，通過用細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化的非轉(zhuǎn)染A549-GL3Luc細(xì)胞的內(nèi)源性熒光素酶水平對(duì)熒光酶沉默效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖5:當(dāng)具有能誘導(dǎo)它們分子間寡聚化的3，突出端的雙鏈RNA與jetPErM復(fù)合時(shí)介導(dǎo)序列特異性GL3熒光素酶沉默。用與jetPEI復(fù)合的(dA)5-GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。3)和(dA)8-GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。7)的雙鏈轉(zhuǎn)染A549-GL3Luc細(xì)胞。在48小時(shí)溫育期后，測(cè)定熒光素酶基因表達(dá)。作為非特異性對(duì)照，用(dA)5-GL2Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。5)和(dA)8-GL2Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。9)在與用jetPErM的相同條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，通過用細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化的非轉(zhuǎn)染A549-GL3Luc細(xì)胞的內(nèi)源性熒光素酶水平對(duì)熒光酶沉默效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖6:當(dāng)和jetPElTM復(fù)合時(shí)，dsMA的寡聚化介導(dǎo)有效的GL3熒光素酶沉默，dsRM寡聚化是通過使用與dsRNAs雙鏈的對(duì)稱的3，突出端相結(jié)互作用的連接子產(chǎn)生的分子間相互作用而促進(jìn)的。A549-GL3Luc細(xì)胞被復(fù)合有jetPEI的(dT)5—GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。6)和(dT)「GL3Luc-(dT)8(isRNA(SEQN。8)雙鏈轉(zhuǎn)染，所述雙鏈分別為不具有或具有(dA)"(SEQN°12)和(dA)"(SEQN°13)連接子,在溫育48小時(shí)后，測(cè)定熒光素酶基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，且通過用細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化的非轉(zhuǎn)染A549-GL3Luc細(xì)胞的內(nèi)源性熒光素酶水平對(duì)熒光酶沉默效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖7:當(dāng)與例如jetS卜END0頂或RNAiFect的陽離子脂質(zhì)制劑復(fù)合時(shí)，dsRNA的寡聚化介導(dǎo)有效的GL3熒光素酶沉默。dsRNA寡聚化是通過使用與dsRMs雙鏈的對(duì)稱的3，突出端相互作用的連接子產(chǎn)生分子間相互作用而促進(jìn)的。A549-GL3Luc細(xì)胞分別被復(fù)合有jetSi-ENDO(a)和RNAiFect(b)的下述雙鏈轉(zhuǎn)染，雙鏈(dT)廠GL3Luc-(dT)2siRNA(SEQN°l)，(dT)5-GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。6)，和(dT)8-GL3Luc—(dT)8dsRNA(SEQN。8)，其中序歹'JN°6和8分別帶有連接子(dA)"(SEQN°12)和(dA)24(SEQN。13)。在溫育48小時(shí)后，測(cè)定熒光素酶基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，通過同細(xì)胞裂觶物中的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化的非轉(zhuǎn)染A549-GL3Luc細(xì)胞的內(nèi)源性熒光素酶水平對(duì)熒光酶沉默效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。材料和方法化學(xué)試劑和寡核苷酸化學(xué)合成寡核苷酸并由Eurogentec(Belgium)進(jìn)行PAGE純化。寡核苷酸在lx退火緩沖液(50mM醋酸鉀，50mM醋酸鎂)(Eurogentec)中95。C，2分鐘進(jìn)行退火，然后在室溫溫育2—小時(shí)。jetSi-ENDO(用于siRNA轉(zhuǎn)染的陽離子脂質(zhì)試劑)和jetPEI(用于核酸轉(zhuǎn)染的陽離子聚合物、線性聚乙烯亞胺衍生物)來自于Polyplus-Transfection(法國)。RNAifect來自于Qiagen(美國)。細(xì)胞培養(yǎng)在pGL3Luc質(zhì)粒(Clontech)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，獲得了穩(wěn)定表達(dá)GL3熒光素酶(SV40元件控制下的熒火蟲(photinuspyralis)熒光素酶)的A549細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞，ATCC編號(hào)CCL-185)。A549-GL3Luc細(xì)胞生長在RPMI(Eurobio，F(xiàn)rance)培養(yǎng)基中，RPMI中補(bǔ)充入10%胎牛血清(FBS,Perbio，F(xiàn)rance)、2mM谷氨酰胺(E訓(xùn)bio)，IOO單位/ml青霉素(Eurobio)、100jug/ml鏈霉素(Eurobio)和0.8jug/mlG418(Promega)。在37°C含有5%C02的潮濕氣氛中維持細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)轉(zhuǎn)染前一天，將2.5xl(T個(gè)細(xì)胞接種在含有10%FBS的lml新鮮的完全培養(yǎng)基的24孔組織培養(yǎng)板上。在轉(zhuǎn)染前，準(zhǔn)備好dsRNA/轉(zhuǎn)染試劑的混合物。把期望的量的寡核苷酸(帶有或不帶有寡核苷酸連接子的dsRNA)和轉(zhuǎn)染試劑為jetSi-end0tm而稀釋到150jal的無血清培養(yǎng)基中，或?yàn)榱薺etPEr而稀釋到150|il的150mMNaCl中(供三次試驗(yàn)用)。每微克dsON分別使用3jj1和2jj1的jetSi-ENDO和jetPEITM。溶液在振蕩器上混合10秒，然后置室溫10分鐘。轉(zhuǎn)染試劑加到dsRNA溶液中，在振蕩器上混勻10秒，然后置室溫30分鐘。在加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物之前，移去含有血清的完全培養(yǎng)液，并用().smi無血清培養(yǎng)液更換。然后，每孔加入lOO)a1復(fù)合物溶液，并置培養(yǎng)板于37匸。溫育2小時(shí)后，移去完全培養(yǎng)液并置換上lml含有10%血清的完全培養(yǎng)液。對(duì)于RNAifect，期望的量的dsRNA和寡核苷酸連接子被稀釋在300ja1的無血清培養(yǎng)液中(用于三次試驗(yàn))。然后，轉(zhuǎn)染試劑被加入到siRNA混合物中(每iagds0N使用3ji1RNAifect)。用振蕩器混合該溶液10秒，然后置室溫15分鐘。在加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物之前，移去含有血清的完全培養(yǎng)液，置換上0.3ml帶有血清的完全培養(yǎng)液。每孔加入100|a1復(fù)合液，置培養(yǎng)板于37C溫育。24小時(shí)后，移去培養(yǎng)液，置換上0.5ml含10%血清的完全培養(yǎng)液。對(duì)于所有的轉(zhuǎn)染方案，培養(yǎng)板在37。C再溫育24小時(shí)或48小時(shí)。熒光素酶和蛋白質(zhì)分析熒光素酶基因的表達(dá)用商品化試劑盒(Promega，F(xiàn)rance)進(jìn)行測(cè)定。在移去完全培養(yǎng)液后，用lmlPBS溶液洗3次。然后，每孔加入IOOjj1lx裂解緩沖液，培養(yǎng)板置室溫溫育30分鐘。收集裂解物并在14000g離心5分鐘。用5/jl注入100iu1熒光素溶液后的裂解物進(jìn)行熒光素酶分析。用光度計(jì)(Berthold，F(xiàn)rance)監(jiān)測(cè)積分(integration)10秒以上的發(fā)光(RLU)。結(jié)果表達(dá)為每毫克細(xì)胞蛋白積分10秒以上的光亮單位(RLU)，用BCA方法測(cè)定細(xì)胞蛋白質(zhì)(Pierce,France)。結(jié)果作為內(nèi)源性基因的靶模型，我們使用了能穩(wěn)定表達(dá)GL3熒光素酶(在SV40元件控制下的螢火蟲熒光素酶)的A549細(xì)胞。一種很好地定義了的化學(xué)合成的直接針對(duì)GL3熒光素酶mRNA的siRNA(在siRNA的納摩爾濃度范圍內(nèi))和典型的陽離子脂質(zhì)為基礎(chǔ)的遞送試劑(jetSi-ENDOTM)及典型的陽離子聚合物為基礎(chǔ)的遞送試劑(jetPEI)一起被轉(zhuǎn)染。這個(gè)序列特異性的經(jīng)典GL3LucsiRNA是一個(gè)19個(gè)核苷酸的短dsRNA，其和GL3LucmRNA相匹配，并且才艮據(jù)哺乳細(xì)胞中介導(dǎo)RMi的優(yōu)選siRNA的定義(Elbashiretal.，2001),該短dsRNA含有相同的(例如，不互補(bǔ))2個(gè)脫氧核糖核苷酸(dT)的3，突出端。當(dāng)用jetSi-END(T和75nM的siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，顯示在圖1中的GL3熒光素酶的沉默效率在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和48小時(shí)可分別達(dá)到70%和高于80%。用作非相關(guān)序列的GL2LucsiRNA的低沉默水平證實(shí)了序列特異性的RNAi。當(dāng)用jetPElTM進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，盡管比用陽離子脂質(zhì)衍生物進(jìn)行轉(zhuǎn)染有低一些的效率和持續(xù)時(shí)間，還是觀察到了GL3熒光素酶的序列特異性沉默。為了改進(jìn)介導(dǎo)RNAi的dsRNA的沉默效率，我們使用了一種和GL3LucmRM相匹配的具有19個(gè)核苷酸的dsRM(SEQN°3),該dsRM含有在反義鏈末端具有5個(gè)脫氧胸腺嗜啶核苷酸的3，突出端，還含有在正義鏈末端具有5個(gè)脫氧鳥嘌呤核苷酸的3，突出端。這些3，突出端可以促進(jìn)3，突出端-3，突出端的相互作用從而導(dǎo)致dsRNA分子間寡聚化為長的dsRNA。在用復(fù)合有jetPEITM的(dA)5-GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。3)轉(zhuǎn)染A549-GL3Luc細(xì)胞后(圖2),可以觀察到較高的熒光素酶沉默(轉(zhuǎn)染24和48小時(shí)后，dsRNA濃度為50-75nM時(shí)大于80%)。(dA)5-GULuc-(dT)5dsRNA(SEQN°3)比用jetSi-END(T和jetPErM兩種試劑轉(zhuǎn)染的標(biāo)準(zhǔn)siRNA能更好地介導(dǎo)熒光素酶基因沉默。使用所用的任一遞送試劑導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，在10nm濃度轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用(dA)廣GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN°3)引起的基因沉默是特別有效的，而GL3LucsiRNA不能夠沉默熒光素酶的表達(dá)(圖2)。序列特異的(dA)5-GL3Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。3)9號(hào)位置(在反義鏈上A對(duì)G)—個(gè)單一的核苷酸替換用來廢除GL3LucmRNA靶的特異性識(shí)別。這個(gè)單一突變的序列，(dA)「GL3Luc-(dT)5-MutdsRNA(SEQN°4),用jetPE"轉(zhuǎn)染到A549-GL3Luc細(xì)胞。在5-50nM的濃度范圍內(nèi),轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，不能沉默熒光素酶的表達(dá)(圖3)。作為其它的選擇性對(duì)照，和不相關(guān)的GL2熒光素酶相匹配的(dA)5-GL2Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。3)被轉(zhuǎn)染，也不能沉默熒光素酶表達(dá)(圖3)通過使用雙鏈3，端的5個(gè)或8個(gè)核苷酸對(duì)寡聚化的dsRNAs的3'突出端的長度進(jìn)行了研究。用jetPEI把(dA)5-GL3Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。3)和(dA)8-GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。7)兩者轉(zhuǎn)染到A549-GL3Luc細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，兩者顯示出有效的而且可比較的沉默水平(圖4)。作為對(duì)照，使用不能促進(jìn)它們自己寡聚化的(dT)5-GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。6)和(dT)8-GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。8),與能夠寡聚化的dsRNAsSEQN。3和7獲得的結(jié)果相比較，對(duì)照對(duì)沉默熒光素酶表達(dá)是非常低效的(圖4)。一種沉默選擇性對(duì)照通過使用可以寡聚化的dsRNA來進(jìn)行。該dsRNA除了和GL2序列相匹配，在雙鏈的每條鏈的3，端具有5個(gè)或8個(gè)核苷酸。(dA)5-GL2Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。5)和(dA)8-GL3Luc-(dT)8dsRM(SEQN。9)兩者是不能夠沉默內(nèi)源性表達(dá)的GL3熒光素酶(圖5)。通過堿基配對(duì)識(shí)別dsON雙鏈3，突出端的一種寡核苷酸連接子可以促進(jìn)介導(dǎo)RNAi的短dsON的寡聚化。作為一個(gè)模型，在poly(dA)核苷酸存在或不存在的情況下，使用jetPErM把(dT)5-GL3Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。6)和(dT)8-GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。8)轉(zhuǎn)染到A549-G13Luc細(xì)胞中。長度上含有15(SEQN。12)和24(SEQN。13)個(gè)核苷酸的poly(dA)被分別用來促進(jìn)雙鏈SEQN。6和8的寡聚化。和不具有poly(dA)連接子獲得的沉默效率相比較，poly(dA)連接子存在時(shí)，兩種dsRNA雙鏈的熒光素酶沉默效率是高效的(圖6)。在這個(gè)實(shí)施方案中，在(dA)"連接子存在時(shí)，具有5個(gè)核苷酸長度的3，突出端的dsRNA顯示出最好的沉默能力(圖6)。具有寡核苷酸連接子的介導(dǎo)RNAi的dsRNA的寡聚化因而增強(qiáng)了它的效率。含有dsON的組合物在A549-GL3Luc細(xì)胞中介導(dǎo)特異的GL3熒光素酶基因沉默，其中該dsON被一個(gè)通過堿基配對(duì)識(shí)別該dsON雙鏈3，突出端的寡核苷酸連接子寡聚化，并被遞送試劑例如基于jetSi-END0TM或RMiFect的陽離子脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑遞送到細(xì)胞中。Poly(dA)被用來作為長度上包含有15(SEQN。12)和24(SEQN°13)個(gè)核苷酸的連接子，以分別促進(jìn)雙鏈SEQN°6和8的寡聚化。和使用典型的GL3LucsiRNA(SEQN。1)獲得的沉默效率相比較，當(dāng)poly(dA)連接子存在時(shí)，兩個(gè)dsRMA雙鏈在納摩爾水平上的熒光素酶沉默是非常高效的(圖7)。當(dāng)用陽離子脂質(zhì)為基礎(chǔ)的遞送系統(tǒng)導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，和使用siRM的傳統(tǒng)策略相比較，具有寡核苷酸連接子的介導(dǎo)RNAi的dsRNA的寡聚化增強(qiáng)了所述基因的沉默效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>參考文獻(xiàn)Elbashii.、SMe/o/.(20(M)Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinmammaliance"culture.Nature41.1:494-498，Elbashir，SM(2001)RNAinterferenceismediatedby2and22ntRNAs.Genes&Dev.15:188-200.Fii'e.A.(1999)RNA-triggeredgenesilencing.7Vewrfi.IS,358-363.Ge.Qc吖(2004)h，hibhionofinfluenzavirusproductioninvirusinfectedmicebyRNAm,erference.PNAS101.867^8681.Guan.H.(2005)AsmallinterferingRNAtargetingvascularendothelialgrowthfactorinhibitsEwing'ssarcomagrowthinaxenograftmousemodel,C7/wCawcerWes7，2662-2669，Hammond,SMc//.(2000)AnRNA*directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosopl，ilacells.404>363-366.JepsenJS、Wengel丄(2004)LNA'antisenserivalssiRNAforgenesilencing,CzwO;/"Z>wgD/.vcovZ^ve/.7(2):188-94.Kim，DHetal.(2005)SyntheticdsRNfADicersubstratesenhanceRNAipotencyandefficacy.NatureBiotech.23,222-226.Ku，TeckJ.(2003)Antisensetechnologies.Improvementthroughnovelchemicalmodifications.￡wrJjS/'ocAw,.270(8):162844.MillerPS,(1991)Oligonucleosidemethylphosphonatesasantisensereagents.歷0/ec/7"0/0gy(W>99(4):358-62.Pal,A.e/(2005)SystemicdeliveryifRafsiRNAusingcationiccardiolipinliposomessilencesRaf-1expressionandinhibitstumorgrowthinxenograftmodelofhumanprostatecaiicer，/"/JO"co/,26，1087-91Parrish，S,etal.(2000)FunctionalanatomyofadsRNAtrigger:differentialrequirementfortl，etwoniggerstrandinRNAinterference.M/Ce〃.6,1077-1087.Siolas，Detal.(2005)SyntheticshRNAsaspotentRNAitriggers.23，227-231.Tuschl,丁.(2001)RNAinterfeienceandsmallinterferingRNAs.CAemfc/oc^ew.2，239-245,丁uscl，l，T.etal.(1999)TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedRNAinvitro'Genes&Dev.13，391-3197.Urban-Klein,B.e,(2004)RNAi-mediatedgene-targetingthroughsystemicapplicationofpolyethykm'mine(PEI)-complexedsiRNAinvivo,Gewe7Tera;少23,1-6VermaS、EcksteinF.(1998)Modifiedoligonucleotides:synthesisandstrategyforusers,/J畫//evfi/oc/a亂67:99-134.VesterB，Wengel.1.(2004)LNA(lockednucleicacid):high-affinitytargetingofcompkn，emaryRNAandDNA.Z/oc/7em"77.43(42):13233-41.Yang,D，etal.(2000)EvidencethatprocessedsmalldsRNAsmaymediatesequence-specificmUNAdegradationduringRNAiinDrosophilaembryos.Cw/rB/o/.10，191'〗200.Zamore，PDWo/.(2000)RNAi:Double-strandedRNAdirectstheATP-d印endentcleavageofmRNAat21to23nucleotidesintervals.Cell101，25-33,ZonG,GeiserTG.(1991)Phosphorothioateoligonucleotides:chemistry,purification,analysis,scale-upandf，咖iedirections.ZVwgDes,6(6):539-68.權(quán)利要求1、包含具有序列和/或長度相同或不同的雙鏈寡核苷酸的組合物，所述寡核苷酸具有序列3′N1N2...Ni-1Ni...Nj5′，其中-3′Ni...Nj5′是19-28聚體的雙鏈寡核苷酸的序列的一半，其互補(bǔ)于存在于活細(xì)胞中的靶核酸序列，和-3′N1...Ni-15′是3-50聚體的突出端的序列，其允許上述雙鏈寡核苷酸的寡聚化。2、權(quán)利要求1的寡核苷酸組合物，其中序列3'Ni...N,包含19-21個(gè)核苷酸。3、權(quán)利要求1或2的寡核苷酸組合物，其包含具有5-8個(gè)核苷酸的序列..NiV'。4、權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的寡核苷酸組合物，其中序列I"..N卜/包含穩(wěn)定化基團(tuán)。5、權(quán)利要求4的寡核苷酸組合物，其中所述穩(wěn)定化基團(tuán)選自被修飾的類似物例如脫氧核糖核苷酸取代的噤呤核苷酸、嘧啶核苷酸，和/或修飾的核苷酸類似物例如糖或骨架經(jīng)修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。6、權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的寡核苷酸組合物，其包含至少一種在一個(gè)或兩個(gè)5，末端帶有5，磷酸或羥基的寡核苷酸。7、權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的寡核苷酸組合物，其中序列3'Ni.,.N/'選自脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸類似物。8、轉(zhuǎn)染組合物，其包含至少一種權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的寡核苷酸組合物，和轉(zhuǎn)染試劑或制劑。9、權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)染組合物，其中轉(zhuǎn)染試劑是非病毒載體。10、權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)染組合物，其中所述轉(zhuǎn)染試劑選自陽離子脂質(zhì)或陽離子聚合物。11、用于制備權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的寡核苷酸組合物的方法，其包括-通過化學(xué)或酶催化途徑合成具有在權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)中定義的序列3'Ni...N,和L.N卜,的寡核苷酸鏈；-退火由此獲得的合成的寡核苷酸。12、權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步包括在權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸的退火步驟之后加入連接子，所述連接子具有互補(bǔ)于序列3'Nl..NiV'的核苷酸序列末端。13、權(quán)利要求12的方法，其中連接子選自寡核苷酸、發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)、具有3，或5，突出端的短雙鏈核酸、雙鏈寡核苷酸。14、權(quán)利要求13的方法，其中連接子選自脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸或核苷酸類似物。15、在體外和體內(nèi)抑制基因表達(dá)的方法，其包括使用權(quán)利要求l至7中任一項(xiàng)的寡核苷酸組合物，或使用權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)染組合物。16、權(quán)利要求15的方法，其用于例如癌癥或病毒感染治療的治療應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及組合物，其包含具有序列和/或長度相同或不同的雙鏈寡核苷酸，上述寡核苷酸具有序列^3′N₁N₂...N_i-1N_i...N_j^5′，其中^3′N_i...N_j^5′是19-28聚體的雙鏈寡核苷酸序列的一半，其互補(bǔ)于存在于活細(xì)胞中的靶核苷酸；和-^3′N₁...N_i-1^5′是3-50聚體的突出端的序列，其允許上述雙鏈寡核苷酸寡聚化。本發(fā)明還涉及包含上述寡核苷酸組合物的轉(zhuǎn)染組合物及其治療應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K31/713GK101213300SQ200680023782公開日2008年7月2日申請(qǐng)日期2006年6月1日優(yōu)先權(quán)日2005年6月1日發(fā)明者A-L·波爾卡托貝勒敏,J-P·拜赫,P·厄巴徹申請(qǐng)人:聚加轉(zhuǎn)染股份有限公司