專利名稱：使用鴕鳥產(chǎn)生的抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用鴕鳥產(chǎn)生的抗體及其制備方法。本發(fā)明提 5 供在人的治療、診斷中使用的醫(yī)療用抗體的大量生產(chǎn)、及其它 可以利用抗體的各種領(lǐng)域中有用的技術(shù)。
技術(shù)背景以往，抗體的制備中使用小鼠、大鼠、綿羊、山羊等動物。 但是，由于這些哺乳類的蛋白質(zhì)與人類蛋白質(zhì)的相似性很高，10 因此多難以制備抑制人類蛋白質(zhì)功能的抗體。即，即便免疫與 人類疾病有關(guān)的分子(主要是蛋白質(zhì))，在上述動物中也難以獲 得目標(biāo)抗體(特別是治療抗體)。另一方面，最近嘗試使用與人類的關(guān)系較遠(yuǎn)的雞(家雞) 制備人類的治療、診斷用抗體(例如參照下述專利文獻(xiàn)l )。但15 是，考慮到雞的血液量很少，因此難以一次性地獲得大量且均 質(zhì)的抗體。另外，雖然可以連續(xù)進(jìn)行單克隆抗體的制備，但為 了獲得充分量的抗體量，需要繁雜的工作和培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)液。專利文獻(xiàn)l:日本特開2001 - 238676號公報20 發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題本發(fā)明鑒于上述問題點而完成，其目的在于提供可大量、 均質(zhì)且簡單地制備抗體(尤其是用以往的使用哺乳動物的方法 難以制備的抗體)的方法。25 用于解決問題的方法本發(fā)明人為了解決上述問題，特別聚焦大型鳥類鴕鳥而進(jìn) 行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1 )在以往使用小鼠或兔子的方法中，難以制備對哺乳類之間相似性很高的蛋白質(zhì)(或其一部分)為特異性的抗體，但通過免疫鴕鳥可以簡單地制備這種抗體；(2) 在實際中，利用使用鴕鳥制備的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)分析和免疫細(xì)胞化學(xué)法時，可以特異地;險測出作為癌標(biāo)5 記物的目標(biāo)蛋白質(zhì)(CD166蛋白質(zhì))，可以作為診斷用抗體利用； (3 )對這樣使用鴕鳥制備的抗CD166抗體，確認(rèn)了腫瘤增殖抑 制效果，還可以作為治療用抗體等利用，進(jìn)而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供使用鴕鳥制備的抗體及其制備方法。鴕鳥 近年來在日本也開始家畜化(食用化)，飼養(yǎng)場的數(shù)量也有增多io 的傾向。飼養(yǎng)飼料也有市售，營養(yǎng)效率也極高。體重可以達(dá)到 約120kg,在l只個體中幾乎可以采集100只雞份量的血液。即， 使用l只鴕鳥可以均勻且大量地生產(chǎn)用小鼠、大鼠等哺乳類無法 制備的治療用(或者診斷用)抗體。由此，可以解決以往使用 其它動物制備多克隆抗體時的批間差異問題。而且，當(dāng)使用鴕15鳥幼鳥時，以少量的抗原量即可建立免疫，之后經(jīng)過約10個月 的伺養(yǎng)(直至成體鳥)和追加免疫即可在l只中制造大量的抗體。 即，當(dāng)使用鴕烏時，可以簡單地制備用以往的方法難以制 備的對蛋白質(zhì)(包含其一部分)為特異性的抗體。而且，批間 差異少，可以產(chǎn)生均勻且大量的抗體，適于商品化(治療用、20診斷用)。這里，抗體是指特異性地識別抗原并與之結(jié)合的蛋白質(zhì)， 其種類(例如IgG、 IgM、 IgA、 IgD、 IgE、 IgY等)不限。抗體 可以是一價或多價的任一種。另外，本發(fā)明的抗體還可以利用 焚光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、酶及其它蛋白質(zhì)(例如抗生物素蛋白) 25等進(jìn)行標(biāo)記，也可以通過使用識別本發(fā)明的抗體并與之結(jié)合的 二抗，不標(biāo)記本發(fā)明抗體就進(jìn)行目標(biāo)分子的^^測。本說明書中，"鴕鳥"是指屬于鴕鳥目(^^//z,'o"(/^附")的鳥類。其中優(yōu)選使用屬于鴕鳥科(5Y^A/omWae )的鴕鳥 (5Vn///^0 c"we/w)。雌雄均可。"使用鴕鳥，，是指為了制備抗 體，使用鴕鳥作為給予抗原的動物。作為抗原而給予的物質(zhì)并 無特別限定，除了蛋白質(zhì)、肽(包括天然來源、合成肽、重組 5 肽)之外還可以是多糖類等的生物體物質(zhì)。抗原的制備方法、 給予方法并無特別限定，優(yōu)選方式在后面敘述。在后述實施例中，為了制備抗人CD166蛋白質(zhì)的抗體，將 20個殘基的合成肽(在哺乳類間高度保守的細(xì)胞外區(qū)域的第4 號Ig環(huán)內(nèi)的20個氨基酸)用作抗原，將其接種于鴕鳥的幼鳥進(jìn)io 行免疫，從而制備抗體。所得的抗CD166鴕鳥抗體可以特異性 地識別、檢測作為癌標(biāo)記物的人CD166蛋白質(zhì)(圖l、 3),可以 用作癌癥的診斷用抗體。而且，該抗CD166鴕鳥抗體具有抑制 腫瘤增殖的抗腫瘤效果(圖4 ),可以用作癌癥的治療用抗體。 這樣，通過使用鴕鳥，可以簡單地制備通過使用哺乳動物的以15 往方法難以制備的醫(yī)療用抗體(用于治療或診斷的抗體)。當(dāng)然，在抗CD166鴕鳥抗體的制備中，抗原并非局限于上 述合成肽，可以將人CD166蛋白質(zhì)整體或其一部分特異的肽序 列(優(yōu)選10 20個殘基左右)用作抗原。另外，當(dāng)然還可以通 過同樣的方法制備抗CD166以外的CD抗原的抗體(抗CD抗20 體)。這里，CD ( Cluster of differentiation,分化抗原簇)是指 通過CD分類分別附上固有序號的細(xì)胞表面抗原(例如黏附分 子)，上述CDi66也是其中之一。通過本發(fā)明的^f吏用鴕鳥的抗體 制備法，可以大量、均質(zhì)且簡單地制備高靈敏度的抗人CD抗體。 如上所述，使用鴕鳥幼鳥時由于具有以少量的抗原量即可25 建立免疫等的優(yōu)點，因此優(yōu)選通過對鴕鳥的幼鳥進(jìn)行首次免疫， 制備本發(fā)明的抗體。更具體地說，優(yōu)選對出生后2個半月齡以上、 不足10個月齡左右的幼鳥進(jìn)行首次免疫、更優(yōu)選對出生后3個月齡以上、7個月齡以下左右的幼鳥進(jìn)行首次免疫、進(jìn)一步優(yōu)選對 出生后3個月齡以上、5個月齡以下左右的幼鳥進(jìn)行首次免疫。 13另外，列舉使用鴕鳥制備抗體時的優(yōu)點、優(yōu)選方式等的話， 如下所述。5 ( 1 )鴕鳥從孵化時(體重約0.8kg)開始迅速生長、在6個月齡時達(dá)到60kg、在10個月(成體鳥)時達(dá)到120kg。即，當(dāng) 在幼鳥時開始免疫，則少量抗原即可，通過數(shù)次的追加免疫可 以獲得大量的抗體。(2)下面說明抗體制備的一例使用合成肽為抗原，進(jìn)行io 免疫的抗原量為每次100pg、在3個月齡時進(jìn)行首次免疫，之后 每隔l個月實施每次為相同抗原量的免疫，直至成為成體鳥(在 后述實施例中，以隔周共進(jìn)行3次免疫。)。首次免疫為混合 10(Vg抗原液(0.5mL)和完全佐劑0.5mL,接種于鴕鳥胸部的 肌肉內(nèi)。從第2次開始，混合100iig的抗原液(0.5mL)和不完is 全佐劑0.5mL，接種于鴕鳥頸部肌肉內(nèi)。在距離最終免疫2-5 天后進(jìn)行采血，從所得鴕鳥的抗血清中使用蛋白G柱純化抗體。 (3 )用于測定抗體效價的血液到4個月齡為止優(yōu)選采集于 羽翼下的靜脈，之后適宜從頸部靜脈釆集(這是由于從5個月齡 開始比較兇狠)。20 (4)由于2個月齡及其以前的鴕鳥幼鳥對應(yīng)激敏感，因此優(yōu)選從3個月齡起開始免疫。(5) 通過上述(2)的方法免疫鴕鳥時，在3次免疫時(5 個月齡)已經(jīng)確認(rèn)了抗體效價的上升，在第5次(7個月齡)達(dá) 到最高值。在此階段可以大量采集血液獲得抗體，但由于隨著25 飼養(yǎng)期間的進(jìn)一步延長和追加免疫，抗體效價的最高值可以維持到成體鳥(體重120kg),因此成長階段可以回收更多的抗體。(6) 由于只要不殺死免疫過的鴕鳥，則可以半永久性地回收抗體，因此可以持續(xù)地提供抗體。(7)由于鳥類的抗體會向卵轉(zhuǎn)移，因此在免疫過的鴕鳥的 卵中含有高精度的抗體。即，如下所迷，當(dāng)利用卵時，可以持 續(xù)、簡單、大量地獲得抗體。 5 ( 8)在免疫鴕鳥而獲得的抗體IgG的純化中，由于與蛋白A的結(jié)合很弱，因此優(yōu)選使用蛋白G。接著，說明使用鴕鳥制備抗體時的優(yōu)點、優(yōu)選方式和利用例。本發(fā)明通過使用鴕鳥，與使用雞(家雞)等的情況相比， io 可以大量、均質(zhì)且簡單地制備高靈敏度抗體。例如，使用鴕鳥 制備抗人CD146的抗體和抗人CD166的抗體，就各個抗原檢測 靈敏度，與使用雞制備的抗體進(jìn)行比較的結(jié)果，鴕鳥抗體的檢 測靈敏度顯著高，與雞抗體相比具有顯著的優(yōu)越性(圖8、 9)。 另外，如上述(7)所述，通過對雌鴕鳥免疫抗原，由其產(chǎn) 15下的鴕鳥卵的卵黃純化抗體(IgY)，可以持續(xù)且簡單、大量地 獲得抗體。例如，將l型膠原作為抗原每周免疫鴕鳥的產(chǎn)卵雌鳥 時，在首次免疫后第4周確認(rèn)產(chǎn)下的卵黃中產(chǎn)生了其抗體(圖5、 6)。同樣，當(dāng)對鴕鳥的產(chǎn)卵雌鳥每周免疫IBV (雞傳染性支氣 管炎病毒)的滅活疫苗時，在首次免疫后第6周確認(rèn)產(chǎn)下的卵黃 20中產(chǎn)生了其抗體(圖7)。另外，使用IgY純化法時，從首次免疫后第6周的一個鴕鳥 卵的卵黃中純化出2 ~ 4g抗體(IgY)。由于從1只雌鴕鳥在4月~ 9月的產(chǎn)卵期中可獲得約100個卵，因此最多可以獲得約400g的 抗體(IgY)。這表明，在制備病毒感染的診斷4全查用抗體時，25 通過調(diào)整免疫時期，可以在6個月內(nèi)從l只鴕鳥制備可應(yīng)用到約400 ~ 4000萬份樣品量的診斷檢查試劑盒中的大量抗體。鴕鳥卵黃的IgY純化法與通常的雞卵黃的純化法(例如J.Immunol. Methods 46: 63 - 68， 1981.; Agric. Biol. Chem. 54: 2531 - 2535， 1990.; Immunological Investigations 19:253 -258,1990.)基本相同地進(jìn)行，還可以使用市售的由雞卯黃的抗 體(IgY)純化用試劑盒。另外，由于鴕鳥卵黃的脂質(zhì)很多， 5因此優(yōu)選將相對于卵黃量的所有的溶液(葡聚糖硫酸酯/TBS 等)量增加到雞卯黃情況的1.5倍左右進(jìn)行純化。本發(fā)明的抗體用途并無特別限定，除了之前所述的醫(yī)療用 抗體之外，還可以在目前各種領(lǐng)域中利用的各種抗體中使用本 發(fā)明的抗體。特別是由于本發(fā)明的抗體可以使用鴕鳥大量地生io 產(chǎn)，因此通過在癌檢測試劑盒或病毒感染檢查試劑盒等中所用 的檢查用抗體的制備中應(yīng)用本發(fā)明，可以在在健康診斷或感染、 食物中毒的檢查等必須檢查多個樣品的情況中，短期間內(nèi)簡單 地由1只鴕鳥制備檢查所必需的大量檢查試劑盒。例如，由于上述IBV (雞傳染性支氣管炎病毒)為與SARS15 病毒近緣的冠狀病毒，因此也可以使用鴕鳥大量制備抗SARS 病毒的抗體，另外，還可以大量制備禽流感等病原性病毒檢測 用抗體。而且，還可以大量制備BSE (瘋牛病)等朊病毒病或 其它疾病的檢查用抗體。本發(fā)明的抗體還可以作為工業(yè)用抗體 應(yīng)用，即在空調(diào)過濾器、口罩、水管的過濾器等各種工業(yè)制品20 中可以作為用于除去病原體、變應(yīng)原及其它抗原物質(zhì)的抗體來 應(yīng)用。這樣，本發(fā)明不僅作為病毒檢測用、疾病檢查用抗體來應(yīng) 用，還可以通過用于空調(diào)過濾器、口罩等中，作為除去病毒用 的工業(yè)用抗體來應(yīng)用。當(dāng)然，還可以作為病毒以外的病原體(傳25染病或食物中毒菌等)或食品中的變應(yīng)原(蕎麥或卵清白蛋白等)、飲用水中的病原體等的檢測、除去用抗體來應(yīng)用。 本發(fā)明的抗體既可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。對于一般的抗體制備方法，例如在Harlow等人的"Antibodies: A laboratory manual" ( Cold Spring Harbor Laboratory, New York ( 1988 ))、巖崎等的《単夕口一乂抗體八< 7、、 ！J K一^ ^rELISA,講談社(1991)》等中有記載，以下簡單地說明各抗體 5 的制備方法。(1 )多克隆抗體的制備多克隆抗體可以通過將成為抗原的物質(zhì)單獨或與載體、稀 釋劑 一起給予到鴕鳥的能夠產(chǎn)生抗體的部位、例如上述的胸部 肌肉內(nèi)、頸部肌肉內(nèi)等而制備。給予時，為了提高抗體的產(chǎn)生 io 能力，可以給予完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑。抗原的給予 可以僅進(jìn)行l(wèi)次，但通常為每2 6周給予1次，共計給予2~10 次左右。血清中的對抗原的抗體效價的測定是用液相法(例如使標(biāo) 記的抗原與抗血清反應(yīng)后，測定結(jié)合于抗體上的標(biāo)識劑的活性 j5 的方法)、或者固相法(例如在96孔板的各孔內(nèi)壁面上固定抗原， 在其中添加將血清適當(dāng)稀釋的溶液，使抗體結(jié)合于抗原，然后洗滌孔中的溶液以除去多余的抗體，測定結(jié)合于孔內(nèi)壁面的抗 體量的方法)進(jìn)行的。本發(fā)明的多克隆抗體的分離純化根據(jù)免疫球蛋白的分離純20 化法(例如鹽析法、醇沉淀法、等電點沉淀法、電泳法、利用 離子交換劑(例如DEAE)的吸附脫附法、超離心法、凝膠過 濾法、通過結(jié)合抗原的固相或蛋白G等活性吸附劑僅采集抗體 并解離結(jié)合之后獲得抗體的特異純化法等)進(jìn)行。 (2)單克隆抗體的制備25 在制備單克隆抗體時，從免疫過抗原的鴕鳥中選擇確認(rèn)了抗體效價的個體，在最終免疫的2 5天后采集脾臟或淋巴節(jié)， 將其中所包含的抗體產(chǎn)生纟田月包與骨骨泉 瘤細(xì)胞融合，從而可以制備本發(fā)明的單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤。融合才喿作可以根據(jù)已知方法實施，例如Kayler和Milstein的 方法(Nature, 256巻，495頁，1975年)。作為融合促進(jìn)劑，可 以舉出聚乙二醇(PEG)或仙臺病毒等，優(yōu)選使用PEG等。作5 為骨髓瘤細(xì)胞可以舉出例如NS- 1、 P3U1、 SP2/0、 AP- l等， 優(yōu)選使用P3U1等。所使用的抗體產(chǎn)生細(xì)胞(脾臟細(xì)胞等)數(shù)與 骨髓瘤細(xì)胞數(shù)的優(yōu)選比例通常為l: 1~20: l左右，通過以10~ 800/。左右的濃度添加PEG (優(yōu)選PEG1000 PEG6000 )、通常在 20 ~ 4(TC 、優(yōu)選30 ~ 37°C下賻育1 ~ IO分鐘可以高效地實施細(xì)胞io 融合。在抗體產(chǎn)生雜交瘤的篩選中可以使用各種方法，可以列舉 出例如在直接或與載體一起吸附有抗原或其部分肽的固相(例 如微孔板)中添加雜交瘤培養(yǎng)上清，接著加入用熒光物質(zhì)或酶 等標(biāo)記過的抗鴕鳥免疫球蛋白抗體或蛋白G,檢測結(jié)合于固相is 的本發(fā)明的單克隆抗體的方法；在吸附有抗鴕鳥免疫球蛋白抗 體或蛋白G的固相中添加雜交瘤培養(yǎng)上清，加入用熒光物質(zhì)或 酶等標(biāo)記的抗原，檢測結(jié)合于固相的單克隆抗體的方法等。本發(fā)明的單克隆抗體的篩選、培養(yǎng)通常在添加HAT (次黃 嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)、含有IO ~ 20%胎牛血清的動20 物細(xì)胞用培養(yǎng)基(例如RPMI1640 )中進(jìn)行。雜交瘤培養(yǎng)上清的 抗體效價可以與上述抗血清中抗體的抗體效<介的測定同樣地測 定。單克隆抗體的分離純化與上述多克隆抗體的分離純化同樣 地進(jìn)行。如上所述，通過在動物的體內(nèi)或體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞并從 25 其體液或培養(yǎng)物中采集抗體，可以制備本發(fā)明的抗體。當(dāng)然，并非局限于上述示例的方法，可以應(yīng)用以往公知的 各種方法制備本發(fā)明多克隆抗體和單克隆抗體。另外，本發(fā)明還可以使用以后新開發(fā)的方法。


圖1為表示分別用人CD166肽免疫小鼠、兔子、鴕鳥后，通 5 過使用這些動物的抗血清進(jìn)行的Western Blot分析檢測人 CD166蛋白質(zhì)的結(jié)果的圖。圖2為表示使用SDS - PAGE確認(rèn)純化的鴕鳥IgG的結(jié)果的圖。圖3為表示通過使用抗CD166鴕鳥抗體進(jìn)行的免疫細(xì)胞化io 學(xué)法在人肺癌細(xì)胞(A549 )中檢測人CD166蛋白質(zhì)的結(jié)果的圖。 圖4為表示向移植有人肺癌細(xì)胞的棵鼠給予抗CD166鴕鳥 抗體所產(chǎn)生的胂瘤增殖抑制效果的圖表。""，表示與給予PBS具 有顯著性差異。*P<0.01 ( Student-t)圖5為表示對鴕鳥的產(chǎn)卯雌鳥免疫1型膠原，利用瓊脂凝膠15 內(nèi)沉降方法隨時間調(diào)查其血清和卵黃中的抗體產(chǎn)生情況的結(jié)果 的圖。圖中，A為抗原(l型膠原)、l為免疫前的鴕鳥血清、2 為免疫第l周的鴕鳥血清、3為免疫第2周的鴕鳥血清、4為免疫 第3周的鴕鳥血清、5為免疫第4周的鴕鳥卵黃提取液、6為PBS。 抗原抗體反應(yīng)所產(chǎn)生的白色沉降線表示抗體的產(chǎn)生。20 圖6為表示對鴕鳥的產(chǎn)卵雌鳥免疫1型膠原，利用瓊脂凝膠內(nèi)沉降方法隨時間調(diào)查其卵黃中的抗體產(chǎn)生情況的結(jié)果的圖。 圖中，A為抗原(l型膠原)、l為免疫前的鴕鳥卵黃提取液、2 為免疫第l周的鴕鳥卵黃提取液、3為免疫第2周的鴕鳥卵黃提取 液、4為免疫第3周的鴕鳥卵黃提取液、5為免疫第4周的鴕鳥卵25 黃提取液、6為PBS?？乖贵w反應(yīng)所產(chǎn)生的白色沉降線表示抗 體的產(chǎn)生。圖7為表示對鴕鳥的產(chǎn)卵雌鳥免疫IBV (雞傳染性支氣管炎病毒)的滅活疫苗，利用瓊脂凝膠內(nèi)沉降方法隨時間調(diào)查其血清和卵黃中的抗體產(chǎn)生情況的結(jié)果的圖。圖中，A為抗原(IBV)、 1為PBS、 2為免疫前的鴕鳥血清、3為免疫第4周的鴕烏血清、4 為免疫第6周的鴕鳥血清、5為免疫第6周的鴕鳥卵黃提取液、6 5 為免疫前的鴕鳥卵黃提取液?？乖贵w反應(yīng)所產(chǎn)生的白色沉降 線表示抗體的產(chǎn)生。圖8為使用鴕鳥和雞分別制備抗CD146抗體并比較兩者的 檢測強(qiáng)度的圖，(a)為表示兩抗體的免疫印跡結(jié)果的圖表、(b) 為表示兩抗體的相對強(qiáng)度的圖表。"*"表示與雞相比具有顯著性 io 差異。*P<0.01 ( Student-t)圖9為使用鴕鳥和雞分別制備抗CD166抗體并比較兩者的 檢測強(qiáng)度的圖，(a)為表示兩抗體的免疫印跡結(jié)果的圖表、(b) 為表示兩抗體的相對強(qiáng)度的圖表。"*，，表示與雞相比具有顯著性 差異。*P<0.01 ( Student曙t)1具體實施方式
實施例以下參照

本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明并非局限于 下述實施例。 加 [實施例l〗為了制備抗人CD166蛋白質(zhì)的抗體，其中，人CD166蛋白 質(zhì)被期待作為肺癌、黑色素瘤、前列腺癌等的癌標(biāo)記物，將人、 小鼠、兔子的種間一致的合成肽(哺乳類間高度保守的細(xì)胞外 區(qū)域的第4號Ig環(huán)內(nèi)的20個氨基酸)免疫小鼠(BALBc)、兔子 25 (日本大耳白兔)、鴕鳥(3個月幼鳥)(隔周共3次)，采血。首次免疫是混合100)ig的抗原液(0.5mL)和0.5mL完全佐 劑并接種于鴕烏胸部的肌肉內(nèi)、兔子背部皮內(nèi)。對于小鼠則將0.4mL上述混合液接種于背部皮內(nèi)。從第2次開始，混合100pg 的抗原液(0.5mL)和0.5mL不完全佐劑，沖妾種于鴕鳥頸部月幾肉 內(nèi)、兔子背部皮內(nèi)。對于小鼠，將0.4mL上述混合液接種于背 部皮內(nèi)。當(dāng)使用這些動物的抗血清(從最終免疫起2周后)進(jìn)行 5 人肺癌的細(xì)胞膜部分的WesternBlot時，4又在鴕鳥中產(chǎn)生識別人 CD166蛋白質(zhì)的抗體(圖1 )。用于上述WesternBlot中的標(biāo)記二抗如下制備。首先，使用 蛋白G由非免疫鴕鳥的血液純化免疫球蛋白G ( IgG),通過SDS -PAGE進(jìn)行確認(rèn)(圖2)。將其免疫兔子。更詳細(xì)地說，將l次 io 量200pg的鴕鳥IgG隔周4次免疫日本大耳白兔，在最后一次起 的第2周回收全血，制備抗鴕鳥IgG兔多克隆抗體(血清)。根 據(jù)使用蛋白A的常規(guī)方法進(jìn)行純化。對所得純化抗體進(jìn)行FIT C 標(biāo)記和HRP標(biāo)記后用作二抗。由鴕鳥的上述抗血清如下純化抗體。首先，將鴕鳥的抗血 is清上到蛋白G柱中。用PBS洗滌后，利用檸檬酸緩沖液和甘油緩 沖液的混合液(pH9.0)進(jìn)行洗脫后，用2Mtris/HCl中和。將如 此純化的抗體作為抗CD166鴕鳥抗體在以下實驗中使用。[實施例2]將實施例1所得抗C D16 6鴕鳥抗體作為 一 抗，對培養(yǎng)人肺癌 20細(xì)胞(A549 )實施免疫熒光抗體法，結(jié)果在肺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜 上反應(yīng)強(qiáng)烈(圖3)。在實驗中，首先在蓋玻片上培養(yǎng)A549細(xì)胞 l天，利用Zamboni液固定。接著，用PBS將實施例1獲得的抗 CD166鴕鳥抗體(lmg/mL)稀釋1000倍作為一抗，在上述細(xì)胞 上于37。C下反應(yīng)l小時。之后，用PBS將實施例1中制備的FITC 25 標(biāo)記抗鴕鳥IgG兔多克隆抗體(lmg/mL )稀釋1000倍，作為二 抗，在上述細(xì)胞上于37。C下反應(yīng)l小時，通過熒光顯微鏡觀察。 [實施例3]將106個培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞(A549 )分別移植于5只棵鼠皮下， 從第5天開始每周腹腔內(nèi)給予實施例1獲得的抗C D16 6鴕鳥抗體 (120pg),在移植第3周測定腫瘤體積。對照小鼠僅給予PBS。 結(jié)果表明在抗C D16 6鴕鳥抗體給予組中顯著地抑制了腫瘤的增 5 殖(圖4 )。[實施例4]為了調(diào)查卵黃的抗體的產(chǎn)生，對2歲零6個月齡的鴕鳥的產(chǎn) 卵雌鳥每周免疫大鼠的l型膠原，利用瓊脂凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng)確認(rèn)從首次免疫起第l周~ 3周的血清和第4周的卵黃提取液中的抗 io 體的產(chǎn)生。實驗方法如下所示?？乖亢兔庖叻▽?mg/0.5mL的抗原液與0.5mL完全佐劑 混合，接種于鴕鳥的背部皮內(nèi)。之后的追加免疫為將4mg/0.5mL 的抗原液與0.5mL不完全佐劑混合，接種于鴕鳥的背部皮內(nèi)。 血清的純化使用通過從頸靜脈采血、靜置l小時后通過離 15心分離(15000rpm)分離的血清。卯黃提取法從鴕鳥卯中僅取出卵黃(250 ~ 350mL)并攪 拌。僅使用10mL,剩余保存于冰箱。混合lOmL卵黃液和75mL的TBS ( 20mM Tris - HC1 (pH7.5)、 0.15MNaCl、 0.5%NaN3 ),力口入5mLl()o/o葡聚糖硫酸 20 酯/TBS攪拌30分鐘。加入10mL 1M CaCl/TBS并攪拌后，靜置2 小時以上。在10000rpm下離心30分鐘，回收上清。在上清中加 入硫酸銨至最終濃度為40%，靜置12小時以上。在10000rpm下 離心分離，回收沉淀。將該沉淀再次懸浮于10mLTBS中，使用 TBS透析。25 瓊脂凝膠內(nèi)沉降反應(yīng)將瓊脂混合于0.8。/。NaCl液中至最終濃度達(dá)到1%,通過加熱使瓊脂完全溶解。裝載在玻璃載片上后 冷卻，使其形成中央具有l(wèi)個孔穴和周圍具有6個孔穴的結(jié)構(gòu)。在中央滴加30微升抗原液(2mg/ml),在周圍的孔穴中分別滴 加30微升PBS、血清、卵黃提取液，靜置12小時后觀察有無沉 降線。結(jié)果示于圖5中。圖中的記號、數(shù)字如下所述。 5 A:抗原(l型膠原)1:免疫前的鴕鳥血清2:免疫第l周的鴕鳥血清3:免疫第2周的鴕鳥血清4:免疫第3周的鴕鳥血清 io 5:免疫第4周的鴕鳥卵黃提取液6: PBS同樣，對鴕鳥的產(chǎn)卵雌鳥每周免疫大鼠的l型膠原，利用瓊 脂凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng)確認(rèn)從首次免疫起第l周~第4周的卵黃提取 液中抗體的產(chǎn)生。結(jié)果示于圖6中。圖中的記號、數(shù)字如下所述。 is A:抗原(l型膠原)1:免疫前的鴕鳥卵黃提取液2:免疫第l周的鴕鳥卵黃提取液3-.免疫第2周的鴕鳥卵黃提取液4:免疫第3周的鴕鳥卵黃提取液 20 5:免疫第4周的鴕鳥卵黃提取液6: PBS在圖5、 6中，抗原抗體反應(yīng)所產(chǎn)生的白色沉降線表示抗體 的產(chǎn)生(圖7也相同)。如這些圖所示，從免疫第2周開始血液中 產(chǎn)生抗體、從免疫第4周開始卵黃中產(chǎn)生抗體，確認(rèn)鴕鳥卵黃中 25 的抗體的產(chǎn)生。另外，同樣對鴕鳥的產(chǎn)卵雌鳥每周免疫IBV (雞傳染性支 氣管炎病毒)的滅活疫苗，利用瓊脂凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng)隨時間調(diào)查其血清和卵黃中的抗體產(chǎn)生情況。結(jié)果示于圖7中。圖中的記 號、數(shù)字如下所述。A:抗原(IBV)1: PBS5 2:免疫前的鴕鳥血清3:免疫第4周的鴕鳥血清 4:免疫第6周的鴕鳥血清 5:免疫第6周的鴕鳥卵黃提取液 6:免疫前的鴕鳥卵黃提取液 io 如圖7所示，在從首次免疫起第4周、第6周的血清和第6周的卵黃提取液中產(chǎn)生抗體，確認(rèn)鴕鳥卯黃中產(chǎn)生抗體。 [實施例5]為了比較鴕鳥抗體和雞抗體的檢測強(qiáng)度，使用鳥它鳥和雞分 別制備抗C D14 6抗體，比較兩者的檢測強(qiáng)度。is 在實一瞼中，用人CD146蛋白質(zhì)對雌雞和雌鴕鳥隔周進(jìn)行免疫，由第6周采集的血清純化抗體，分別將等量(O.lmg)抗體 進(jìn)行HRP標(biāo)記。將10ng CD146蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS - PAGE后使用 PVDF膜轉(zhuǎn)印，并4吏其與上述各個抗體反應(yīng)。洗滌后，使用ECL 發(fā)光，用倫琴膜(roentgen film )感光。20 結(jié)果示于圖8中。圖中(a)表示使用來自2只雞、2只鴕鳥的抗體的免疫印跡結(jié)果，可知鴕鳥抗體的檢測強(qiáng)度更強(qiáng)。(b) 表示3只雞、3只鴕鳥相對強(qiáng)度的平均值，相對強(qiáng)度是利用顯像 密度測定法測量倫琴膜上的條帶濃度并以無帶區(qū)域的強(qiáng)度為1 時計算的相對強(qiáng)度。由該圖表可知，鴕鳥抗體的相對靈敏度顯25 著地高。同樣，使用鴕鳥和雞分別制備抗CD166抗體，比較兩者的 檢測強(qiáng)度。在實驗中，用人CD166蛋白質(zhì)隔周對母雞和雌鴕鳥進(jìn)行免 疫，由第6周采集的血清純化抗體，分別將等量(O.lmg)抗體 進(jìn)行HRP標(biāo)記。將20ng CD166蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS - PAGE后使用 PVDF膜轉(zhuǎn)印，與上述各個抗體反應(yīng)。洗滌后，4吏用ECL發(fā)光， 5用倫琴膜感光。結(jié)果示于圖9。圖中(a)表示使用來自2只雞、2只鴕鳥的 抗體的免疫印跡結(jié)果，可知鴕鳥抗體的檢測強(qiáng)度更強(qiáng)。(b)表 示3只雞、3只鴕鳥的相對強(qiáng)度的平均值，相對強(qiáng)度是利用顯像 密度測定法測量倫琴膜上的條帶濃度，以無帶區(qū)域的強(qiáng)度為1 io 時計算的相對強(qiáng)度。由該圖表可知，鴕鳥抗體的相對強(qiáng)度顯著 地高。這樣，通過本實施例確認(rèn)與雞抗體相比，鴕鳥抗體的檢測 靈敏度更高，相對于雞抗體，鴕鳥抗體具有顯著的優(yōu)越性。 產(chǎn)業(yè)實用性15 如上所述，本發(fā)明涉及使用鴕鳥制備的抗體及其制造方法，如上所述，可以在人的治療或診斷中使用的醫(yī)療用抗體的大量 生產(chǎn)、及其它可以利用抗體的各種領(lǐng)域中利用。
權(quán)利要求
1.抗體，其為使用鴕鳥制備的抗體。
2. 醫(yī)療用抗體，其為使用鴕鳥制備的用于治療或診斷的醫(yī) 療用抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的醫(yī)療用抗體，其為癌癥的治療用 5 或診斷用的抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的醫(yī)療用抗體，其為將CD166蛋白 質(zhì)(包括其一部分)作為抗原而制備的抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗體，其為抗CD抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗體，其為將病毒蛋白作為抗原 io 而制備的抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗體，其為病毒感染的檢查用抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗體，其為用于除去病原體、變 應(yīng)原及其它抗原而使用的工業(yè)用抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求l ~ 8任一項所述的抗體，其通過對鴕鳥的幼鳥實施首次免疫而制備。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l ~ 8任一項所述的抗體，其通過對雌鴕 鳥實施免疫、由其產(chǎn)下的卵的卵黃制備。
11. 抗體的制備方法，其特征在于，將蛋白質(zhì)或其肽片斷 等作為抗原免疫鴕烏，制備多克隆抗體或單克隆抗體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的抗體的制備方法，其對鴕鳥的 幼烏實施首次免疫。
13. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的抗體的制備方法，其特征在于， 對雌鴕鳥實施免疫，由其產(chǎn)下的卵的卵黃制備抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供使用鴕鳥制備的抗體及其制備方法。通過使用鴕鳥，可以使用1只鴕鳥，大量、均質(zhì)且簡單地生產(chǎn)用小鼠、大鼠等哺乳類難以制備的抗體(特別是醫(yī)療用抗體)。由此，可以解決以往使用其它動物制備多克隆抗體時的批間差異的問題。
文檔編號A61K39/395GK101253198SQ200680031810
公開日2008年8月27日 申請日期2006年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月29日
發(fā)明者本康浩 申請人:獨立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu);公立大學(xué)法人大阪府立大學(xué)