專利名稱：包含SODs和基于谷醇溶蛋白的肽片段的藥物組份的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含超氧化物歧化酶，尤其是與其它化合物協(xié)同使用的藥 物組份。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(E.C丄15丄1.)簡稱SOD，包括一族能夠?qū)Π渲?的超氧(o2-)陰離子歧化作用的普遍存在的金屬酶。積累或產(chǎn)生大量的 自由基對大多數(shù)活的有機(jī)體都是有害的，這種狀態(tài)被稱為氧化脅迫。這種 狀態(tài)與許多的代謝紊亂相關(guān)，代謝紊亂本身可導(dǎo)致多種病理，如致癌作用、 動(dòng)脈硬化癥、老化及炎癥紊亂，如腹部疾病，也稱為谷蛋白不耐受性。
除了其進(jìn)化程度或所處細(xì)胞位置不同，根據(jù)分子中包含的金屬離子 不同，SOD目前以3種主要的形式存在，即銅-鋅或CuZn-SOD，錳或 Mn-SOD和鐵或Fe-SOD。也在更多的特定細(xì)胞結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)CuZn-SOD和 Mn-SOD，如植物中的過氧化物酶體或葉綠體。也可在哺乳動(dòng)物特定的胞 外室中發(fā)現(xiàn)CuZn-SOD或Ec-SOD。最近，鑒定了一種與其它已知的SODs 具有弱同源性的Ni-SOD在鏈霉菌中。
許多試驗(yàn)已經(jīng)顯示即使所有的SODs具有相同的清除自由基的活性， 它們有效的生物活性對于給定的治療癥狀和目標(biāo)機(jī)體都是不同的。尤其 是，同源SODs在經(jīng)過角叉膠和阿霉素誘導(dǎo)的鼠的足水腫中的抗炎活性與 異源SODs相比是無效，異源SODs的活性似乎更依賴于酶的氨基酸的變 體，即使是微小的變化，而不是其活性位點(diǎn)的金屬的種類或酶的球形分子
質(zhì)量o然而，從免疫原性的SOD中分離異源SOD的界限須由其不同的應(yīng)用內(nèi) 容來決定。
事實(shí)上，在大鼠的研究中已經(jīng)表明
(a) 同源的大鼠的CuZn-SOD或某種異源的SODs，如人的Mn-SOD， 都沒有抗炎活性，
(b) 某種異源的SOD如牛CuZn-SODs具有這樣的抗炎活性，但是還 有其它的，特別是酵母CuZn-SODs，甚至具有前促炎活性。
通過已經(jīng)執(zhí)行的多種不同的研究結(jié)果表明，即使是臨床劑量，同源類 型的酶有效性較低，由此可知，與異源的SODs相比，人的SOD在人體內(nèi) 某種抗炎作用中活性更小。因此，在牛海綿狀腦炎(BSE)之前用藥，牛 CuZn-SOD的臨床治療效果較好。
盡管牛CuZn-SOD和人CuZn-SOD之間有18.3%的不同，實(shí)施大量的 注射試驗(yàn)的結(jié)果表明，僅僅有極少數(shù)過敏性或過敏性休克的病例。 一些早 期開展后期延續(xù)的研究表明，異源的SODs的藥理活性能夠隨抗SOD的抗 體循環(huán)速率的升高而抑制更多。此外，近期的報(bào)道傾向于說明循環(huán)的抗體 參與到異源SOD的外現(xiàn)和內(nèi)化的過程。
SODs口服給藥的問題在于它在胃腸道中會很快的降解，進(jìn)而降低生 物利用度和療效。將SOD導(dǎo)入它能發(fā)揮最好效果的細(xì)胞特定位置更困難。

發(fā)明內(nèi)容
申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)配制包含至少一種超氧化物歧化酶和至少一種基于 谷醇溶蛋白的肽片段的藥物組份可以解決所述困難，并且這種關(guān)聯(lián)作用使 得SOD的靶向可以定位于可更好發(fā)揮療效的細(xì)胞位點(diǎn)。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種適于給藥的藥物組份，包含至少 一種超氧化物歧化酶(SOD)和至少一種基于谷醇溶蛋白的肽片段的所組 成的功能活性的結(jié)合。"功能活性的結(jié)合"一詞應(yīng)理解為上述的兩種化合物無論是通過物理方式或化學(xué)方式結(jié)合在一起，產(chǎn)生的效果超過其中每一種
化合物簡單相加的效果的協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明的特別之處在于， 一個(gè)SOD 和一個(gè)基于谷醇溶蛋白的肽片段的協(xié)同作用不但可以可以延長SOD作用
時(shí)間，同時(shí)還可以明顯地減少基于谷醇溶蛋白的肽片段偶爾引起的炎癥反 應(yīng)。
隨著整個(gè)說明書的描述，本發(fā)明的其它目的會很明了，但是特別優(yōu)選 的目的也包括藥物組份中的氨基酸分子，任意的編碼核苷酸序列或通過雜 交得到皆可，并且可以利用氨基酸分子作為抗細(xì)胞脅迫劑或者治療炎癥病 理中的藥物。本發(fā)明還包括用于檢測某些基于谷醇溶蛋白肽的片段或至少 與一種超氧化物歧化酶以化學(xué)或物理方式結(jié)合的抗體。權(quán)利要求和說明書 中使用的"嵌合"一詞意味著組份中包含的分子來源于兩個(gè)或更多的截然 不同的遺傳資源。
適合的谷醇溶蛋白
最適地，至少一種基于谷醇溶蛋白的肽片段是麥醇溶蛋白的片段或衍生 物，類似物，鹽或其代謝物。更適宜地，基于谷醇溶蛋白的肽片段是麥醇 溶蛋白的非免疫原性類似物。在一個(gè)最適合的實(shí)施例中，基于谷醇溶蛋白 的肽片段是對于免疫原性的基于谷醇溶蛋白的肽具有競爭性抑制活性的 麥醇溶蛋白的非免疫原性類似物。
在本發(fā)明另一個(gè)適宜的實(shí)施例中，至少一種基于谷醇溶蛋白的肽片段 選自由基于谷醇溶蛋白的肽片段的完全水解物，部分水解物或輕微水解物 組成的組中。然而，通常情況，至少一種基于谷醇溶蛋白的肽片段選自模 擬胃腸水解過程產(chǎn)生的從PTC (胰液素、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)水解 谷醇溶蛋白獲得的肽片段的組中。
在另一個(gè)可選的但也是適宜的實(shí)施例中，至少有一種基于谷醇溶蛋的肽片段須水解到可作為腸道中靶信號的程度。
適合的SODs
超氧化物歧化酶可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員常見的生物中選取，并且可以 從人超氧化物歧化酶、動(dòng)物超氧化物歧化酶、細(xì)菌超氧化物歧化酶、酵母 超氧化物歧化酶和植物超氧化物歧化酶所組成的組中選擇。然而，更適宜 地，至少一種超氧化物歧化酶從CuZn超氧化物歧化酶、Mn超氧化物歧化 酶、胞外超氧化物歧化酶、Ni超氧化物歧化酶和Fe超氧化物歧化酶所組成 的組中選擇。本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施例中至少有一種超氧化物歧化酶是一 個(gè)同源的超氧化物歧化酶。在本發(fā)明另一個(gè)適宜的具體實(shí)施例中，超氧化 物歧化酶是一個(gè)異源的超氧化物歧化酶。術(shù)語"同源的"指的是SOD與給定 的耙宿主中的天然分子的來源是相同的。術(shù)語"異源的"是指SOD與給定的 耙宿主中的天然分子的來源是不同的。
在一個(gè)最適宜的具體實(shí)施例中，至少有一種異源的CuZn超氧化物歧 化酶。如前所述，至少一種超氧化物歧化酶優(yōu)選的是一種植物超氧化物歧 化酶，并且更優(yōu)選的是一種異源的CuZn植物超氧化物歧化酶。這樣的超 氧化物歧化酶可以通過多種途徑獲得或生產(chǎn)。
例如，至少一種超氧化物歧化酶可以從植物中提取。如果植物被是用 于提取或生產(chǎn)至少一種超氧化物歧化酶，這些植物可以來源于葫戸科，更 合適的是選自瓜類組成的組中或選擇性地選自茄科組成的組中并且選擇 西紅柿組成的組中。
在可以獲得的多種植物超氧化物歧化酶中，本發(fā)明的超氧化物歧化酶 優(yōu)先從由過氧化物酶體的，葉綠體的和胞質(zhì)的超氧化物歧化酶組成的植物 超氧化物歧化酶中選擇。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，至少一種超氧化物歧化酶是一個(gè)重組的超 氧化物歧化酶，所述的重組超氧化物歧化酶可以通過基因工程并在轉(zhuǎn)換的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述的SOD的編碼核酸而獲得。特別地，申請人發(fā)現(xiàn)當(dāng)至 少一種超氧化物歧化酶為一種修飾的葉綠體的，過氧化物酶體的或胞質(zhì)的 CuZn超氧化物歧化酶時(shí)是特別適宜的。在另一個(gè)仍然是適宜的具體實(shí)施 例中，至少一種超氧化物歧化酶是一種異源/同源雜交的超氧化物歧化酶， 優(yōu)選是一種雜交的植物/人超氧化物歧化酶。
在宿主細(xì)胞基因組中引入外界的或內(nèi)在的基因的技術(shù)對于本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說是熟知的，通常的表達(dá)重組蛋白的技術(shù)也一樣。因此，在本發(fā) 明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，修飾過的葉綠體的、過氧化物酶體的或胞 質(zhì)的超氧化物歧化酶被由修飾的核酸序列編碼，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)。本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以熟練的通過PCR擴(kuò)增技術(shù)來獲得這些修飾的編碼序列， 在此不需描述。
在本發(fā)明一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施例中，至少一種超氧化物歧化酶是一種重 組的超氧化物歧化酶，由下述序列編碼
一根據(jù)SEQ.ID24至8￡0.10 33確認(rèn)的任意一種核苷酸序列； 一在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID 24至SEQ.ID 33確認(rèn)的任意一種核苷酸序 列雜交的核苷酸序列；
—與SEQ.ID 24至SEQ,ID 33確認(rèn)的任意一種核苷酸序列至少有70。％ BLAST同一性的核苷酸序列； 在嚴(yán)格式條件下雜交，應(yīng)該理解為所述的核苷酸序列將與所提到的序 列在SSPEx0,2， 65'C的條件下進(jìn)行雜交。
最后，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及前面描述的藥物組份的應(yīng)用，生產(chǎn)藥物是 為了用于治療氧化和炎癥病理或紊亂，尤其是伴有很多疾病的紊亂，包括 谷蛋白不耐受癥，尤指腹部的疾病。 異源的植物SODs
申請人發(fā)現(xiàn)源于植物的SODs在本發(fā)明中是非常有利的。CuZn-SODs以多種形式存在于高等植物的光合細(xì)胞中。它們主要存在于葉綠體中，在 胞質(zhì)和過氧化物酶體中含量較低。
它們之間的區(qū)別在于氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和它們的聚合程度。
它們中的很多已經(jīng)具有生化或遺傳的特征。先生產(chǎn)作為前體的葉綠體
或過氧化物酶體的植物SODs，該前體在蛋白的N末端含有一段引導(dǎo)序列 -或信號肽。在轉(zhuǎn)移到葉綠體或超氧化物酶體之后，前體功能性成熟后即除 去多余的N-末端。
除了這種特異性之外，過氧化物酶體的SODs,尤其是瓜類的，或者葉 綠體SODs，尤其是西紅柿的，(a)它們自身之間與胞質(zhì)SODs相比，它們自 己的保守區(qū)更多，在葉綠體和過氧化物酶體SODs中大約有90%的保守區(qū)， 而胞質(zhì)SODs中有相對70X的保守區(qū)；(b)對于加熱和過氧化氫失活與其 它的植物CuZn-SODs相比更有抵抗力，然而還從來沒有用于治療的報(bào)道， 無論是腸道給藥還是注射給藥。
申請人已經(jīng)公開了序列排列，然而，由申請人已經(jīng)公開的序列可知， 葉綠體或過氧化物酶體的SODs與人或牛SOD的不同之處只比它們相同的 胞質(zhì)來源的植物SODs的不同之處少2—4%。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，葉綠體CuZn-SOD的選擇，例 如選自瓜中，被申請人所保留，因?yàn)橐呀?jīng)確認(rèn)植物中豐富存在的以胞質(zhì)形 式的密碼子在細(xì)菌中卻是稀有的，又由于富含它們的生物合成酶的特殊的 活性，其表達(dá)程度有明顯地改變。
申請人優(yōu)選采用細(xì)菌系統(tǒng)作為SODs生物合成的重組表達(dá)的宿主細(xì) 胞，并使這兩方面都得到證實(shí)。
人CuZn-SOD在申請人的該細(xì)菌系統(tǒng)中得到表達(dá)并具有功能。其中僅 含有至少兩個(gè)稀有的密碼子產(chǎn)生了兩個(gè)精氨酸殘基，它們存在于N末端區(qū)，但沒發(fā)現(xiàn)參與人SOD的酶功能。另一方面，西紅柿SOD中，由稀有密 碼子產(chǎn)生的兩個(gè)精氨酸殘基位于酶的C-末端，其中的一個(gè)參與了酶所固有 的吸引超氧化物陰離子的功能。
本例中，此系統(tǒng)中表達(dá)的生物合成的西紅柿胞質(zhì)SODs是活性很低。 在沒有這種稀有密碼子的葉綠體西紅柿SOD上所做的其它的研究顯示在 細(xì)菌中表達(dá)可得到全功能性并具有完全活性的生物合成的SOD。 在該細(xì)菌系統(tǒng)中克隆并得到的首2個(gè)瓜類SODs已經(jīng)證實(shí)具有特定的活 性，并與純化胞質(zhì)西紅柿后所得的SODs活性相似。本例中，稀有密碼子 的位點(diǎn)與那些在胞質(zhì)西紅柿SOD中確認(rèn)的位置相同，其中一個(gè)精氨酸專門 吸引超氧化物。
因此用另外一種菌株代替目前使用的菌株是有利的，另外一種菌株中 含有在E coli中稀有使用的針對密碼子的額外的tRNAs，比如精氨酸AGG 或AGA。
這種特殊的菌株被設(shè)計(jì)為旨在增強(qiáng)功能性活性植物蛋白在細(xì)菌中的 表達(dá)。
來源于植物的成熟SODs，其提取的形式并且優(yōu)選地作為一種重組的 酶，口服給藥不但可以解決異源活性和免疫耐受，并且可以作為牛SOD 的替代品用于病理炎癥過程的治療。 SODs的口服給藥和細(xì)胞靶位點(diǎn)
為了提高適合治療用的SODs的活性，可以考慮下列幾種不同的方案
脂質(zhì)體封裝，白蛋白結(jié)合，或者與聚乙二醇聯(lián)合使用，或者甚至與肝素親 和性肽雜交聯(lián)合使用。
異源的牛CuZn-SODs用脂質(zhì)體或神經(jīng)酰胺口服給藥的抗炎活性，第一 次在角叉膠誘導(dǎo)的大鼠腿部水腫表現(xiàn)出減少活性降低現(xiàn)象。用植物谷醇溶 蛋白如麥醇溶蛋白代替神經(jīng)酰胺，用非重組植物SOD代替非重組牛SOD確定的治療活性與注射的牛SOD相比可以延遲誘導(dǎo)鼠的認(rèn)知紊亂的出現(xiàn)。 使用麥醇溶蛋白的副作用
然而對于有限的但不可忽略的患者群體，這種口服給藥的形式還存在 很大的副作用?，F(xiàn)已熟知，用于上述修改配方中的某些物質(zhì)，尤其是植物 谷醇溶蛋白，如麥醇溶蛋白，在胃腸道中經(jīng)過胃蛋白酶-胰蛋白酶的水解 之后能產(chǎn)生患者耐受性差的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物導(dǎo)致患者谷蛋白過敏，甚至是 患者中毒，就像在腹部疾病的病例中一樣。這種人類僅有的疾病與人類腸 道細(xì)胞的毛刷類型邊緣表達(dá)HLA class II分子的特殊能力有關(guān)。 一些單體 型，如HLA-DR和HLA-DP，還有HLA-DQ已經(jīng)有很充分的證據(jù)表明其參 與了麥醇溶蛋白特異性T細(xì)胞的激活?，F(xiàn)在確信麥醇溶蛋白肽的致毒包括 3個(gè)連續(xù)的步驟a)麥醇溶蛋白的毒性片段結(jié)合到HLA受體并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)位于 腸道微茸毛邊緣的腸道細(xì)胞中；b)轉(zhuǎn)運(yùn)到腸道嗜堿性水平面，在那里它們 出現(xiàn)在淋巴細(xì)胞固有層中的CD4+型內(nèi)皮細(xì)胞中；c)最后，完全水解或部 分水解的多肽從腸道細(xì)胞嗜堿性膜釋放到淋巴細(xì)胞固有層中的APC抗原 呈現(xiàn)細(xì)胞。
麥醇溶蛋白肽存在于小麥中并且那些在腸道中水解產(chǎn)生的那些產(chǎn)物 導(dǎo)致產(chǎn)生負(fù)反應(yīng)，就是炎癥反應(yīng)，而當(dāng)酶活性SOD聯(lián)合使用，這些肽的負(fù) 反應(yīng)可以大大地減少。
另外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，小麥的麥醇溶蛋白與酶活性的SOD—起用于治療氧脅 迫介導(dǎo)的缺陷時(shí)是最好選擇，除了上面提到的消極的副作用之外，其與小 麥中存在的麥醇溶蛋白相似。
在生理?xiàng)l件下，針對上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)的抗原反應(yīng)是由TH2型T細(xì)胞介 導(dǎo)的。其中，這些細(xì)胞負(fù)責(zé)產(chǎn)生IgA并且其中負(fù)責(zé)對食物抗原的免疫耐受。 在谷蛋白不耐受的例子或腹部疾病的更嚴(yán)重的形式中，由麥醇溶蛋白衍生 而來的肽通過產(chǎn)生一種氧化脅迫的狀態(tài)可以改變腸道細(xì)胞的氧化代謝，這種狀態(tài)是對麥醇溶蛋白更加敏感的，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)處于一種前氧化狀態(tài)。
這種炎癥狀態(tài)的特征是對TH1型細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)變，是與細(xì)胞因子和 一氧化氮的產(chǎn)生形成的重要修飾有協(xié)同作用。在這些狀態(tài)下，脂肪過氧化 作用的升高和谷胱甘肽(GSSG/GSH)氧化和還原形式的比例的升高進(jìn)一 步證明了申請人的假說，抗氧化劑融合到麥醇溶蛋白應(yīng)會使治療指標(biāo)的效 果更好。
作為一個(gè)推論，由于和麥醇溶蛋白的聯(lián)合作用使得口服SOD的抗炎活 性增強(qiáng)，可能歸因于對細(xì)胞膜的親和性的升高和對相關(guān)的代謝途徑的潛在 控制。
為了證明這些作用，酶活性的異源SOD首先與小麥的谷醇溶蛋白的水 解產(chǎn)物的衍生物聯(lián)接，尤其是Vul-麥醇溶蛋白，確定的氨基酸序列為N末 端-QQPYPQPQPF畫Cter (SEQ.ID N°01)，然后與小麥谷醇溶蛋白水解產(chǎn)物 的無毒類似物聯(lián)接，尤其是Dur-麥醇溶蛋白，確定的氨基酸序列為 Nter-QQPQDAVQPF-Cter (SEQ.ID N°02)。這種類似物是麥醇溶蛋白的有 毒衍生物的競爭性抑制劑，并且能夠靶向定位于與腸道細(xì)胞相互作用的位 點(diǎn)上。
谷醇溶蛋白，尤其是麥醇溶蛋白，在胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)中保護(hù)周圍的活性成 分發(fā)揮了積極的作用，并且在保護(hù)它們的適合于耙向結(jié)合的水解形式和進(jìn) 行性緩慢釋放腸道粘膜中的細(xì)胞活性成分中發(fā)揮了積極的作用。當(dāng)這些衍 生物被N末端增加了無毒類似物的蛋白質(zhì)代替時(shí)，例如異源的SOD，可能 會保持衍生物肽片段作為腸道細(xì)胞靶向分子的作用，同時(shí)避免了谷醇溶蛋 白抗原衍生物的毒性作用。
考慮到可注射的牛SOD在幾個(gè)治療指標(biāo)中表現(xiàn)出的藥效，以及BSE和 CFJD的到來產(chǎn)生的公共安全問題，上述的本發(fā)明的目的有以下優(yōu)點(diǎn)1) . 一種異源的非免疫原性的SOD，或者僅僅誘導(dǎo)免疫耐受力，不考慮
受體的遺傳背景；
2) .源于植物的SOD，食物來源的便利；
3) .通過傳統(tǒng)已知的對于SODs無效的給藥途徑使異源SODs具有藥物活
性；
4) .并且這種異源的SOD與無毒的腸道的耙肽偶聯(lián)，從而增強(qiáng)口服給藥
的SODs的異源活性，并且表現(xiàn)出對還沒有治療方法的替代治療選
擇，特別是用于治療罕見疾病的藥物的方案。 這些和本發(fā)明的其它的具體實(shí)施方式
將在后面進(jìn)行詳細(xì)的描述。


圖1是為了從甜瓜中獲得編碼CuZn超氧化物歧化酶的cDNA的克隆方 法的示意圖2是基因工程生產(chǎn)本發(fā)明的重組和嵌合的S0D分子的常規(guī)方案示意
圖3代表依據(jù)本發(fā)明獲得的多種甜瓜Cu-Zn SOD變體的RT-PCR擴(kuò)增 的瓊脂糖凝膠電泳，特別是在泳道A中是一種重組的瓜葉綠體Cu-ZnSOD， 泳道B是重組的瓜偽-胞質(zhì)Cu-Zn SOD，泳道C是泳道B中的重組偽-胞質(zhì) Cu-Zn SOD在N末端融合麥醇溶蛋白肽；
圖4是不同來源的3種不同的Qi-Zn超氧化物歧化酶的氨基酸排列 圖，特別是，西紅柿胞質(zhì)SOD (第1行)，人SOD (第2行)，瓜葉綠體SOD (第3行)。序列之間同一的氨基酸殘基用一個(gè)圓圈在3個(gè)SOD的每一組 之下標(biāo)記。
圖5是重組SOD (1-7列)和重組融合Gli-SOD (A-F列)的純化步驟 的考馬斯亮蘭染色凝膠，其中
列1和A是分子重量(分子質(zhì)量)標(biāo)記，是從Invitrogen公司獲得的己知的基準(zhǔn)蛋白梯度；
列2禾口B代表His-tag的分離;
列3、 4、 5、 6和C、 D、 E分別代表依據(jù)本發(fā)明的在連續(xù)的純化步 驟期間獲得的重組SOD和重組Gli-SOD;
列7和F代表用單Q柱處理之后保留的條帶。 圖6表示重組SOD和Gli-SOD的折疊分別用NBT還原凝膠電泳，其中 圖6A顯示了rec SOD在列A和A'中加入125嗎天然的瓜提取物(相 當(dāng)于90U/mg)，列l(wèi)， l'和l'〃加入0.92ing的天然SOD;
圖6B顯示了依據(jù)本發(fā)明的rec Gli -SOD ，在列A和A'中加入125|ig 天然的瓜提取物(相當(dāng)于90U/mg)，在列1和l'中加入了 1.84jig的重組 Gli-SOD，在列2和2'中入了 0.92i!g的重組Gli-SOD; 圖7是下述情況的SDS-PAGE:
圖7A表示考馬斯亮蘭顯示以下內(nèi)容 列1中50ng的天然的甜瓜提取物；
列2是蛋白標(biāo)記物(6.6， 14.1， 21.1， 31， 45，和67KDa);
列3是2.5iug的牛SOD (Sigma)。 圖7B代表EP1699抗體用以下內(nèi)容顯示
列4表示50嗎的天然甜瓜提取物；
列5是蛋白標(biāo)記物(6.6， 14.1， 21.1， 31， 45， 67KDa)
列6是2.5iug牛SOD (Sigma)。 圖8麥醇溶蛋白作用于HT29細(xì)胞系的增殖曲線的反應(yīng)圖，其中N=4; 圖9是一個(gè)依據(jù)本發(fā)明的recSOD或recGli-SOD的最小有效劑量的比較 圖；其中N二4;
圖10是依據(jù)本發(fā)明的recSOD或recGli-SOD作用于HT29細(xì)胞系的增殖 曲線的反應(yīng)圖，其中N^4;圖11是一組FITC圖像顯示了SOD或Gli-SOD與HT29細(xì)胞的結(jié)合，利 用EP1669抗SOD抗體，其中圖IIA是一個(gè)陰性對照，圖11B是用rec SOD處理之后，圖11C是用rec Gli -SOD處理之后，白色區(qū)域表示 SOD存在于細(xì)胞的附近；
圖12圖解表示依據(jù)本發(fā)明的SODs作用于基礎(chǔ)的(A)食欲肽誘導(dǎo)的 (B) HT-29細(xì)胞凋亡，N=4，用膜聯(lián)蛋白V檢驗(yàn)；圖12A代表分別用
10U的recSOD和recGli-SOD獲得的結(jié)果，圖12B分別用50U的recSOD
和recGli-SOD獲得的結(jié)果；
圖13圖解重組SOD或Gli-SOD對于次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘導(dǎo)的
HT-29細(xì)胞凋亡的作用(N=4，膜聯(lián)蛋白V檢驗(yàn))。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
用順序RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)從瓜《 Cucumis melo L 中獲得編碼銅-鋅過 氧化物酶體的或葉綠體的超氧化物歧化酶的信使RNA克隆，并且確定其 完整的核苷酸序列(包括編碼的和不翻譯的序列)。第一個(gè)克隆僅僅包含 有被基因工程修飾的編碼序列，為了獲得被稱為偽-胞質(zhì)的第一蛋白變體， 如圖2所示，其中表示了對瓜葉綠體SOD基因修飾的一般方案。
第一變體顯示在N-末端的第65個(gè)氨基酸，相當(dāng)于自然的信號肽，用 標(biāo)志胞質(zhì)植物SODs的N-末端的甲硫氨酸-纈氨酸對替代。這種技術(shù)性的工 程過程復(fù)制了SODs在植物細(xì)胞中經(jīng)歷的葉綠體成熟的步驟，然后通過兩 個(gè)增加的氨基酸顯示。第2和第3變體除了分別含有甲硫氨酸-纈氨酸對 之外，還含有靶向到胃腸道的麥醇溶肽序列(Nter-QQPYPQPQPF-Cter (SEQ.IDN。01)，作為Vul被提到)，其來源于小麥，能夠讓麥醇溶多肽復(fù)制 并與消化道細(xì)胞相互作用而不產(chǎn)生敏化反應(yīng)的肽序列如下所示 (Nter-QQPQDAVQPF-Cter (SEQ.ID N°02),作為Dur被提到)，其來源于小麥。
實(shí)施例2
從西紅柿葉可食用番茄素(PubMed Blast Accession number X14040) 中獲得的編碼銅-鋅SOD胞質(zhì)超氧化物歧化酶的信使RNA的克隆，是通過 直接RT-PCR擴(kuò)增完整的編碼序列以產(chǎn)生稱為胞質(zhì)的第1個(gè)西紅柿變體， 第2和第3變體是通過增加靶向胃腸道的麥醇溶多肽 (Nter-QQPYPQPQPF-Cter (SEQ.ID N°01),作為Vul提到的)而在基因?qū)哟?修飾的、其麥醇溶多肽來源于小麥，能夠讓麥醇溶多肽復(fù)制并與消化道細(xì) 胞相互作用而不產(chǎn)生敏化反應(yīng)的肽序列如下所示 (Nter-QQPQDAVQPF-Cter (SEQ.ID N°02)，作為Dur被提到)，其來源于小 麥。
實(shí)施例3
從人血細(xì)胞Homo sapiens (PubMed/Blast Accession number K00065 ) 中獲得的編碼銅-鋅SOD胞質(zhì)超氧化物歧化酶的信使RNA的克隆，是通過 直接RT-PCR擴(kuò)增完整的編碼序列以產(chǎn)生被稱為胞質(zhì)的第1個(gè)人變體，第 2和第3變體是通過增加靶向胃腸道的麥醇溶多肽 (Nter-QQPYPQPQPF-Cter (SEQ.ID N°01)，作為Vul提到)而在基因?qū)哟涡?飾的、能夠讓麥醇溶多肽復(fù)制并與消化道細(xì)胞相互作用而不產(chǎn)生敏化反應(yīng) 的肽序列如下所示(Nter-QQPQDAVQPF-Cter (SEQ.ID N°02),作為Dur 被提到)。 實(shí)施例4
每種結(jié)構(gòu)的第一變體的表達(dá)產(chǎn)物用于驗(yàn)證所獲得的各種生物合成的 SODs的抗自由基活性。這些活性在天然的PAGE上因NBT還原作用而改 變。結(jié)果顯示重組的生物合成蛋白的活性與植物中的cDNA鏈接是非常密 切地，密碼子的活性在當(dāng)今最常使用的細(xì)菌宿主菌株中很少顯現(xiàn)。現(xiàn)今使用的菌株中的3種cDNA的低表達(dá)率和低活性率可以解釋為是 由于菌株中出現(xiàn)很少使用的密碼子，如AGA， AGG(精氨酸),程度更輕的密 碼子有CCC (脯氨酸)，GGA (甘氨酸)CTA (亮氨酸)，和ATA (異亮氨 酸)。為了解決這個(gè)問題，cDNA轉(zhuǎn)入另一個(gè)表達(dá)載體系統(tǒng)，確認(rèn)為？￡丁3(^+ (由NOVAGEN獲得)，并且用于轉(zhuǎn)染許可的細(xì)菌菌株，確認(rèn)為RosettaDE3 pLysS (由NOVAGEN獲得)，其中含有適合于這些稀有氨基酸的tRNAs。 本發(fā)明的詳細(xì)方案
Cucumis melo L SOD的克隆方案和基因修飾
使用與真核-細(xì)胞的技術(shù)[TRIzoUTM kit, Life Technologies, France]從 氮?dú)饫鋬鲑A藏的Cucumis melo L瓜葉中提取總RNA，或者從品種cucumis melo L (商業(yè)品種登記為VILMORIN-GNIS-2251029)提取，或者從品種 cucumis melo LC (商業(yè)品種登記為ASL-NCIMS-40310)提取。 瓜SOD的3'RACE-PCR
將 修 飾 的 寡 聚 dT 引 物 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTVN (SEQ.ID N° 03) [Clontech, Smart cDNA ref:kl051]加入25|il 緩沖液中，其中含有pH值為8.3的Tris HC1 20mM, KC1 50mM， MgCl2 2.5mM, 10mM DTT和400pl各種dNTP，在200單位Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶 (Gibco-BRL)的作用下，在42。C保持1小時(shí)，信使RNA轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA基 體。
編碼SOD的信使RNA的3'端的擴(kuò)增反應(yīng)通過結(jié)合幾個(gè)單鏈引物對進(jìn) 行，如末端引物AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT (SEQ.IDN°04)，作 為互補(bǔ)于修飾的寡dT引物，和分別從Mdcyt5Fl GGTGAYACMACMAATGGYTG (SEQ.ID N。05) 和 Melcyt5S2 CATGCKGGKGAYCTDGG (SEQ.ID N。06)得到瓜的編碼區(qū)域。擴(kuò)增引物序列本身是非常簡并的，因?yàn)樗鼈兪腔诙喾N植物品種的過氧化物酶體
的、葉綠體的和胞質(zhì)的CuZn-SODs的保守區(qū)。 瓜SOD的5， RACE-PCR
在克隆到細(xì)菌載體pGEM-T (獲自Promega)之后，7個(gè)獨(dú)立的克隆被 測序并且一致的序列用于構(gòu)建3個(gè)新的特定的引物Ved3R3 ACAAAGGCTCTTCCAACTACAG (SEQ.ID N。07)， Ved3R2 GCCGCTAAGAGGAATCTG (SEQ.ID N。08) 和 Ved3Rl TGGTTGCCTCTGCTACTCCATC (SEQ.ID N°09)。特定引物Ved3R3用于 將信使RNA轉(zhuǎn)錄為單鏈DNA基體，通過一個(gè)dCTP同聚延長(5'RACE system, Life Technologies, ref: 18274-058)形成端部。該序列的擴(kuò)增作用是 通 過 弓| 物 AAPP GGCCAGGCGTCGACTA GTACGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ.ID No10)和Ved3R2的連續(xù)結(jié)合 形成預(yù)擴(kuò)增步驟，然后AAP GGCCAGGCGTCGACTAGTAC (SEQ.ID N°ll) 和Ved3Rl結(jié)合形成特定信使RNA的5'端的最終的擴(kuò)增反應(yīng)。 三種SOD變體的擴(kuò)增作用和基因修飾
從人、西紅柿和瓜中所得的不同的SOD變體的擴(kuò)增反應(yīng)是通過3種單鏈
5'擴(kuò)增引物與唯一的每種單鏈3'擴(kuò)增引物結(jié)合得到，如下所示 名稱位點(diǎn) 系列
Hum5Cyt Ncol atcggatccATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG (SEQ.ID
N°12)
Hum5Dur Ncol
atcggatccATGGCTCAACAACCACAAGATGCTGTCCAACCATTCATGGCGACGA AGGCCGTGTGCGTG (SEQ.ID N°13) Hum5Vul Ncol
atcggatccATGGCTCAACAACCATATCCACAACCACAACCATTCATGGCGACGA AGGCCGTGTGCGTG (SEQ.ID N°14)
Hum3RJW HindIII ctcgagaaqcttTTATTGGGCGATCCCAATTAC (SEQ.ID N° 15) 名稱 位點(diǎn) 系列<formula>formula see original document page 22</formula>
在Cyt表明的瓜偽胞質(zhì)形式中包含有2個(gè)額外的氨基酸，而不是起初 的65氨基酸序列，在人和西紅柿中的胞質(zhì)形式的也一樣。Dur和Vul分別 表明
DUR包含了來自小麥的胃腸道的耙向信號肽的胞質(zhì)形式， VUL包含了來自小麥的胃腸道的靶向信號肽的胞質(zhì)形式。 這些引物構(gòu)建成含有必需的合成序列使得它們能夠進(jìn)入細(xì)菌表達(dá)載 體？￡丁30&+ (獲自NOVAGEN)的5' Bamffl或Ncol sites位點(diǎn)和3' Hindlll 位點(diǎn)的狀態(tài)。這些擴(kuò)增和基因修飾的的全部過程請參考圖1中。
細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)使得克隆的cDNA作為雜交蛋白得以表達(dá)，其中SOD 或蛋白變體通過它們的N末端與His-Tag序列連接。所有的擴(kuò)增反應(yīng)是在一 個(gè)50|11體積的反應(yīng)中進(jìn)行的，其中包含25 mM TAPS (pH 9.3)， 50 mM KCI:1.5 mM MgCI2, 200 pM每種dNTP， 10 pM每種引物，10 ng質(zhì)粒DNA， 和2.0單位Goldstar DNA聚合酶(Eurogentec)。使用的各個(gè)熱循環(huán)程序在 下表中給定并且在基因擴(kuò)增PCR熱循環(huán)系統(tǒng)9700 (AppliedBiosystem)上進(jìn)行。
RT-PCR擴(kuò)增循環(huán)表
瓜3， RACE瓜葉綠體
95°C—3min95。C—- 3min
95。C，25sec95。C，40sec
55°C， 30sec57。C，40sec
72。C，40sec72。C，40sec
95。C,25sec95。C,40sec
58。C，30sec60。C,40sec
72。C,40sec72。C,50sec
瓜5， RACE瓜Pseudo-Cyt
95°C—3min95 °C— 3min
95。C,30sec95。C，40sec
55。C,30sec57。C,40sec
72。C，60sec72。C，40sec
95。C,30sec95。C，40sec
61。C，40sec60。C,40sec
72。C，50sec72。C,50sec
考慮到5'寡核苷酸引物的大小可變性，編碼人、西紅柿和瓜SOD的蛋 白變體"Cyt,Dur和Vul"的擴(kuò)增反應(yīng)都按照同樣的方案執(zhí)行。反應(yīng)首先加熱 到94'C保持5min并在下,述條件下進(jìn)行5個(gè)循環(huán)(在94"C變性0.45 min,在 56。C退火0.55 min并且在72"延伸0.55 min)，然后進(jìn)一步進(jìn)行25個(gè) 循環(huán)(在94。C變性0.45 min，在59。C退火0.55 min并且在72° C延伸 0.55 min)。前面所述的每種通過PCR擴(kuò)增得到的克隆Cu-ZnSOD CDNA的編碼區(qū) 和459bp和495bp的擴(kuò)增產(chǎn)物而后被合適的限制性內(nèi)切酶Ncol在5'端消化 并且在3'端用Hindlll消化，使得它們形成能夠引入細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng) ￡丁303+ (available from NOVAGEN)的狀態(tài)。
三種克隆中的每1種(人，西紅柿和瓜)的核苷酸序列被確定并且發(fā)
現(xiàn)與先前獲得的序列是相同的，如下所示
用于葉綠體或過氧化物酶體的CuZn-SOD形式(SEQ.IDN。24):
CATGTGGTGT TGTCGGTCTG ACTCCTGTGT GAC7Y7C4(7
用于瓜偽胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ,IDN。25):。26):
帶有小麥肽的用于瓜偽胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ.IDN°27):
用于西紅柿胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ.ID N。28):帶有小麥肽的用于西紅柿胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ.ID N。29):
帶有小麥肽的用于西紅柿胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ.IDN。30):用于人胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ.ID N。31):
GC4 C7T G4G C4C C4C C4C C4C
帶有小麥肽的人胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQJD N22):
帶有小麥肽的Cu-ZnSOD形式(SEQ.ID N。33):C4C C4C C4C C4C
用計(jì)算機(jī)軟件對核苷酸序列進(jìn)行分析確定ORFs并與己知的植物超氧 化物歧化酶進(jìn)行序列比較可以確定與所需序列一致的肽序列也可以獲得 前面描述的通過基因修飾獲得的變體的肽序列。 用于瓜葉綠體CuZn-SOD形式(SEQ.ID N。34):
MQAVLAAMAA QSLLSVSLSN YIALPPFSNS SSSLSLTSSF HGASLKLPRH SLSLAASVAPKPLAVVAASK KAVAVLKGTS DVEGVVTLTQ EDDGPTSVNV RITGLTPGPH GFHLHEFGDT TNGCISTGAH FNPNKLTHGA PEDEIRHAGD LGMIANADG VAEATIVDNQ IPLSGPNSVV GRAFVVHELA DDLGKGGHEL SLTTGNAGGR LACGVVGLTP V*
用于瓜偽胞質(zhì)CuZnSOD形式(SEQ,IDN。35):
MVKAVAVLKG TSDVEGVVTL TQEDDGPTSV NVRITGLTPG PHGFHLHEFG DTTNGCISTG AHFNPNKLTH GAPEDEIRHA GDLGNIIANA DGVAEATIVD
用于瓜偽胞質(zhì)CuZnSOD形式+小麥肽(SEQ.IDN。36): QQPQDAVQPF MVKAVAVLKG TSDVEGVVTL TQEDDGPTSV NVRITGLTPG PHGFHLHEFG DTTNGCISTG AHFNPNKLTH GAPEDEIRHA GDLGNIIANA DGVAEATIVD輝PLSGPNS WGRAFVVHE LADDLGKGGH ELSLTTGNAG GRLACGVVGL TPV*
用于瓜偽胞質(zhì)CuZnSOD形式+小麥肽(SEQ.ID N。37):QQPYPQPQPF MVKAVAVLKG TSDVEGVVTL TQEDDGPTSV NVRITGLTPG PHGFHLHEFG DTTNGCISTG AHFNPNKLTH GAPEDEIRHA GDLGNIIANA
GRLACGVVGL TPV*
用于西紅柿胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ.ID N°38):
DTTNGCMSTG PHYNPAGKEH GAPEDEVRHA GDLGNITVGE DGTASFTITD KQIPLTGPQS IIGRAVVVHA DPDDLGKGGH ELSKSTGNAG GRIACGIIGL QG*
帶有小麥肽的西紅柿胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ,IDN。39):
LHGFHVHALG DTTNGCMSTG PHYNPAGKEH GAPEDEVRHA GDLGNITVGE DGTASFTITD KQIPLTGPQS IIGRAVVVHA DPDDLGKGGH ELSKSTGNAG GRIACGIIGL QG*
帶有小麥肽的西紅柿胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ.IDN。40): QQPYPQPQPF MVKAVAVLNS SEGVSGTILF TQDGDAPTTV NGNISGLKPG LHGFHVHALG DTTNGCMSTG PHYNPAGKEH GAPEDEVRHA GDLGNITVGE DGTASFTITD KQIPLTGPQS IIGRAVVVHA DPDDLGKGGH ELSKSTGNAG GRIACGIIGL (^G*
用于人的胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ.ID N°41):
MATKAVCVLK GDGPVQGIIN FEQKESNGPV KVWGSIKGLT EGLHGFHVHE
帶有小麥肽的人胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ,IDN。42): QQPQDAVQPF MATKAVCVLK GDGPVQGIIN FEQKESNGPV KVWGSIKGLT EGLHGFHVHE FGDNTAGCTS AGPHFNPLSR KHGGPKDEER HVGDLGNVTA DKDGVADVSI EDSVISLSGD HCIIGRTLW HEKADDLGKG GNEESTKTGN AGSRLACGVI GIAQ
帶有小麥肽的人胞質(zhì)Cu-ZnSOD形式(SEQ.IDN。43):
QQPYPQPQPF MATKAVCVLK GDGPVQGIIN FEQKESNGPV KVWGSIKGLT
EGLHGFHVHE FGDNTAGCTS AGPHFNPLSR KHGGPKDEER HVGDLGNVTA
AGSRLACGVI GIAQ細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)pET30a，可以表達(dá)作為雜交蛋白的克隆的CDNA，在 Rosetta (DE3) pLysS菌株(Novagen)中表達(dá)之后，在其中SOD與可分幵的 N末端His-Tag序列(His-Tag)融合。
從每種Cu-ZnSOD變體形式中選出并獲得的重組克隆，懸浮于1升的 富培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/1,酵母提取物5g/l,NaC15g/l)中，其中添加了合適 的抗生素(30 |ig/ml的氯霉素和/或34 pg/ml卡那霉素)，直到OD600nm 升值到0.6 ，然后在37 C溫育至少3小時(shí)，此時(shí)加入 IPTG(Isopropylthiogalactopyrannoside)， 一個(gè)控制蛋白表達(dá)的乳酸啟動(dòng)子誘 導(dǎo)物加入其中以獲得i mM的終濃度并溫育4一6小時(shí)以上。
分別準(zhǔn)備2種細(xì)菌顆粒懸浮于(1) 50 ml冷凍的PBS緩沖液中，或(2) 50 ml裝載緩沖液(由Novagen獲得)，并換到超聲波降解緩沖液(Tris.HCl pH7.4 10mM, EDTA lmM, NaCl 150mM)中在4"C下進(jìn)行4個(gè)連續(xù)的30 sec 的循環(huán)(Vibracell 40W-20KHz)。通過用13000g離心20分鐘分離胃腸道細(xì) 胞胞質(zhì)蛋白提取物。
從粗蛋白提取物出發(fā)，多種His-Tag SOD融合蛋白在His-Bind快速萃 取柱中分離(available under ref 70155,獲自NOVAGEN)。雜合蛋白經(jīng)過 重組腸激酶(ref 69066， NOVAGEN)的水解之后，多種SOD及其特異性變體 然后通過一個(gè)新的His-Bind快速萃取柱的純化步驟純化。 實(shí)施例5
瓜抗-recSOD抗體
已經(jīng)獲得的重組瓜SODs的氨基酸序列與其它的植物SODs用Swiss Plot alignement進(jìn)行分析比較，并選取2個(gè)肽序列14-27 (EP1668-GVVTLTQEDDGPTS, SEQ.ID N°44) 和 117-131 (EP1669-HELADDLGKGGHELS, SEQ.ID N。 45)用于兔免疫反應(yīng)以獲得 瓜特異性多克隆抗體(Eurogentec, Belgium)?？贵wEP1669通過免疫吸附在親和柱上被純化，將其1/2000用于western雜交分析以驗(yàn)證抗體的特異性 為瓜重組SODs產(chǎn)物。
為了SDS-PAGE分析，蛋白提取物在95"C加熱5分鐘，然后在12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離開的蛋白轉(zhuǎn)到免疫-雜交膜(BIORAD)上。 抗體的任何潛在的交叉特異性用amplified-Opti4CN羊抗兔檢測試劑盒 (BIORAD)顯示。
通過完整的重組瓜SOD獲得的抗體EP1669與完整的重組瓜SOD顯示 了很好的特異性。而且，它與重組人和西紅柿SOD的交叉特異性和與天然 的牛SOD或人SOD的交叉特異性一樣。由此可知此抗體可作為一個(gè)有用的 檢測工具，用在驗(yàn)證本發(fā)明的重組SOD的藥物活性的必需的實(shí)驗(yàn)中。 實(shí)施例6 抗自由基活性
對瓜偽胞質(zhì)Cu-ZnSOD和人或西紅柿胞質(zhì)Cu-ZnSOD及其連接兩個(gè)不 同麥醇溶多肽的等同物進(jìn)行抗自由基活性分析，并根據(jù)NATIVE-PAGE電 泳(Beauchamps and Fridovitch， 1971)上的NBT光還原作用來驗(yàn)證。 實(shí)施例7 細(xì)胞耙向
為了驗(yàn)證所用的麥醇溶肽作為靶向載體是能夠如前面顯示不但能夠 與HLA-DQ2相互作用然后進(jìn)入人腸道細(xì)胞，而且以物理的或化學(xué)的結(jié)合 方式與蛋白結(jié)合便于陪伴蛋白靶向定位，人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29 (ATCC HTB-38)和Caco-2 (ATCC HTB-37)在含有10 %胎牛血清(FBS)的 Dulbecco，s modified Eagle's的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29 (ATCC HTB-38)和Caco-2 (ATCC HTB-37),培養(yǎng)基中添加了鈉鹽，谷氮酸，非必 需氨基酸和青霉素/鏈霉素。在一些例子中，細(xì)胞須與100 IU/ml的 IFN-y (R&D Systems)—起孵育48小時(shí)以誘導(dǎo)HLAClass II的表達(dá)。麥醇溶肽呈遞試驗(yàn)和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)
約2xl()S個(gè)細(xì)胞與lmg/ml重組SOD在37"C孵育1一20小時(shí)。試驗(yàn)的 SOD混合物用0.2 pm的微孔濾膜除菌。細(xì)胞通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)被收獲并 分析通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)收獲的細(xì)胞用于HLA class II表達(dá)，先使用L243 mAb (anti-HLADR, ATCC HB-55)，再使用異硫氰酸熒光素共軛的羊抗鼠 IgG (ICN-Cappel)。
為了檢測細(xì)胞表面的SOD混合物，細(xì)胞與EP-1669或EP-1668抗體孵 育并用FITC-共軛的羊抗兔IgG顯示。孵育是在4 C下保持60min，之后用 含有IOXFBS和0.1M的疊氮化鈉的PBS緩沖液清洗3次。然后在FAC掃描 流動(dòng)細(xì)胞儀(Becton Dickinson)上分析細(xì)胞。 實(shí)施例8
膜聯(lián)蛋白V陽性細(xì)胞檢測
在這部分陳述的所有的試驗(yàn)曝光時(shí)間都為48小時(shí)。凋亡粘附細(xì)胞的 檢測通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行，利用熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V 結(jié)合到PS(Martinetal., 1995)。孵育階段之后，單層細(xì)胞用含有胰蛋白酶 和EDTA的PBS容易進(jìn)行分離，在無鈣和無鎂的磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 中洗漆，通過離心獲得1><106個(gè)細(xì)胞用于評估粘附細(xì)胞的凋亡。膜聯(lián)蛋白 V-FITC陽性細(xì)胞的評估通過凋亡預(yù)報(bào)膜聯(lián)蛋白V凋亡試劑盒(Clontech Laboratories, Palo Alto， CA， USA)進(jìn)行。細(xì)胞重懸于200 jil結(jié)合緩沖液 中，在黑暗中與膜聯(lián)蛋白V-FITC (終濃度0.5 pg/ml)和0.5 pg/ml的碘化 丙錠孵育15min以排除壞死的細(xì)胞。兩種顏色的細(xì)胞計(jì)數(shù)(熒光激活的細(xì) 胞分選(FACS))分析通過488nm氬一離子激光在Coulter Epics Elite ESP 細(xì)胞分選儀(Miami, FL)上分析兩種顏色的細(xì)胞計(jì)數(shù)(熒光激活的細(xì)胞分 選(FACS) (Koopman et al,, 1994)) 實(shí)施例9如上描述的處理過的細(xì)胞的第二部分用于制備不同細(xì)胞部分的蛋白
提取物，如細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，用EP1669和EP-1668抗體進(jìn)行Western blot
分析進(jìn)行檢測，以顯示它們已經(jīng)依靠靶信號肽轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)入上述的
細(xì)胞部分中。
實(shí)施例10
SOD組份在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出不同的氧化還原態(tài)
控制并經(jīng)過處理的細(xì)胞(5xl()S)被收獲并在495 W的Hanks，平衡鹽 溶液(pH7.4)中與hydroetidine(HE;分子探針)、二氫羅丹明123(DHR 123; 分子探針)或5-氯甲基-2，,7，-二氯一二氫熒光二乙酸酯(CM-H2DCFDA,分 子探針)孵育以分別檢測超氧化陰離子，過氧化氫和GSH。在37'C保溫15 min之后，樣品在前面描述過的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行分析。 實(shí)施例11 細(xì)胞活性
一直以來認(rèn)為SOD因?yàn)槠涓叻肿恿坎荒芡高^細(xì)胞膜，只有少數(shù)的嘗 試表明在加入外源的CuZn SOD24小時(shí)之后，大量的無載體的CuZn SOD 能夠透過細(xì)胞膜(Edeas MA, et al. Cell Mol Biol. 1996 vol 42 p 1137)。 除此之外，為了使SOD酶更有效地解除從胞外加入胞內(nèi)的RQS的毒性， 細(xì)胞會產(chǎn)生可滲透性的重組SOD蛋白。人CuZn-超氧化物歧化酶 (CuZn-SOD)基因與一個(gè)基因片段進(jìn)行融合，該基因片段可以編碼HIV-1 的9個(gè)氨基酸的Tat蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域(RKKRRQRRR)。當(dāng)外源性地加入生 長培養(yǎng)基中，Tat-SOD融合蛋白進(jìn)入Hda細(xì)胞中的速度與時(shí)間(lO to 60 min)和劑量(0.2 to 2 ^M)有關(guān)。 一旦進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)入的Tat-SOD蛋白表現(xiàn) 出酶活性并穩(wěn)定24h。轉(zhuǎn)入的Tat-SOD增加了用除草劑(一種胞內(nèi)超氧化 陰離子生成劑)處理過的Hela細(xì)胞的生存能力(Kwon HY et al. FEBS Lett. 2000 vol 485 p 163)。然而，在本例中，HIV-lTat轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白明顯地降低了多種細(xì)胞類型的MnSOD的表達(dá)。(Marecki JC, et al. 2004 Free Radic Biol Med vol 37 p 869/ Porntadavity S et al. DNA cell Biol, 2005 vol 24 p 299) 當(dāng)人CuZn-超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)與一個(gè)編碼9個(gè)氨基酸序列富 含賴氨酸的肽(KKKKKKKKK)的基因片段進(jìn)行融合時(shí)，9Lys-SOD的轉(zhuǎn)導(dǎo) 效率比Tat-SOD更有效(Park J, et al. Mol Cells. 2002 vol 13 p 202)。
現(xiàn)在認(rèn)識到，從多種麥醇溶鏈衍生的水解肽能夠?qū)δc道細(xì)胞產(chǎn)生重要 的修飾作用和/或改變作用依照a)它們相對的消化力(蛋白水解抗性)，b) 它們相對的大小或序列(脯氨酸富集區(qū))，c)它們在細(xì)胞中相對濃度(聚 集或凋亡)，d)它們被HLA class II分子(HLA DQ2 or DR3)相對的識別 作用，e)它們相對的粘連蛋白誘導(dǎo)的潛在能力。
不僅僅只有一種特異性麥醇溶蛋白-衍生肽(19-20氨基酸殘基 -LGQQQQPFPPQQPYPQPQPF-)遇到HLADR3分子時(shí)可以有效地結(jié)合到 HLADQ2分子(Shidrawi.RG et al. 1998, Clin Exp Immunol vol 11, pl58)。 許多其它的分離自麥醇溶鏈的肽針對HLADQ2或DR3具有相似的能力 (Qiao.SW et al. 2004， J. Immunol vol 173 p 1757)但是關(guān)于麥醇溶蛋白與正 常的class IIHLA的相互作用還知之甚少。
首先在鼠腸上皮細(xì)胞IEC-6上實(shí)施麥醇溶蛋白克服腸道障礙的早期 步驟。IEC-6細(xì)胞與麥醇溶蛋白孵育導(dǎo)致腸道細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲的重聚，在 麥醇溶蛋白孵育15分鐘就可以看見，在60分鐘達(dá)到峰值并在2.5小時(shí)之 后恢復(fù)基線值。
在+4"不能抑制麥醇溶蛋白誘導(dǎo)的F-肌動(dòng)蛋白的改變，這排除了肌 動(dòng)蛋白聚合與麥醇溶蛋白內(nèi)吞作用之間相關(guān)的可能性(Kwiatkowska K, et al. Bioassays 1999, vol 21 p 422)。
麥醇溶蛋白可能利用另外的途徑誘導(dǎo)zonulin從腸道細(xì)胞中釋放。 Zonulin的生成依賴麥醇溶蛋白的濃度并當(dāng)細(xì)胞在至少0.1 mg/ml的麥醇溶蛋白加速孵育15分鐘之時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液中可以檢測到，在30分鐘 達(dá)到峰值，60分鐘之后返回基線。麥醇溶蛋白加入兔腸道粘膜細(xì)胞在
Ussing腔增加導(dǎo)致在Rt (抵抗力)的減弱，其在孵育30分鐘之后變得很 明顯。其它的作者已經(jīng)推測麥醇溶蛋白的肽衍生物是zonulin釋放的有效 的誘導(dǎo)劑并導(dǎo)致腸內(nèi)滲透力的增加(Clemente MG., et al. Gut. 2003 vol 52 p 218)。
后來證明麥醇溶蛋白與腸上皮細(xì)胞的相互作用通過zonulin的釋放增 加腸滲透作用，zonulin的釋放使得麥醇溶蛋白側(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移并隨后在腸粘 膜下層中與巨噬細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致促炎反應(yīng)和自由基的產(chǎn)生(Thomas KE et al. 2006, J Immunol vol 176 p 2512)。
上述的重組瓜CuZn超氧化物歧化酶基因與編碼10個(gè)氨基酸肽的A-麥醇溶蛋白(QQPYPQPQPF, SEQ.ID N。 01，在此后指定為肽982)的基因 片段融合。Gli-SOD其融合蛋白在大腸埃希氏菌中表達(dá)后純化。 從克隆培養(yǎng)細(xì)菌生產(chǎn)并純化標(biāo)記的重組甜瓜蛋白(SOD和Gli-SOD)
細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)pET30a可以將克隆的cDNA作為雜交蛋白表達(dá)，其中 重組瓜SOD或(QQPYPQPQPF-SOD)在細(xì)菌菌株Rosetta (DE3) pLysS(Novagen)中表達(dá)之后與N端可切割的His-Tag序歹U(聚合多肽-His6-腸激酶切割序列 5kDa)融合。 發(fā)酵和誘導(dǎo)方法
發(fā)酵是在37"C下進(jìn)行的，2升YES培養(yǎng)基中添加50 pg/ml的卡那霉 素和35 pg/ml的氯霉素，直到A,的光吸收值達(dá)到1個(gè)單位。然后加入 IPTG至終濃度達(dá)到0.5mM誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。經(jīng)過一個(gè)晚上的生長之后，細(xì) 胞通過離心收集并在高壓下(French Press, 2 cycles: P > 800 bars)破碎。 變性步驟
然后在容器中通過逐步加入尿素使得含有Tris20mM的緩沖液的終濃度達(dá)到8M， pH8.0進(jìn)行變性。充分溶解之后，在室溫下加入(3-巰基乙醇(終 濃度10 mM)以完全溶解蛋白。溶解的蛋白通過17000g離心15分鐘進(jìn)行 回收。 純化步驟
重組標(biāo)記蛋白通過固定離子親和吸附(用NiCl2 0.25M, Ni2+離子螯和 瓊脂糖激活)進(jìn)行親和純化分離并首先在平衡緩沖液Tris20mM,尿素8 M，(3-巰基乙醇10mMpH值為8.0中上柱。 入柱重折疊步驟
多次洗脫固定化的重組蛋白減少尿素量使部分蛋白重折疊，上柱的成 分中的尿素從8M減少到1.5M (緩沖液中含有Tris20mM, |3-巰基乙醇 10mM， PH8.0)。
恢復(fù)超氧化物歧化酶的抗氧化活性須在復(fù)原步驟中恢復(fù)其自然共聚因子， 即在含有NaAc 50mM ，尿素1.5 M, CuCl2 0.1 mM, ZnCl2 0.1 mM,p-巰基 乙醇1 OmM pH 5.0的緩沖液中不斷地添加Cu/Zn。
折疊的穩(wěn)定性在Tris 20 mM ,尿素1.5 M, CuCl2 0.1 mM, ZnCl2 0.1 mM , GSH 1 mM, GSSG 4mM, pH 8.0組成的緩沖液中，重組SOD由其胱 氨酸之間形成分子內(nèi)二硫鍵而穩(wěn)定。 洗脫步驟
洗脫從親和柱獲得的富集的標(biāo)記重組蛋白由Tris20mM,尿素1.5 M, 咪唑0.5 M pH8.0組成的緩沖液中獲得，然后在Tris 20mM, CuCl2 0.1 mM， ZnCl20.1 mMpH8.0中滲透過夜，最后通過0.22 |im的濾器過濾以避免在
消化過程中微生物的生長。用mbca方法估算上清液中的蛋白含量。
標(biāo)記切割
重組蛋白作為雜交蛋白被表達(dá)，其中SOD或Gli-SOD的N-末端與一 個(gè)含有His-Tag序列的小蛋白通過一個(gè)小的可切割的接頭融合。切割可以在室溫下2.0%的腸激酶中孵育44小時(shí)完成。 折疊的和無菌重組SOD的純化
解析后，小的標(biāo)記蛋白通過用Tris-HCl 20 mM pH 8.0的緩沖液平衡 過的MonoQ柱進(jìn)行最后的純化步驟，然后用Tris-HCl 20 mM, NaCl 0.5 M pH 8.0洗脫緩沖液洗脫之后從重組SOD中除去。
為了避免在消化過程中微生物的生長在0.22pm下進(jìn)行過濾。蛋白含量估 算通過pBCA方法評價(jià)。 通過上述純化獲得的結(jié)果在圖5中說明。 重組折疊的甜瓜SOD或Gli-SOD的抗氧化活性
甜瓜重組SOD及其帶有麥醇溶多肽的等同物(Gli-SOD)依據(jù)多步 變性/復(fù)性方式生產(chǎn)并純化。當(dāng)SDS-PAGE分析顯示重要的純化程度，折 疊方法的功效依據(jù)其抗氧化活性的恢復(fù)來評價(jià)。兩種重組蛋白(甜瓜SOD 和Gli-SOD)的潛在能力依據(jù)在NATIVE-PAGE電泳(NBTphotoreduction, Beauchamps and Fridovitch, 1971)上減少NBT來評估并與來自天然甜瓜提 取物的蛋白進(jìn)行比較。在Native-PAGE電泳上的遷移和NBT的減少證明 了 SOD或Gli-SOD(4 000 - 10 000UNBT/mg protein)兩種重組蛋白的正 確并有效的折疊，這是一個(gè)顯示它們抗氧化活性的重要的結(jié)果。 此結(jié)果在圖6中顯示。 瓜抗-recSOD抗體
己經(jīng)獲得的重組瓜SOD的氨基酸序列與其它植物SODs進(jìn)行相對的 序列分析，利用Swiss Plot序列對比以選擇兩個(gè)相對保守的肽序列14-27 (EP1668陽 GVVTLTQEDDGPTS) 和 117-131
(EP1669-HELADDLGKGGHELS)。為了獲得植物特異性單克隆抗體 (Eurogentec， Belgium),兩種肽被合成并與合適的載體結(jié)合用于兔免疫反 應(yīng)。抗體EP1669在親和柱上通過免疫吸附純化并且用于在1/2000進(jìn)行western blot分析以證明該抗體特異性針對天然的和瓜的重組SOD，也針 對純化的牛SOD。
為了分析SDS-PAGE，加熱蛋白到95'C并保持5分鐘，然后在12% 的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。分離的蛋白轉(zhuǎn)到免疫-雜交 PVDF膜(BIORAD)上?？贵w任何的潛在的交叉特異性用擴(kuò)增-Opti4CN羊 抗兔檢測試劑盒(BIORAD)顯示。
EP1669抗體對天然的瓜提取物中含有的2種SODs或再一次對純化 的牛SOD顯示交叉特異性。
此外，EP1669抗體對獲得該免疫反應(yīng)肽的完整的重組瓜SOD蛋白顯 示了很好的特異性。由此可以確定抗體與至少一種存在于天然提取物中的 活性SODs具有同源性，而且這種同源性(不完全同源性)可以存在于各 個(gè)物種的SOD家族之間。這個(gè)抗體是用于證實(shí)本發(fā)明的重組SOD蛋白藥 物活性必需的檢測試驗(yàn)中必須的有用的工具。 上述抗體結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果在圖7中顯示。 細(xì)胞培養(yǎng)
人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29 (ATCC HTB-38)在含有10%胎牛血清的 Dulbecco，s改進(jìn)型Eagle's培養(yǎng)基(D-MEM)中生長，其中還添加了 GlutaMAX-l， 4.5g/L D-葡萄糖，丙酮酸鈉和100 unit/ml的青霉素/鏈霉 素。每個(gè)試驗(yàn)(n=4)大約2xl04 cells/well在37。C含有5%0)2的空氣中 孵育24小時(shí)。在任一試驗(yàn)之前，用過的培養(yǎng)基都用新鮮的培養(yǎng)基替換。
在孵育階段之后，單層細(xì)胞用含有0.05%胰蛋白酶和0.5mMEDTA的 PBS溶液分離，在無鈣和無鎂的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中洗滌并通過離 心收集。然后細(xì)胞通過GUAVAPC Viacount Flex Kit細(xì)胞技術(shù)儀計(jì)數(shù)并報(bào) 告每毫升細(xì)胞數(shù)以評估細(xì)胞的擴(kuò)增。 麥醇溶肽的無毒性濃度的作用先前己經(jīng)顯示麥醇溶蛋白處理以濃度依賴性有關(guān)的方式對細(xì)胞生長
發(fā)揮多種作用。濃度在50到200 pg/ml之間可以抑制細(xì)胞的生長，而濃 度超過500 pg/ml可以嚴(yán)重的破壞細(xì)胞。現(xiàn)在知曉麥醇溶多肽發(fā)動(dòng)其作用 首先是改變?nèi)四c道細(xì)胞的氧化平衡(Dolfmi E et al. 2002, Toxicol in Vitro vol 16 p 331)。
在目前的試驗(yàn)中，培養(yǎng)物在暴露或不暴露在多種成分之后經(jīng)過72小 時(shí)的階段之后周期性地取樣以評估細(xì)胞的擴(kuò)增率和HT-29細(xì)胞的生存能 力，多種成分為(a) 10|iM的麥醇溶肽982(小麥屬vulgare, OOPYPOPOPF, SEQ. ID N。01)表現(xiàn)出少于先前誘導(dǎo)重要的腸細(xì)胞聚集(De Vicenzi.M et al. 1997 Toxicology, vol 120 p 207)或腸細(xì)胞凋亡(Giovannini et al. 2000, Toxicology, vol 145 p 63)的濃度至少100倍的濃度。
在以這樣低的濃度進(jìn)行的試驗(yàn)中，麥醇溶多肽對HT-29細(xì)胞系的增殖 起主要作用，但僅存在于培養(yǎng)的24小時(shí)內(nèi)。這種作用48小時(shí)之后會快速 完全地失效，因?yàn)樵谠擖c(diǎn)時(shí)增殖反應(yīng)返回基線水平并且看上去完全獨(dú)立于 肽的存在，這可能是由于肽的內(nèi)化了。要導(dǎo)致人腸道細(xì)胞的聚集或進(jìn)一步 的凋亡，似乎麥醇溶肽需要跨過一個(gè)濃度檻和/或在人腸道細(xì)胞培養(yǎng)上維 持有效的濃度。這一點(diǎn)通過試驗(yàn)驗(yàn)證了在腸道細(xì)胞暴露于高濃度的麥醇溶 肽24小時(shí)之后可以明顯的發(fā)現(xiàn)02—和H202的產(chǎn)生，同時(shí)在麥醇溶肽誘導(dǎo) 的凋亡之前就可以觀察到抗氧化酶的減少。(Giovannini.C et al. 2003, FEBS Letters vol 540 p 117)。 上面描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8中的曲線圖釋。 重組SOD的最小活性劑量
對于重組蛋白劑量-反應(yīng)試驗(yàn)，HT-29細(xì)胞與漸增的重組SOD或 Gli-SOD (0 to 50 NBT units)濃度進(jìn)行孵育維持另一個(gè)48小時(shí)。 在這個(gè)試驗(yàn)中，依據(jù)提供的較低的或較高的劑量，兩個(gè)重組蛋白SOD和Gli-SOD作用于HT-29細(xì)胞生長48小時(shí)時(shí)觀察到兩個(gè)不同但平行的現(xiàn)象。 HT-29細(xì)胞系的生長，即不會因10 units劑量的重組SOD改變而改變，也 不會因5 units劑量的重組Gli-SOD改變而改變；但是如果低于這些單位， HT-29細(xì)胞的生長速度會輕微地減緩。即使使用更高劑量的重組SOD和 Gli-SOD，誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞的生長相對水平依然相同，劑量再高也沒變 化了，因?yàn)檎T導(dǎo)的閾值可能達(dá)到了。由此可知，重組Gli-SOD的最佳的 劑量界于5到10 units,重組SOD的最佳劑量界于10到25units。 上述試驗(yàn)的結(jié)果在圖9中說明。 本發(fā)明的重組SOD校正"肽反應(yīng)"
培養(yǎng)物在暴露或不暴露于多種成分72小時(shí)之后周期性地取樣以評 價(jià)HT-29細(xì)胞的擴(kuò)增率和生存能力，多種成分包括(a) 10 units的重組 SOD或(b) 10 units重組SOD與10pM的月太982聯(lián)合，或最后(c) 10units 的重組Gli-SOD (SOD與麥醇溶肽982物理性連接)。
這個(gè)濃度的SOD或Gli-SOD都沒有毒性作用，因?yàn)閿U(kuò)增曲線嚴(yán)格與 基本曲線平行。此外，就像預(yù)期的一樣在培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)沒有"肽反應(yīng)"盡 管重組Gli-SOD的N末端部分存在肽982。由實(shí)驗(yàn)觀察到，如果麥醇溶肽 與重組SOD (Gli-SOD)聯(lián)合或偶聯(lián)，培養(yǎng)24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)以前的麥醇溶 肽作用于HT-29細(xì)胞的增殖的反應(yīng)不存在，這樣反過來抵消了被麥醇溶肽 引起的自由基產(chǎn)生的瞬時(shí)增長和/或抗氧化酶的損傷(Rivabene R et al. 1999, Biochem Biophys Acat vol 1453 p 152)。這種令人驚訝的協(xié)同作用在 治療和包含功能性連接的治療成份中是非常有用的，無論麥醇溶肽和 SOD的連接是物理的還是化學(xué)的；即使有意使用炎癥反應(yīng)多肽劑型，預(yù) 期的炎癥反應(yīng)也能減輕甚至消除。 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖10中可以方便地(簡便的)概括。 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡有兩種基本的途徑。第一種途徑，死亡配體激活其受體
(Fas/FasLigand)，然后形成死亡復(fù)合物，隨后激活caspase 8)。第二種途 徑，細(xì)胞脅迫導(dǎo)致線粒體功能紊亂伴隨細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中，隨后 其與凋亡蛋白因子-l和caspase 9形成一個(gè)激活反應(yīng)復(fù)合物。兩個(gè)復(fù)合物 反過來激活下游因子caspase3， 6和7，由它們執(zhí)行最終的凋亡轉(zhuǎn)變。
而從小麥麥醇溶蛋白消化得到的肽通過CD95/Fas凋亡途徑誘導(dǎo)腸內(nèi) 皮細(xì)胞的凋亡是己知的(Giovannini C et al. 2003, FEBS Lett. Vol 540 p 117)， ROS (自由氧基)的產(chǎn)生是通過黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶的混合激活 caspase-3與細(xì)胞色素C并釋放到胞質(zhì)中共同作用產(chǎn)生ROS (自由氧 基)(Higuchi M et al. 1998, oncogene vol 17 p 2753)。
作為神經(jīng)肽的第一特征，不僅orexins而且其受體都可在一些外周組 織中表達(dá)(Voisin T et al. 2003， Cell Mol Life Sci vol 60 p 72)，包括胃腸道 (Voisin T et al. 2000, J Pharmacol Exp Ther vol 292 p 638)。 Orexins具有完全 抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞生長的能力，機(jī)理是從線粒體中釋放細(xì)胞色素C 并激活caspase促進(jìn)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡24小時(shí)之后而(Rouet-Benzineb P et al. 2004, J Biol Chem vol 279 p46875)。
依據(jù)本發(fā)明的重組SOD和GIi-SOD的預(yù)期的特定活性以抗細(xì)胞脅迫 和線粒體損傷，在可誘導(dǎo)系統(tǒng)中進(jìn)行試驗(yàn)以驗(yàn)證它們潛在的抗凋亡功效。 重組SOD或Gli-SOD的使用濃度依據(jù)增值曲線而設(shè)定。
只有10單位的重組SOD或Gli-SOD似乎只有10單位的重組SOD 或Gli-SOD可以充分去抵消基本的凋亡過程，而50單位的重組SOD或 Gli-SOD似乎更適合于orexin或黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(X/XO)-誘導(dǎo)的 HT-29細(xì)胞的凋亡。 重組SOD抑制orexin誘導(dǎo)的凋亡
HT-29細(xì)胞系的凋亡通過GUAVA Nexin Kit進(jìn)行分析，其可以利用GUAVANexinKit分析區(qū)別HT-29的凋亡和非凋亡的細(xì)胞。該方法利用膜 聯(lián)蛋白V藻紅蛋白來檢測凋亡細(xì)胞膜外表面的phopshatidylserine(磷脂酰 絲氨酸)(PS) (Martin et al. 1995, J Exp Med vol 182 p 1545)
24小時(shí)后，用含有0.05%的胰蛋白酶和0.5mMd EDTA的PBS溶液 分離單層細(xì)胞，然后用無鈣和無鎂的磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行洗滌并染色，隨 后用GUAVAPCA系統(tǒng)進(jìn)行分析。
對于基礎(chǔ)的凋亡抑制(部分A)，生長培養(yǎng)基用含有或不含有兩種重 組SOD (NBT單位)的新鮮培養(yǎng)基替換。對于Orexin誘導(dǎo)的凋亡抑制(部 分B)，生長培養(yǎng)基用含有l(wèi)^M的orexin和/或50單位的每種重組 SOD(NBT單位)的新鮮生長培養(yǎng)基替換。結(jié)果用凋亡的膜聯(lián)蛋白V-PE陽 性細(xì)胞的百分率表示并且是4個(gè)點(diǎn)的平均值。
正常情況下，通過膜聯(lián)蛋白標(biāo)記的膜外PS顯示HT-29細(xì)胞的自然凋 亡發(fā)生占20%(20.5)。當(dāng)10個(gè)單位的重組瓜SOD存在于HT-29細(xì)胞的培 養(yǎng)時(shí)，這個(gè)比率降到18% (12.2%抑制)，當(dāng)10個(gè)單位的重組Gli-SOD存 在于HT-29細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)，直到最后這個(gè)比率降到16.8% (18.1%抑制)。 第二個(gè)試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了將orexin引入到HT-29細(xì)胞的生長培養(yǎng)基中誘導(dǎo) 凋亡時(shí)，重組SOD或Gli-SOD具有潛在的抗凋亡作用。在本例中，通過 在生長培養(yǎng)基中添加lpM的Orexin， HT-29細(xì)胞的凋亡率可以從20%的 基礎(chǔ)值提高到40%。當(dāng)50個(gè)單位的重組瓜SOD存在HT-29細(xì)胞的生長 中時(shí)，orexin誘導(dǎo)的凋亡率降到34.4% (26%抑制)，當(dāng)50個(gè)單位的重組 Gli-SOD存在HT-29細(xì)胞的生長中時(shí)，orexin誘導(dǎo)的凋亡率降到28.7% (54.7%抑制)。
本試驗(yàn)的結(jié)果在圖12中概括。 重組SOD抑制X/XO誘導(dǎo)的凋亡
腸內(nèi)皮細(xì)胞可能會因局部免疫和炎癥的細(xì)胞如激活的巨噬細(xì)胞(腸疾病)產(chǎn)生的氧反應(yīng)組分ROS而受損。這樣ROS可能誘導(dǎo)Fas和FasL表 達(dá)而與腸內(nèi)皮細(xì)胞凋亡偶聯(lián)(Denning TL et al. 2002, Free Radic Biol Med vol 33 p 1641)。黃嘌呤氧化酶在黃嘌呤的存在下主要產(chǎn)生02—，一種主要的 代表性的小腸中的氧自由基并且可能誘導(dǎo)膜滲透性轉(zhuǎn)變，鈣內(nèi)流，脂過氧 化反應(yīng)以及線粒體膜流動(dòng)性改變(Anup R et al. 1999; Indian J biochem Biophys vol 36 p266 and Anup R et al. 2000, Br J Surg, vol 87 p 1094》
在第三個(gè)試驗(yàn)中，由本發(fā)明中黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶在HT-29細(xì)胞生 長培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)產(chǎn)生的Fas/FasL途徑的可能性來測試重組SOD或 Gli-SOD潛在的抗凋亡作用。
本例中，在生長培養(yǎng)基中添加10mU的X/XO(黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶) 復(fù)合物會導(dǎo)致HT-29細(xì)胞凋亡比率從基礎(chǔ)水平的20%上升到30%。
在生長培養(yǎng)基中添加50單位的重組瓜SOD或者再添加50單位的重 組Gli-SOD，抑制X/XO-誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞的Fas/FasL凋亡途徑的比率 分別為71%禾B 86%。 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖13的曲線圖中被闡述。 重組Gli-SOD的結(jié)合
對于每一次試驗(yàn)(11=4)，約15x103細(xì)胞/薄層在37°C 5% C02的空氣 中孵育24小時(shí)。在每次試驗(yàn)之前，用新鮮的生長培養(yǎng)基替換原有的生長
培養(yǎng)基o
然后單層細(xì)胞在含有或不含有50單位的SOD或Gli-SOD的新鮮培 養(yǎng)基中孵育24小時(shí)，用無鈣和無鎂的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗，然 后用免疫組織化學(xué)進(jìn)行分析。Gli-SOD與HT-29細(xì)胞的結(jié)合通過EP-1669 作為第一抗體(兔IgG抗-SOD，稀釋1/2000°)保持30分鐘，然后通過第 二 FITC-偶聯(lián)的抗體保持下一個(gè)30分鐘(羊抗兔抗體，稀釋1/100)進(jìn)行分 析。選擇本方法而非流式細(xì)胞儀是因?yàn)楹笠患夹g(shù)在分析之前需要用胰蛋 白酶處理并收集細(xì)胞，這樣的處理可能會對Gli-SOD和細(xì)胞表面相互之 間的結(jié)合有消極的影響。
FITC熒光試驗(yàn)的結(jié)果可以在圖11中看到，其中可以清楚地看到細(xì)胞 附近存在兩種重組的SOD，而且，顯然Gli-SOD存在于更大的范圍。
上述試驗(yàn)已經(jīng)證明，依據(jù)本發(fā)明的N末端帶有或不帶有小麥麥醇溶 肽序列的基因工程的編碼甜瓜SOD的cDNA可以有效地在Escherichia coli中表達(dá)，并且產(chǎn)生具有抗氧化活性的活性分子。另外，已知消化的麥 醇溶肽可以單獨(dú)誘導(dǎo)細(xì)胞聚集或在一定的情況下引發(fā)細(xì)胞凋亡，發(fā)明人選 擇一個(gè)較短的麥醇溶肽以避免副作用?，F(xiàn)在可以確定本發(fā)明的SOD與選 定的麥醇溶肽的物理性的結(jié)合或僅僅是連接起來就可以抵消麥醇溶肽可 能導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。
權(quán)利要求
1. 一種適合藥物給藥的藥物組份，包含由至少一種超氧化物歧化酶和至少一種基于谷醇溶蛋白的肽片段的功能活性結(jié)合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，還包含藥物上可接受的載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種基于谷醇溶蛋 白的肽片段是麥醇溶蛋白片段或其衍生物、類似物、鹽或代謝物。
4. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的藥物組份，其中所述的基于谷醇溶蛋白 的肽片段是一種麥醇溶蛋白的非免疫原性類似物。
5. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的藥物組份，其中所述的基于谷醇溶蛋白 的肽片段是一種麥醇溶蛋白的非免疫原性類似物，對于免疫原性的基 于谷醇溶蛋白的肽片段具有競爭性抑制活性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化 酶選自由CuZn超氧化物歧化酶、Mn超氧化物歧化酶、胞外超氧化物歧 化酶、Ni超氧化物歧化酶和Fe超氧化物歧化酶組成的組中。
7. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化 物歧化酶是一種同源的超氧化物歧化酶。
8. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化 物歧化酶是一種異源的超氧化物歧化酶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化 酶是一種異源的CuZn超氧化物歧化酶。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化酶是一種雜合異源/同源超氧化物歧化酶，優(yōu)選為一種雜合的植物/人 超氧化物歧化酶。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化 酶選自由人超氧化物歧化酶、動(dòng)物超氧化物歧化酶、細(xì)菌超氧化物歧 化酶、酵母超氧化物歧化酶和植物超氧化物歧化酶組成的組中。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化 酶是一種植物超氧化物歧化酶。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化 酶是一種異源的CuZn植物超氧化物歧化酶。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化 酶是從植物中提取的。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化 酶是一種從葫蘆科植物的組中提取的、并且優(yōu)選從瓜中提取，或者從 茄科的植物中提取、優(yōu)選從西紅柿中提取。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化 酶選自由過氧化物酶體超氧化物歧化酶、葉綠體超氧化物歧化酶和胞 質(zhì)超氧化物歧化酶組成的植物超氧化物歧化酶組中。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化 酶是一種重組的超氧化物歧化酶。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化 酶是一種修飾的葉綠體或過氧化物酶體CuZn重組超氧化物歧化酶。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥物組份，其中所述的修飾的葉綠體或過氧 化物酶體超氧化物歧化酶由基因工程核苷酸序列編碼并在所述核苷 酸序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中表達(dá)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化物歧化 酶是一種重組的超氧化物歧化酶，其被以下序列編碼 一根據(jù)SEQ.ID 24至lJSEQ.ID 33中任一確定的核苷酸序列； 一在嚴(yán)格雜交條件下與SEQ.ID 24至USEQ.ID 33中任一序列雜交的核 苷酸序列；一與SEQ.ID 24歪IJSEQ.ID 33中任一序列具有70XBLAST同一性的核苷酸序列。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種基于谷醇溶蛋 白的肽片段選自由完全水解、充分水解和輕微水解的基于谷醇溶蛋白 的肽片段所組成的組中。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種基于谷醇溶蛋 白的肽片段選自由模擬胃-腸道水解過程從PTC (胰液素、胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶)水解谷醇溶蛋白獲得的片段所組成的組中。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組份，其中所述的至少一種基于谷醇溶蛋 白的肽片段水解到作為胃腸道的靶信號的程度。
24. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的藥物組份，其中所述的至少一種基于谷 醇溶蛋白的肽片段是一種麥醇溶蛋白的非免疫類似物。
25. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的藥物組份，其中所述的至少一種基于谷 醇溶蛋白的肽片段是一種麥醇溶蛋白的非免疫類似物，其具有對于免 疫原性的基于谷醇溶蛋白肽的競爭性抑制活性。
26. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的藥物組份，其中所述的至少一種基于谷 醇溶蛋白的肽片段具有Nter-QQPYPQPQPF-Cter的氨基酸序列。
27. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的藥物組份，其中所述的至少一種基于谷 醇溶蛋白的肽片段具有Nter-QQPQDAVQPF-Cter的氨基酸序列。
28. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的藥物組份，其中所述的至少一種超氧化 物歧化酶和至少一種基于谷醇溶蛋白的肽片段形成一個(gè)單一的肽，從 由SEQ.IDN。 34、 SEQ.IDN。 35、 SEQ.IDN。 36、 SEQ.IDN。 37、 SEQ.ID N。 38、 SEQ.ID N。 39、 SEQ.ID N。 40、 SEQ.ID N。 41、 SEQ.IDN。 42和SEQJDN。 43所組成的氨基酸序列組中選擇。
29. —種超氧化物歧化酶，由以下序列之一編碼 一根據(jù)SEQ.ID24到SEQ.ID33中任一確定的核苷酸序列；—在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID 24到SEQ.ID 33中任一序列雜交的核苷 酸序列；—與SEQ.ID 24至USEQ.ID 33中任一序列具有70XBLAST同一性的 核苷酸序列。
30. 具有超氧化物歧化酶活性的嵌合重組分子，包含在N末端融合一個(gè)接 頭氨基酸序列的植物超氧化物歧化酶的氨基酸序列。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的嵌合重組分子，其中所述的接頭氨基酸序列 包含甲硫氨酸和纈氨酸。
32. 根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的嵌合重組分子，其中所述的嵌合重組分 子進(jìn)一步包含一個(gè)基于谷醇溶蛋白的肽片段融合在接頭氨基酸序列 的N末端。
33. 根據(jù)權(quán)利要求30至32任一所述的嵌合重組分子，其中所述的分子從 由SEQ.IDN。 34、 SEQ.IDN。 35、 SEQ.IDN。 36、 SEQ.IDN。 37、 SEQ.ID N。 38、 SEQ.ID N。 39、 SEQ.ID N。 40、 SEQ.ID N。 41、 SEQ.IDN。 42和SEQ,IDN。 43所組成的氨基酸序列的組中選擇。
34. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的重組超氧化物歧化酶，其中所述的超氧化物 歧化酶從由SEQ.IDN。 34、 SEQ.IDN。 35、 SEQ.IDN° 36、 SEQ.ID N° 37、 SEQ.ID N° 38、 SEQ.ID N° 39、 SEQ.ID N° 40、 SEQ.ID N° 41、 SEQ.IDN° 42和SEQ.ID N° 43所組成的氨基酸序列的組中 選擇。
35. —種分離的核苷酸序列，從由SEQ.IDN。 24到SEQ.IDN° 33確認(rèn) 的核苷酸序列所組成的組中選擇。
36. 根據(jù)權(quán)利要求29—34任一所述的重組超氧化物歧化酶作為藥物的應(yīng) 用。
37. 根據(jù)權(quán)利要求29—34任一所述的重組超氧化物歧化酶作為抗細(xì)胞脅 迫的藥物的應(yīng)用。
38. 根據(jù)權(quán)利要求1一28任一所述的藥物組份或權(quán)利要求29—34任一所 述的重組超氧化物歧化酶作為治療炎癥病理藥物的應(yīng)用。
39. 相應(yīng)于選自SEQ.IDN。 44或SEQ.IDN。 45確定的序列組中的抗重組 超氧化物歧化酶的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及適合藥物給藥的藥物組份，包含至少一種超氧化物歧化酶和至少一種基于谷醇溶蛋白的肽片段。本發(fā)明還涉及某種超氧化物歧化酶和基于谷醇溶蛋白的肽片段。
文檔編號A61K39/395GK101420973SQ200680053826
公開日2009年4月29日 申請日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日
發(fā)明者阿方斯·謝倫德 申請人:埃索謝爾制藥公司