專利名稱：：一種穩(wěn)定的巴曲酶藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地涉及穩(wěn)定的巴曲酶水溶液。技術(shù)背景巴曲酶(Batroxobin)是一種從巴西矛頭蛇(SoWi^os毒液中分離純化出來的蛋白分子，可以作為一種止血藥的主要成分，大劑量使用時還具有降纖作用。上世紀六七十年代，瑞士素高(SolcoBasleLtd.)公司將含有該成分的提取物制成藥物，并上市銷售，商品名為Reptilase,該藥物在中國也已經(jīng)用于臨床實踐十多年了(商品名立止血@)。中國專利申請(申請?zhí)?31160549)公開了一種基因重組方法，在甲醇酵母(Pichiapastoris)中分泌表達重組巴曲酶(RecombinantBat皿obin)蛋白。目前生物提取的含該成分的藥物都采用凍干粉針劑型，臨床使用時再用少量注射用水溶解。但是，凍干粉針劑的生產(chǎn)成本高，而且臨床使用不便。生物提取巴曲酶，或通過基因重組方法獲得的重組巴曲酶，若制成水針劑，又都極其不穩(wěn)定。人血白蛋白是目前國內(nèi)外制劑中的常用成分，但是使用人血白蛋白作為保護劑時，增加了引入外源性病毒的潛在危險，并且增加生產(chǎn)成本。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種巴曲酶組合物，所述的組合物水溶液狀態(tài)下也很穩(wěn)定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供穩(wěn)定的巴曲酶組合物。本發(fā)明的另一個目的是提供上述穩(wěn)定的巴曲酶組合物的制備方法。本發(fā)明的再一個目的是提供上述穩(wěn)定的巴曲酶組合物的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種含巴曲酶的組合物，它包括活性濃度從lKU/ml到2000KU/ml的巴曲酶，并且含有水解明膠作為穩(wěn)定劑。更佳地，所述的組合物具有以下穩(wěn)定性所述的組合物被配制(如稀釋)成或復溶成lKU/ml巴曲酶水溶液后，在37'C下放置20天，含量保持不變。在另一優(yōu)選例中，所述組合物中巴曲酶的活性濃度為l一400KU/ml。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為液體形式。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為注射劑，并且具有以下穩(wěn)定性配制(如稀釋)成lKU/ml巴曲酶水溶液后，在37'C下放置20天，100ul所述的水溶液可以使100ul經(jīng)抗凝處理的人標準血漿能在60土20秒內(nèi)凝固。在另一優(yōu)選例中，所述的抗凝處理是加入抗凝劑，如肝素、水蛭素等。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為固體形式。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為凍干粉劑、噴霧干燥粉劑，并且具有以下穩(wěn)定性當所述凍干粉劑、噴霧干燥粉劑復溶形成巴曲酶lKU/ml水溶液后，在37。C下放置20天，100ul所述的水溶液可以使100ul經(jīng)抗凝處理的人標準血漿能在60土20秒內(nèi)凝固。在另一優(yōu)選例中，所述組合物中水解明膠的含量為O.l—5重量份，而所述組合物的干重為100重量份。更佳地，水解明膠的含量為0.5—3重量份。在另一優(yōu)選例中，所述組合物還含有選自下組的輔助性穩(wěn)定劑L一谷胱甘肽、甘氨酸、和/或海藻糖，所述的輔助性穩(wěn)定劑的含量為1X10—4—2重量份L一谷胱甘肽、0.02—0.l重量份甘氨酸、禾卩/或0.02—0.l重量份海藻糖。在另一優(yōu)選例中，所述的輔助性穩(wěn)定劑的含量為1X10—3—0.1重量份L一谷胱甘肽、0.03—0.07重量份甘氨酸、和/或0.03—0.07重量份海藻糖。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物被配制(如稀釋)成或復溶成水溶液后，PH為6.0±1.5。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有緩沖劑，等滲等張調(diào)節(jié)劑，和抑菌劑。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物中包括1—8重量份磷酸鈉鹽，7—9X10—3重量份氯化鈉，0.l—5重量份水解明膠，和l一5重量份三氯叔丁醇。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括2—5重量份磷酸鈉鹽，7.5—8.8X10—3重量份氯化鈉，IX10—3—0.1重量份L一谷胱甘肽，0.5—3重量份水解明膠，和2—4重量份三氯叔丁醇。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括l一8重量份磷酸鈉鹽，7.5—8.8X10—3重量份氯化鈉，1X10—4—2重量份L一谷胱甘肽0.1—5重量份水解明膠，l一.5重量份三氯叔丁醇，和0.02—0.1重量份甘氨酸，和/或0.02—0.1重量份海藻糖。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括2—5重量份磷酸鈉鹽，0.75—0.88重量份氯化鈉，1X1(T3—0.1重量份L一谷胱甘肽0.5—3重量份水解明膠，2—4重量份三氯叔丁醇，和0.03—0.07重量份甘氨酸，和/或0.03—0.07重量份海藻糖。在本發(fā)明的第二方面，提供了上述組合物的制備方法，它包括步驟將巴曲酶和作為穩(wěn)定劑水解明膠混合，從而上述的組合物。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種上述組合物的用途，所述的組合物用于制備止血的藥物。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種巴曲酶組合物，所述的組合物水溶液狀態(tài)下也很穩(wěn)定。具體實施方式發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)巴曲酶與一定量的水解明膠混合成的組合物，在液體狀態(tài)下能保持巴曲酶的生物學活性。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在所述的溶液中加入一些對重組巴曲酶生物學活性起保護作用、且不與重組巴曲酶藥理作用產(chǎn)生拮抗的緩沖鹽、抗氧化劑、等滲等張調(diào)節(jié)劑和抑菌劑等，巴曲酶的穩(wěn)定性能更佳。由此制得的組合物可以作為肌肉、靜脈注射以及外用噴霧用物質(zhì)。如本文所用，巴曲酶可是本領(lǐng)域熟知的提取物或基因重組蛋白，優(yōu)選基因重組巴曲酶。如本文所用，1KU是取0.lml的人標準血漿于標準血凝儀(C2000-4血凝儀，北京普利生儀器有限公司)檢測杯中，37。C預溫3分鐘，加入經(jīng)適量稀釋的待測定的巴曲酶溶液O.lml，計時，如果血漿在60士20秒凝固，則每lml該待測溶液中就含一個克氏單位(KU)的巴曲酶。如本文所用，"重量份"或"重量份數(shù)"可互換使用，所述的重量份可以是任何一個固定的以毫克、克數(shù)或千克數(shù)表示重量(如lmg、lg、2g、5g、或1kg等)。例如，一個由l重量份組分a和9重量份組分b構(gòu)成的組合物，可以是1克組分a+9克組分b，也可以是10克組分a+90克組分b等構(gòu)成的組合物。在所述組合物，某一組分的百分比含量=(該組分的重量份數(shù)/所有組分的重量份數(shù)之和)X100%。因此，由1重量份組分a和9重量份組分b構(gòu)成的組合物中，組分3的含量為10%，組分b為90。/。。如本文所用，本發(fā)明的組合物被配制成lKU/ml巴曲酶水溶液，是指①若本發(fā)明的組合物為lKU/ml巴曲酶水溶液，直接使用；②若本發(fā)明的組合物為〉lKU/ml巴曲酶水溶液，則用水對其進行稀釋，使成為lKU/ml巴曲酶水溶液；③若本發(fā)明的組合物為固態(tài)形式(如凍干粉劑或噴霧干燥粉劑)，則用水復溶，使其成為lKU/ml巴曲酶水溶液。如本文所用，輔助性穩(wěn)定劑是指除水解明膠以外的其它穩(wěn)定劑，它可以是本領(lǐng)域常用的穩(wěn)定保護劑，例如但不限于，甘氨酸、海藻糖、乳糖、蔗糖、和/或麥芽糖。也可以是本領(lǐng)域常用的抗氧化抗聚集劑，例如但不限于谷胱甘肽(GSH)、維生素C、乙二氨四乙酸二鈉鹽(EDTA-Na2)、聚山梨醇酯(如，Tween-20、Tween-80)等。本發(fā)明的組合物中的輔助性穩(wěn)定劑優(yōu)選L一谷胱甘肽、、甘氨酸、禾B/或海藻糖。其中可以含有1X10—J—2重量份L一谷胱甘肽，較佳地為1X10—3—0.1重量份；可以含有0.02—0.1重量份甘氨酸，較佳地為0.03—0.07重量份；可以含有0.02—0.1重量份海藻糖，較佳地為0.03—0.07重量份。水解明膠是本發(fā)明組合物中的必要物質(zhì)，其含量為0.l—5重量份，較佳地為O.5—3重量份，更佳地為1一2重量份。本發(fā)明提供的組合物，當水溶液中巴曲酶規(guī)格為lKU/ml時，37'C下放置20天，經(jīng)抗凝處理的人標準血漿能在60士20秒內(nèi)凝固。較佳地，放置30天，經(jīng)抗凝處理的人標準血漿能在60士20秒內(nèi)凝固。更佳地，放置40天，經(jīng)抗凝處理的人標準血漿能在60土20秒內(nèi)凝固。本發(fā)明提供的組合物中還包括緩沖體系，所述的緩沖體系選自但不限于醋酸一醋酸鹽緩沖對、磷酸一磷酸鹽緩沖對、或Tris—鹽酸緩沖對，優(yōu)選磷酸一磷酸鹽緩沖對。本發(fā)明提供的組合物中包括l一8重量份磷酸鹽，較佳地是2—5重量份。本發(fā)明的組合物所形成的溶液pH為6.0±1.5，較佳地pH為6.O土l.O，更佳地pH為6.0±0.5。本發(fā)明提供的組合物中還可以包括等滲等張調(diào)節(jié)劑、鰲合劑、表面活性劑、抑菌劑等?？梢允褂帽绢I(lǐng)域常規(guī)的等滲等張調(diào)節(jié)劑，例如但不限于氯化鈉(NaCl)、丙酮酸鈉(NaPyr)、葡萄糖，其中優(yōu)選氯化鈉。本發(fā)明的組合物中可以含有7一9X10—3重量份氯化鈉，較佳地為7.5—8.8X10—3重量份?？梢允褂帽绢I(lǐng)域常規(guī)的抑菌劑，例如但不限于苯甲醇、對羥基苯甲酸甲酯、對輕基苯甲酸丁酯、苯酚、三氯叔丁醇、或柳硫汞。優(yōu)選三氯叔丁醇。本發(fā)明的組合物中可以含有l(wèi)一5重量份三氯叔丁醇，較佳地為2—4重量份。本發(fā)明提供的組合物可以是固態(tài)形式也可以是液體形式。所述的固態(tài)形式為凍干粉劑、噴霧干燥粉劑。所述的液體形式是注射劑。優(yōu)選注射劑或液體噴霧劑。本發(fā)明提供的組合物為注射液時，它包括O.l—5mg/ml的水解明膠；較佳地為0.5—3mg/ml，更佳地為1—2mg/ml。本發(fā)明提供的注射液，巴曲酶規(guī)格為lKU/ml時，37。C下放置20天，經(jīng)抗凝處理的人標準血漿能在60土20秒內(nèi)凝固。較佳地，放置30天，經(jīng)抗凝處理的人標準血漿能在60土20秒內(nèi)凝固。更佳地，放置40天，經(jīng)抗凝處理的人標準血槳能在60士20秒內(nèi)凝固。本發(fā)明提供的注射液pH為6.0土1.5，較佳地pH為6.0±1.0，更佳地pH為6.0±0.5。本發(fā)明提供的注射液可含有10—50mM磷酸鹽，較佳地為15—30mM。本發(fā)明提供的注射液中還可以包括等滲等張調(diào)節(jié)劑、還原劑、鰲合劑、表面活性劑、抑菌劑等。其中等滲等張調(diào)節(jié)劑氯化鈉的含量為0.7%—0.9%(mg/100ml)，較佳地為0.75—0.88%;抗氧化抗聚集劑谷胱甘肽的含量為含有1X10—5—0.2mML—谷胱甘肽，較佳地為1X10—4—0.OlmM;抑菌劑三氯叔丁醇的含量為l一5mg/ml，較佳地為2—4mg/ral?？梢允褂帽绢I(lǐng)域常規(guī)的方法得到本發(fā)明的組合物，將巴曲酶與水解明膠混合。可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的方法獲得固態(tài)形式的本發(fā)明組合物。也可以將巴曲酶與水解明膠溶解于注射用水中得到溶液形式的本發(fā)明組合物。一種優(yōu)選的方式，是將巴曲酶、水解明膠、緩沖體系、等滲等張調(diào)節(jié)劑、還原劑、鰲合劑、表面活性劑、和抑菌劑溶解于注射用水中得到溶液形式的本發(fā)明組合物。本發(fā)明提供的組合物可用于制備止血劑。可以將液體形式的本發(fā)明組合物直接進行肌肉或靜脈注射或液體噴霧劑；也可將固態(tài)形式的本發(fā)明組合物復溶于注射用水中進行肌肉或靜脈注射或液體噴霧劑。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1、本發(fā)明提供的組合物可以使其中的巴曲酶在液體狀態(tài)下較長時間地保持生物活性。2、本發(fā)明提供的組合物中所含有的穩(wěn)定劑沒有引入外援性病毒的潛在危險。3、本發(fā)明提供的組合物制備成本低，且使用方便。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。制備實施例l一7制備巴曲酶液體制劑將構(gòu)造的巴曲酶甲醇酵母工程菌株(CCTCCNo:M203006)上罐發(fā)酵，經(jīng)過一系列層析純化步驟，獲得高純化的基因重組巴曲酶與含有下表中的各輔料組分的注射用水溶液混合，得到重組巴曲酶液體制劑。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>v代表該組配方選擇了本輔料。試驗實施例8緩沖體系篩選發(fā)明人設(shè)計了七組制劑處方，各處方中成分如下表，分別考察這七組處方在不同緩沖體系下，重組巴曲酶的生物活性以及制劑的基本性能(外觀、色澤、澄明度、pH)等情況。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>一—v代表該組配方選擇了本輔料。各組輔料的使用量是本領(lǐng)域重組蛋白質(zhì)類藥物制劑處方中通常使用的劑量如甘露醇為4%;醋酸鹽、磷酸鹽和Tris-HC1緩沖體系均為20niM;人血白蛋白為0.5%。緩沖體系篩選的結(jié)果根據(jù)動物試驗的結(jié)果，確定的制劑規(guī)格為lKU/ml/瓶。1KU的含義是取0.lml的人標準血漿于標準血凝儀(C2000-4血凝儀，北京普利生儀器有限公司)檢測杯中，37t預溫3分鐘，加入經(jīng)適量稀釋的待測定的巴曲酶溶液0.lral，計時，如果血漿在60士20秒凝固，則每lml該待測溶液中就含一個克氏單位(KU)的重組巴曲酶。下面是重組巴曲酶在上述七組處方中，存放于37'C下，經(jīng)過72小時后的結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>>196s表示超出血凝儀的最大量程仍沒有凝血發(fā)生。由于每組配方中重組巴曲酶的活性濃度均為1KU/ml，也就是說在0小時(稀釋完成時)時，將100ul含重組巴曲酶的某一配方的溶液同100ul的經(jīng)抗凝處理的人標準血漿混合，在37"C下，能在60土20秒內(nèi)凝固?？疾熘亟M巴曲酶各組配方溶液中的活性變化情況就可以初步判斷穩(wěn)定性狀況，選擇最適合的緩沖體系。上表的數(shù)據(jù)顯示，盡管初始時凝血時間都比較接近，并且都符合60±20秒范圍，但在72小時后，不加保護劑的配方l、2、4、6凝血時間都大大超出60士20秒范圍，并且1、2、4三組配方都>196(超出血凝儀的最大量程仍沒有凝血發(fā)生)。加入保護劑的三組配方中，只有配方5凝血時間超出60±20秒范圍，說明在pH7.4條件下，即使加入保護劑，重組巴曲酶也容易喪失活性。結(jié)果表明，配方3、7的溶液中重組巴曲酶的活性在72小時仍符合60±20秒范圍，但兩組相較，在加入保護劑的情況下，以磷酸鹽緩沖pH6.0為體系的配方7比以醋酸鹽緩沖pH5.0體系的配方3要穩(wěn)定。實施例9一15穩(wěn)定性測試實施例根據(jù)上述緩沖體系的篩選結(jié)果，選用pH6.0的磷酸鹽緩沖作為基本緩沖體系，同時加入各種不同的穩(wěn)定保護劑進行穩(wěn)定性考察。參見實施例l一7的配方組成實施例1實施例2實施例3實施例4實施例5實施例6實施例7磷酸鈉鹽緩沖20mMpH6.0VVVVV氯化鈉0.85%VVVVVVL一谷胱甘肽O.OOOlmMVV水解明膠lmg/mlV—一————甘氨酸5%一—一—海藻糖5%一——一—水解明膠0.lmg/ml一一一一—水解明膠2mg/ml—一一—一V甘氨酸3.4%一———一三氯叔丁醇3mg/ml一.—畫一—一—v代表該組配方選擇了本輔料。37'C穩(wěn)定性實驗結(jié)果實施例l一7的重組巴曲酶制劑規(guī)格均為lKU/ml，也就是說在各個檢測點，將100ul含重組巴曲酶的某一配方的溶液同100ul的經(jīng)抗凝處理的人標準血漿混合，在37°〇下，能在60土20秒內(nèi)凝固。超出范圍的均算不合格。在進行制劑穩(wěn)定性試驗時，將原液稀釋至活性濃度為lKU/ml進行。實施例l一7的重組巴曲酶制劑存放在37'C下，于各個檢測點的凝血時間(秒)。見下表(天)071421286090120150180實施例169.671.874.28075.175.073.876.481.782.0實施例252.0100.2實施例36792.5實施例471.199.2實施例567.770.271.873.769.467.868.768.972.473.7<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>>196s表示超出血凝儀的最大量程仍沒有凝血發(fā)生。結(jié)果表明，使用水解明膠作為保護劑，可以使重組巴曲酶顯示出較高的穩(wěn)定性，能在37。C下穩(wěn)定100天以上。實施例16穩(wěn)定性測試實施例采用實施例7中的配方，保存高濃度的重組巴曲酶原液(重組巴曲酶蛋白濃度為2.5mg/ml)。將層析純化獲得的重組巴曲酶溶液，通過G25脫鹽層析柱更換重組巴曲酶的緩沖體系，以檢驗該配方對保護重組巴曲酶原液或高濃度的重組巴曲酶效果。具體操作如下步驟1:用組成如實施例7中的各組分和含量的輔了配制的溶液平衡G25層析柱約4個柱床體積；步驟2:按1/4柱床體積的量上重組巴曲酶溶液，進行脫鹽層析處理，收集流出液的吸收峰部分，此時重組巴曲酶溶液就轉(zhuǎn)變成了平衡G25層析柱的實施例7配方形成的溶液。步驟3:測定蛋白濃度，同時測定活性，作為0時間點的重組巴曲酶溶液穩(wěn)定性試驗的初始值(1.02mg/ml,200KU/ral)。步驟4:將步驟3中獲得的重組巴曲酶溶液分裝為200ul/瓶，放置37i:。分別在如下表中所列的時間點取樣，按2000X倍稀釋后，用血凝儀測定凝血時間，以判斷重組巴曲酶的穩(wěn)定性。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從實際測定結(jié)果可以看出，配方7中的組分不僅對稀釋后重組巴曲酶穩(wěn)定性保存有利，對保存高濃度(活性)的重組巴曲酶也非常有效。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種含巴曲酶的組合物，其特征在于，它包括活性濃度從1KU/ml到2000KU/ml的巴曲酶，并且含有水解明膠作為穩(wěn)定劑。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組合物為液體形式。3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組合物為注射劑，并且具有以下穩(wěn)定性配制成lKU/ml巴曲酶水溶液后，在37'C下放置20天，100ul所述的水溶液可以使100ul經(jīng)抗凝處理的人標準血漿能在60±20秒內(nèi)凝固。4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組合物為固體形式。5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組合物為凍干粉劑、噴霧干燥粉劑，并且具有以下穩(wěn)定性當所述凍干粉劑、噴霧干燥粉劑復溶形成巴曲酶lKU/ral水溶液后，在37。C下放置20天，100ul所述的水溶液可以使100ul經(jīng)抗凝處理的人標準血漿能在60土20秒內(nèi)凝固。6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物中水解明膠的含量為O.l—5重量份，而所述組合物的干重為100重量份。7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有選自下組的輔助性穩(wěn)定劑L一谷胱甘肽、甘氨酸、和/或海藻糖，所述的輔助性穩(wěn)定劑的含量為1X10—4—2重量份L一谷胱甘肽、0.02—0.1重量份甘氨酸、和/或0.02—0.1重量份海藻糖。8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組合物被配制成或復溶成水溶液后，pH為6.0士1.5。9.一種如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征在于，它包括步驟將巴曲酶和作為穩(wěn)定劑水解明膠混合，從而形成權(quán)利要求1所述的組合物。10.—種如權(quán)利要求1所述的組合物的用途，其特征在于，所述的組合物用于制備止血的藥物。全文摘要本發(fā)明公開了一種含有巴曲酶的組合物，它包括0.1-5重量份的水解明膠。本發(fā)明公開的組合物即使以液體狀態(tài)保存也具有高度穩(wěn)定性及生物學活性。文檔編號A61P7/04GK101274096SQ20071003867公開日2008年10月1日申請日期2007年3月29日優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日發(fā)明者文張,曹之舫,潘學工,陳佩新,黃秀東申請人:上海萬興生物制藥有限公司