專利名稱：松果菊苷在制備治療帕金森病的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及松果菊苷的用途，尤其涉及在制藥領域的新用途。
背景技術：
肉灰蓉(HeraCistaneMs)是中醫(yī)補益藥物中的常用品種，屬列當科肉蓯 蓉屬植物，藥用品為其干燥帶鱗葉的肉質莖，又名大蕓、精筍、縱蓉、肉松 蓉、地精，始載于《神農本草經》，列為"上品"，具有補腎益精、潤腸通便 之功效，主治男子陽痿、女子不孕等證。
松果菊苷是從管花肉蓯蓉(Cistanche tubulosa)中分離、純化的一種化 合物。以往的研究表明松果菊苷可以提高多種中樞神經遞質的含量，具有很 強的抗氧化作用，還可延長動物壽命和抗衰老作用。目前用于治療抗衰老或 老年性癡呆。
帕金森病(PD)是中老年人神經系統(tǒng)常見疾病。其特征性病理改變是中 腦黑質多巴胺能神經元變性減少，導致紋狀體內多巴胺濃度明顯下降，目前 治療主要依賴多巴胺替代療法。盡管神經科學家采取包括左旋多巴制劑在內 的各種治療方法，但目前所有的研究都提示無法阻止多巴胺能神經元變性減 少的進展。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供松果菊苷在制備治療帕金森病的藥物中的應用。 松果菊苷是從肉蓯蓉中提取的一種化合物，其公知的化學結構式為<formula>formula see original document page 3</formula>本發(fā)明提供了松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中的應用。 上述的松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中可與矯味劑、溶劑或輔劑— 起制成口服液劑、片劑、丸劑、沖劑、膠囊劑、注射劑、滴丸劑、糖漿劑、膏劑。
由于采用了上述的技術解決方案，松果菊苷可以用來制備治療帕金森病 的藥物，給帕金森病患者的治療帶來了新的希望。
圖1松果菊苷對MPP+介導的帕金森病細胞模型的保護作用；
圖2 GADD153的mRNA在不同組別中的表達電泳圖3松果菊苷對MPP+介導的細胞損傷模型GADD153 mRNA表達的影響；
圖4 GADD153的蛋白在不同組別中的表達電泳圖5松果菊苷對MPP+介導的SH-SY5Y細胞GADD153蛋白表達的影響。
具體實施例方式
為了更好地理解本發(fā)明的實質，下面將用藥理試驗及結果來說明其在用 來制備治療帕金森病的藥物的新的用途。
松果菊苷可以采用目前公開的文獻的記載制備方法制備。如可以采用如 下方法制備
將管花肉蓯蓉(產地為新疆和田)的干燥肉質莖10kg粉碎后，用體積分 數為95%的乙醇回流提取3次，每次2h。將提取液合并，減壓濃縮至膏狀， 加少量水制成混懸液。以石油醚、乙酸乙醋、水飽和正丁醇依次分別萃取3 次，萃取液濃縮備用。取正丁醇萃取物10 g，用約2倍的水溶解之，隨后 注人D101大孔吸附樹脂柱(柱床體積約1000ml)，先以3000ml去離子水洗 脫，棄去水洗脫液，再以3倍柱床體積的體積分數為5%的甲醇水溶液洗脫， 即約3000ml，棄去。最后采用體識分數為20%的甲醇水溶液作洗脫液，以 500ml為一個餾分，用聚酞胺薄層色譜檢識，以質量分數為5%的三氯化鐵乙 醇溶液作顯色劑，收集并合并有目標點的餾分進行減壓濃縮。濃縮物經葡聚 糖凝膠LH-20柱色譜，用體積分數為10%的甲醇水溶液等度洗脫。將含有較高純度的餾分合并，減壓濃縮至干，得到2g樣品(所有減壓濃縮的水浴鍋溫
度均低于6(TC)。以HPLC測定—峰面積比ff，松果菊昔的相對含量為87%。將 上述粗品配制成0. 15kg/L的甲醇溶液，采用半制備型高效液相色譜法純化。 進樣量為120juL，收集保留時間為13.6min的組分。將其減壓濃縮(在6(TC 以下)至有少量液體時取出，冷凍干燥，最后得灰白色無定形粉末220mg， 此即為松果菊苷的標準品。松果菊苷公知的化學結構式為
1、松果菊苷對1甲基-4苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion， MPP+)介導的SH-SY5Y多巴胺能細胞系損傷的保護作用試驗
由于帕金森病的病因是多巴胺能神經元減少，SH-SY5Y多巴胺能細胞是 研究帕金森病的典型細胞模型。以往的研究表明1甲基-4苯基-批啶離子 (1-methyl-4-phenylpyridinium ion， MPP+)處理SH-SY5Y多巴胺能細胞 后使SH-SY5Y多巴胺能細胞細胞存活率隨MPP+的濃度增加而降低。本試驗以 lmM的l甲基-4苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+) 介導的損傷的SH-SY5Y多巴胺能細胞系為研究帕金森病的細胞模型。
1.1細胞培養(yǎng)及分組
SH-SY5Y細胞每2 3d用10%DMEM培養(yǎng)液換液1次。待細胞增長至80% 融合時，用0. 25%胰酶消化細胞，按1x105分瓶傳代，置于5%C02的細胞培 養(yǎng)箱中。試驗用細胞分為對照組、MPP+組和松果菊苷不同濃度組。用DMEM 培養(yǎng)液將MPP+按1: 10梯度稀釋成400mM，按1: 100體積比例加入96孔板 或6孔板中，使MPP+終濃度分別為0.25mM， 0. 5函，lmM， 2mM， 4mM。松果 菊苷用DMEM培養(yǎng)液按1: 10梯度稀釋成lmg/ml與10ug/ml兩個工作濃度。 按1: 100加入96孔板或6孔板中，使終濃度分別為l/ig/ml， lOpg/ml, 100iiig/ml。六孔板每孔總體積為2ml， 96孔板每孔總體積為200/n。每項相 同實驗均重復3次。
1. 2檢測細胞活性MTT(四氮唑藍)為荷蘭Duchefa公司產品。MPP+對SH-SY5Y細胞存活 率的影響1x104密度S—FFSY5Y細胞200ul接種于96孔板，24h后換含MPP+ 終濃度分別為0. 25mM， 0. 5mM， lraM， 2mM, 4mM的培養(yǎng)液，每濃度3復孔， 置于5%C02培養(yǎng)箱37。C孵育，分別于6h， 12h， 24h， 48h時各孔加入MTT20/xl， 繼續(xù)孵育4h取出培養(yǎng)板。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150M1，充分震蕩 10min，待藍色顆粒完全溶解后用全自動酶標儀(Biorad產品)570nm處測定 吸光度值。松果菊苷對MPP+介導的SH-SY5Y細胞損傷的影響終濃度lmM MPP+與松果菊苷分別為lMg/ml， 10Mg/ral， 100Mg/ral同時加入96孔板置 5%C02培養(yǎng)箱37。C孵育48h。余同上。
1. 3試驗結果
圖1:松果菊苷對MPP+介導的細胞損傷模型具保護作用。三種濃度的松 果菊苷處理的SH-SY5Y多巴胺能細胞存活率均比MPP+組明顯增高(P〈0. 01)
MPP+ lmM處理的SH-SY5Y多巴胺能細胞48小時存活率為45. 3±3. 21%， 1/xg/ml，而松果菊苷處理上述細胞的細胞存活率對應為85.97±3.41%， 10ptg/ml為129. 97±4. 84%, 100ptg/ml為164. 1±3. 91%。松果菊苷三種濃度與 MPP+ lmM對照處理比較，細胞存活率具有明顯差異(P〈0.01)。因此松果菊
苷不僅有較好的神經保護作用，而且還可能有促進細胞增殖作用。l蹄/ml， 10|Lig/ml， 100Mg/ml松果菊苷的SH-SY5Y多巴胺能細胞存活率均比MPP+組明 顯增高(P〈0.01)，而且細胞存活率與松果菊苷濃度呈劑量依賴關系。因此試 驗結果表明松果菊苷對MPP+介導的損傷具有顯著的保護作用。
2、 松果菊苷對介導的損傷的SH-SY5Y多巴胺能細胞的保護作用的機制
試驗
GADD153是內質網應激以及其它應激狀態(tài)的共同通路，同時又會引起細 胞凋亡的重要分子，它在帕金森病這一目前存在著多種發(fā)病機制的疾病的研 究中有著重要的地位。
2.1 RT-PCR檢測GADD153的mRNA表達
反轉錄試劑盒(RevertAidTM First Strand c薩Synthesis Kit)購自 MBI公司。
終濃度lraM MPP+與松果菊苷分別為l|Ug/ml， lO/xg/ml, lOO/^g/ml同時加入6孔板置5%C02培養(yǎng)箱37。C孵育48h。取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，按 Trizol法提取總RNA。取—>gRM7按反—轉錄試劑盒說明進行逆轉錄。聚合 酶鏈反應總體積為25ul ，引物序列為GADD153 (上引物 5'-GCACCTCCCAGAGCCCTCACTCTCC-3，和下引物5，-GTCTACTCCAAGCCTTCCCCC TGCG -3，) . /3-Actin (上引物5，- ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3，，下引物 5，-TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGGC-3，)。擴增目的產物的長度分別為422bp ， 244bp。94。C預變性5min，循環(huán)參數為95。C變性0. 5 min， 60。C退火0. 5 min, and 72 °C延伸1 min共35個循環(huán)。取PCR產物4ul，電泳后拍照。 2. 2 Western Blot檢測GADD153蛋白表達
終濃度lraM MPP+與松果菊苷分別為lMg/ml， 10nig/ml, 100Mg/nil同時 加入6孔板置5%C02培養(yǎng)箱37。C孵育48h。取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，加 入60mL蛋白裂解液裂解，超聲震蕩，IOCTC變性10min。用lowry法測定樣 品蛋白濃度。電泳積層膠60V 30min，分離膠120V 90min; PVDF膜轉膜 110V 100min。加1:50小鼠抗人GADD153單克隆抗體，4。C過夜。TBST溶液 洗滌3次，每次10min,加含服P的兔抗小鼠二抗室溫孵育2h，化學發(fā)光法 顯影X膠片。每個樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的/3-actin比較后作統(tǒng) 計學分析。
圖2:在對照組(Con)， MPP+組(M)， ljug/ml松果菊苷組(El)， 10/ig/ml 松果菊苷組(CE2)， 100/xg/ml松果菊苷組(CE3)中的GADD153的mRNA的表達。
圖3: MPP+ lraM處理SH-SY5Y細胞后GADD153 mRNA水平較對照組明顯 升高(P〈0.01)。而加入松果菊苷組的GADD153 mRNA水平較MPP+組明顯下降 (P<0. 01)。
圖4:在對照組(Con)， MPP+組(M)， lpg/ml松果菊苷組(El)， 1(^g/ml 松果菊苷組(CE2)， 100/xg/ml松果菊苷組(CE3)中的GADD153蛋白的表達。
圖5: MPP+組的GADD153蛋白的表達較對照組有顯著的增長，而不同濃 度的松果菊苷組的GADD153蛋白的表達與MPP+組相比明顯降低。(P<0. 01)
通過RT-PCR和Western-Blot，發(fā)現GADD153的表達與對照組相比也明 顯降低。其中在松果菊苷最高濃度組(100mg/L) GADD153 mRNA水平降到了最低(P<0. 01)，而Western Blot的結果也發(fā)現GADD153的蛋白表達同時將到 了最低(P<0. 01)。基于上述結果廠可以iX為松果菊苷對MPP+介導的SH-SY5Y 細胞損傷模型的保護作用可能是通過調控GADD153來實現的。
上述試驗結果表明松果菊苷對MPP+介導的細胞損傷具有顯著的保護作 用。而松果菊苷對MPP+介導的SH-SY5Y細胞損傷模型的保護作用是通過調 控GADD153來實現的。松果菊苷可以用來制備治療帕金森病的藥物。
使用方法
松果菊苷50mg/kg小鼠體重的劑量灌胃，成人體重按60kg計算，為每 日20mg 口服。 實施例
上述松果菊苷可以和藥劑學上可接受的輔劑(如果需要的話)，按照常 規(guī)制藥方法，制成口服劑和注射劑。
實施例1 制成片劑、丸劑、沖劑、糖漿劑、膏劑。
除松果菊苷外可根據需要添加矯味劑，或輔劑如增強營養(yǎng)或免疫力的維 生素、蛋白質和礦物質，或能協(xié)同作用能治療帕金森病的藥物。該片劑、丸 劑、沖劑、糖漿劑、膏劑成分包括
松果菊苷 5%-90% (重量比)
矯味劑 0.1-1% (重量比)
輔劑 適量
上述矯味劑可選自a -環(huán)糊精(a -CD)、 P -環(huán)糊精(P -CD)、 N-LOK變 性淀粉、蔗糖、木糖醇、高果糖、甜蜜素、甜菊糖和蛋白糖中的一種或多種。
輔劑可選自人體需要的維生素或氨基酸，如維生素B，維生素C，賴氨 酸，谷氨酸等。
實施例2制成膠囊劑。該膠囊劑成分包括
松果菊苷15%-30% (重量比)
矯味劑 0.5-10% (重量比)
上述矯味劑主要有羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙二醇(PEG)、丙烯 酸樹脂等。也可添加輔劑，輔劑可選自人體需要的維生素或氨基酸，如維生 素B，維生素C，賴氨酸，谷氨酸等。實施例3制成注射劑、滴丸劑。該注射劑、滴丸劑成分包括 松果菊苷 20%-30°/T(重量比)—溶劑 適量以上實施例僅供說明本發(fā)明之用，而非對本發(fā)明的限制，有關技術領域 的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以作出各種變換 或變型，因此所有等同的技術方案也應該屬于本發(fā)明的范疇，應由各權利要 求所限定。
權利要求
1、松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中的應用，其中，所述松果菊苷是從肉蓯蓉中提取的，其化學結構式為
2、如權利要求1所述的松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中可與矯味 劑、溶劑或輔劑一起制成口服液劑、片劑、丸劑、沖劑、膠囊劑、注射劑、 滴丸劑、糖漿劑、膏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及松果菊苷在制備治療帕金森病藥物中的應用。本發(fā)明公開了松果菊苷對MPP+介導的細胞損傷具有顯著的保護作用。由于松果菊苷可以用來制備治療帕金森病的藥物，給帕金森病患者的治療帶來了新的希望。
文檔編號A61P25/16GK101313912SQ200710041519
公開日2008年12月3日 申請日期2007年5月31日 優(yōu)先權日2007年5月31日
發(fā)明者唐紅敏, 李文偉, 楊云柯, 越 范, 蔡定芳, 虹 趙, 顧喜喜 申請人:復旦大學附屬中山醫(yī)院