專利名稱：：水痘減毒活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及皰疹病毒科的醫(yī)用微生物，具體為一種水痘減毒活疫苗。技術(shù)背景水痘是由水痘-帶狀皰疹病毒(vzv)引起的髙度接觸傳播的常見呼吸道傳染病，水痘病毒是一種人a-皰疹病毒，能導(dǎo)致兩種人類疾病:.初次感染好發(fā)年齡為10歲以下兒童，導(dǎo)致兒童水痘，此后病毒變?yōu)闈摲⒊３Ｖ丶せ?通常幾十年后)產(chǎn)生帶狀皰疹。原發(fā)感染可致患者不同程度的典型疾病，尤其對免疫功能低下及接觸免疫抑制劑治療者，后果更為嚴(yán)重?；妓粫r，病毒透入外周神經(jīng)系統(tǒng)并潛伏直至以痛苦的帶狀皰疹形式重激活。由于病毒是潛伏的，大部分病毒基因的表達(dá)被抑制。VZV感染具有存在最小量的自由病毒的特征，在潛伏狀態(tài)和重激活時，病毒主要在細(xì)胞內(nèi)。相應(yīng)的，甚至使用高濃度中和抗體和依賴于細(xì)胞介導(dǎo)免疫的病毒控制也不能預(yù)防復(fù)發(fā)疾病。目前對水痘的治療并無專用有效藥物及治療方法，常規(guī)以預(yù)防為主，通過接診水痘疫苗的方法預(yù)防感染水痘-帶狀皰疹病毒(VZV),因此用安全有效的水痘疫苗對高危人群進行免疫已日益受到人們的重視。在國內(nèi)由于國家對預(yù)防的日益重視，水痘疫苗市場的增長速度呈快速增長態(tài)勢。雖然目前中國水痘疫苗市場還處于萌芽狀態(tài)，但市場潛力巨大。我國每年出生嬰兒超過1500萬，存在著巨大的兒童免疫接種市場；同時隨著人民生活水平的進一步提高，由消費者自己負(fù)擔(dān)的成人有價免疫市場也將會有大幅度的提高。依據(jù)有關(guān)資料顯示，國內(nèi)水痘疫苗市場增長率將達(dá)到15%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全球10%的增長率。我國擁有將近13億的人口，根據(jù)全國人口和經(jīng)濟實力，可以將市場定位于城f^人口，按中小學(xué)生和兒童以及老年人的數(shù)量計算，應(yīng)在l億以t，按其中的20%的人進行預(yù)防接種，全國的潛在市場應(yīng)為2000萬人份左右，同時隨著人民生活水平的提高和市場宣傳的深化，最新疫苗技術(shù)的創(chuàng)新及人們對免疫和病原體抵抗力認(rèn)識的進展，市場將逐步擴大。要獲得安全有效的水痘疫苗，需解決的主要關(guān)鍵技術(shù)及試驗內(nèi)容有1.病毒培養(yǎng)包括細(xì)胞培養(yǎng)的條件，病毒的接種量，病毒的培養(yǎng)條件和收獲條件以及細(xì)胞培養(yǎng)液和病毒培養(yǎng)液的成分等。2.病毒純化包括病毒超聲的時間、頻率等。3.凍干方法比較在不同的凍干工藝下生成的疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量。4.疫苗穩(wěn)定劑的配方比較不同配方的疫苗穩(wěn)定劑對疫苗的質(zhì)量及其穩(wěn)定性情況的影響。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有預(yù)防水痘手段的不足，提供一種安全有效的預(yù)防水痘的手段，本發(fā)明公開了一種水痘減毒活疫苗。本發(fā)明通過如下技術(shù)手段達(dá)到發(fā)明目的一種水痘減毒活疫苗，按如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞在細(xì)胞瓶中連續(xù)傳代不超過33代；(2)至細(xì)胞生長至一定規(guī)模后，將毒種接種至細(xì)胞中，進行兩次連續(xù)感染，M.O.I分別為0.0010.002和0.010.03;(3)加入含23。/。胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于3537X:培養(yǎng)；(4)當(dāng)MRC-5細(xì)胞病變程度達(dá)到++~+++時，倒去培養(yǎng)液，以PBS洗液洗滌細(xì)胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05n/。的EDTA溶液洗脫感染細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于離心管中，在48r下以1800ipm離心5分鐘，棄上清，加入含有穩(wěn)定劑的疫苗液，混勻，收集，吸樣做單瓶無菌檢測，-sox:凍存；(6)將單瓶無菌檢測合格者，移入超聲瓶中進行超聲破碎，超聲波頻率30KHz，0.10.2秒/ml，以lOOOrpm離心10分鐘，收集上清，即為病毒原液；(7)將病毒原液合并、稀釋成半成品，吸樣進行無菌檢測，并立即進行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。所述的水痘減毒活疫苗，制備方法第(5)〗j(luò);中所加入的穩(wěn)定劑配方如下序號組分重量份數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>將以上各組分均溶于重量份數(shù)為IOOO的去離子水中，即得穩(wěn)定劑。本發(fā)明選用唯一被WHO推薦用于生產(chǎn)水痘活疫苗的減毒株Oka水痘減毒株和MRC-5細(xì)胞，Oka水痘減毒株是1974年由日本大阪大學(xué)微生物病研究會(BKEN)髙橋理明博士研究成功的，經(jīng)過15年的臨床試驗，證明該病毒株具有很好的有效性和安全性，是最為理想的活疫苗株。采用自行研制的不含明膠的穩(wěn)定劑，生產(chǎn)出具有較髙病毒滴度和良好安全性的水痘疫苗，有效解決了部分注射人群的過敏性問題。以前的水痘疫苗穩(wěn)定劑配方中多含有明膠，由于明膠是一種潛在的過敏原，大多數(shù)對水痘疫苗的接種過敏反應(yīng)是由疫苗中作為穩(wěn)定劑的明膠所致。在曾經(jīng)統(tǒng)計過的30例水痘疫苗過敏反應(yīng)的兒童中，7例反應(yīng)嚴(yán)重，7例輕微，14例全身皮膚反應(yīng)，30人中有27人具有抗明膠IgE抗體。經(jīng)統(tǒng)計，嚴(yán)重過敏反應(yīng)的發(fā)生率為每100萬劑10.3例。因此，開發(fā)不含明膠的水痘疫苗穩(wěn)定劑，可以避免部分注射人群的過敏性問題，己經(jīng)成為水痘疫苗的一個發(fā)展方向。經(jīng)過長達(dá)2年的穩(wěn)定性研究表明，利用本發(fā)明的穩(wěn)定劑生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗具有良好的穩(wěn)定性，在28C放置2年以上仍然具有較髙的病毒滴度。在生產(chǎn)水痘疫苗的過程中，經(jīng)過試驗，最終選用的毒株為世界公認(rèn)的Oka水痘減毒株，細(xì)胞基質(zhì)為由國家藥品管理當(dāng)局認(rèn)可的MRC-5細(xì)胞，從而保證了生產(chǎn)出來的水痘疫苗具有良好的安全性和免疫原性。以本發(fā)明為試驗疫苗，并選用上海生物制品研究所生產(chǎn)的水痘疫苗為對照疫苗，開始水痘減毒活疫苗的臨床試驗研究。研究釆用隨機、盲法試驗。研究對象為112歲人群，分為兩個年齡段入組，1~5歲和6~12歲各300人，以隨機方式接種1針試驗疫苗或1針對照疫苗，采集免前和免后4-6周血樣評估免疫原性效果，以主動隨訪和受試者自動報告方式進行安全性觀察。1.安全性觀察通過對400名接種試驗疫苗和200名接種對照疫苗的受試者進行注射后至10天內(nèi)精細(xì)觀察以及30天內(nèi)不良事件收集試驗組和對照組總反應(yīng)率為31.75%和35.0%，中度以上反應(yīng)率8.5%和10.5%;試驗組和對照組局部反應(yīng)率為2.25%和1.50%;試驗組全身反應(yīng)率29.5%,中度以上反應(yīng)率8.5%;對照組全身反應(yīng)率33.5%，中度以上反應(yīng)率10.0%。兩組間總反應(yīng)率、局部和全身反應(yīng)率比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。2.免疫原性效果受試者免疫后經(jīng)血清學(xué)試驗結(jié)果表明試驗組和對照組受試者免疫后抗體陽轉(zhuǎn)率分別為100.0%和98.74°/0，4倍增長率為89.66%和卯.91%，陽性率為訴.30%和97.79%。試驗組和對照組抗體陽性率比較無統(tǒng)計學(xué)差異(t=0.1659，P=0.6832)。試驗組免后抗體GMT為57.90，較免疫前平均增長約21倍；對照組免后抗體GMT為46.79，較免疫前平均增長約18倍。試驗組與對照組的抗體GMT比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.5329,P=0.0004)，但免疫前后抗體增長倍數(shù)無差異(t=1.3892，P=0.0827)。具體實施方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明實施例l一種水痘減毒活疫苗，按如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞在細(xì)胞瓶中連續(xù)傳代20代；(2)至細(xì)胞生長至一定規(guī)模后，將毒種接種至細(xì)胞中，進行兩次連續(xù)感染，M.O.I分別為0.001和0.01,以擴大病鳥液的收獲量；(3)加入含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于35X:培養(yǎng)；(4)3皿05細(xì)胞病變朽:度達(dá)到+++++時，倒去培養(yǎng)液，以PBS洗液洗滌細(xì)胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05。/。的EDTA溶液洗脫感染細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于離心管中，在4r下以1800rpm離心5分鐘，棄上清，加入含有穩(wěn)定劑的疫苗液，混勻，收集，吸樣做單瓶無菌檢測，-sox:凍存；其中，穩(wěn)定劑配方如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>將以上各組分均溶于重量份數(shù)為1000的去離子水中，即得穩(wěn)定劑。(6)將單瓶無菌檢測合格者，移入超聲瓶中進行超聲破碎，超聲波頻率30KHz,0.1秒/ml，以1000rpm離心10分鐘，收集上清，即為病毒原液；(7)將病毒原液合并、稀釋成半成品，吸樣進行無菌檢測，并立即進行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。實施例2一種水痘減毒活疫苗，按如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞在細(xì)胞瓶中連續(xù)傳代不超過25代；(2)至細(xì)胞生長至一定規(guī)模后，將毒種接種至細(xì)胞中，進行兩次連續(xù)感染，M.O.I分別為0.0015和0.02，以擴大病毒液的收獲量；(3)加入含2.5。/。胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于36"C培養(yǎng)；(4)當(dāng)MRC-5細(xì)胞病變程度達(dá)到+++++時，倒去培養(yǎng)液，以PBS洗液洗滌細(xì)胞表面，洗去牛血清(5)加入0.05。/。的EDTA溶液洗脫感染細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于離心管中，在6'C下以1800rpm離心5分鐘，棄上清，加入含有穩(wěn)定劑的疫苗液，混3,收集，吸樣做單瓶無菌檢測，-sox:凍存;其中，穩(wěn)定劑配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將以上各組分均溶于重量份數(shù)為iooo的去離子水中，即得穩(wěn)定劑。(6)將單瓶無菌檢測合格者，移入超聲瓶中進行超聲破碎，超聲波頻率30KHz，0.1秒/ml，以lOOOrpm離心10分鐘，收集上清，即為病毒原液；(7)將病毒原液合并、稀釋成半成品，吸樣進行無菌檢測，并立即進行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。實施例1一種水痘減毒活疫苗，按如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞在細(xì)胞瓶中連續(xù)傳代不超過33代；(2)至細(xì)胞生長至一定規(guī)模后，將毒種接種至細(xì)胞中，進行兩次連續(xù)感染，M.O.I分別為0.002和0.03，以擴大病毒液的收獲量；(3)加入含3。/。胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于37X:培養(yǎng)；(4)當(dāng)MRC-5細(xì)胞病變程度達(dá)到++~+++時，倒去培養(yǎng)液，以PBS洗液洗滌細(xì)胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05。/。的EDTA溶液洗脫感染細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于離心管中，在8'C下以1800rpm離心5分鐘，棄上清，加入含有穩(wěn)定劑的疫瞎液，混勻，收集，吸樣做單瓶無菌檢測，-SO'C凍存；其中，穩(wěn)定劑配方如下序號組分重量份數(shù)1NaCl32KC10,13KH2P040.24Na2HP0412H203.3蔗糖506谷氨酸鈉0.47卡那霉素(100單位/ml)0.18紅霉素(30單位/ml)0.03將以上各組分均溶于重量份數(shù)為IOOO的去離子水中，即得穩(wěn)定劑。(6)將單瓶無菌檢測合格者，移入超聲瓶中進行超聲破碎，超聲波頻率30KHz，0.2秒/ml，以lOOOrpm離心10分鐘，收集上清，即為病毒原液；(7)將病毒原液合并、稀釋成半成品，吸樣進行無菌檢測，并立即進行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。權(quán)利要求1.一種水痘減毒活疫苗，按如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞在細(xì)胞瓶中連續(xù)傳代不超過33代；(2)至細(xì)胞生長至一定規(guī)模后，將毒種接種至細(xì)胞中，進行兩次連續(xù)感染，M.O.I分別為0.001～0.002和0.01～0.03；(3)加入含2～3％胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于35～37℃培養(yǎng)；(4)當(dāng)MRC-5細(xì)胞病變程度達(dá)到++～+++時，倒去培養(yǎng)液，以PBS洗液洗滌細(xì)胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05％的EDTA溶液洗脫感染細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于離心管中，在4～8℃下以1800rpm離心5分鐘，棄上清，加入含有穩(wěn)定劑的疫苗液，混勻，收集，吸樣做單瓶無菌檢測，-80℃凍存；(6)將單瓶無菌檢測合格者，移入超聲瓶中進行超聲破碎，超聲波頻率30KHz，0.1～0.2秒/ml，以1000rpm離心10分鐘，收集上清，即為病毒原液；(7)將病毒原液合并、稀釋成半成品，吸樣進行無菌檢測，并立即進行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。2.如權(quán)利要求1所述的水痘減毒活疫苗，其特征在于制備方法第(5)步中所加入的穩(wěn)定劑配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>將以上各組分均溶于重量份數(shù)為IOOO的去離子水中，即得穩(wěn)定劑。全文摘要本發(fā)明涉及皰疹病毒科的醫(yī)用微生物，具體為一種水痘減毒活疫苗。本發(fā)明通過如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞連續(xù)傳代；(2)接種至細(xì)胞并連續(xù)感染；(3)加入培養(yǎng)液；(4)洗滌細(xì)胞表面；(5)洗脫感染細(xì)胞，離心分離，加入含穩(wěn)定劑的疫苗液凍存；(6)超聲破碎并離心分離得病毒原液；(7)合并稀釋，并立即進行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。穩(wěn)定劑是將NaCl、KCl、KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O、蔗糖、谷氨酸鈉、卡那霉素、紅霉素和去離子水以重量比3∶0.1∶0.2∶3.3∶50∶0.4∶0.1∶0.03∶1000溶于水制得。本發(fā)明具有良好的安全性和免疫原性的優(yōu)點。文檔編號A61K39/275GK101161286SQ20071004565公開日2008年4月16日申請日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日發(fā)明者朱紹榮申請人:上海榮盛生物技術(shù)有限公司