專利名稱：一種骨修復(fù)材料及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種引導(dǎo)骨再生的骨修復(fù)材料及其制備方法，用于骨缺損的修復(fù)，屬于生物材料制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代化的進(jìn)程和生活水平的提高，生活節(jié)奏逐漸加快，造成骨缺損的疾病有上升的趨勢。由于外傷、炎癥、骨腫瘤摘除等各種病變治療造成的骨缺損是臨床上經(jīng)常遇到的問題。
骨缺損達(dá)到一定面積后不能骨性愈合，一直是骨科修復(fù)領(lǐng)域中的難題。而植骨術(shù)是治療骨缺損的最有效措施，關(guān)于骨移植生物替代材料的研究是骨科長期以來的重點(diǎn)研究課題。幾個(gè)世紀(jì)以來，人們嘗試了各種不同的修復(fù)材料，利用組織工程學(xué)原理解決臨床骨折、骨缺損及關(guān)節(jié)融合等治療問題已成為骨科研究的一個(gè)熱點(diǎn)，其中，尋找理想的細(xì)胞外基質(zhì)材料或載體材料是組織工程順利發(fā)展的關(guān)鍵。理想的基質(zhì)材料應(yīng)達(dá)到以下要求1.良好的生物相容性除滿足生物醫(yī)用材料的一般要求，如無毒性、不致畸等之外，不會(huì)引起炎癥和排異反應(yīng)；還要有利于種子細(xì)胞粘附、增殖，降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞無毒害作用，甚至利于細(xì)胞生長和分化。2.良好的生物降解性基質(zhì)材料在完成支架作用后應(yīng)能降解，降解率應(yīng)與組織細(xì)胞生長率相適應(yīng)，降解時(shí)間應(yīng)能根據(jù)組織生長特性作人為調(diào)控，最后可完全吸收。3.具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)基質(zhì)材料可加工成三維立體結(jié)構(gòu)，孔隙率最好達(dá)到90％以上，具有高的面積體積比。這種結(jié)構(gòu)可提供寬大的表面積和空間，利于細(xì)胞粘附生長，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，營養(yǎng)和氧氣進(jìn)入，代謝產(chǎn)物排出，也有利于血管和神經(jīng)長入。4.可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度基質(zhì)材料具有良好的塑性，可預(yù)先制成一定形狀。并具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，為新生組織提供支撐，并保持一定時(shí)間直至新生組織具有自身生物力學(xué)特性。5.良好的材料-細(xì)胞界面材料應(yīng)能提供良好的細(xì)胞界面，利于細(xì)胞粘附、增殖，更重要的是能激活細(xì)胞特異基因表達(dá)，維持細(xì)胞正常表型表達(dá)。6.高度的骨引導(dǎo)性，可以促進(jìn)骨缺損周圍骨壁上的新骨形成。目前骨組織工程中采用的支架材料種類繁多，雖各有優(yōu)點(diǎn)，但均有無法克服的不足，因而限制了材料的發(fā)展。煅燒骨是擁有天然骨小梁結(jié)構(gòu)和骨無機(jī)物晶體結(jié)構(gòu)的生物材料，其作為引導(dǎo)骨組織再生術(shù)的支架材料，越來越引起人們的重視。其結(jié)構(gòu)式同羥基磷灰石，有一定的硬度和強(qiáng)度、易于塑形且來源豐富，解決了人工合成材料在孔隙率、孔隙交通、孔隙大小等方面的制作難題。而且煅燒骨粉在制備的過程中經(jīng)過了一定的物理化學(xué)方法處理，并經(jīng)過高溫煅燒，消除了抗原性，解決了生物相容性的問題。但單純的煅燒骨粉作為骨修復(fù)材料尚存在一定的缺陷，是因?yàn)樗挥泄且龑?dǎo)作用，不具有骨誘導(dǎo)作用。
生物高分子材料中的膠原(collen，co)是脊椎動(dòng)物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其主要功能是作為組織的支持物，賦與組織以張力。此外，膠原分子及其纖維在生物的發(fā)育、生長、細(xì)胞分化及粘附、運(yùn)動(dòng)、化學(xué)趨向以及抗原抗體結(jié)合反應(yīng)等均起著重要作用。膠原不僅為細(xì)胞提供支持保護(hù)作用，而且與細(xì)胞的粘附、生長、表型表達(dá)均有密切關(guān)系。膠原有良好的生物相容性和完全的生物降解性，而免疫抗原性很低。因此，近年來被作為一種新的生物材料應(yīng)用于臨床軟組織整形、止血、細(xì)胞生長的支持物、神經(jīng)再生的管道、創(chuàng)面覆蓋和保護(hù)角膜的材料。膠原纖維，不僅起支架作用，還影響著細(xì)胞的增殖與分化、骨質(zhì)的形成與吸收以及骨基質(zhì)礦化等，機(jī)體通過膠原的合成和改建使骨折修復(fù)得以完成和完善。
其它高分子可降解材料主要有聚羥乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)聚乳酸/聚羥乙酸共聚物(PLGA或PGA/PLLA)、甲殼素、殼聚糖、透明質(zhì)酸(HA)、藻酸鈣凝膠、硫酸軟骨素、聚氧乙烯水凝膠等。PGA和聚乳酸(PLA)都屬于聚α-羥基酯類，PLLA和PDLLA是PLA的兩種常見形式，它們均具有良好的生物相容性，已被美國食品及藥物管理(abbr，food and Drug Administation FDA)批準(zhǔn)廣泛地用作可吸收縫線和骨折內(nèi)固定材料等。
骨修復(fù)材料主要用于骨缺損的修補(bǔ)，尤其適用于牙槽嵴的擴(kuò)展和重建治療、填充牙周部位的骨缺損，截根術(shù)、囊腫切除術(shù)后的缺損充填，填充拔牙窩，以保持牙槽嵴形態(tài)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種骨修復(fù)材料，克服了現(xiàn)有人工合成材料硬度、強(qiáng)度和易于塑形方面不好的問題。
本發(fā)明的目的在于提供一種骨修復(fù)材料的制備方法，解決了人工合成材料在孔隙率、孔隙交通、孔隙大小等方面的制作難題。
本發(fā)明在骨缺損修補(bǔ)中的用途，尤其適用于牙槽嵴的擴(kuò)展和重建治療、填充牙周部位的骨缺損，截根術(shù)、囊腫切除術(shù)后的缺損充填，填充拔牙窩，以保持牙槽嵴形態(tài)等。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下本發(fā)明公開的骨修復(fù)材料為不同粒徑的煅燒骨粉與生物可吸收高分子材料的組合物。
本發(fā)明所述的骨修復(fù)材料是通過以下方法制備的A、取生物可降解性高分子材料用0.1％(V∶V)乙酸配制成0.01-0.1％(W∶V)濃度的溶液，并用NaHCO3調(diào)pH值至中性后以5∶1-20∶1(V∶W)的比例加入0.04-2.5mm直徑范圍的煅燒骨粉；B、50-80℃水浴4-8小時(shí)，1500轉(zhuǎn)/秒離心6分鐘，棄上清，取沉淀物；C、將沉淀物真空抽干，紫外線下照射30-60分鐘，期間多次翻轉(zhuǎn)顆粒；D、環(huán)氧乙烷熏蒸，消毒備用。
以下實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的生物特性和物理特性實(shí)驗(yàn)例1骨修復(fù)材料的抗壓強(qiáng)度測定骨修復(fù)材料放入直徑為4毫米的玻璃管中高度為10毫米，緩慢加力，高度每降低0.25毫米記錄一次瞬間壓力值。
實(shí)驗(yàn)例2膠原包裹骨粉的生物相容性體外試驗(yàn)1.兔間質(zhì)細(xì)胞(MSCs)的體外分離及培養(yǎng)選取三周齡的大耳白兔，雌雄不限，體重2.5-3.5公斤。速眠新(1ml/kg)肌肉注射麻醉后無菌抽取骨髓1.5-2.0ml(注射器內(nèi)含稀釋的肝素鈉3000u約定0.2ml)，放入DMEM培養(yǎng)基中吹打制成單細(xì)胞懸液，置于2個(gè)25ml培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，于第五天首次細(xì)胞換液，棄去培養(yǎng)液，用Tyrode’s平衡鹽溶液沖洗4次，沖去懸浮生長的造血干細(xì)胞，之后每2-3天換液，待骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶低壁80％后，倒掉培養(yǎng)液，用D-Hanks液緩慢沖洗2次，然后用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA聯(lián)合消化，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)偽足回縮約50％時(shí)，呈圓形(大約5分鐘)，用含有15％血清的完全培養(yǎng)液終止消化，加入培養(yǎng)液5ml用吸管反復(fù)吹打?qū)⒓?xì)胞懸浮，將壁上細(xì)胞吹打下來，以1000轉(zhuǎn)/分離心，棄上清，收取底壁細(xì)胞，以1∶2傳代(見圖4)。
2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳3代后，以5×104/孔接種于預(yù)置載玻片的12孔板的6孔，更換入含有地塞米松(DEX)，抗壞血酸和β-磷酸甘油的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)21天后，見細(xì)胞呈集落生長。將細(xì)胞10％福爾馬林固定20分鐘，2％硝酸銀孵育10分鐘，去離子水沖去多余的硝酸銀，紫外光照射半小時(shí)，光鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的兔MSCs中加入誘導(dǎo)液后，周邊部細(xì)胞由單層逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)層生長，部分細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槠教苟噙吔切?，在?xì)胞高度密集區(qū)又轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或橢圓形，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，甲苯胺藍(lán)染色呈陽性反應(yīng)。3天后原來細(xì)胞密集的區(qū)域細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)收縮，1周左右大部分細(xì)胞收縮成細(xì)胞團(tuán)，最后在整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境中形成2-3個(gè)細(xì)胞結(jié)節(jié)。VonKossa染色陽性區(qū)，呈斑塊狀，多見于細(xì)胞密集生長區(qū)。證明該細(xì)胞具成骨細(xì)胞樣特性。
3.成骨細(xì)胞與骨修復(fù)材料的復(fù)合實(shí)驗(yàn)將骨修復(fù)材料用Co60Y消毒后用培養(yǎng)液預(yù)濕備用。取傳第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5×106與小塊狀骨修復(fù)材料共同培養(yǎng)，24小時(shí)后見材料周圍有細(xì)胞貼壁生長，2-3天換液，5天后見細(xì)胞明顯增殖，且細(xì)胞形態(tài)未見異常變化(見圖5)。證明本材料沒有細(xì)胞毒性。
12天后將植有細(xì)胞的材料取出，用2.5％的戊二醛固定，1％的鋨酸固定，乙醇系列脫水后噴金給予掃描電鏡觀察。掃描電鏡二次成像法顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，骨修復(fù)材料在體外培養(yǎng)第五天時(shí)已有成骨細(xì)胞附著，數(shù)量較多，同時(shí)在孔洞中也有細(xì)胞生長；且生長狀態(tài)良好，貼附緊密，形態(tài)正常.證明本實(shí)驗(yàn)研制的骨粉生物相容性好，對(duì)細(xì)胞無不良刺激，材料無細(xì)胞毒性，可做骨組織工程的種子細(xì)胞載體使用。(見圖6)。
實(shí)驗(yàn)例3
骨修復(fù)材料對(duì)家兔顱骨損傷的修復(fù)作用試驗(yàn)方法將新西蘭白兔隨機(jī)分為六組(動(dòng)物由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物室提供)，每組四只，雌雄不限，體重2.5-3.5公斤。速眠新(1ml/kg)肌肉注射麻醉，無菌條件下備皮，在兩側(cè)顱骨上分別制成1.0×1.5cm的骨穿通缺損，然后在缺損處放入骨修復(fù)材料，外部復(fù)蓋生物可降解膜，左側(cè)為實(shí)驗(yàn)骨粉組，右側(cè)為對(duì)照材料組。分別在3、6、8、12周處死家兔，取顱骨拍X線片，然后，固定在10％的中性福爾馬林中，一周后，置20％EDTA中脫鈣，脫鈣完全后，常規(guī)石蠟包埋，切片(6μm)進(jìn)行HE染色及改良的Comori特殊染色，鏡下觀察。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果大體觀察術(shù)后三周，骨缺損表面覆蓋較厚的纖維結(jié)締組織，骨缺損處厚度比宿主骨薄，可見骨修復(fù)材料顆粒布滿骨缺損區(qū)域，透光性好，說明骨組織密度低。術(shù)后六周，骨缺損表面纖維組織被膜色澤與正常部位相同，呈乳白色，與正常部位呈移行關(guān)系，骨缺損區(qū)透光性較好。術(shù)后八周，骨缺損處透光性減弱，說明骨組織密度增加，骨缺損中心部位稍凹陷。術(shù)后十二周，骨缺損處透光性進(jìn)一步減弱，缺損處厚度與宿主骨接近。術(shù)后三周時(shí)可降解膜變脆，觸之易碎，但完整，六周時(shí)可見少量剩余碎片，八周時(shí)可降解膜消失。
軟X線片觀察術(shù)后三周——骨修復(fù)材料植入?yún)^(qū)，顯示為植入物的低密度影，植入?yún)^(qū)的骨組織密度為宿主骨密度約60％，骨折線清晰。術(shù)后六周——宿主骨和骨修復(fù)材料植入?yún)^(qū)之間的結(jié)合部有低密度骨痂出現(xiàn)，骨折線部分可見，植入?yún)^(qū)中心的骨修復(fù)材料密度較三周降低，植入?yún)^(qū)骨組織密度為宿主骨密度大約40％，說明植入?yún)^(qū)中心的骨修復(fù)材料顆粒降解，原始骨痂形成。術(shù)后八周——結(jié)合部骨痂面積增大，密度增高，骨折線消失。植入?yún)^(qū)中心部密度較六周減低。術(shù)后十二周——植入?yún)^(qū)骨組織密度增高接近宿主骨，植入?yún)^(qū)骨組織密度為宿主骨密度大約87％(見圖7)。
HE染色術(shù)后3周——植入物內(nèi)部均有小血管長入，周圍的軟組織無炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)合部少量原始骨痂形成，骨修復(fù)材料無降解。術(shù)后6周——植入物內(nèi)可見成纖維母細(xì)胞，外表面及結(jié)合部骨痂亦明顯增多，出現(xiàn)新生骨單位，骨小梁排列不規(guī)則，少量骨髓成分長入。術(shù)后8周——植入物的內(nèi)部、周圍及結(jié)合部骨痂內(nèi)可見成熟的骨單位，骨陷窩增多，出現(xiàn)類似板層骨結(jié)構(gòu)。術(shù)后12周——成熟骨痂排列規(guī)則致密，新生骨形成與宿主骨類似的骨組織結(jié)構(gòu)，殘留的骨修復(fù)材料呈細(xì)小的顆粒狀被新生骨包繞(見圖8)。
改良的Gomori特殊染色改良的Gomori特殊染色可清楚的顯示骨修復(fù)材料植入后早期活躍的膜成骨反應(yīng)。無活力的骨修復(fù)支架呈藍(lán)綠色，缺損區(qū)內(nèi)引導(dǎo)產(chǎn)生的骨基質(zhì)也呈藍(lán)綠色，基質(zhì)鈣化為新骨組織后呈紅色，易與原植骨材料、基質(zhì)、纖維區(qū)分。植骨后期，原植骨材料被吸收替代，視野中主要為紅染的新生骨組織。
術(shù)后三周時(shí)——結(jié)合部煅燒骨顆粒周圍有片狀的綠染骨基質(zhì)及纖維結(jié)構(gòu)；術(shù)后六周時(shí)——結(jié)合部可見綠染的骨基質(zhì)、骨陷窩和紅染的新生骨單位增多，血管結(jié)構(gòu)增多，有紅染排列不規(guī)則的骨小梁；術(shù)后八周時(shí)——結(jié)合部可見綠染的骨基質(zhì)和紅染的新骨單位增多，類似板層骨結(jié)構(gòu)，骨髓成分增多，哈佛管周圍紅染其中心綠染；術(shù)后十二周時(shí)——紅染的成熟骨痂排列規(guī)則致密，新生骨形成與宿主骨類似的骨組織結(jié)構(gòu)(見圖9)。
實(shí)驗(yàn)例4新骨形成積分光密度值(IOD)及統(tǒng)計(jì)分析用尼康E600顯微鏡采集骨切片圖像，放大倍數(shù)4×3，每一張切片再隨機(jī)選取10個(gè)視野，SPOT Cool CCD攝像頭采集圖像進(jìn)入計(jì)算機(jī)，采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析軟件對(duì)數(shù)碼圖像進(jìn)行分析，將骨修復(fù)材料植入骨缺損處新骨形成面積和灰度作為分析因素，檢測新骨形成積分光密度值(IOD)。
結(jié)果顯示，隨著時(shí)間推移，各組的新骨形成積分光密度值都有所增加，說明成骨在繼續(xù)，結(jié)果見表2。
表2新骨形成積分光密度值(IOD)(×106)

本發(fā)明所制備的骨修復(fù)材料經(jīng)能譜分析、X線衍射及掃描電鏡觀察顯示其為無有機(jī)質(zhì)，具有完整三維交通的松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，孔隙率為84.9％，孔徑在200-550μm之間。其大小適合肉芽組織長入，有利于傳導(dǎo)成骨。在結(jié)構(gòu)上符合理想骨缺損修復(fù)材料要求。
抗壓實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明顆粒在壓縮相同體積時(shí)，小顆粒所承受的力大，大顆粒則??；在承受相同的力時(shí)，顆粒越小體積變化越小，顆粒越大則越大。煅燒溫度與次數(shù)可改變骨粉內(nèi)成分存在的形式，從而改變骨粉的抗壓強(qiáng)度。因此我們可通過調(diào)整煅燒次數(shù)和不同大小的顆粒的組合來修復(fù)不同承重部位的骨缺損。
通過兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與本發(fā)明的骨修復(fù)材料體外復(fù)合試驗(yàn)，證明本發(fā)明制備的骨修復(fù)材料生物相容性好，對(duì)細(xì)胞無不良刺激，材料沒有細(xì)胞毒性。因此本發(fā)明研制的骨修復(fù)材料可作為優(yōu)良的骨替代材料，構(gòu)建組織化人工骨。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的骨修復(fù)材料組織相容性好，在植入體內(nèi)早期亦未見有明顯的淋巴細(xì)胞浸潤，且成骨速度較快，骨缺損是以膜內(nèi)化骨的方式愈合，未見軟骨化骨。
成骨實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，骨修復(fù)材料的顆粒大小對(duì)其引導(dǎo)成骨作用存在直接影響。本發(fā)明所制備的0.05-2.5mm直徑范圍的混合骨修復(fù)材料顆粒的引導(dǎo)成骨作用較好。不同大小的顆粒的組合可修復(fù)不同承重部位的骨缺損。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供了一種較為理想的骨缺損修復(fù)材料的制備方法，本方法所制備的骨修復(fù)材料具有良好的抗壓能力，且其主要成分骨粉材料是經(jīng)過高溫煅燒的純無機(jī)物質(zhì)，不存在任何抗原物質(zhì)。掃描電鏡照片結(jié)果顯示，骨粉保留了天然骨的多孔結(jié)構(gòu)及骨小梁，與人體骨結(jié)構(gòu)相似、內(nèi)表面積大、孔隙間相互交通，有利于成骨細(xì)胞的粘附與生長，有利于纖維及血管長入。另外骨粉塑形能力強(qiáng)，可根據(jù)原來骨的形態(tài)塑形，可操作性好。
生物高分子材料中的膠原能促進(jìn)成骨細(xì)胞粘附、增殖和分化，增強(qiáng)其成骨能力。但其最大的缺點(diǎn)是缺乏一定的機(jī)械強(qiáng)度，難以單獨(dú)用作成骨細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)材料。本研究用膠原等高分子材料將煅燒骨粉進(jìn)行包裹，制成骨修復(fù)材料，此骨修復(fù)材料兼具煅燒骨粉與高分子材料的優(yōu)點(diǎn)，可達(dá)到較好的骨修復(fù)效果。
將從兔的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化來的成骨細(xì)胞與本發(fā)明的骨修復(fù)材料共同培養(yǎng)后，掃描電鏡下觀察可見骨修復(fù)材料表面有大量的成骨細(xì)胞吸附，生長狀態(tài)良好，形態(tài)正常，數(shù)量較多，且與骨結(jié)合較緊密。這說明本實(shí)驗(yàn)研制的骨修復(fù)材料不僅生物相容好，可做為骨缺損修復(fù)支架，也可以作為骨組織工程的載體使用。
動(dòng)物成骨實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的骨修復(fù)材料具有較好的引導(dǎo)成骨作用，而且在成骨完全時(shí)，此材料完全降解，不形成占位。
說明書附1骨粉被膠原包裹后的電鏡圖片圖2骨修復(fù)材料顆粒的力與位移曲線圖3骨修復(fù)材料與兔成骨細(xì)胞共同培養(yǎng)5天的光鏡圖片圖4成骨細(xì)胞與骨修復(fù)材料復(fù)合的電鏡圖片圖5A骨修復(fù)材料治療家兔顱骨損傷8周時(shí)骨組織的軟X線圖片圖5B骨修復(fù)材料治療家兔顱骨損傷12周時(shí)骨組織的軟X線圖片圖6A骨修復(fù)材料治療家兔顱骨損傷8周時(shí)骨組織HE染色圖片圖6B骨修復(fù)材料治療家兔顱骨損傷12周時(shí)骨組織HE染色圖片圖7A骨修復(fù)材料治療家兔顱骨損傷8周時(shí)骨組織的改良的Comori特殊染色圖片圖7B骨修復(fù)材料治療家兔顱骨損傷12周時(shí)骨組織的改良的Comori特殊染色圖片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1I型膠原的制備取新鮮牛腱，去掉脂肪以及筋膜等，切碎并且稱重，用碳酸鈉溶液浸泡2小時(shí)，蒸餾水漂洗。用含1M NaCl的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.5)除雜質(zhì)蛋白。用0.3％醋酸酶溶液(含無花果蛋白酶或胃蛋白酶)消化水解48-72小時(shí)。每2個(gè)小時(shí)測提取液的吸光度，繪制消化曲線。高速冷凍離心，200rpm/20min，-4～4℃，取上清液，此為膠原蛋白粗提液。用1％的H2O2溶液作用4小時(shí)。用NaCl溶液鹽析12～18小時(shí)，Tris(pH7.0)浸泡24小時(shí)。透析6小時(shí)，透析液NaCl溶液濃度遞減，最后用蒸餾水透析3天。冷凍干燥，-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2膠原包裹骨修復(fù)材料的制備①將膠原加0.1％乙酸配成0.2％膠原原液；
②將膠原原液繼續(xù)用0.1％乙酸稀釋制成0.01％-0.1％膠原；③將膠原溶液用1mol/L NaHCO3調(diào)pH值至中性，加入0.05-2.5直徑煅燒骨粉，使膠原溶液與骨粉的體積重量比為5∶1-20∶1；④將③制備的骨粉置30-80℃水浴4-6小時(shí)。1500轉(zhuǎn)/秒離心6分鐘，棄上清，取沉淀物；⑤將④制備物真空抽干，紫外線下照射40分鐘。期間多次翻轉(zhuǎn)顆粒；⑥電鏡下觀察表面包裹情況；⑦選擇效果最佳組，環(huán)氧乙烷熏蒸，消毒備用。
實(shí)施例3殼聚糖包裹骨修復(fù)材料的制備①將骨粉溶于乙醇中配成5％的懸浮液，簡稱A液；②按骨粉與殼聚糖重量比為4∶1-1∶3的比例稱取殼聚糖，將其粉末溶于2％醋酸水溶液中，連續(xù)攪拌5h，過濾得到完全透明的3％殼聚糖溶液；③將配好的10％磷酸水溶液傾入殼聚糖溶液中，充分?jǐn)嚢瑁玫紹液，整個(gè)反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，④在劇烈攪拌下將B液緩慢滴入A液中，該過程pH值保持在10左右，滴加速度4ml/min滴加完畢，繼續(xù)攪拌24h，所得材料室溫下陳化1天，將沉淀過濾，洗滌，消毒備用。
實(shí)施例4透明質(zhì)酸包裹骨修復(fù)材料的制備①將透明質(zhì)酸加0.1％乙酸配成0.2％透明質(zhì)酸原液；②將透明質(zhì)酸原液繼續(xù)用0.1％乙酸稀釋制成0.01％-0.1％透明質(zhì)酸；③將透明質(zhì)酸溶液用1mol/L NaHCO3調(diào)pH值至中性，加入0.05-2.5直徑煅燒骨粉，使透明質(zhì)酸溶液與骨粉的體積重量比為5∶1-20∶1；④將③制備的骨粉置30-80℃水浴4-6小時(shí)。1500轉(zhuǎn)/秒離心6分鐘，棄上清，取沉淀物；⑤將④制備物真空抽干，紫外線下照射40分鐘。期間多次翻轉(zhuǎn)顆粒；⑥電鏡下觀察表面包裹情況；⑦選擇效果最佳組，環(huán)氧乙烷熏蒸，消毒備用。
實(shí)施例5硫酸軟骨素包裹骨修復(fù)材料的制備①將硫酸軟骨素加0.1％乙酸配成0.2％硫酸軟骨素原液；②將硫酸軟骨素原液繼續(xù)用0.1％乙酸稀釋制成0.01％-0.1％硫酸軟骨素；③將硫酸軟骨素溶液用1mol/L NaHCO3調(diào)pH值至中性，加入0.05-2.5直徑煅燒骨粉，使硫酸軟骨素溶液與骨粉的體積重量比為5∶1-20∶1；④將③制備的骨粉置30-80℃水浴4-6小時(shí)。1500轉(zhuǎn)/秒離心6分鐘，棄上清，取沉淀物；⑤將④制備物真空抽干，紫外線下照射40分鐘。期間多次翻轉(zhuǎn)顆粒；⑥電鏡下觀察表面包裹情況；⑦選擇效果最佳組，環(huán)氧乙烷熏蒸，消毒備用。
實(shí)施例6藻酸鈣包裹骨修復(fù)材料的制備①將藻酸鈉干粉(Sigma，美國)溶解于含0.135mol/L NaCl和0.1mol/LK2HPO4的水溶液中。使藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％，pH7.4，121℃高壓消毒滅菌30min后，4℃保存?zhèn)溆谩?br> ②在已配制好的藻酸鈉溶液中加入骨粉，每毫升中加入骨粉20mg，滴入10％葡萄糖酸鈣溶液后，混勻，在交聯(lián)劑鈣離子的作用下發(fā)生側(cè)向交聯(lián)形成藻酸鈣凝膠，消毒備用。
實(shí)施例7纖維蛋白包裹骨修復(fù)材料的制備①將纖維蛋白加0.1％乙酸配成重量體積比為0.2％的纖維蛋白原液；②將纖維蛋白原液繼續(xù)用0.1％乙酸稀釋制成0.01％-0.1％纖維蛋白；③將纖維蛋白溶液用1mol/L NaHCO3調(diào)pH值至中性，加入0.05-2.5直徑煅燒骨粉，使纖維蛋白溶液與骨粉的體積重量比為5∶1-20∶1；④將③制備的骨粉置30-80℃水浴4-6小時(shí)。1500轉(zhuǎn)/秒離心6分鐘，棄上清，取沉淀物；⑤將④制備物真空抽干，紫外線下照射40分鐘。期間多次翻轉(zhuǎn)顆粒；⑥電鏡下觀察表面包裹情況；
⑦選擇效果最佳組，環(huán)氧乙烷熏蒸，消毒備用。
實(shí)施例8彈性蛋白包裹骨修復(fù)材料的制備①將彈性蛋白加0.1％乙酸配成0.2％彈性蛋白原液；②將彈性蛋白原液繼續(xù)用0.1％乙酸稀釋制成0.01％-0.1％彈性蛋白；③將彈性蛋白溶液用1mol/L NaHCO3調(diào)pH值至中性，加入0.05-2.5直徑煅燒骨粉，使彈性蛋白溶液與骨粉的體積重量比為5∶1-20∶1；④將③制備的骨粉置30-80℃水浴4-6小時(shí)。1500轉(zhuǎn)/秒離心6分鐘，棄上清，取沉淀物；⑤將④制備物真空抽干，紫外線下照射40分鐘。期間多次翻轉(zhuǎn)顆粒；⑥電鏡下觀察表面包裹情況；⑦選擇效果最佳組，環(huán)氧乙烷熏蒸，消毒備用。
實(shí)施例9膠原與硫酸軟骨素包裹骨修復(fù)材料的制備①將膠原與硫酸軟骨素等量混合加0.1％乙酸配成重量體積比為0.2％的原液；②將①中制備的原液繼續(xù)用0.1％乙酸稀釋制成0.01％-0.1％膠原/硫酸軟骨素；③將膠原/硫酸軟骨素溶液用1mol/L NaHCO3調(diào)pH值至中性，加入0.05-2.5直徑煅燒骨粉，使膠原/硫酸軟骨素溶液與骨粉的體積重量比為5∶1-20∶1；④將③制備的骨粉置30-80℃水浴4-6小時(shí)。1500轉(zhuǎn)/秒離心6分鐘，棄上清，取沉淀物；⑤將④制備物真空抽干，紫外線下照射40分鐘。期間多次翻轉(zhuǎn)顆粒；⑥電鏡下觀察表面包裹情況；⑦選擇效果最佳組，環(huán)氧乙烷熏蒸，消毒備用。
權(quán)利要求
1.一種引導(dǎo)骨組織再生的骨修復(fù)材料，為不同粒徑的煅燒骨粉與生物可吸收高分子材料的組合物，其中，煅燒骨粉的顆粒大小范圍為0.05-2.5mm；生物可吸收高分子材料選自膠原、甲殼素、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、藻酸鈣、纖維蛋白、彈性蛋白的一種或是它們的衍生物，或是其中兩種或多種的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述骨修復(fù)材料的制備方法，將不同粒徑的煅燒骨粉混合后與膠原等生物可吸收高分子材料在乙酸、NaHCO2溶液中進(jìn)行混合，之后進(jìn)行真空抽干、紫外線照射、環(huán)氧乙烷熏蒸消毒；所述的生物可吸收高分子材料是膠原、甲殼素、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、藻酸鈣、纖維蛋白、彈性蛋白的一種或是它們的衍生物，或是其中兩種或多種的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于A、取生物可降解性高分子材料用0.1％(V∶V)乙酸配制成適當(dāng)濃度的0.05％(W∶V)的溶液，用NaHCO3調(diào)pH值至中性后加入0.04-2.5mm直徑范圍的煅燒骨粉；B、50-80℃水浴4-8小時(shí)，1500轉(zhuǎn)/秒離心6分鐘，棄上清，取沉淀物；C、將沉淀物真空抽干，紫外線下照射30-60分鐘，期間多次翻轉(zhuǎn)顆粒；D、環(huán)氧乙烷熏蒸，消毒得本發(fā)明。
4.權(quán)利要求1中的骨修復(fù)材料在骨缺損修補(bǔ)中的用途。
5.權(quán)利要求1中所述骨缺損為口腔頜面部骨缺損。
6.權(quán)利要求1中所述骨缺損為肘關(guān)節(jié)缺損。
7.權(quán)利要求1中所述骨缺損為脊椎骨缺損。
8.權(quán)利要求1中所述骨缺損為肘關(guān)節(jié)缺損。
全文摘要
本發(fā)明公開一種引導(dǎo)骨再生的骨修復(fù)材料及其制備方法，用于骨缺損的修復(fù)，該材料為不同粒徑的煅燒骨粉與生物可吸收高分子材料的組合物，其中煅燒骨粉的顆粒大小范圍為0.05－2.5mm；生物可吸收高分子材料是膠原、聚酯、殼聚糖或硫酸軟骨素等；骨修復(fù)材料的制備方法為根據(jù)不同骨缺損的特點(diǎn)，選取不同粒徑范圍的骨粉顆粒與生物可吸收高分子材料在乙酸、NaHCO
文檔編號(hào)A61L27/00GK101020082SQ20071005539
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日
發(fā)明者高心, 何鐘勤 申請人:高心, 李玉新