專利名稱：一種復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架的制備方法。具體說是通過對(duì)人體骨結(jié)構(gòu)和功能的仿生模擬，采用膠原/殼聚糖和羥基磷灰石模擬骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，為骨修復(fù)提供一種制備復(fù)合結(jié)構(gòu)支架的方法。
背景技術(shù)：
骨損傷是目前常見的疾病。由于風(fēng)濕、類風(fēng)濕等各種骨關(guān)節(jié)疾病或運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷所造成的關(guān)節(jié)骨損傷給許多病人帶來痛苦。迄今為止，臨床上仍然缺少有效的方法修復(fù)大尺寸的骨缺損。應(yīng)用再生醫(yī)學(xué)的方法和原理來進(jìn)行骨組織的修復(fù)是目前的一個(gè)重要手段，且取得了良好的效果。其中，骨修復(fù)支架在骨再生中起著十分重要的作用。
骨是一族生物礦物材料的總稱，主要發(fā)育于脊椎動(dòng)物中。雖然每一種類型的骨的結(jié)構(gòu)和組成稍有變化，但都有一個(gè)共同的特點(diǎn)它們主要成分都是由I型膠原纖維、碳羥磷灰石和水組成。骨是最復(fù)雜的生物礦化系統(tǒng)之一，也是最典型的天然有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料。骨中的碳羥磷灰石晶體都是板形的，平均長(zhǎng)度和寬度分別為50nm和25nm；晶體厚度極薄，且非常一致，一般1.5nm至4.0nm。骨的主要有機(jī)相為膠原纖維，另外還有少量骨涎酸蛋白、硫酸軟骨素、脂類、肽類等。膠原纖維中的原膠原分子具有三重螺旋結(jié)構(gòu)，骨中的礦物相位于原膠原分子間的間隙孔內(nèi)，排列成層，構(gòu)成骨的基本結(jié)構(gòu)。
模仿天然骨的成分及結(jié)構(gòu)特征制造的骨替代材料，可為細(xì)胞提供與天然骨相類似的微環(huán)境。這有助于骨系細(xì)胞的粘附、增殖及功能發(fā)揮。這種材料不僅可直接作為骨缺損修復(fù)材料，也是優(yōu)異的骨組織工程載體材料，尤其適用于無需承力的骨組織部位。
傳統(tǒng)的骨修復(fù)材料難以獲得細(xì)胞活性位點(diǎn)，以促進(jìn)造骨細(xì)胞的正?；钚缘谋磉_(dá)。近年來，人體生理體液礦化的方法由于其優(yōu)異的生物活性和制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而廣受關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種模擬人體天然骨的化學(xué)組成，并為受損的骨組織提供良好的微環(huán)境并且能夠有效地促進(jìn)骨細(xì)胞的遷移、生長(zhǎng)與分化，促進(jìn)受損骨修復(fù)的一種復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架的制備方法。
本發(fā)明的一種復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架的制備方法，其制備過程包括以下步驟1)將膠原/殼聚糖溶解在質(zhì)量濃度為3％的乙酸溶液中，膠原與殼聚糖的質(zhì)量比為5∶5～9∶1，得質(zhì)量濃度為0.5％的膠原/殼聚糖溶液，注入到模具中，于-20℃下冷凍2小時(shí)，于-20℃下冷凍，在凍干機(jī)中冷凍干燥，從模具中取出，然后置于質(zhì)量濃度為0.3％的乙酸溶液中浸潤(rùn)，再經(jīng)三蒸水充分洗滌，放入質(zhì)量濃度為0.25％的戊二醛水溶液中在4℃下交聯(lián)3～24小時(shí)，用三蒸水充分洗滌，得交聯(lián)的膠原/殼聚糖支架；2)將交聯(lián)的膠原/殼聚糖支架在0.05～0.5mol/L的CaCl2水溶液中浸潤(rùn)至少2小時(shí)后取出，放入模具中，加入與支架中吸附的CaCl2溶液等體積但摩爾濃度為CaCl2溶液濃度0.6倍的磷酸氫二氨水溶液，調(diào)節(jié)pH值到11，反應(yīng)15～60分鐘，用三蒸水充分洗滌；3)將步驟2)所得支架浸入到由每升三蒸水中含有2.5mM CaCl2、5mM的氯化鉀、142mM的氯化鈉、1.5mM的氯化鎂、4.2mM的碳酸氫鈉、0.5mM硫酸鈉、1mM磷酸氫二氨和50mM三羥甲基氨基甲烷所配制的模擬人體生理體液中，在振蕩的條件下，37℃下礦化處理12～48小時(shí)，得到復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架。
本發(fā)明的有益效果在于制備方法簡(jiǎn)單、材料來源豐富、生產(chǎn)效率高，本發(fā)明以可生物降解的膠原/殼聚糖為主要原料，采用化學(xué)沉積和人體生理體液礦化相結(jié)合的方法將活性的羥基磷灰石引入到膠原/殼聚糖支架中，得到了具有類骨結(jié)構(gòu)的支架；所得支架具有生物相容性好、綜合性能優(yōu)良和使用方便等優(yōu)點(diǎn)，可以有效地促進(jìn)骨細(xì)胞的遷移、生長(zhǎng)與分化，有利于提高受損骨組織的修復(fù)效率，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1是交聯(lián)的膠原/殼聚糖支架的掃描電鏡照片；圖2是沉積了羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架的掃描電鏡照片(CaCl2水溶液的濃度為0.05mol/L)；圖3是沉積在膠原/殼聚糖支架內(nèi)的羥基磷灰石粒子的掃描電鏡照片(CaCl2水溶液的濃度為0.05mol/L)；圖4是經(jīng)礦化處理的復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架內(nèi)羥基磷灰石粒子的掃描電鏡照片(CaCl2水溶液的濃度為0.05mol/L)；圖5是不同礦化時(shí)間的復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架的X射線衍射圖(CaCl2水溶液的濃度為0.1mol/L)；圖6是經(jīng)礦化處理的羥基磷灰石復(fù)合膠原/殼聚糖支架內(nèi)羥基磷灰石粒子的掃描電鏡照片(CaCl2水溶液的濃度為0.1mol/L)；圖7是不同氯化鈣溶液浸潤(rùn)條件下，得到的沉積支架和礦化支架的吸水率的變化。(CaCl2水溶液的濃度為0.05～0.5mol/L)；圖8是不同氯化鈣溶液浸潤(rùn)條件下，得到的沉積支架和礦化支架的羥基磷灰石與膠原/殼聚糖質(zhì)量比的變化(CaCl2水溶液的濃度為0.05～0.5mol/L)。
具體實(shí)施方法以下結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這些實(shí)例并不用來限制本發(fā)明。
實(shí)例11)將膠原/殼聚糖溶解在質(zhì)量濃度為3％的乙酸溶液中，膠原與殼聚糖的質(zhì)量比為5∶5，得質(zhì)量濃度為0.5％的膠原/殼聚糖溶液，注入到模具中，于-20℃下冷凍2小時(shí)，于-20℃下冷凍，在凍干機(jī)中冷凍干燥24小時(shí)，從模具中取出，然后置于質(zhì)量濃度為0.3％的乙酸溶液中浸潤(rùn)，再經(jīng)三蒸水充分洗滌，放入質(zhì)量濃度為0.25％的戊二醛水溶液中在4℃下交聯(lián)12小時(shí)，用三蒸水充分洗滌，得交聯(lián)的膠原/殼聚糖支架。圖1是交聯(lián)的膠原/殼聚糖支架的掃描電鏡照片。
2)配制0.05mol/L的CaCl2水溶液和0.03mol/L的磷酸氫二氨水溶液；將步驟1)所得交聯(lián)的膠原/殼聚糖支架在0.05mol/L的CaCl2水溶液中浸潤(rùn)2小時(shí)后取出，放入模具中，加入與支架中吸附的CaCl2溶液等體積但摩爾濃度為CaCl2溶液濃度0.6倍的磷酸氫二氨水溶液，用1mol/L的氫氧化鈉水溶液將pH值調(diào)節(jié)到11后，反應(yīng)30分鐘，用三蒸水充分洗滌，獲得沉積了羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架。圖2是沉積了羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架的掃描電鏡照片；圖3是沉積在膠原/殼聚糖支架內(nèi)的羥基磷灰石粒子的掃描電鏡照片。
3)將2.5mM CaCl2、5mM的氯化鉀、142mM的氯化鈉、1.5mM的氯化鎂、4.2mM的碳酸氫鈉、0.5mM硫酸鈉、1mM磷酸氫二氨和50mM三羥甲基氨基甲烷溶解于1L三蒸水中，配制成模擬的人體生理體液；將步驟2)所得沉積了羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架浸入到該模擬的人體生理體液中，在振蕩的條件下，37℃下礦化處理24小時(shí)，得到復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架。
圖4是經(jīng)礦化處理的復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架內(nèi)的羥基磷灰石粒子掃描電鏡照片；圖5是不同礦化時(shí)間的復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架的X射線衍射圖。
實(shí)例2
步驟1)同實(shí)例1的步驟1)，但膠原與殼聚糖的質(zhì)量比為9∶1；步驟2)同實(shí)例1的步驟2)，制備了沉積羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架，但CaCl2水溶液的濃度為0.1mol/L，對(duì)應(yīng)的磷酸氫二氨水溶液的濃度為0.06mol/L；步驟3)同實(shí)例1的步驟3)，但礦化時(shí)間為12小時(shí)；圖6是經(jīng)礦化處理的復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架內(nèi)羥基磷灰石粒子的掃描電鏡照片。
實(shí)例3步驟1)同實(shí)例1的步驟1)，但膠原/殼聚糖的質(zhì)量比為8∶2；步驟2)～3)同實(shí)例1的步驟2)～3)；圖7是不同氯化鈣溶液浸潤(rùn)條件下，得到的沉積支架和礦化支架的吸水率的變化。
實(shí)例4步驟1)同實(shí)例1的步驟1)，但膠原/殼聚糖的質(zhì)量比為7∶3；步驟2)～3)同實(shí)例1的步驟2)～3)。
實(shí)例5步驟1)同實(shí)例2的步驟1)；步驟2)同實(shí)例1的步驟2)，制備了沉積羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架，但CaCl2水溶液的濃度分別為0.05、0.1、0.25、0.5mol/L，對(duì)應(yīng)的磷酸氫二氨水溶液的濃度為0.03、0.06、0.15、0.3mol/L；步驟3)同實(shí)例1的步驟3)；圖8是不同濃度的氯化鈣溶液浸潤(rùn)條件下，得到的沉積支架和礦化支架的羥基磷灰石與膠原/殼聚糖質(zhì)量比的變化。
實(shí)例6步驟1)同實(shí)例1的步驟1)；步驟2)同實(shí)例1的步驟2)，制備了沉積羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架，但反應(yīng)時(shí)間為60分鐘，其余步驟同實(shí)例1。
實(shí)例7步驟1)～2)同實(shí)例1的步驟1)～2)；步驟3)同實(shí)例1的步驟3)，但礦化時(shí)間為48小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架的制備方法，其制備過程包括以下步驟1)將膠原/殼聚糖溶解在質(zhì)量濃度為3％的乙酸溶液中，膠原與殼聚糖的質(zhì)量比為5∶5～9∶1，得質(zhì)量濃度為0.5％的膠原/殼聚糖溶液，注入到模具中，于-20℃下冷凍2小時(shí)，于-20℃下冷凍，在凍干機(jī)中冷凍干燥，從模具中取出，然后置于質(zhì)量濃度為0.3％的乙酸溶液中浸潤(rùn)，再經(jīng)三蒸水充分洗滌，放入質(zhì)量濃度為0.25％的戊二醛水溶液中在4℃下交聯(lián)3～24小時(shí)，用三蒸水充分洗滌，得交聯(lián)的膠原/殼聚糖支架；2)將交聯(lián)的膠原/殼聚糖支架在0.05～0.5mol/L的CaCl2水溶液中浸潤(rùn)至少2小時(shí)后取出，放入模具中，加入與支架中吸附的CaCl2溶液等體積但摩爾濃度為CaCl2溶液濃度0.6倍的磷酸氫二氨水溶液，調(diào)節(jié)pH值到11，反應(yīng)15～60分鐘，用三蒸水充分洗滌；3)將步驟2)所得支架浸入到由每升三蒸水中含有2.5mM CaCl2、5mM的氯化鉀、142mM的氯化鈉、1.5mM的氯化鎂、4.2mM的碳酸氫鈉、0.5mM硫酸鈉、1mM磷酸氫二氨和50mM三羥甲基氨基甲烷所配制的模擬人體生理體液中，在振蕩的條件下，37℃下礦化處理12～48小時(shí)，得到復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復(fù)合羥基磷灰石的膠原/殼聚糖支架的制備方法，步驟包括1)制備交聯(lián)的膠原/殼聚糖支架；2)利用化學(xué)沉積的方法將羥基磷灰石復(fù)合到步驟1)所得支架中；3)利用礦化的方法獲得活性的復(fù)合骨支架。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、材料來源豐富、生產(chǎn)效率高，本發(fā)明以可生物降解的膠原/殼聚糖為主要原料，采用化學(xué)沉積和人體生理體液礦化相結(jié)合的方法將活性的羥基磷灰石引入到膠原/殼聚糖支架中，得到了具有類骨結(jié)構(gòu)的支架；所得支架具有生物相容性好、綜合性能優(yōu)良和使用方便等優(yōu)點(diǎn)，可以有效地促進(jìn)骨細(xì)胞的遷移、生長(zhǎng)與分化，有利于提高受損骨組織的修復(fù)效率，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61L27/00GK101081314SQ20071006973
公開日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2007年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月27日
發(fā)明者高長(zhǎng)有, 馬列, 趙海光, 沈家驄 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)