專利名稱：：能敲除hpve7蛋白的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種能敲除HPVE7蛋白的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：宮頸癌是目前影響女性健康的重要惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌，位于女性惡性腫瘤的第二位，并且近年來(lái)宮頸癌的發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)?，F(xiàn)階段宮頸癌的治療主要采用手術(shù)、放療和化療的綜合治療，但手術(shù)僅適用于早期的宮頸癌患者，晚期患者只能依靠放療、化療，而對(duì)于腫瘤復(fù)發(fā)患者的治療效果就更差。同時(shí)，以上提及的治療手段對(duì)患者造成的創(chuàng)傷大，副反應(yīng)嚴(yán)重，而且對(duì)于年輕的患者還可能剝奪其生育功能。因此，微創(chuàng)、副反應(yīng)小的治療方法是醫(yī)藥研究者一直以來(lái)努力的方向。研究證實(shí)人乳頭狀瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因。HPV病毒有多種亞型，不同亞型對(duì)宮頸上皮的致病力不同，HPV主要分為高危型和低危型，高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸癌的主要原因，高危型HPV的轉(zhuǎn)化特性主要存在于兩個(gè)基因E6和E7，其中E6可與p53結(jié)合導(dǎo)致p53失活，并促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)的降解，從而使細(xì)胞周期失控，抑制細(xì)胞凋亡；E7則與非磷酸化pRb(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白)結(jié)合，導(dǎo)致Rb蛋白功能失活，改變了細(xì)胞生長(zhǎng)周期的調(diào)控機(jī)制，使細(xì)胞永生化和惡變(ZtoorZar/ifo7ec〃JarWoJog/力咖朋iW^r^W.'5^5-W)。非磷酸化Rb蛋白(pRb)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)功能，pRb可以通過(guò)同轉(zhuǎn)錄因子E2F的結(jié)合抑制細(xì)胞增殖，磷酸化pRb失去對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的控制。HPV病毒的E7蛋白能與pRb結(jié)合，使pRb與E2F不能形成復(fù)合體，游離的E2F便促進(jìn)進(jìn)入S期所需蛋白的轉(zhuǎn)錄。因此，細(xì)胞生長(zhǎng)不受限制，促進(jìn)了感染細(xì)胞惡性化的進(jìn)展。E7的這種作用對(duì)于細(xì)胞的增生過(guò)程是非常重要的(5e/^"eZ/a/^C力叫^m7o邁朋.foz^r《"/朋/扁'7y腦6erp，/ora^r油"肌尸愿，asAe_rtargetsoft力es鵬W"朋f/it/s0/2co;i"-ofei/s.。/co《e"e.,iVM05入5^77-《5！)。研究表明，HPVE7是通過(guò)一條含有9個(gè)氨基酸殘基的LxCxE肽與RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)中的BBox結(jié)合的，RBA-Bbox是一個(gè)含有405個(gè)氨基酸殘基的蛋白，分子量約為45KDOz'e-Zee,^h'c/aA化^so&Ho7a尸.泛素蛋白復(fù)合體目標(biāo)性降解蛋白途徑在真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)代謝過(guò)程中起重要作用。泛素介導(dǎo)的蛋白降解過(guò)程主要由3種酶組成泛素活化酶E1、泛素耦聯(lián)酶E2、E3泛素連接酶。SCF類(lèi)E3連接酶是目前研究比較深入的一類(lèi)連接酶，SCF復(fù)合體的名稱來(lái)源于其中的3個(gè)亞基Skpl、Cdc53(cullin)、F-box蛋白，另外一個(gè)亞基是RBX1。除F-box蛋白以外的3個(gè)亞基組成一個(gè)一般骨架，通過(guò)與不同的F-box蛋白結(jié)合識(shí)別不同的底物，即F-box蛋白決定了底物識(shí)別的特異性。F-box蛋白是一類(lèi)含有F-box基序(motif)，在泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解過(guò)程中具有底物識(shí)別特性的蛋白質(zhì)家族，這類(lèi)蛋白質(zhì)在細(xì)胞時(shí)相轉(zhuǎn)換、信號(hào)傳導(dǎo)、發(fā)育等多種生理過(guò)程中都具有重要功育g(尸e/2^"力oZZo〃.7krgefec^/i"ofeY/G^egracfefio",C〃rreytQw'/2io/C力,.ca7A'。7。^j，<5Y^.'57-幼。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程疫苗的研究成為治療和預(yù)防因HPV病毒感染而引發(fā)的疾病的重要方法，雖然治療型疫苗的研究已取得了一定的進(jìn)展，但是存在著制備成本高，免疫源性不強(qiáng)等弱點(diǎn)，因此，尋找廉價(jià)與高效的疫苗是研究工作者努力的方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能敲除HPVE7蛋白的融合蛋白。本發(fā)明所提供的融合蛋白，是如下(1)或(2)的蛋白質(zhì)(1)包括人F-box蛋白的結(jié)構(gòu)域和人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域；所述人F-box蛋白的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是自GenBankAccessionNumber:AAF04464的氨基末端第1位至254位氨基酸殘基；所述人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是自GenBankAccessionNumber:NP—000312的氨基末端第379位至787位氨基酸殘基；(2)將(1)的融合蛋白的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能敲除HPVE7蛋白的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。所述融合蛋白，具體可為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能敲除HPVE7蛋白的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2由691個(gè)氨基酸殘基組成。自序列表中序列2的氨基末端的第12位至265位為人F-box蛋白的結(jié)構(gòu)域；自序列表中序列2的氨基末端的第283位至691位為人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域；自序列表中序列2的氨基末端的第266位至282位為連接肽。為了使(1)和(a)中的融合蛋白便于純化，可在(1)和(a)中的融合蛋白的氨基酸殘基序列的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(2)和(b)中的融合蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的融合蛋白的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述融合蛋白的編碼基因，其核苷酸序列是編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)的多核苷酸。所述融合蛋白的編碼基因，具體可為如下c)或d)的基因c)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第16位至2091位脫氧核糖核苷酸；d)在嚴(yán)格條件下與c)限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5%SDS，5XDenhardt,0.1mg/mL鮭精DNA的溶液中，在65。C下雜交，并用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液洗膜。序列表中的序列1由2100個(gè)脫氧核糖核苷酸組成。序列表中序列1的自5'末端第16位至2091位脫氧核糖核苷酸為編碼序列。含有上述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因重組細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明根據(jù)HPVE7在宿主細(xì)胞內(nèi)的作用特點(diǎn)及真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的特點(diǎn)，構(gòu)建了本發(fā)明的融合蛋白，該融合蛋白包含決定底物識(shí)別的特異性的結(jié)構(gòu)域一F-box蛋白的結(jié)構(gòu)域和與HPVE7蛋白特異結(jié)合的人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域，研究表明在泛素蛋白降解系統(tǒng)中泛素連接酶E3是選擇性降解蛋白質(zhì)的關(guān)鍵因素，它可以識(shí)別被降解的蛋白質(zhì)并將泛素連接到底物上，從而最終形成蛋白酶體對(duì)底物的降解，其中F-box蛋白是E3連接酶中識(shí)別底物的關(guān)鍵所在，因此在本發(fā)明中對(duì)F-box蛋白進(jìn)行了相應(yīng)改造，使其融合了人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)可以特異性的與HPVE7蛋白結(jié)合，這樣HPVE7蛋白可以被本發(fā)明所表達(dá)的融合蛋白識(shí)別，從而進(jìn)入泛素介導(dǎo)的蛋白降解過(guò)程，達(dá)到最終敲除HPVE7蛋白目的。因此該融合蛋白能敲除HPVE7蛋白，降低人乳頭瘤病毒對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力，并最終能夠消除其危害。實(shí)驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)染含有本發(fā)明融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體pcDNA3.一F-box-RBABbox的Hela細(xì)胞中的HPV18型E7蛋白被敲除。本發(fā)明的融合蛋白的編碼基因克隆于人源細(xì)胞，且在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了帶myc標(biāo)簽的融合蛋白，不但易于分離純化，還克服了異源蛋白的免疫源性。本發(fā)明的融合蛋白，和/或含有本發(fā)明融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體，和/或本發(fā)明融合蛋白編碼基因可用于敲除HPVE7蛋白，可用于制備預(yù)防和/或治療HPV感染所致疾病的藥物。本發(fā)明還提供了預(yù)防和/或治療HPV感染所致疾病的藥物。本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療HPV感染所致疾病的藥物，它的活性成分可為上述融合蛋白，還可為含有該融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體。所述HPV感染所致疾病可為宮頸癌。需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。該藥物可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。所述藥物可通過(guò)注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機(jī)體。圖1為PC財(cái)廣增F-box、RBABbox基因和F-box—RBABbox融合基因片段的l。/o瓊脂糖電泳結(jié)果其中l(wèi):DNAMarker,2:F-box，3:RBABbox,4:F—box—RBABbox。圖2為PCR鑒定pcDNA3.F-box-RBABbox陽(yáng)性克隆其中l(wèi):DNAMarker,2:F-box—RBABbox。圖3為EcoRV和XbaI雙酶切鑒定pcDNA3.l(+)—F-box-RBABbox陽(yáng)性克隆其中l(wèi):DNAMarker,2:重組質(zhì)粒pcDNA3.l(+)—F-box-RBABbox的酶切片段，5000bp左右處為pcDNA3.l(+)、2000bp左右處為F-box—RBABbox融合基因，3:pcDNA3.l")空質(zhì)粒。圖4為Westernblot檢測(cè)融合蛋白F-box-RBABbox的表達(dá)其中l(wèi):蛋白質(zhì)Marker，2:重組蛋白F-box-RBABbox,大小約為70KD左右。圖5為Westernblot檢測(cè)融合蛋白F-box-RBABbox在Hela細(xì)胞中敲除HPVE7蛋白的效果其中，A中l(wèi):蛋白質(zhì)Marker，2:轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)_F-box-RBABbox的Hela細(xì)胞中HPV18E7蛋白的表達(dá)，3:轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒pcDNA3.l("的Hela細(xì)胞中HPV18E7蛋白的表達(dá)。B圖是使用Gel-ProAnalyzer軟件對(duì)Westernblot結(jié)果進(jìn)行灰度分析的結(jié)果，其中l(wèi):轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)—F-box-RBABbox后Hela細(xì)胞中HPV18E7蛋白表達(dá)的灰度值，2:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)后Hela細(xì)胞中HPV18E7蛋白表達(dá)的灰度值。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的融合蛋白F-box-RBABbox通過(guò)下述步驟獲得①目的基因的獲得從Hela細(xì)胞中分別擴(kuò)增人F-box蛋白結(jié)構(gòu)域編碼序列和人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域編碼序列片段，根據(jù)已知的上述兩條基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)引物，并加上myc標(biāo)簽，用RT-PCR方法擴(kuò)增出這兩條基因的cDNA序列。②構(gòu)建融合蛋白基因兩段PCR產(chǎn)物分別酶切后連接，以連接產(chǎn)物為模板，用PCR方法得到融合蛋白基因。③構(gòu)建pcDNA3.1(+)—F-box-RBABbox載體融合蛋白基因雙酶切后連接入pcDNA3.1(+)載體中，經(jīng)酶切、PCR鑒定后，對(duì)插入序列進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)插入片段含有F-box蛋白結(jié)構(gòu)域編碼序列和人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域編碼序列。④pcDNA3.1")—F-box-RBABbox在Hela細(xì)胞中的表達(dá)重組質(zhì)粒使用Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染進(jìn)入Hela細(xì)胞，用westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后樣品，證明有融合蛋白F-box-RBABbox的表達(dá)。再用westernblot的實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)重組蛋白有結(jié)合HPV18型E7蛋白的功能，即可敲除E7蛋白。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。本發(fā)明所涉及的各種實(shí)驗(yàn)材料，除了已在文中注明了來(lái)源的，其他的材料均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品，本發(fā)明中所提及的引物和測(cè)序服務(wù)均由上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司提供。實(shí)施例l、融合蛋白F-box-RBABbox的表達(dá)1.融合蛋白F-box-RBABbox基因的獲得采用TRIzol(Gibco)提取Hela(ATCC)細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)驗(yàn)具體方法是lugRNA+lug01igo(dT)18(Promega)，70。C反應(yīng)5分鐘后，立即置于冰上2分鐘，再加M-MLV5XReactionBuffer(Promega)1，2.5raMdNTP(Promega)5pl，RecombinantRNasinRibonucleaseInhibitor(Promega)25units,M-MLVRT(Promega)200units,力口DEPCH20至25ul，混勻，42。C反應(yīng)l小時(shí)。然后采用巢式PCR的方法得至ljF-box蛋白結(jié)構(gòu)域編碼序列和人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域編碼序列片段。其中巢式PCR的第一次PCR引物分別是F-box蛋白結(jié)構(gòu)域編碼序列的上游引物(pffl):5，-TGGCCTCGGCGATTATGGAC-3，，下游引物(pfrl):5，-AAACTATGTCTTCCACATCTCCAATTAG-3，，RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域編碼序列片段的上游引物(pafl):5，-TCCACACACTCCAGTTAGGACTG-3，，下游引物(pari):5，—AGGGCTTCGAGGAATGTGAG-3，。反應(yīng)體系均為ddH2019ul，DMS05ul，2.5mMdNTP(Takara)4u1，5Xprimestarbuffer(Takara)10u1，4umol/L上幼,弓l物5y1，4umol/L下游引物5u1，cDNA(HeLa)2u1，PrimeSTARDNApolymerase(2.5U/u1)(Takara)0.5ul，反應(yīng)體積為50u1。F-box蛋白結(jié)構(gòu)域編碼序列的反應(yīng)條件為98變性2分鐘50秒;98。C10秒，60。C10秒，72。C40秒，20個(gè)循環(huán)，72。C延伸6分鐘。RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域編碼序列片段的反應(yīng)條件為98變性2分鐘50秒；98。C10秒，58°。10秒，72X:i分30秒，20個(gè)循環(huán)，72。C延伸6分鐘。接下來(lái)分別用上述PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二次PCR，以獲得最終的目的片段，其中第二次PCR的引物分別是F-box蛋白結(jié)構(gòu)域編碼序列的上游引物(pff2):5'-GTCGATATCGCCACCATGGAACAAAAACTTATTTCTGMGAAGATCTGATGGACCCGGCCGAGG-3'，下游引物(pfr2):5，-GTCGGATCCTCTTCCACATCTCCAATTAGATTC-3，，上述兩條引物分別含有EcoRV和BamHI的酶切位點(diǎn)；RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域編碼序列片段的上游引物(paf2):5，-CTGGGATCCGGCTCAGGCTCAGGATCAGGCTCACACACTCCAGTTAGGACTGTTATGA-3'，下游引物(par2):5，-GTCTCTAGATTATCGAGGAATGTGAGGTATTGGTG-3，，上述兩條引物分別含有BamHI和XbaI的酶切位點(diǎn)。反應(yīng)體系均為ddH2031u1,DMSOlOix1，2.5raMdNTP8u1，5Xprimestarbuffer(Takara)20u1，4umol/L上游弓I物IOu1，4ymol/L下游引物10ul，第一次PCR產(chǎn)物10u1，PrimeSTARDNApolymerase(Takara)(2.5U/ul)lul，反應(yīng)體積為100ul。F-box蛋白結(jié)構(gòu)域編碼序列的第二次PCR反應(yīng)條件為98變性2分鐘50秒;98。C10秒，57。C10秒，72。C40秒，20個(gè)循環(huán)，72。C延伸6分鐘。RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域編碼序列片段的反應(yīng)條件為98'C變性2分鐘50秒；98。C10秒，57。C10秒，72。Cl分30秒，20個(gè)循環(huán)，72。C延伸6分鐘。PCR產(chǎn)物用l。/。瓊脂糖電泳鑒定，結(jié)果如圖l所示，分別得到了大小為819bp的F-box蛋白結(jié)構(gòu)域編碼序列和1293bp的B蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域編碼序列片段。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分離后，回收并克隆到pMD18-TVector載體上，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明，該819bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列是序列表中的序列3，包括F-box蛋白結(jié)構(gòu)域的編碼cDNA序列(自序歹U3的5'末端第16—810位脫氧核糖核苷酸)；該1293bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列是序列表中的序列4，包括人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域的編碼cDNA序列(自序列4的5'末端第55—1284位脫氧核糖核苷酸)。2.構(gòu)建融合蛋白F-box-RBABbox基因應(yīng)用QIAquickGelExtractionKit(Qiagen)回收上述兩條目的基因片段，用BamHI(Takara)分別酶切上述兩條片段，切膠回收后，酶切產(chǎn)物l:l混合(總體積5itl)，再加入等體積(5ul)的LigationMix(Takara)，混勻后16。C反應(yīng)3小時(shí)后，以此連接產(chǎn)物為模板，用F-box蛋白結(jié)構(gòu)域第二次PCR的上游引物(pff2)和人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域第二次PCR的下游引物(par2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小約為2kb的F-box-RBABbox片段，反應(yīng)體系為ddH2031ul，DMS010ul，2.5mMdNTP8u1，5Xprimestarbuffer(Takara)20u1，4umol/L上游弓I物IOu1，4nmol/L下游引物10u1，連接產(chǎn)物10u1，PrimeSTARDNApolymerase(Takara)(2.5U/u1)lul，反應(yīng)體積為100ul。PCR反應(yīng)條件為98變性2分鐘50秒；98。C10秒，58°C10秒，72。C40秒，40個(gè)循環(huán)，72'C延伸6分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物包含有EcoRV(Takara)和XbaI(Takara)的酶切位點(diǎn)，反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳鑒定(圖l)。3.構(gòu)建pcDNA3.F-box-RBABbox載體用EcoRV和XbaI分別對(duì)膠回收純化后的pcDNA3.(Invitrogen)和F-box-RBABbox片段進(jìn)行雙酶切，按載體酶切產(chǎn)物=1:4比例混合(總體積5ul)，再加入等體積(5ul)的LigationMix，混勻后16。C反應(yīng)過(guò)夜；連接液全部加入100iUDH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘，42"C90秒，再冰上放置2分鐘，加入900u1LB培養(yǎng)基，37°C200rpm培養(yǎng)l小時(shí)，低速離心后取下層菌液300yl涂布含有氨芐青霉素(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基中，37。C過(guò)夜培養(yǎng)。挑取菌落，加入到2ml含有氨芐青霉素(100wg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，用QIApr印SpinMinipr印Kit(Qiagen)提取質(zhì)粒，用PCR和EcoRV和XbaI雙酶切進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖2和3所示，鑒定出的陽(yáng)性質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明，陽(yáng)性重組質(zhì)粒含有核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi)的F-box-RBABbox基因，將該重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1(+)_F-box-RBABbox。4.pcDNA3.1(+)—F-box-RBABbox在Hela細(xì)胞中的表達(dá)使用LipofectamineTM2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染pcDNA3.l(+)—F-box-RBABbox質(zhì)粒進(jìn)入Hela細(xì)胞，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑說(shuō)明書(shū)，簡(jiǎn)單陳述如下①轉(zhuǎn)染前一天，在不包含抗生素的含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度達(dá)到70-80%;②.在0pti-MEJ^I低血清培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，輕輕混勻；③稀釋適量的試劑到0pti-MEJ^I低血清培養(yǎng)基，輕輕混勻后在室溫下孵育5分鐘；④孵育5分鐘后，混合稀釋的質(zhì)粒和稀釋的LipofectamineTM2000，輕輕混合，在室溫下孵育20分鐘，以允許復(fù)合物的形成；將質(zhì)粒-LipofectamineTM2000復(fù)合物加入到每一個(gè)包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中。通過(guò)輕輕地前后搖動(dòng)培養(yǎng)板混合。⑥37"C，C02培養(yǎng)箱孵育48小時(shí)，收集樣品，以c-MycAntibody為一抗(SantaCruz，sc-56634)，并按照文獻(xiàn)"薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T著.金冬雁，黎孟楓譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，北京科學(xué)出版社，1992.第889—898頁(yè)"中描述的方法進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，證明有融合蛋白F-box-RBABbox的表達(dá)。實(shí)施例2、pcDNA3.l(+)_F-box-RBABbox在Hela細(xì)胞中降解HPV18型E7蛋白的效果使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染pcDNA3.l(+)—F-box-RBABbox質(zhì)粒進(jìn)入Hela細(xì)胞，具體實(shí)驗(yàn)步驟如上所述，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，以HPV18E7Antibody為一抗(SantaCruz，sc-51952)，并按照文獻(xiàn)"薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T著.金冬雁，黎孟楓譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，北京科學(xué)出版社，1992.第889—898頁(yè)"中描述的方法進(jìn)行Westernblot，檢測(cè)HPV18型E7蛋白的水平，結(jié)果如圖5中A;并使用Gel-ProAnalyzer軟件對(duì)Westernblot結(jié)果進(jìn)行灰度分析，結(jié)果如圖5中B所示，結(jié)果證明本發(fā)明所表達(dá)的融合蛋白可以敲除HPV18型E7蛋白。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><row><column>〈210>2〈211〉691<212〉PRT<213〉人工序列〈220〉<223><400>2</column></row><row><column>ValAlaLysThrLysLeuAlaAsnGlyThrSerSerMetlieValPro859095LysGinArgLysLeuSerAlaSerTyrGluLysGluLysGluLeuCys100105110ValLysTyrPheGluGinTrpSerGluSerAspGinValGluPheVal115120125GluHisLeulieSerGinMetCysHisTyrGinHisGlyHislieAsn130135140SerTyrLeuLysProMetLeuGinArgAspPhelieThrAlaLeuPro145150155160AlaArgGlyLeuAspHislieAlaGluAsnlieLeuSerTyrLeuAsp165170175AlaLysSerLeuCysAlaAlaGluLeuValCysLysGluTrpTyrArg180185190ValThrSerAspGlyMetLeuTrpLysLysLeulieGluArgMetVal195200205ArgThrAspSerLeuTrpArgGlyLeuAlaGluArgArgGlyTrpGly210215220GinTyrLeuPheLysAsnLysProProAspGlyAsnAlaProProAsn225230235240SerPheTyrArgAlaLeuTyrProLyslielieGinAsplieGluThr245250255lieGluSerAsnTrpArgCysGlyArgGlySerGlySerGlySerGly260265270SerGlySerHisThrProValArgThrValMetAsnThrlieGinGin275280285LeuMetMetlieLeuAsnSerAlaSerAspGinProSerGluAsnLeu290295300lieSerTyrPheAsnAsnCysThrValAsnProLysGluSerlieLeu305310315320LysArgValLysAsplieGlyTyrliePheLysGluLysPheAlaLys325330335AlaValGlyGinGlyCysValGlulieGlySerGinArgTyrLysLeu340345350GlyValArgLeuTyrTyrArgValMetGluSerMetLeuLysSerGlu355360365GluGluArgLeuSerlieGinAsnPheSerLysLeuLeuAsnAspAsn370375380liePheHisMetSerLeuLeuAlaCysAlaLeuGluValValMetAla385390395400ThrTyrSerArgSerThrSerGinAsnLeuAspSerGlyThrAspLeu405410415SerPheProTrplieLeuAsnValLeuAsnLeuLysAlaPheAspPhe420425430TyrLysVallieGluSerPhelieLysAlaGluGlyAsnLeuThrArg435440445GluMetlieLysHisLeuGluArgCysGluHisArglieMetGluSer450455460LeuAlaTrpLeuSerAspSerProLeuPheAspLeulieLysGinSer465470475480LysAspArgGluGlyProThrAspHisLeuGluSerAlaCysProLeu485490495AsnLeuProLeuGinAsnAsnHisThrAlaAlaAspMetTyrLeuSer500505510ProValArgSerProLysLysLysGlySerThrThrArgValAsnSer515520525ThrAlaAsnAlaGluThrGinAlaThrSerAlaPheGinThrGinLys530535540ProLeuLysSerThrSerLeuSerLeuPheTyrLysLysValTyrArg545550555560LeuAlaTyrLeuArgLeuAsnThrLeuCysGluArgLeuLeuSerGlu565570575HisProGluLeuGluHislielieTrpThrLeuPheGinHisThrLeu580585590GinAsnGluTyrGluLeuMetArgAspArgHisLeuAspGinlieMet595600605MetCysSerMetTyrGlylieCysLysValLysAsnlieAspLeuLys610615620PheLyslielieValThrAlaTyrLysAspLeuProHisAlaValGin625630635640GluThrPheLysArgValLeulieLysGluGluGluTyrAspSerlie645650655lieValPheTyrAsnSerValPheMetGinArgLeuLysThrAsnlie660665670LeuGinTyrAlaSerThrArgProProThrLeuSerProlieProHis675680685lieProArg690<210>3〈211〉819<212〉腿〈213〉人工序列<220〉〈223〉<400〉3<image>imageseeoriginaldocumentpage17</image>atttttcatatgtctttattggcgtgcgctcttgaggttgtaatggccacatatagcaga420agtacatctcttctggaacagatttgtctttcccatggattctgaatgtg480ctt3attta^aagcctttgattttt￡LCaa￡Lgtgatcgaaagttttatcaa540aacttgac^gagaaatg3tg認(rèn)gatgtgaacatcgaatcatggaatcc600cttgcatggctctcagattcacctttatttgatcttattaggaxxgag^660gg3ccaax:1:gatcaccttgaatctgcttgtcctcttaatcttcctctccagaataatcac720actgcagcagatatgtatctttctcctgtaagatctccaaagaaaaaaggttcaactacg780cgtgtaaattctactgcaaatgcagagacacaagcaacctcagccttccagacccagaag840cc3ttgaa^tctacctctctttcactgttttgtatcggctagcctatctc900cactttgtgaacgccttctgtctgagcacccagaattagaacatatcatc960tggacccttttccagcacaccctgcagaMtcatgagagacaggcatttg1020tgatgtgttccatgtatggcatatgcaa^gtg犯g犯t^t1080ttcaaaatcattgtMcagcata<ca^gg8tcttcctcatgctgttcagga1140cgtgttttgatcaaaga^gaiggagt3tg3ttctattatagtattct3taactcggtcttc1200atgca^gactgaaaaca^atattttgcagtatgcttccaccaggccccctaccttgtca1260ccaatacctcacattcctcggac129權(quán)利要求1、一種能敲除HPVE7蛋白的融合蛋白，是如下(1)或(2)的蛋白質(zhì)(1)包括人F-box蛋白的結(jié)構(gòu)域和人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域；所述人F-box蛋白的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是自GenBankAccessionNumberAAF04464的氨基末端第1位至254位氨基酸殘基；所述人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是自GenBankAccessionNumberNP_000312的氨基末端第379位至787位氨基酸殘基；(2)將(1)的融合蛋白的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能敲除HPVE7蛋白的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能敲除HPVE7蛋白的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。3、權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白的編碼基因。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因，為如下c)或d)的基因c)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第16位至2091位脫氧核糖核苷酸；d)在嚴(yán)格條件下與c)限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白的DNA分子。5、含有權(quán)利要求1或2所述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在pcDNA3.1(+)的EcoRV和XbaI位點(diǎn)間插入序列表中的序列1的DNA序列得到的重組表達(dá)載體。7、含有權(quán)利要求1或2所述融合蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)基因重組細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因重組菌。8、預(yù)防和/或治療HPV感染所致疾病的藥物，它的活性成分是權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，或權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體。9、權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，和/或權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白編碼基因，和/或權(quán)利要求'5或6所述的重組表達(dá)載體在制備預(yù)防和/或治療HPV感染所致疾病的藥物中的應(yīng)用。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物和權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述HPV感染所致疾病為宮頸癌；所述HPV為HPV18型。11、權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，和/或權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體，禾口/或權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白編碼基因在敲除HPVE7蛋白中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種能敲除HPVE7蛋白的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該融合蛋白，是如下(1)或(2)的蛋白質(zhì)包括人F-box蛋白的結(jié)構(gòu)域和人RB蛋白的A-Bbox結(jié)構(gòu)域，(2)將(1)的融合蛋白的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能敲除HPVE7蛋白的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。該融合蛋白，和/或該融合蛋白編碼基因，和/或含有該融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體可用于敲除HPVE7蛋白，用于制備預(yù)防和/或治療HPV感染所致疾病的藥物。文檔編號(hào)A61P35/00GK101100487SQ20071011781公開(kāi)日2008年1月9日申請(qǐng)日期2007年6月25日優(yōu)先權(quán)日2007年6月25日發(fā)明者吉雁鴻,張雅鷗申請(qǐng)人:清華大學(xué)深圳研究生院