專利名稱：：一種新的殺菌肽及其產(chǎn)生菌株和用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物資源利用領域。尤其是，本發(fā)明涉及一種新的殺菌肽及其產(chǎn)生菌株和用途。
背景技術：
：眾所共知，自1928年Flamin發(fā)明青霉素并于40年代實際應用于人類以來，各種產(chǎn)自微生物代謝產(chǎn)物的抗生素層出不窮，挽救了無數(shù)的生命，為人類健康作出了不可磨滅的貢獻。然而，隨著時間的推移，人們發(fā)現(xiàn)許多抗生素都存在一個致命的弱點，慢慢會產(chǎn)生耐藥性，有的還會在體內(nèi)積累，或通過生物循環(huán)、食物鏈的作用而間接進入人體內(nèi)，有些抗生素還會影響人的新陳代謝或生物合成，如氯霉素，因此已被停止應用。所以，人們迫切尋找抗生素的代用品或作為補充?？咕氖?0年代以來被看好的物質(zhì)之一。抗菌肽分子量小，一般為10000Da以下，因此，不產(chǎn)生抗原性；對細菌的作用機理獨特，主要是通過對細菌細胞膜穿孔的物理化學作用，與一般抗生素阻斷生物合成等途徑明顯不同，因此，比較難產(chǎn)生抗藥性。而且研究還發(fā)現(xiàn)，某些抗菌肽還有明顯的抑殺胂瘤細胞的作用。目前，抗菌肽的研究，已經(jīng)成為許多生物學家的研究熱點。目前，已經(jīng)從許多生物中發(fā)現(xiàn)了很多的抗菌肽。如從昆蟲、蛙類、豬小腸、植物、真菌、細菌等眾多生物中發(fā)現(xiàn)了各種各樣的抗菌肽，有些已在應用，如多肽抗菌素，有些已進入臨床ni試驗。但由于抗菌肽在生物體中含量不高，提取困難，自然成本就高，限制了它的實際應用。尋找效價高、來源易、成本低的抗菌肽，成為許多生物學家追求的目標。因此從微生物代謝產(chǎn)物中尋找抗菌肽是新藥研究中的重要課題之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠產(chǎn)生新的殺菌肽的芽孢桿菌CP7菌株。能高效分泌抗菌蛋白的CP7菌株是多粘類芽孢桿菌(Pflem'&fldZ/ws,已于2005年10月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCCNO:M205119。根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》、《芽孢桿菌屬》、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》等對芽孢桿菌的特征和種的描述，上述CP7菌株的形態(tài)特征和生理生化特性與多稱類芽孢桿菌的形態(tài)特征和生理生化特性的描述相一致。因而屬于多粘類芽孢桿菌(尸fle"必fld/Z";spo/;ywyxfl)。用16SrDNA序列分析法進行生物分子的分類，該菌株16SrDNA序列與34個類芽孢桿菌屬(i^em'&flc說"s)的細菌的同源性為96%-99%，與多粘類芽孢桿菌po/ymym)的同源性為99%。同樣表明CP7菌株屬于多熬類芽孢桿菌(P;ofym戸fl)。16SrDNA序列已在GenBank上登錄，注冊號為AY772704。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種新的殺菌肽，該殺菌肽由上述菌株發(fā)酵液中分離，由國家生物醫(yī)學分析中心測定該抗菌肽的分子量為2510Da,由23個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA;經(jīng)該中心的檢索為未知多肽。經(jīng)圓二色譜初步檢測分析出其二級結構，該多肽在溶液中有74.5%呈p-折疊，25.5%為無規(guī)卷曲，沒有a-螺旋和轉(zhuǎn)角。利用軟件DNASIS計算出其等電點為11.13即Cpadn為陽離子型肽，與已經(jīng)公開的在各種細菌中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有很大差別(很多都有cx-螺旋結構或環(huán)狀結構)，根據(jù)得到的多肽氨基酸序列經(jīng)國際互聯(lián)網(wǎng)的蛋白質(zhì)公用數(shù)據(jù)庫檢索，未發(fā)現(xiàn)有與其同源性的蛋白質(zhì)，表明是一種新的蛋白。現(xiàn)初步命名為Cpacin。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的多粘類芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)為多肽類的多粘菌素A、B、C、D、E系列，其中多粘菌素E和B已經(jīng)在臨床上應用，專門用于抗革蘭氏陰性菌。本課題組也從CP7菌株中分離出多粘菌素El,分子量為1169.822Da，另外還分離出與多粘菌素類似的3個抗菌活性系列物質(zhì)成分Bl(1155.703Da)、B2(1185.801Da)、C2(1191.923Da)，根據(jù)分子量的大小，其中B2和C2可能是多粘菌素的另兩種未知組分；經(jīng)我們的測試，也是只對革蘭氏陰性菌有抑殺作用。另外還克隆到p-l,3-1，4-葡聚糖酶的基因，經(jīng)初步研究該活性組分為抗真菌的組分。圖1是CP7菌株的菌體形態(tài)。其中A'為營養(yǎng)體，B，為孢子囊、芽孢。圖2是CP7菌株與相近菌株的聚類圖。圖3是CP7菌抗菌肽分離純化技術路線。圖4是固相萃取(Sep-Pak)各活性組分的分離效果。其中出芽短梗霉作為真菌的指示菌；大腸桿菌為革蘭氏陰性菌的指示菌；金黃葡萄球菌為革蘭氏陽性菌的指示菌。以0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%(圖中濃度0—10分別表示0%~100%)的異丙醇水溶液分步梯度洗脫，檢測各步收集的洗脫液的抗菌活性。圖5是各活性組分的抗菌效果測試。其中A為抗真菌活性組分，B為多粘菌素El,C為Cpacin,CK為滅菌水，D為出芽短梗霉，E為大腸桿菌，F(xiàn)為金黃葡萄球菌。圖6是Cpadn的反相-高效液相色譜(RP-HPLC)層析效果。圖7是國家生物醫(yī)學分析中心測定Cpaciri的分子量結果。圖8是國家生物醫(yī)學分析中心測定Cpacin的氨基酸序列結果。圖9是Cpadn經(jīng)圓二色譜分析結果。其中G為標準品色譜圖，H為Cpacin色譜圖。圖IO是Cpadn耐熱性測試結果。其中指示菌為金黃葡萄球菌。具體實施例方式實施例1.CP7菌株的篩選與鑒定菌株篩選自本實驗室冷凍保存的樣品，用傳統(tǒng)的平板劃線法分離。平板培養(yǎng)基為YEPD固體培養(yǎng)基(100mL):YEASTEXTRACT1.0g，TRYPTONE2,0g,Glucose2.0g，蒸餾水100mL，自然pH值，加1.5%的瓊脂；產(chǎn)抗菌蛋白的液體培養(yǎng)基為(lOOmL):YEASTEXTRACT1.0g，TRYPTONE2.0g,Glucose2.0g,蒸餾水100mL,自然pH值。LB培養(yǎng)基(100mL):TRYPTONE1.0g,YEASTEXTRACT0.5g，Nacll.Og，蒸餾水100mL，pH7，固體培養(yǎng)基另加1.5%的瓊脂。按《伯杰細菌鑒定手冊》、《芽孢桿菌屬》、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》等中的方法和標準對CP7菌株進行形態(tài)特征和生理生化特性測定，結果見圖l和表l。表lCP7菌株的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>N03—N02—+卵磷脂酶+pH6.8肉湯生長+pH5.7肉湯+2%NaCl生長+5y。NaCl生長-7%NaCl生長_^_產(chǎn)"Cpacin"抗菌蛋白的CP7菌株的形態(tài)特征和生理生化特性與多粘類芽孢桿菌的形態(tài)特征和生理生化特性的描述相一致。因而菌種鑒定為多粘類芽孢桿菌(Pae"必fldZZ"s/7oZ戸yxa)。生物分子的分類法鑒定采用細菌16SrDNA的一對通用引物正向引物BsF8/20,反向引物BsR1541/20，序列由上海生物工程有限公司合成。BsF8/20:5，一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3'BsR1541/20:5，一AAGGAGGTGATCCAGCCGCA—3'CP7菌抹的基因組DNA用《細菌基因組DNA提取試劑盒》(北京百泰克生物技術有限公司)提取，PCR擴增條件參照許玫英等〖2"的方法進行。PCR反應體系的總體積50[iL，其中10xPCRbuffer5^iL，2.5mmol/LdNTPs4nl，引物各2pL,模板DNA2pL,TaqDNA聚合酶(10000U/mL)1mL,無菌水36pL,混勻后，在上面加10石蠟油防止水分揮發(fā)。PCR擴增反應程序94T:預變性4min，然后緊接94。C30s,57。C40s，72°C90s，35個循環(huán)后72。C延伸10min，4。C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳，采用《DNA快速純化/回收試劑盒》(北京鼎國生物技術有限責任公司)回收擴增的DNA片段。測序得到CP7菌株的16SrDNA的序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，結果見圖2。傳統(tǒng)細菌學方法和生物分子分類法鑒定的結果一致。說明CP7菌株屬于多粘類芽孢桿菌(i^em'&flc說MS/o/;ym戸fl)。實施例2.cp7菌株發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化對CP7菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基(100mL)的配方為花生餅粉10g，可溶性淀粉0.67g,MgS04.7H200.15g,K2HP043H200.1076g，自然pH值時，發(fā)酵液中的抗菌活性最高。通過單次單因素試驗，發(fā)現(xiàn)搖瓶發(fā)酵的適宜條件為培養(yǎng)溫度30。C、搖床轉(zhuǎn)速100r/min,接種量19Kv/v)菌液，自然pH值，培養(yǎng)48h。實施例3."Cpacin"的制備對CP7菌的發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)粗分離獲得粗提物(發(fā)酵液經(jīng)IO(TC熱處理15min，低溫高速離心后去沉淀的上清液。下同)，經(jīng)考馬氏藍反應為陽性，表明其為蛋白質(zhì)；然后經(jīng)葡聚糖凝膠過濾、陽離子交換或陰離子交換層析，快速或高效液相色譜反相層析等方法分別得到不同的抗菌活性組分。其分離純化路線見圖3。如圖所示，抗革蘭氏陰性菌的活性組分為多粘菌素El及其系列組分，已在此前分離鑒定；抗真菌的活性組分也通過基因克隆的方法初步確定其為p-l，3-1,4-葡聚糖酶；而Cpacin為本課題組最近分離的抗革蘭氏陽性菌的活性組分。圖4為分離的效果。各活性組分的抗菌效果如圖5如示，圖5中的D，是抗真菌(出芽短梗霉)的抑菌圈，其抑菌圈有18~20mm，E的抗G+菌的抑菌圈為16~18mm,F的抗G-菌的抑菌圈為8~10mm(用凝膠孔穴擴散法，孔的直徑2.7mm,加液量為5.5mL),用Hulmark(1980)對抗菌肽活性的檢測方法，其活性分別達到40000U/mL、30000U/mL、7000U/mL。實施例4."Cpacin"的活性鑒定瓊脂平板孔穴擴散法用接種環(huán)從￡.0^&2031菌種平板培養(yǎng)基上挑取單菌落于加有3mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C、250r/min振蕩培養(yǎng)過夜，吸取IO~50jiL轉(zhuǎn)接于3~5mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)3~5h,測OD值，用滅菌水稀釋為OD55()=0.001~0.01(此時菌液的濃度應為105~106細胞/mL)。吸取此稀釋液IO~20nL于有刻度的滅菌試管中，加入10mL經(jīng)溶解并冷卻至455(TC的LB固體培養(yǎng)基，迅速倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，注意轉(zhuǎn)搖和充分振蕩培養(yǎng)i，使菌體均勾分散，凝固后用直徑2，7mm的真空打孔器打孔，每孔加入5.5nL待測液，37。C倒置培養(yǎng)過夜，測量抑菌圏直徑。真菌培養(yǎng)基改為PDA,菌種為培養(yǎng)4天以后取分生孢子加入培養(yǎng)基倒平板，其余同細菌。實施例5."Cpacin"的鑒定反相-高效液相色譜(RP-HPLC)分離Cpacin的效果如圖6。上述組分送國家生物醫(yī)學分析中心測定該抗菌肽的分子量和氨基酸序列，結果如圖7、圖8。根據(jù)測定結果，Cpacin的分子量為2510Da;氨基酸序列為LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA。經(jīng)國家生物醫(yī)學分析中心檢索和分析，以及本課題組的初步檢索，該抗菌肽尚未見報道。實施例6."Cpacin"化學性質(zhì)的初步研究樣品在中山大學化工學院經(jīng)圓二色譜分析，結果如圖9。根據(jù)檢測結果，經(jīng)相關軟件分析，其結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上述結果初步分析，Cpacin在溶液中沒有a-螺旋，主要為(3-折疊，沒有轉(zhuǎn)角，部分表現(xiàn)為無規(guī)卷曲。與多肽族里天蠶素類有螺旋-鉸鏈-螺旋的結果明顯不同。對其結構，還有待進一步深入研究。Cpacin的熱穩(wěn)定性Cpacin樣品分別于恒溫水洛鍋中按下列條件處理，60。C20min;70。C20min;80。C10min，20min;90。C10min,20min;100。ClOmin，20min。結果如圖10。上述結果表明，Cpadn對熱不敏感，當100。C加熱20min時，其抗菌活性幾乎不受影響。實施例7."Cpacin"抗革蘭氏陽性菌譜的初步測定Cpacin對部分革蘭氏陽性菌的活性作用見表3。表3Cpadn抗革蘭氏陽性菌的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由上述結果可知，在所測試的6個菌株中，除了枯草桿菌的抑菌效果相對低一些以外，其余均表現(xiàn)出顯著的抗革蘭氏陽性菌作用。鑒于人類對抗生素的耐藥性日益嚴重，迫切尋找或補充新的替代品。本課題組所分離的CP7菌能產(chǎn)生抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的抗菌蛋白，其中抗革蘭氏陽性菌的Cpadn屬于新發(fā)現(xiàn)的抗菌多肽。該菌培養(yǎng)容易，經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基成本低，代謝產(chǎn)物抗菌活性高。除有希望開發(fā)為醫(yī)藥以外，還可以開發(fā)為飼料添加劑，替代抗生素用于家畜、家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖的疾病預防，以及植物的病害防治。權利要求1.一種殺菌肽，其特征在于，氨基酸序列為LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA。2.—種可產(chǎn)生權利要求1所述殺菌肽的多粘類芽孢桿菌3.如權利要求2所述的多粘類芽孢桿菌，其為CP7菌株，保藏號為CCTCCNO:M205119。4.一種用于CP7菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基，其特征在于，100mL該培養(yǎng)基含有如下配比的成分花生餅粉10g,可溶性淀粉0.67g,MgS04'7H200.15g，K2HP04.3H200.1076g;自然pH值。5.權利要求1所述的殺菌肽在抗革蘭氏陽性菌藥物制備中的應用。全文摘要本發(fā)明提供了一種能產(chǎn)生新抗菌多肽的CP7菌株，其產(chǎn)生的新抗菌多肽對革蘭氏陽性菌具有強烈的抑菌效果，經(jīng)測定為23個氨基酸殘基的小肽，其氨基酸序列為LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA。本發(fā)明還提供了新抗菌多肽在抗革蘭氏陽性菌藥物制備中的應用。文檔編號A61P31/04GK101104637SQ20071011897公開日2008年1月16日申請日期2007年6月15日優(yōu)先權日2007年6月15日發(fā)明者宋家清,宋雪艷,廖富蘋,徐鳳霞,林健榮,趙亞華,陳海英,黃旭華申請人:華南農(nóng)業(yè)大學