專(zhuān)利名稱(chēng)：非離子表面活性劑修飾的聚乙烯亞胺及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因載體材料，即非離子表面活性 劑修飾的聚乙烯亞胺，及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是將正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入耙細(xì)胞以糾 正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)。 但是由于缺乏安全、有效的基因載體，限制了其臨床應(yīng)用。目前使用的基因載 體一般分為病毒和非病毒載體，病毒載體轉(zhuǎn)染效率較高但存在著運(yùn)載能力低， 有潛在的安全威脅等問(wèn)題，所以非病毒載體逐漸引起了人們的重視。在眾多非 病毒載體中，聚乙烯亞胺(polyethylenimine， PEI)因其在體內(nèi)外有較高的轉(zhuǎn)染 效率，并且無(wú)免疫源性、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)而備受人們的重視。PEI的轉(zhuǎn) 染效率與其分子量相關(guān)，其分子量大于22kd時(shí)才可獲得滿(mǎn)意的轉(zhuǎn)染效果，然而 隨著PEI的分子量的增大，其細(xì)胞毒性隨之增加，這就限制了它在臨床的應(yīng)用。 為了克服PEI的缺點(diǎn)， 一般使用生物相容性的親水性聚合物，例如聚乙二醇 (PEG)修飾PEI (Kichler A, Chillon M， Leborgne C, Danos O, Frisch B. Intranasal gene delivery with a polyethylenimine-PEG conjugate. / Cbwfra/ 7 e/mse, 2002, 81(3):379-88),以此提高PEI/DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性，降低它的毒性，由于PEI 被親水性聚合物修飾后與細(xì)胞的親和力降低，使得基因無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效 率下降。
因此如何將PEI改造成細(xì)胞毒性小及轉(zhuǎn)染效率高的基因載體材料，是解決 PEI應(yīng)用難題的突破口。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于PEI，細(xì)胞毒性小、轉(zhuǎn)染效率高的基因載體。 本發(fā)明提供一種非離子表面活性劑修飾的聚乙烯亞胺，使用的非離子表面活 性劑是聚氧乙烯硬脂酸酯(polyoxyethylenestearate)。聚乙烯亞胺和聚氧乙烯硬 脂酸酯的摩爾比為1:1-20，較佳的摩爾比為1:1-5，最佳的摩爾比為1:1和1:2。 聚氧乙烯硬脂酸酯包含PEG鏈和硬脂酸鏈，PEG鏈可以降低PEI的細(xì)胞毒 性，而硬脂酸鏈可以增加PEI的親脂性，提高PEI對(duì)細(xì)胞的親和力，進(jìn)而提高 轉(zhuǎn)染效率。
本發(fā)明還提供了聚氧乙烯硬脂酸酯修飾的PEI的制備、修飾后的PEI的細(xì)胞 毒性、修飾后的PEI/DNA復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染。
一種非離子表面活性劑修飾的聚乙烯亞胺的制備方法
(A) 聚氧乙烯硬脂酸酯的活化 將聚氧乙烯硬脂酸酯溶于甲苯和二氯甲垸的混合溶劑中，加入三光氣，磁力
攪拌過(guò)夜，將有機(jī)溶劑蒸干，殘留物再用甲苯和二氯甲烷的混合溶劑溶解，加 入N-羥基琥珀酰亞胺，在磁力攪拌下緩慢滴加無(wú)水三乙胺，反應(yīng)3-8小時(shí)后， 將溶液過(guò)濾，濾液蒸干后得到活化的聚氧乙烯硬脂酸酯；
聚氧乙烯硬脂酸酯的活化方法還包括如文獻(xiàn)Nguyen HK， Lemieux P, Vinogradov SV, Gebhart CL， Gu6rin N， Paradis Q Bronich TK, Alakhov VY, Kabanov AV. Evaluation of polyether-polyethyleneimine graft copolymers as gene transfer agents. Ge恥77^， 2000， 7(2):126-38;曹榮月，錢(qián)之玉,劉飛鍵,胡燕,劉景晶. 重組L-門(mén)冬酰胺酶的聚乙二醇化學(xué)修飾及修飾后酶的穩(wěn)定性研究.^y^f眾夯 激染,家2004,25(3):135-8記載的方法。
(B) 活化后的聚氧乙烯硬脂酸酯修飾聚乙烯亞胺 將聚乙烯亞胺溶解在5-30%的乙醇溶液中，在攪拌下加入活化后的聚氧乙烯
硬脂酸酯，反應(yīng)16-48小時(shí)，將反應(yīng)液過(guò)葡聚糖凝膠柱，將未反應(yīng)的聚乙烯亞胺 去除，再經(jīng)過(guò)超濾純化，純化后的反應(yīng)液冷凍干燥得到經(jīng)聚氧乙烯硬脂酸酯修 飾的聚乙烯亞胺。
本發(fā)明修飾后的PEI的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
將PEI及修飾后的PEI以不同濃度梯度加入到Hela細(xì)胞的96孔板中，培養(yǎng) 24小時(shí)后使用MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性。結(jié)果是修飾后的PEI比未修飾的PEI顯示 出了較高的細(xì)胞活性。
本發(fā)明修飾后的PEI/DNA復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
Hela細(xì)胞消化后，均勻接種在24孔板上，加入培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h，使細(xì)胞 匯合度達(dá)到70%，轉(zhuǎn)染前，換上無(wú)血清的培養(yǎng)液。將修飾后的PEI溶于超純水 中，加入到等體積的質(zhì)粒DNA溶液中，在室溫下孵育30分鐘制成復(fù)合物。每 孔加入100|il的復(fù)合物(含DNA 2|ig)，輕輕搖動(dòng)24孔板使復(fù)合物鋪勻，孵育 5h后換含有10%血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。36h后測(cè)定蟲(chóng)熒光素酶。結(jié)果是修
飾后的PEI比未修飾的PEI顯示出很強(qiáng)的轉(zhuǎn)染效率。


圖1是修飾后的PEI與未修飾的PEI細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果。
圖2是修飾后的PEI與未修飾的PEI體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施并不僅限于此。
實(shí)施例l PEI的修飾
取0.550g聚氧乙烯硬脂酸酯(Solutol，德國(guó)巴斯夫公司)在50。C下真空干 燥24h，溶解在40ml甲苯和二氯甲烷的混合溶劑中(3:1)，加入三光氣0.149g， 磁力攪拌過(guò)夜。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)溶劑在5(TC下蒸干，剩余物重新溶解在 30 ml甲苯和二氯甲垸的混合溶劑中(2:1)，加入0.060g N-羥基琥珀酰亞胺， 滴加入無(wú)水三乙胺0.071ml。反應(yīng)4h后，反應(yīng)液過(guò)濾除去不溶物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去有機(jī)溶劑，得到活化的聚氧乙烯硬脂酸酯。
取5份PEI (0.25 g， 0.01 mmol， 25kd， sigma公司)分別溶解在10ml乙醇 溶液中(10%)，在持續(xù)攪拌下分別加入0.01， 0.02， 0.05， 0.1，和0.2 mmol 量的活化的聚氧乙烯硬脂酸酯，室溫?cái)嚢?4h，反應(yīng)液離心除去不溶物，過(guò)葡聚 糖凝膠柱(Sephadex G-75)除去未反應(yīng)的原料，經(jīng)冷凍干燥后得到純化的反應(yīng) 物，將不同修飾度的反應(yīng)物分別命名為Solutol-lg-PEI， Solutol-2g-PEI ， Solutol-5g-PEI， Solutol-10g-PEI和Solutol-20g-PEI 。 實(shí)施例2修飾后的PEI的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)
將Hda細(xì)胞接種在96孔板上，每孔約10,000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后分別 加入一系列濃度(2、 4、 6、 8、 16、 24、 32嗎/ml)的PEI和修飾后的PEI (Solutol-g-PEI)，繼續(xù)培養(yǎng)24h， MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性。從圖1中可以看出經(jīng) 修飾的PEI (Solutol-g-PEI)與未修飾的PEI相比，在各個(gè)濃度都顯示出了較強(qiáng) 的細(xì)胞活性。
實(shí)施例3修飾后的PEI的體外基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
將Hela細(xì)胞接種在24孔板上，每孔約10,000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h。將PEI和 經(jīng)修飾的PEI (Solutol-g-PEI)與質(zhì)粒pGL3 (可表達(dá)蟲(chóng)熒光素酶，購(gòu)自Promega
公司)在不同N/P比(N/P=10， 20， 30)下混合形成復(fù)合物，室溫孵育30min， 復(fù)合物分散在無(wú)血清的培養(yǎng)液中，加入到24孔板上，培養(yǎng)5h，替換含有血清的 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)。從圖2中可以看到，在 N/P-20或30時(shí)各種修飾度的PEI都比未修飾的PEI顯示出很強(qiáng)的轉(zhuǎn)染效率，在 N/P=10時(shí)Solutol-lg-PEI和Solutol-2g-PEI顯示了較強(qiáng)的轉(zhuǎn)染效率。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)聚氧乙烯硬脂酸酯修飾的PEI作為基因載體，毒性小， 轉(zhuǎn)染效率高，應(yīng)用前景廣泛。
權(quán)利要求
1、一種非離子表面活性劑修飾的聚乙烯亞胺，其特征在于非離子表面活性劑是聚氧乙烯硬脂酸酯，且聚乙烯亞胺和聚氧乙烯硬脂酸酯的摩爾比為1∶1-20。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種非離子表面活性劑修飾的聚乙烯亞胺，其特征在 于聚乙烯亞胺和聚氧乙烯硬脂酸酯的摩爾比為1:1-5 。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非離子表面活性劑修飾的聚乙烯亞胺，其特征在 于聚乙烯亞胺和聚氧乙烯硬脂酸酯的摩爾比為1:1或1:2。
4、 一種如權(quán)利要求1-3所述的非離子表面活性劑修飾的聚乙烯亞胺的制備方法， 包括如下步驟(A) 聚氧乙烯硬脂酸酯的活化；(B) 活化后的聚氧乙烯硬脂酸酯修飾聚乙烯亞胺 將聚乙烯亞胺溶解在5-30%的乙醇溶液中，在攪拌下加入活化后的聚氧乙烯硬脂酸酯，反應(yīng)16-48小時(shí)，將反應(yīng)液過(guò)葡聚糖凝膠柱，將未反應(yīng)的聚乙烯亞胺 去除，再經(jīng)過(guò)超濾純化，純化后的反應(yīng)液冷凍干燥得到經(jīng)聚氧乙烯硬脂酸酯修 飾的聚乙烯亞胺。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的非離子表面活性劑修飾的聚乙烯亞胺的制備方法，其 中的(A)步驟具體是將聚氧乙烯硬脂酸酯溶于甲苯和二氯甲垸的混合溶劑中， 加入三光氣，磁力攪拌過(guò)夜，將有機(jī)溶劑蒸干，殘留物再用甲苯和二氯甲垸的 混合溶劑溶解，加入N-羥基琥珀酰亞胺，在磁力攪拌下緩慢滴加無(wú)水三乙胺， 反應(yīng)3-8小時(shí)后，將溶液過(guò)濾，濾液蒸干后得到活化的聚氧乙烯硬脂酸酯。
6、 一種如權(quán)利要求1-3所述的非離子表面活性劑修飾的聚乙烯亞胺作為基因載 體材料的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因載體材料，即非離子表面活性劑修飾的聚乙烯亞胺，及其制備與應(yīng)用。PEI作為非病毒載體還存在細(xì)胞毒性大等缺點(diǎn)，目前使用生物相容性的親水性聚合物如聚乙二醇修飾PEI雖降低毒性，但轉(zhuǎn)染效率下降。本發(fā)明的目的在于提供一種基于PEI，細(xì)胞毒性小、轉(zhuǎn)染效率高的基因載體。本發(fā)明提供一種聚氧乙烯硬脂酸酯修飾的聚乙烯亞胺，本發(fā)明還提供了它的制備與應(yīng)用。修飾后的聚乙烯亞胺在體外顯示出了更低的細(xì)胞毒性和更高的轉(zhuǎn)染效率，克服了聚乙烯亞胺的缺點(diǎn)，為聚乙烯亞胺的廣泛應(yīng)用提供了可靠的技術(shù)保障。
文檔編號(hào)A61K47/32GK101199852SQ20071017172
公開(kāi)日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日
發(fā)明者丁雪鷹, 曄 佟, 唐文燕, 尹東鋒, 怡 張, 顧圣瑩, 申 高, 靜 高 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)