專利名稱：：B7-1、cd40l質(zhì)粒混合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及腫瘤免疫
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，是一種由質(zhì)粒B7-l和質(zhì)粒CD40L聯(lián)合組成的質(zhì)粒混合物。
背景技術(shù)：
：目前，腫瘤免疫治療是近年來(lái)淋巴瘤治療的一個(gè)重要方向，腫瘤免疫治療主要包括四方面①免疫基因治療②腫瘤細(xì)胞疫苗③基于抗體的免疫治療④重組細(xì)胞因子的聯(lián)合治療。目前臨床試驗(yàn)應(yīng)用較多的為細(xì)胞疫苗治療，即通過對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外修飾、培養(yǎng)將其制作為瘤苗回輸患者體內(nèi)，但是因?yàn)轶w外修飾及培養(yǎng)需要條件較高，存在易污染等原因，臨床推廣應(yīng)用受到一定限制，而免疫基因治療因其簡(jiǎn)單易行，越來(lái)越多的研究針對(duì)此方法進(jìn)行。免疫基因治療即體外重組基因，通過重組病毒、脂質(zhì)體、基因槍等將其直接導(dǎo)入體內(nèi)的腫瘤組織中進(jìn)行表達(dá)，本質(zhì)是原位誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。用來(lái)攜帶目的基因的載體有病毒載體和非病毒載體。病毒載體有引起潛在感染或?qū)е禄蛲蛔兊奈ｋU(xiǎn)，且在體內(nèi)僅有少量進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，免疫效果較差。非病毒載體特別是質(zhì)粒載體的應(yīng)用則非常廣泛。以質(zhì)粒為載體的免疫基因治療主要通過質(zhì)粒肌肉注射、質(zhì)粒瘤內(nèi)注射、基因槍轟擊技術(shù)實(shí)現(xiàn)。質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射后，可直接被肌肉細(xì)胞攝取，也可被肌肉組織中的專職抗原提呈細(xì)胞攝取，通過抗原的加工、遞呈而激活細(xì)胞免疫和體液免疫。質(zhì)粒直接瘤內(nèi)注射，可使腫瘤細(xì)胞表達(dá)導(dǎo)入的基因序列編碼的蛋白分子。基因槍轟擊技術(shù)將目的基因包裹在金顆粒上，使金顆粒以很高的速度轟擊靶細(xì)胞，從而將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞。共刺激途徑作為第二信號(hào)通路的重要作用使其成為腫瘤基因治療新的有效介入點(diǎn)。多基因聯(lián)合治療是目前基因治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn):也是未來(lái)基因治療的模式。目前對(duì)B7-1介導(dǎo)的免疫治療研究集中在與GM-CSF、IL-2、IL-12等細(xì)胞因子聯(lián)合治療中，國(guó)內(nèi)外尚未見B7-l和CD40L混合質(zhì)粒施用于小鼠瘤內(nèi)的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明克服了上述缺點(diǎn)，提出了一種用于治療腫瘤的B7-l、CD40L質(zhì)?；旌衔?。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是一種B7-l、CD40L質(zhì)?；旌衔?，按體積百分比計(jì)，B7-l占4060%，CD40L占6040%。上述的混合物中，優(yōu)選B7-l和CD40L各占總體積的50%這一比發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了上述的B7-l、CD40L質(zhì)粒混合物在制備治療腫瘤藥物中的用途。當(dāng)腫瘤的直徑大于或等于0.8cm時(shí)，效果尤其明顯。本發(fā)明的B7-l、CD40L質(zhì)?；旌衔镉绕溥m用于制備治療淋巴瘤藥物。當(dāng)淋巴瘤的直徑大于或等于0.8cm，效果尤其明顯。B7-l是目前共刺激分子中研究最深入、應(yīng)用最成熟的分子。B7-1是CD28和CTLA-4的配體，表達(dá)于多種抗原提呈細(xì)胞表面。通過與T淋巴細(xì)胞表面的CD28和CTLA—4分子結(jié)合而上調(diào)機(jī)體的免疫應(yīng)答，并可通過打破腫瘤免疫耐受，誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，協(xié)助T淋巴細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。CD40L可上調(diào)B7-l分子的表達(dá)，增加IL-12的分泌。同時(shí)它們各自都可以激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，打破腫瘤的免疫耐受狀態(tài)。故兩者的混合物在淋巴瘤免疫基因治療中具有廣闊的前景。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明使用時(shí)質(zhì)粒瘤內(nèi)注射，使用方法簡(jiǎn)單，干擾因素少，適合大規(guī)模推廣。特別適用于尺寸直徑大于或等于0.8cm腫瘤特別是淋巴瘤。具體實(shí)施例方式(1)材料動(dòng)物雄性BALB/c小鼠，6—8周齡。細(xì)胞株淋巴瘤細(xì)胞株A20源自BALB/c小鼠。37T培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中。質(zhì)粒與菌株小鼠B7-1全長(zhǎng)質(zhì)粒，質(zhì)粒載體為pCDM8，擴(kuò)增菌株為P3E.coli，小鼠CD40L全長(zhǎng)質(zhì)粒，質(zhì)粒載體為pCDNA3.1，擴(kuò)增菌株為DH5aE.coli。RPM1640培養(yǎng)液由RPMI1640粉配制，美國(guó)Gibco公司出品。胎牛血清(FBS):天津產(chǎn)，-2(TC保存。(2)方法質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增、提純和鑒定E.coli菌擴(kuò)增質(zhì)粒并用QingenPlasmidMaxi試劑盒提取及純化質(zhì)粒，具體步驟見試劑盒說明。紫外分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒DNA濃度取2ul質(zhì)粒稀釋100倍，測(cè)OD值估計(jì)DNA濃度。質(zhì)粒DNA保存于-80。C。質(zhì)粒mB7-l用XhoI限制性內(nèi)切酶切鑒定，質(zhì)粒mCD40L用EcoRI限制性內(nèi)切酶和NheI限制性內(nèi)切酶切鑒定。構(gòu)建荷瘤小鼠模型取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的2*106八20細(xì)胞在BALB/c小鼠右側(cè)背部皮下注射，構(gòu)建荷瘤小鼠模型。(3)B7-l和CD40L表達(dá)載體用于治療淋巴瘤的實(shí)驗(yàn)如下。3丄實(shí)施例1和對(duì)比例14用于小腫瘤小腫瘤組待小鼠腫瘤長(zhǎng)至直徑3-4mm，按如下方式隨機(jī)分組，每組取三只進(jìn)行瘤內(nèi)注射，7天后以同樣劑量第二次注射，每2天測(cè)一次腫瘤生長(zhǎng)情況。腫瘤大小按公式a*b2/2計(jì)算，(a為腫瘤最大直徑，b為與它垂直的直徑)。第二次注射后5天取小鼠脾作CTL殺傷實(shí)驗(yàn)。對(duì)比例1(空白對(duì)照)每只注射PBS100ul。對(duì)比例2(空質(zhì)粒對(duì)照)以PBS調(diào)空質(zhì)粒濃度為1ug/ul，每只注射100ul。對(duì)比例3、B7-l(質(zhì)粒單獨(dú)注射)以PBS調(diào)質(zhì)粒濃度為1ug/ul，每只注射100ul。對(duì)比例4、CD40L質(zhì)粒(單獨(dú)注射)以PBS調(diào)質(zhì)粒濃度為1ug/ul，每只注射100ul。實(shí)施例1(B7-l、CD40L質(zhì)?；旌衔?以PBS調(diào)質(zhì)粒濃度為1ug/ul，質(zhì)?；旌衔镉?0ulB7-l質(zhì)粒和50ulCD40L質(zhì)粒組成。將該混合物注射入小鼠體內(nèi)。3.2.實(shí)施例1和對(duì)比例14用于大腫瘤大腫瘤組待小鼠腫瘤長(zhǎng)到直徑7-8mm時(shí)，同樣按小腫瘤組方式隨機(jī)分組，每組取三只進(jìn)行瘤內(nèi)注射，7天后以同樣劑量第二次注射，第二次注射后4天取小鼠脾作CTL殺傷實(shí)驗(yàn)，并取瘤組織制作病理切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。對(duì)比例l(空白對(duì)照)每只注射PBS100ul。對(duì)比例2(空質(zhì)粒對(duì)照)以PBS調(diào)空質(zhì)粒濃度為1ug/ul，每只注射100ul。對(duì)比例3、B7-l(質(zhì)粒單獨(dú)注射)以PBS調(diào)質(zhì)粒濃度為1ug/ul，每只注射100ul。對(duì)比例4、CD40L質(zhì)粒(單獨(dú)注射)以PBS調(diào)質(zhì)粒濃度為1ug/ul，每只注射100ul。實(shí)施例1(B7-l、CD40L質(zhì)?；旌衔?以PBS調(diào)質(zhì)粒濃度為1ug/ul，質(zhì)?；旌衔镉?0ulB7-l質(zhì)粒和50ulCD40L質(zhì)粒組成。將該混合物注射入小鼠體內(nèi)。(4)結(jié)論1、對(duì)于直徑0.3cm以內(nèi)的小腫瘤，單獨(dú)作用B7-1、CD40L基因可以使其減小，實(shí)施例1在13天內(nèi)腫瘤完全消失，而PBS和空質(zhì)粒對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)迅速，13天內(nèi)直徑達(dá)10cm。統(tǒng)計(jì)分析顯示，對(duì)于小腫瘤，對(duì)比例3、對(duì)比例4與實(shí)施例1均有明顯抑瘤作用，但實(shí)施例1并無(wú)顯著的進(jìn)步。表1小腫瘤組體積(mm3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、對(duì)于直徑0.8cm的腫瘤，實(shí)施例1在13天內(nèi)腫瘤基本消退，瘤體直徑達(dá)3cm以下。對(duì)比例3和對(duì)比例4腫瘤生長(zhǎng)得到抑制，對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)迅速。統(tǒng)計(jì)分析顯示，實(shí)施例1效果優(yōu)于對(duì)比例3和對(duì)比例4。表2大腫瘤組體積(mm3)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>。表3小腫瘤脾CTL殺傷率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以上對(duì)本發(fā)明所提供的B7-l、CD40L質(zhì)?；旌衔镞M(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方式及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。權(quán)利要求1.一種B7-1、CD40L質(zhì)?；旌衔?，其特征在于按體積百分比計(jì)，B7-1占40～60％，CD40L占60～40％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的B7-1、CD40L質(zhì)?；旌衔?，其特征在于所述的B7-l和CD40L各占總體積的50y。。3.權(quán)利要求1或2所述的B7-l、CD40L質(zhì)?；旌衔镌谥苽渲委熌[瘤藥物中的用途。4.權(quán)利要求3所述的B7-1、CD40L質(zhì)粒混合物在制備治療腫瘤藥物中的用途，其特征在于所述的腫瘤的直徑大于或等于0.8cm。5.權(quán)利要求1或2所述的B7-1、CD40L質(zhì)?；旌衔镌谥苽渲委熈馨土鏊幬镏械挠猛?。6.權(quán)利要求5所述的B7-1、CD40L質(zhì)?；旌衔镌谥苽渲委熈馨土鏊幬镏械挠猛?，其特征在于所述的淋巴瘤的直徑大于或等于0.8cm。全文摘要本發(fā)明公開了一種B7-1、CD40L質(zhì)?；旌衔?。該混合物按體積百分比計(jì)，B7-1占40～60％，CD40L占60～40％。該混合物對(duì)抑制和消除直徑大于或等于0.8cm的大腫瘤特別是淋巴瘤，效果特別顯著。本發(fā)明使用時(shí)質(zhì)粒瘤內(nèi)注射，使用方法簡(jiǎn)單，干擾因素少，適合大規(guī)模推廣。文檔編號(hào)A61K48/00GK101199862SQ200710179849公開日2008年6月18日申請(qǐng)日期2007年12月19日優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日發(fā)明者克曉燕,晶王,趙靈芝申請(qǐng)人:北京大學(xué)第三醫(yī)院