專利名稱：用于治療傷口的基于TGF-β單體的藥物和蛋白質(zhì)的制作方法
專利說明用于治療傷口的基于TGF-β單體的藥物和蛋白質(zhì) 本發(fā)明涉及新藥物的提供。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了適合用于加速傷口愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成的藥物。本發(fā)明還提供了加速傷口愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成的方法。
轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)類是具多樣生物活性的細(xì)胞因子家族。TGF-β家族包括五種同工型TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5。
TGF-β用于很多不同的治療背景。由于TGF-β的治療性潛能，對TGF-β家族成員尤其是TGF-β1-3的藥學(xué)用途產(chǎn)生了很大興趣。
眾所周知，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3在調(diào)節(jié)傷口愈合的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。TGF-β的活性可能影響了傷口愈合的速度和愈合引起的瘢痕形成的范圍。
TGF-β1用于預(yù)防和/或治療硬皮病、血管生成病癥、腎病、骨質(zhì)疏松、骨病、血管球性腎炎和腎病。
TGF-β2可用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、胰腺腫瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸瘤、卵巢瘤、年齡相關(guān)性黃斑變性、視覺損傷、骨質(zhì)疏松、視網(wǎng)膜病、潰瘍、癌、口腔發(fā)炎和硬皮病。
TGF-β3可用于治療纖維化疾病、肺纖維化、肝硬化、硬皮病、血管生成病癥、再狹窄、粘連、子宮內(nèi)膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨的誘導(dǎo)、體外受精、口腔粘膜炎、腎病，預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成，促進(jìn)外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元重連接，預(yù)防、減少或抑制眼外科手術(shù)(例如LASIK或PRK手術(shù))并發(fā)癥或眼后部瘢痕形成(例如與增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變相關(guān)的瘢痕形成)。
TGF-β家族的成員以包含兩條肽鏈的二聚體形式天然存在。有活性的TGF-β二聚體的分子量為大約25.4kDa。有活性的TGF-β二聚體片段可通過疏水和離子相互作用來穩(wěn)定，所述相互作用可由亞基間的二硫鍵來進(jìn)一步加強(qiáng)。普遍認(rèn)為，TGF-β家族成員的生物活性和如此多的治療活性只是由活性二聚體引起。
根據(jù)上面所述，人們認(rèn)識到迫切需要提供能夠利用TGF-β家族成員的治療特性的藥物。盡管充分認(rèn)識到了對包含TGF-β家族成員的藥物組合物的需求，但是關(guān)于生產(chǎn)用于治療的TGF-β，仍存在很多公認(rèn)的問題。
利用TGF-β作為治療劑的最大的弊端之一是，為了用原核宿主生產(chǎn)有生物(及由此的治療)活性的蛋白二聚體，需要對具生物活性的二聚體形式進(jìn)行加強(qiáng)復(fù)性。二聚體形式能顯著延長生產(chǎn)的時(shí)間。這在限制任何TGF-β的治療用途上也有重要的意義。
本發(fā)明的目的是消除或減輕至少某些與包含TGF-β的藥物組合物的現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。尤其地，本發(fā)明某些實(shí)施方案的目的是，消除或減輕與時(shí)間密集生產(chǎn)方法的應(yīng)用相關(guān)的問題，所述方法用于生產(chǎn)這些蛋白的生物活性二聚體。
本發(fā)明的第一方面提供了用作藥物的TGF-β單體或其具生物活性的片段。
本發(fā)明基于發(fā)明人非常令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即單體TGF-β能發(fā)揮出目前認(rèn)為只能由二聚體TGF-β蛋白提供的生物活性。這個(gè)發(fā)現(xiàn)使單體TGF-β用于有效的藥物成為可能，所述藥物能利用所選TGF-β的生物特性。由于這個(gè)發(fā)現(xiàn)立即被接受，因而本發(fā)明通過減少與適合藥物生產(chǎn)相關(guān)的時(shí)間和成本，大大擴(kuò)展了TGF-β用于治療的實(shí)際應(yīng)用。
本發(fā)明人相信本發(fā)明的藥物的優(yōu)點(diǎn)可以由包含任何單體TGF-β同工型的藥物提供。因此，除了上下文另外需要的地方，提及的一種或多種TGF-β可用來包括任何具生物活性的單體形式的TGF-β同工型，例如TGF-β1，2，3，4和5。優(yōu)選的適合用于本發(fā)明藥物的單體是(任何期望的同工型的)野生型TGF-β單體。優(yōu)選地，適合本發(fā)明應(yīng)用的單體TGF-β選自TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。更優(yōu)選的單體TGF-β是TGF-β3，本發(fā)明的第二方面提供了用作藥物的TGF-β3單體或其生物活性的片段。優(yōu)選地，依照本發(fā)明應(yīng)用的TGF-β單體是人類TGF-β單體。優(yōu)選地，在本發(fā)明藥物中提供的TGF-β應(yīng)該基本上全部以單體的形式存在。適合用于本發(fā)明藥物或方法的單體TGF-β優(yōu)選具有的分子量為大約12kDa，尤其為大約12.5kDa。
人類形式的TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3同工型的氨基酸殘基序列分別顯示為序列ID號1，2和3，包含這些序列的任意一個(gè)或這些序列任意一個(gè)具生物活性片段的單體TGF-β，構(gòu)成了本發(fā)明應(yīng)用的優(yōu)選單體。單體TGF-β3(序列ID號3)構(gòu)成本發(fā)明多個(gè)方面應(yīng)用的尤其優(yōu)選的單體。
除了上下文另外需要，本說明書提及的單體TGF-β(包括提及的特殊同工型)也應(yīng)被用來包括這些單體TGF-β的生物活性片段和衍生物。從序列ID號1-3衍生的生物活性片段代表本發(fā)明藥物中應(yīng)用的優(yōu)選片段，其中從序列ID號3衍生的生物活性片段構(gòu)成尤其優(yōu)選的片段。優(yōu)選的生物活性片段可以包含所選TGF-β同工型的受體結(jié)合部分。
可用于本發(fā)明藥物或方法的單體TGF-β的適合衍生物包括單體TGF-β(或其片段)的治療有效的肽衍生物；包含或基于單體TGF-β(或其片段)的藥效基團(tuán)的治療有效的片段或衍生物；單體TGF-β(或其片段)的治療有效的類肽衍生物；單體TGF-β(或其片段)的治療有效的D氨基酸衍生物；基于單體TGF-β(或其片段)的治療有效的肽模擬物；單體TGF-β(或其片段)的治療有效的肽類似物；基于單體TGF-β(或其片段)的治療有效的假肽；基于單體TGF-β(或其片段)的治療有效的逆反式肽；基于單體TGF-β(或其片段)的治療有效的縮酚酸肽衍生物；基于單體TGF-β(或其片段)的治療有效的β-肽衍生物；基于單體TGF-β(或其片段)的治療有效的逆類肽衍生物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人類TGF-β3的單體形式可采用與二聚體TGF-β3同樣的方式應(yīng)用，例如治療纖維化疾病、硬皮病、血管生成病癥、再狹窄、粘連、子宮內(nèi)膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨的誘導(dǎo)、體外受精、口腔粘膜炎、腎病，預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成，促進(jìn)外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元重連接，預(yù)防、減少或抑制眼外科手術(shù)(例如LASIK或PRK手術(shù))并發(fā)癥，治療唇裂和腭裂，預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成以及加速肌腱和韌帶的恢復(fù)。TGF-β3的單體形式也能促進(jìn)表皮損傷部位的上皮再生。
本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)也表明TGF-β1和TGF-β2的單體形式能發(fā)揮出與這些生長因子二聚體形式相關(guān)的全部治療活性。
本發(fā)明上下文中的“生物活性”優(yōu)選地在體內(nèi)測量。與現(xiàn)有技術(shù)公布的發(fā)現(xiàn)保持一致，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用體外方法評測的TGF-β的單體形式一般不表現(xiàn)生物活性。但是與現(xiàn)有技術(shù)的信條完全相反，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)TGF-β的單體形式能在體內(nèi)發(fā)揮出生物和治療活性。因此，認(rèn)識到，對于根據(jù)本發(fā)明被認(rèn)為具生物活性的單體TGF-β或其片段或衍生物而言，單體TGF-β沒有必要在體外和體內(nèi)方式下都表現(xiàn)出可測量的生物活性，而是僅在體外或體內(nèi)表現(xiàn)出可測量的生物活性即可，優(yōu)選在體內(nèi)可測量的活性。
適合地，本發(fā)明的第一方面適合應(yīng)用的單體TGF-β的生物活性可參考給定TGF-β的二聚體的已知生物活性進(jìn)行測量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物活性可參考單體(例如序列ID號3的單體)加速傷口愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成的能力進(jìn)行測量。
根據(jù)前段，認(rèn)識到本發(fā)明第一或第二方面的藥物尤其適合用于加速傷口愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成。而且，本發(fā)明第一或第二方面的藥物也尤其適合用于促進(jìn)上皮再形成。
實(shí)際上，本發(fā)明的第三方面提供了TGF-β3單體或其生物活性片段在用于加速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成的藥物制備中的用途。
本發(fā)明的第四方面提供了TGF-β3單體或其生物活性片段在用于促進(jìn)上皮再生的藥物制備中的用途。
本發(fā)明的第五方面提供了TGFβ3單體或其生物活性片段在用于預(yù)防和/或治療纖維化疾病的藥物制備中的用途?？梢杂眠@些藥物預(yù)防和/或治療的優(yōu)選的纖維化疾病選自肺纖維化、肝纖維化、硬皮病、皮膚纖維化、肌肉纖維化、放射纖維化、腎臟纖維化和子宮纖維化。
而且，本發(fā)明第六方面提供了一種加速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成的方法，所述方法包括對需要這種治療的患者施用治療有效量的單體TGF-β3或其片段。
本發(fā)明第七方面提供了一種促進(jìn)上皮再生的方法，所述方法包括對需要這種治療的患者施用治療有效量的單體TGF-β3或其片段。
本發(fā)明第八方面提供了一種預(yù)防和/或治療纖維化疾病的方法，所述方法包括對需要這種預(yù)防和/或治療的患者施用治療有效量的單體TGF-β3或其片段?？梢杂眠@些方法預(yù)防和/或治療的優(yōu)選的纖維化疾病肺纖維化、肝纖維化、硬皮病、皮膚纖維化、肌肉纖維化、放射纖維化、腎臟纖維化和子宮纖維化。
出于本發(fā)明的目的，單體TGF-β或其片段的治療有效量是足以產(chǎn)生以下效果所需的量 i)加速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成；或 ii)促進(jìn)上皮再生；或 iii)預(yù)防和/或治療纖維化疾病。
加速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成、或促進(jìn)上皮再生的程度，或者可能需要的預(yù)防或減少纖維化對于負(fù)責(zé)照料患者的臨床醫(yī)生是顯然的，或?qū)嶋H可容易地由其決定。加速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成、或促進(jìn)上皮再生或預(yù)防或減少纖維化的程度的適合的評定可由臨床醫(yī)生決定，并且可參考這里描述的測量建議方法。
本發(fā)明應(yīng)用的適合和優(yōu)選的單體TGF-β可參考這里描述的任一項(xiàng)或全部考慮因素來進(jìn)行選擇。
在期望實(shí)現(xiàn)加速傷口愈合而且預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成，或?qū)崿F(xiàn)預(yù)防或治療纖維化疾病例如肺纖維化、肝硬化、硬皮病、血管球性腎炎或類似疾病的情況下，一般優(yōu)選使用單體TGF-β3或適合的生物活性片段。
盡管單體TGF-β3的應(yīng)用有特別顯著的好處，但是包含其它TGF-β同工型的單體形式的藥物也有很大價(jià)值。
例如，包含單體TGF-β1或其生物活性片段的藥物可用于預(yù)防和/或治療慢性未愈傷口，例如靜脈性潰瘍、壓瘡、糖尿病性潰瘍、血管生成病癥、腎病、骨質(zhì)疏松、骨病、血管球性腎炎和腎病。舉例來說，局部遞送的野生型二聚體TGF-β1在動(dòng)物模型中顯示為骨骼生長和再生的有效刺激劑。而且，已經(jīng)顯示施用TGF-β1保護(hù)組織免受缺血再灌注損傷，尤其是在大腦(中風(fēng)后)和心臟(冠狀動(dòng)脈梗塞后)中的組織。
包含單體TGF-β2或其生物活性片段的藥物可用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、胰腺腫瘤、實(shí)體瘤、結(jié)腸瘤、卵巢瘤、年齡相關(guān)性黃斑變性、視覺損傷、骨質(zhì)疏松、視網(wǎng)膜病、潰瘍、癌、口腔發(fā)炎和硬皮病。舉例來說，在兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，局部施用野生型二聚體TGF-β2顯示加速終止靜脈停滯相關(guān)的下肢慢性潰瘍，而在動(dòng)物模型中局部遞送重組人類TGF-β2顯示促進(jìn)了骨骼再生長和再生。
包含單體TGF-β3或其生物活性片段的藥物可用于治療傷口(包括慢性傷口例如潰瘍)、硬皮病、纖維化疾病(例如肺纖維化、肝硬化、腎臟纖維化等)、血管生成病癥、再狹窄、粘連、子宮內(nèi)膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨的誘導(dǎo)、體外受精、口腔粘膜炎和腎病。舉例來說，在動(dòng)物模型和臨床中顯示局部施用野生型二聚體TGF-β3加速了慢性不愈合性壓迫潰瘍愈合的速度；減少了口腔粘膜炎的發(fā)生率、嚴(yán)重性和持續(xù)時(shí)間；減少了癌癥治療中放療和化療造成的干細(xì)胞損傷而導(dǎo)致的放射胃腸道綜合癥的不利副作用。本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)表明，為了產(chǎn)生二聚體TGF-β3的已知治療活性，單體TGF-β3可用于所有這些背景。
參考治療的傷口顯示的特性，本發(fā)明某些方法和藥物(例如那些利用序列ID號3所列TGF-β單體的方法和藥物)加速傷口愈合的能力易于理解和/或測量。出于當(dāng)前目的，“治療的傷口”可認(rèn)為是暴露于治療有效量的本發(fā)明藥物的傷口或已依據(jù)本發(fā)明方法接受治療的傷口。
治療的傷口愈合的加速可由與對照傷口相比上皮形成增加的速率表示。這樣，本發(fā)明的方法和藥物與其他方式相比，促進(jìn)傷口面積上方的功能性上皮層更快地重建。
可選擇地或另外，治療的傷口愈合的加速可由與對照傷口相比對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上減小的寬度表示。應(yīng)理解的是，這種傷口寬度的減小確保了傷口閉合的相對較快的速率(由于待閉合的傷口寬度更小)，預(yù)示這些藥物加速愈合反應(yīng)的能力。較窄的傷口可導(dǎo)致美學(xué)上優(yōu)于較寬瘢痕的較窄瘢痕。
因此，本發(fā)明上下文中的加速的傷口愈合應(yīng)包括，與對照治療或未治療傷口中發(fā)生的愈合速率相比，治療的傷口愈合速率的任何提高。優(yōu)選地，傷口愈合的加速可從治療和對照傷口中得到的表皮細(xì)胞再生速率比較方面，或治療和對照傷口在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上相對寬度的比較方面進(jìn)行評定。更優(yōu)選地，加速的傷口愈合可定義為包含與對照傷口相比上皮再形成提高的速率和傷口寬度在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的減小。
優(yōu)選地，促進(jìn)傷口愈合加速可產(chǎn)生的傷口愈合速率比對照或未治療傷口中發(fā)生的愈合速率高至少5％、10％、20％或30％。更優(yōu)選地，促進(jìn)傷口愈合加速可產(chǎn)生的愈合速率比對照傷口的愈合高至少40％、50％或60％。甚至更加優(yōu)選地，促進(jìn)傷口愈合加速可產(chǎn)生的愈合速率比對照傷口中發(fā)生的高至少70％、80％或90％，最優(yōu)選地，促進(jìn)傷口愈合加速可產(chǎn)生的愈合速率比對照傷口中發(fā)生的速率高至少100％。
存在范圍廣泛的傷口愈合疾病，其特征為或至少部分特征為正常傷口愈合反應(yīng)的不當(dāng)?shù)娜笔А⒀舆t或障礙。因此，本發(fā)明某些方法和藥物促進(jìn)傷口加速愈合的能力在預(yù)防或治療這些疾病中是有用的。
由于本發(fā)明的某些方法和藥物能通過促進(jìn)上皮再形成反應(yīng)的激活(因此提高了傷口閉合的速率)而引起傷口愈合的加速，因此可理解地，本發(fā)明的這些方法和藥物尤其有利于有上皮再形成缺陷、延遲或其他方式損傷傾向的患者傷口的治療。例如，眾所周知老年人的皮膚傷口表現(xiàn)出比年輕個(gè)體的皮膚傷口更弱的上皮再形成反應(yīng)。也有很多其它的狀態(tài)或疾病，在這些狀態(tài)或疾病中，傷口愈合與延遲或其他方式損傷的上皮再形成相關(guān)。例如，患糖尿病的患者、復(fù)方用藥的患者(例如由于老齡)、絕經(jīng)期后的婦女、易于壓迫受傷的患者(例如截癱患者)、靜脈疾病患者、臨床肥胖患者、接受化療的患者、接受放療的患者、接受類固醇治療的患者或免疫功能低下的患者可能都會經(jīng)受損傷上皮再形成的傷口愈合。在很多這樣的情況下，缺乏適當(dāng)?shù)纳掀ぴ傩纬煞磻?yīng)促成了傷口部位感染的發(fā)生，這可能又促成慢性傷口例如潰瘍的形成。因此，可理解的是，這些患者尤其可能從本發(fā)明適合的方法或藥物中受益。
慢性傷口可能是與延遲傷口愈合反應(yīng)相關(guān)的疾病的最重要的實(shí)例。如果受到適當(dāng)(常規(guī))治療處理時(shí)，傷口在形成八周內(nèi)沒有表現(xiàn)出任何愈合傾向，就被定義為慢性。慢性傷口眾所周知的實(shí)例包括靜脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍和褥瘡，但是慢性傷口可在任意時(shí)間由另外的正常急性損傷引發(fā)。通常，慢性傷口可由傷口部位的感染、不當(dāng)?shù)膫谥委熞l(fā)，或作為靜脈、動(dòng)脈或代謝血管疾病、壓迫、放射損傷或腫瘤造成的進(jìn)展性組織衰竭的結(jié)果。
可理解的是，能加速傷口愈合的本發(fā)明的方法和藥物可應(yīng)用于現(xiàn)有慢性傷口的治療，旨在促進(jìn)它們的愈合。這些方法和藥物可促進(jìn)慢性傷口的上皮再形成，從而使得疾病治愈和終止。本發(fā)明優(yōu)選的方法和藥物(例如那些利用包含序列ID號3的單體TGF-β的方法和藥物)還可抑制與傷口愈合相關(guān)的瘢痕形成。由于慢性傷口可典型地在患者身體相對大的部分延伸，這些背景中瘢痕形成的預(yù)防尤其有利。
可選擇地或除了在現(xiàn)有慢性傷口治療中的用途之外，本發(fā)明適合的方法和藥物可用于預(yù)防患者的急性傷口，所述患者具有受損的傷口愈合發(fā)展成慢性傷口的傾向。由于本發(fā)明適合的方法和藥物能促進(jìn)上皮對損傷部位的覆蓋，因此它們能減小治療的傷口發(fā)生感染的可能性。同樣地，對上皮再形成的這種促進(jìn)可能有利于由其它狀態(tài)例如糖尿病或靜脈疾病引發(fā)的慢性傷口的治療。
可以從本發(fā)明方法和藥物中得到特別益處的另一組患者是那些免疫系統(tǒng)低下的患者(例如經(jīng)受化療或放療或患有HIV感染的患者)。廣為承認(rèn)的是免疫低下患者可能不能在傷口產(chǎn)生后發(fā)生正常的炎癥反應(yīng)，其傷口傾向于與較差的愈合結(jié)果相關(guān)。這些患者可從本發(fā)明適合的方法和藥物治療中受益。
利用包含序列ID號3的單體TGF-β的本發(fā)明方法和藥物，促進(jìn)加速的傷口愈合，同時(shí)預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成的能力在更多普遍的臨床背景中也有用處。這些更多益處的實(shí)例可參考下面描述的初級、二級或三級愈合的傷口愈合進(jìn)行判斷。
出于本發(fā)明的目的，初級愈合治療可認(rèn)為涉及利用外科手段對傷口對立邊緣的閉合(例如縫合、粘合帶或釘)。初級愈合治療典型地用于手術(shù)切口或其它清潔傷口的治療，且與最低水平的組織缺失相關(guān)。技術(shù)人員認(rèn)識到由于本發(fā)明適合的藥物或方法(例如那些利用包含序列ID號3的單體的藥物或方法)能減小傷口寬度，因此它們也有利于傷口對立邊緣的接合，這樣可能有益于為初級愈合的傷口愈合。而且，這些方法或藥物(正如下面進(jìn)一步描述的)導(dǎo)致預(yù)防、減少或抑制這種愈合可能另外發(fā)生的瘢痕形成。本發(fā)明人認(rèn)為這種方式的治療可對治療的傷口形成的瘢痕的肉眼和顯微鏡下的外觀產(chǎn)生影響；肉眼下瘢痕可能更不引人注意并與周圍的皮膚融合，顯微鏡下瘢痕可表現(xiàn)出更多正常的皮膚結(jié)構(gòu)的再生。
出于本發(fā)明的目的，二級愈合治療可認(rèn)為包括傷口愈合過程中，非直接手術(shù)干預(yù)的傷口閉合。有待二級愈合治療的傷口可經(jīng)過持續(xù)地護(hù)理(例如傷口的包扎和再包扎以及施用適合的藥物)，但是它是肉芽組織形成和上皮再形成的、導(dǎo)致傷口閉合的天然過程。可理解的是由于本發(fā)明優(yōu)選的方法和藥物(例如那些利用包含序列ID號3的單體的方法和藥物)與對照傷口中所發(fā)生的相比，能提高上皮再形成的速率和減少并發(fā)的瘢痕形成，因此所述方法和藥物在促進(jìn)二級愈合的傷口愈合中有用處。
三級愈合治療可認(rèn)為包含先前開著的傷口的手術(shù)閉合，允許至少部分肉芽組織形成和上皮再形成。使之適合初級或二級愈合治療應(yīng)用的本發(fā)明優(yōu)選方法和藥物的特性也有益于促進(jìn)三級愈合治療傷口方面。
利用包含序列ID號3的單體的本發(fā)明優(yōu)選方法和藥物促進(jìn)上皮再形成(作為它們促進(jìn)傷口愈合加速的一部分)同時(shí)抑制瘢痕形成的應(yīng)用也在與移植過程相關(guān)的傷口治療中尤其有效。用本發(fā)明這些方法和藥物的治療有益于移植供體部位(在此部位其能輔助功能性上皮層的重建同時(shí)預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成)和移植受體部位(在此部位治療的抗瘢痕形成作用抑制了瘢痕形成，同時(shí)加速的愈合促進(jìn)了移植組織的整合)。本發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明的方法和藥物在用皮膚、人造皮膚或皮膚取代物移植的方面中提供了優(yōu)勢。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用包含序列ID號3的單體的本發(fā)明的方法和藥物，在傷口產(chǎn)生前或者傷口已經(jīng)形成時(shí)施用，能促進(jìn)加速的傷口愈合且抑制瘢痕形成。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用單體TGF-β3(例如包含序列ID號3的那些)的本發(fā)明的方法或藥物能促進(jìn)上皮再生。在本發(fā)明上下文中的促進(jìn)上皮再生可理解為，包括與對照治療或未治療的上皮發(fā)生的再生相比，上皮再生速率的任何提高。
可容易地將本發(fā)明適合的方法或藥物得到的上皮再生速率與對照治療或未治療的上皮獲得的速率相比，這可用本領(lǐng)域已知的任何適宜的上皮再生模型進(jìn)行。例如，具有已知面積的實(shí)驗(yàn)上皮損傷部位的再生速率可用公知的小鼠、大鼠、兔子或豬體內(nèi)模型進(jìn)行比較，例如在Tomlinsonand Ferguson(2003)、Davidson等(1991)和Paddock等(2003)中描述的那些。
本發(fā)明人不希望被任何假說限制，認(rèn)為通過TGF-β3單體形式實(shí)現(xiàn)的上皮再生的促進(jìn)由上皮細(xì)胞遷移的單體促進(jìn)作用介導(dǎo)。上皮細(xì)胞(其遷移已被促進(jìn))因此能夠比未治療的上皮更快速地重建和再生損傷的上皮。
可理解地，利用包含序列ID號3的單體促進(jìn)上皮再生可誘導(dǎo)有效的上皮再形成，其處于上皮再形成反應(yīng)被損傷、抑制、延遲或具有缺陷的情況中。上皮再生的促進(jìn)也可有效地加快經(jīng)受上皮損傷患者的具有缺陷的或正常上皮再生反應(yīng)的速率。
在很多情況中，機(jī)體上皮再形成反應(yīng)可能是具有缺陷的。例如，皮膚上皮再形成的缺陷可能與狀態(tài)相關(guān)，所述狀態(tài)例如天皰瘡、Hailey-Hailey病(家族性良性天皰瘡)、中毒性表皮壞死松解癥(TEN)/Lyell′s綜合癥、大皰性表皮松解癥、皮膚利什曼病和光化性角化病。肺上皮再形成的缺陷可能與原發(fā)性肺纖維化(IPF)或肺間質(zhì)性疾病相關(guān)。眼上皮再形成的缺陷可能與狀態(tài)相關(guān)，所述狀態(tài)例如部分角膜緣干細(xì)胞缺失或角膜糜爛。胃腸道或結(jié)腸的上皮再形成的缺陷可能與狀態(tài)相關(guān)，所述狀態(tài)例如慢性肛裂(肛(門)裂)、潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病(Crohn’sdisease)和其他炎癥性腸病。
正如上文所陳述的，本發(fā)明的某些方法或藥物(和尤其是利用包含序列ID號3的單體的那些)能預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成。瘢痕形成的抑制能在任意機(jī)體部位和任意組織或器官，包括皮膚、眼睛、神經(jīng)、肌腱、韌帶、肌肉和口腔(包括嘴唇和上腭)，以及內(nèi)部器官(例如肝臟、心臟、大腦、腹腔、骨盆腔、胸腔、腸和生殖組織)實(shí)現(xiàn)。皮膚中，治療可改善瘢痕肉眼下和顯微鏡下的外觀；肉眼下瘢痕可能更不明顯并且與周圍的皮膚融合，顯微鏡下瘢痕里的膠原纖維可具有與周圍皮膚的形態(tài)和組織更相似的形態(tài)和組織。本發(fā)明上下文中的預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成應(yīng)被理解為與對照治療或未治療傷口(如說明書其他地方定義)產(chǎn)生的瘢痕形成的水平相比，包括任何程度的預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成。除了上下文另外需要參考的地方，瘢痕形成的“預(yù)防”、“減少”或“抑制”可被作為抗瘢痕活性中全部被證實(shí)的等效機(jī)制。
使用本發(fā)明的方法或藥物實(shí)現(xiàn)的皮膚瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制，可根據(jù)治療的瘢痕的顯微鏡下或優(yōu)選肉眼下的外觀與未治療瘢痕的外觀比較來進(jìn)行評定和/或測量。更優(yōu)選地，瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制可根據(jù)治療的瘢痕的顯微鏡下和肉眼下的外觀進(jìn)行評定。出于本發(fā)明的目的，“治療的瘢痕”可被定義為在治療的傷口愈合時(shí)形成的瘢痕，而“未治療的瘢痕”可被定義為未治療的傷口、或用安慰劑治療或標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療的傷口愈合時(shí)形成的瘢痕。適合的瘢痕比較可優(yōu)選地根據(jù)瘢痕年齡、部位、尺寸和患者，與治療的瘢痕進(jìn)行匹配。
在考慮治療傷口產(chǎn)生的瘢痕肉眼下外觀時(shí)，瘢痕的程度和由此的任何瘢痕形成預(yù)防、減少或抑制的量級可根據(jù)以下很多參數(shù)中的任一項(xiàng)進(jìn)行評定。
肉眼下瘢痕評定的適合參數(shù)可包括 i)瘢痕的顏色。正如上文提到的，瘢痕典型地可相對于周圍皮膚而色素沉著減少或色素沉著過度。當(dāng)治療的瘢痕的色素沉著比未治療瘢痕的色素沉著更接近無瘢痕皮膚時(shí)，表明瘢痕的抑制或減少。同樣地，瘢痕可能比周圍皮膚更紅。在這種情況下，當(dāng)治療的瘢痕的紅色與未治療瘢痕比較，更早褪色、褪色更完全或更類似周圍皮膚的外觀時(shí)，表明瘢痕形成的抑制或減少。
ii)瘢痕的高度。瘢痕與周圍皮膚比較可典型地升高或降低。當(dāng)治療的瘢痕的高度比未治療瘢痕的高度更接近無瘢痕皮膚(即無升高和降低)時(shí)，表明瘢痕形成的抑制或減少。
iii)瘢痕的表面肌理。瘢痕比周圍皮膚可能具有相對更光滑的表面(瘢痕產(chǎn)生“有光澤的”外觀)或比周圍皮膚更粗糙。當(dāng)治療的瘢痕的表面肌理比未治療瘢痕的表面更接近無瘢痕皮膚時(shí)，表明瘢痕形成的抑制或減少。
iv)瘢痕的硬度。瘢痕異常的成分和結(jié)構(gòu)意味著它們通常比瘢痕周圍未損傷的皮膚更硬。在這種情況下，當(dāng)治療的瘢痕的硬度比未治療瘢痕的硬度更接近無瘢痕皮膚時(shí)，表明瘢痕形成的抑制或減少。
優(yōu)選地，當(dāng)根據(jù)上文所述肉眼下評定的至少一項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行評定時(shí)，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預(yù)防、抑制或減少。更優(yōu)選地，根據(jù)這些參數(shù)中至少兩項(xiàng)參數(shù)，甚至更加優(yōu)選地至少三項(xiàng)參數(shù)和最優(yōu)選地全部四項(xiàng)參數(shù)，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預(yù)防、抑制或減少。瘢痕形成的全面評定可利用，例如視覺模擬評分(Visual Analogue Scale)或數(shù)字評定等級來進(jìn)行。
顯微鏡下瘢痕評定的適合參數(shù)可包括 i)胞外基質(zhì)(ECM)纖維的厚度。瘢痕典型地比周圍皮膚包含較細(xì)的ECM纖維。這個(gè)特性在瘢痕瘤和肥厚性瘢痕的情況下甚至更明顯。當(dāng)治療的瘢痕的ECM纖維厚度比未治療瘢痕的ECM纖維厚度更接近無瘢痕皮膚的ECM纖維厚度時(shí)，表明瘢痕形成的抑制或減少。
ii)ECM纖維的定向。瘢痕中發(fā)現(xiàn)的ECM纖維比無瘢痕皮膚發(fā)現(xiàn)的那些(經(jīng)常具有隨機(jī)的定向，稱為“籃網(wǎng)狀”)傾向于表現(xiàn)出互相之間更高程度的排列。病理性瘢痕，例如瘢痕瘤和肥厚性瘢痕的ECM可表現(xiàn)出更加不規(guī)則的定向，經(jīng)常形成ECM分子的大的“渦旋”或“囊”。因此，當(dāng)治療的瘢痕的ECM纖維定向比未治療瘢痕中的ECM纖維定向更接近無瘢痕皮膚中發(fā)現(xiàn)的ECM纖維定向時(shí)，表明瘢痕形成的抑制或減少。
iii)瘢痕的ECM成分。瘢痕中存在ECM分子的成分表現(xiàn)出與其在正常皮膚中發(fā)現(xiàn)的成分的差異，瘢痕的ECM存在的彈性蛋白數(shù)量有所減少。因此，當(dāng)治療的瘢痕真皮的ECM纖維成分比未治療瘢痕中發(fā)現(xiàn)的成分更接近無瘢痕皮膚中發(fā)現(xiàn)的這種纖維成分時(shí)，表明瘢痕形成的抑制或減少。
iv)瘢痕的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。瘢痕傾向于比無瘢痕皮膚包含相對少的細(xì)胞。因此可理解當(dāng)治療的瘢痕的細(xì)胞結(jié)構(gòu)比未治療瘢痕的細(xì)胞結(jié)構(gòu)更接近無瘢痕皮膚的細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)，表明瘢痕形成的抑制或減少。
優(yōu)選地，當(dāng)根據(jù)上文所述的顯微鏡下評定的至少一項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行評定時(shí)，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預(yù)防、抑制或減少。更優(yōu)選地，根據(jù)這些參數(shù)中的至少兩項(xiàng)參數(shù)，甚至更加優(yōu)選地至少三項(xiàng)參數(shù)，最優(yōu)選地全部四項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行評定，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預(yù)防、抑制或減少。
治療的傷口的瘢痕形成預(yù)防、抑制或減少可進(jìn)一步根據(jù)以下使用的適合參數(shù)進(jìn)行評定 i)瘢痕肉眼下的臨床評定，尤其是對個(gè)體瘢痕的評定； ii)瘢痕照片圖像的評定； iii)有機(jī)硅模具或由瘢痕的有機(jī)硅模具制作的陽性石膏模型進(jìn)行評定；和 iv)瘢痕的顯微鏡下評定，例如瘢痕顯微結(jié)構(gòu)的組織學(xué)分析。
可理解地，治療傷口的瘢痕形成的預(yù)防、抑制或減少可通過改善這些適合參數(shù)的一項(xiàng)或多項(xiàng)來顯示，在根據(jù)大量參數(shù)評定預(yù)防、抑制或減少的情況下，可根據(jù)不同的評定方案將這些參數(shù)結(jié)合(例如肉眼評定中使用的至少一項(xiàng)參數(shù)和顯微鏡下評定中使用的至少一項(xiàng)參數(shù)的減少、抑制或改善)。
可通過一項(xiàng)或多項(xiàng)參數(shù)的改善表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制，這顯示根據(jù)所選的參數(shù)，治療的瘢痕比未治療或?qū)φ振：鄹咏鼰o瘢痕皮膚。
瘢痕臨床測量和評定的適合參數(shù)可基于多種測量或評定進(jìn)行選擇，包括由Beausang等(1998)和van Zuijlen等(2002)描述的那些 典型地，適合的參數(shù)可包括 1.根據(jù)視覺模擬評分(VAS)瘢痕分?jǐn)?shù)的評定。
當(dāng)與對照瘢痕比較時(shí)，由治療的瘢痕的VAS分?jǐn)?shù)的減少，表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制。在瘢痕評定中使用的適合的VAS可基于Beausang等人(1998)所述方法進(jìn)行。
2.瘢痕的高度、瘢痕的寬度、瘢痕的周長、瘢痕的面積或瘢痕的體積。
瘢痕的高度和寬度可直接從個(gè)體測量，例如通過利用手工測量裝置例如卡鉗。瘢痕的寬度、周長和面積可直接從個(gè)體測量或從瘢痕的照片圖像分析進(jìn)行測量。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道其他非損傷的方法和裝置，所述方法和裝置可用于研究適合的參數(shù)，包括有機(jī)硅制模、超聲波、光學(xué)三維剖析圖和高分辨率核磁共振圖像。
通過與未治療瘢痕比較，治療的瘢痕的高度、寬度、面積或體積以及其任意組合的減少，表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制。
3.與周圍無瘢痕皮膚比較瘢痕的外觀和/或顏色。
治療的瘢痕的外觀或顏色可與周圍無瘢痕皮膚的外觀或顏色進(jìn)行比較，將其差異(如果有)與未治療瘢痕的外觀和顏色和無瘢痕皮膚的外觀和顏色之間的差異進(jìn)行比較。這種比較可在各自的瘢痕和無瘢痕皮膚的視覺評定的基礎(chǔ)上進(jìn)行。瘢痕的外觀可根據(jù)瘢痕是否比無瘢痕皮膚更亮或更暗，來與無瘢痕皮膚比較。瘢痕和皮膚各自的顏色可完美地互相匹配、輕微錯(cuò)配、明顯錯(cuò)配或顯著錯(cuò)配。
對于視覺評定可選擇地或另外地，有大量非損傷比色裝置，其能夠提供關(guān)于瘢痕和無瘢痕皮膚的色素沉著以及皮膚的紅色(可作為瘢痕或皮膚中存在的血管分布程度的指示)的數(shù)據(jù)。這些裝置的實(shí)例包括MinoltaChronameter CR-200/300；Labscan 600；Dr.Lange Micro Colour；皮膚分光計(jì)(Derma Spectrometer)、激光-多普勒流速計(jì)(laser-Doppler flow meter)和皮內(nèi)分析分光光度法(SIA)。
治療的瘢痕的外觀或顏色和無瘢痕皮膚之間差異的量級比未治療瘢痕和無瘢痕皮膚之間差異更小時(shí)，表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制。
4.瘢痕的變形和機(jī)械性能 瘢痕的變形可通過瘢痕和無瘢痕皮膚的視覺比較進(jìn)行評定。適合的比較可將所選的瘢痕分類為無變形、輕微變形、中等變形或嚴(yán)重變形。
瘢痕的機(jī)械性能可利用大量基于吸力、壓力、扭轉(zhuǎn)力、張力和聲學(xué)的非損傷的方法和裝置進(jìn)行評定。適合的實(shí)例包括能用于評定瘢痕機(jī)械性能的已知裝置，包括直讀壓痕硬度計(jì)、皮膚彈性儀、Reviscometer、粘彈性皮膚分析儀、Dermaflex、硬度計(jì)、皮膚扭力計(jì)和彈力計(jì)。
當(dāng)與未治療瘢痕造成的變形比較時(shí)，由治療的瘢痕造成的變形的減少，表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制。還可理解地，由治療的瘢痕的機(jī)械性能比未治療瘢痕更類似于無瘢痕皮膚的機(jī)械性能，可表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制。
5.瘢痕的輪廓和瘢痕的肌理 瘢痕的輪廓可通過視覺評定的方式進(jìn)行研究。這種評定中考慮的適合參數(shù)包括瘢痕和周圍的皮膚是否為齊平、輕微隆起、輕微鋸齒狀、肥厚性瘢痕或瘢痕瘤。瘢痕的肌理可根據(jù)瘢痕的外觀進(jìn)行評定，這也可通過當(dāng)與無瘢痕皮膚比較時(shí)，瘢痕例如是否無光澤或有光澤發(fā)亮或具有粗糙或光滑外觀的視覺評定來進(jìn)行。
另外，瘢痕的肌理可根據(jù)瘢痕是否具有與無瘢痕皮膚同樣的肌理(正常肌理)，與無瘢痕皮膚比較，是否可觸摸到、結(jié)實(shí)或堅(jiān)硬來進(jìn)行評定。瘢痕的肌理也可根據(jù)漢密爾頓量表(Hamilton scale)(Crowe等描述，1998)進(jìn)行評定。
除了上文所述的技術(shù)外，有大量的使用光學(xué)或機(jī)械的方法評定瘢痕的輪廓和/或肌理的非損傷剖析圖裝置。這種評定可在個(gè)體的身體上進(jìn)行，或例如在瘢痕的有機(jī)硅模具印模，或由這種印模做出的陽性石膏模型上進(jìn)行。
如果治療的瘢痕具有的輪廓和肌理比未治療瘢痕更與無瘢痕皮膚相當(dāng)，則表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制。
照片評定 獨(dú)立外行的小組(Independent lay panel) 治療和未治療瘢痕的照片評定可由獨(dú)立外行的評定者小組用標(biāo)準(zhǔn)化和校準(zhǔn)的瘢痕照片來進(jìn)行。瘢痕可由獨(dú)立外行的小組進(jìn)行評定以提供分類的評分?jǐn)?shù)據(jù)(例如特定治療的瘢痕與未治療瘢痕比較是“較好”、“較差”或“無差異”)和使用基于Beausang等(1998)描述方法的視覺模擬評分(VAS)獲得定量的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)的取得可利用在申請人共同待決的的專利申請中描述的適合軟件和/或電子系統(tǒng)。
專家小組 可選擇地或另外地，治療的和未治療瘢痕的照片評定可由專家評定者小組用待評定的瘢痕的被標(biāo)準(zhǔn)化和校準(zhǔn)的照片來進(jìn)行。優(yōu)選地，專家小組由適合的本領(lǐng)域技術(shù)人員，例如整形外科醫(yī)生和適合背景的科學(xué)家組成。
這種評定可提供分類的數(shù)據(jù)，如上文所述的或根據(jù)所選治療和未治療瘢痕的一段時(shí)間過程的圖像比較。
所進(jìn)行的適合的評定可包括 出于本發(fā)明的目的，最好的瘢痕的鑒別被認(rèn)為是最類似于周圍皮膚的瘢痕。一旦鑒別出最好的瘢痕，瘢痕間差異的量級可認(rèn)為是，例如瘢痕之間的輕微或明顯的差異。所考慮的進(jìn)一步的參數(shù)包括瘢痕形成后檢測到瘢痕間差異的最早時(shí)間，形成后瘢痕間差異最明顯的時(shí)間(或可選擇地在最后評定時(shí)間點(diǎn)繼續(xù)發(fā)現(xiàn)差異)，以及考慮較好的瘢痕是否一貫地保持更好。
也要考慮一個(gè)瘢痕是否會一貫地比另外一個(gè)的更紅和紅色是否會在所認(rèn)定的時(shí)間點(diǎn)后褪色(或在最后時(shí)間點(diǎn)后繼續(xù))以及如果是這樣，則在瘢痕形成后的什么時(shí)間出現(xiàn)。專家小組也可考慮在形成后的什么時(shí)間紅色的任何差異變得可覺察，以及形成后的什么時(shí)間紅色差異最明顯。
專家小組也可考慮治療或未治療的一個(gè)瘢痕是否一貫地比另一個(gè)更白或比無瘢痕皮膚更白。如果白色的差異可覺察，則考慮瘢痕形成后差異可被檢測的時(shí)間，差異最明顯的時(shí)間和差異消失的時(shí)間。
專家小組可評定的進(jìn)一步參數(shù)是治療和未治療瘢痕的肌理。在治療和未治療瘢痕的比較中，專家小組可考慮哪個(gè)瘢痕具有最好的皮膚肌理，瘢痕形成后所存在的任何差異可被檢測的最早時(shí)間，形成后任何差異最明顯的時(shí)間和任何差異消失的時(shí)間。
治療和未治療瘢痕的比較可進(jìn)一步評定哪個(gè)瘢痕是最窄的和哪個(gè)瘢痕是最短的。也可考慮瘢痕的形狀和區(qū)別于周圍皮膚的瘢痕邊緣的比例。正如與前文所述，還可考慮視覺評定，和色素沉著過度的存在、程度和位置的顏色評定。
如上所述，治療和未治療瘢痕性質(zhì)比較的一種方法是通過顯微鏡評定進(jìn)行。瘢痕性質(zhì)的顯微鏡評定可典型地用瘢痕的組織學(xué)切片進(jìn)行。顯微鏡評定和測量瘢痕的過程可考慮基于以下適合參數(shù)的分類數(shù)據(jù) 1.表皮重建。特別關(guān)注網(wǎng)脊(rete ridge)的恢復(fù)程度和恢復(fù)表皮的厚度。
2.血管形成和炎癥?？煽紤]存在血管的數(shù)量、存在血管的尺寸和炎癥的跡象，包括評定存在的任何水平的炎癥。
3.膠原組織。在評定膠原組織時(shí)，可參考瘢痕中存在的膠原纖維的定向、這些纖維的密度和乳突狀及網(wǎng)狀真皮中膠原纖維的厚度。
4.乳突狀真皮和網(wǎng)狀真皮的膠原組織的視覺模擬評分(VAS)評定也可提供有用的瘢痕性質(zhì)指標(biāo)。
5.評定瘢痕的顯微鏡下性質(zhì)時(shí)可考慮其他特征，包括相對于周圍無瘢痕皮膚的瘢痕的升高或降低和正常真皮界面的瘢痕的突出或明顯度。
6.可以看出，與對照、未治療或其他適合比較的瘢痕比較，上文描述的評定產(chǎn)生了能提供關(guān)于治療的瘢痕是否更好、更差或無差別的指示的瘢痕評分?jǐn)?shù)據(jù)。
除了分類數(shù)據(jù)外，可將圖像分析與適合的可視技術(shù)結(jié)合使用來產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)(優(yōu)選與上文參數(shù)有關(guān)的)?？捎糜谠u定瘢痕性質(zhì)的適合可視技術(shù)的實(shí)例是特異的組織學(xué)染色或免疫標(biāo)記，其中呈現(xiàn)的染色或標(biāo)記程度可通過圖像分析定量測定。
可有效和容易地產(chǎn)生與下列參數(shù)有關(guān)的定量數(shù)據(jù) 1.瘢痕的寬度、高度、升高、體積和面積。
2.上皮的厚度和范圍(例如瘢痕中存在的表皮的面積或具有表皮覆蓋傷口的比例)。
3.血管的數(shù)量、尺寸、面積(即橫截面)和位置。
4.炎癥的程度、存在的發(fā)炎細(xì)胞的數(shù)量、位置和種群/類型。
5.膠原的組織、膠原纖維的厚度和膠原纖維的密度。
通過上文考慮的任何一項(xiàng)參數(shù)的變化，可表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制，以至于治療的瘢痕比對照或未治療瘢痕(或其他適合的比較物)更類似于無瘢痕皮膚。
所討論的評定和參數(shù)適合于在動(dòng)物或人中比較本發(fā)明肽或藥物與對照、安慰劑或標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療的效果。為了研究結(jié)果的顯著性，適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)可用于分析產(chǎn)生自不同治療的數(shù)據(jù)組。
優(yōu)選地，根據(jù)一項(xiàng)以上參數(shù)可表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制。更優(yōu)選地，根據(jù)臨床(即觀察個(gè)體)參數(shù)和照片參數(shù)可表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制。甚至更加優(yōu)選地，根據(jù)臨床參數(shù)、照片參數(shù)和顯微鏡下評定參數(shù)(例如組織學(xué)參數(shù))可表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制。最優(yōu)選地，根據(jù)臨床VAS分?jǐn)?shù)、外行小組VAS分?jǐn)?shù)以及網(wǎng)狀真皮的評分(來自照片圖像)和顯微鏡下的VAS分?jǐn)?shù)可表明瘢痕形成的預(yù)防、減少或抑制。
使用本發(fā)明適合方法和藥物能使接受如此治療的損傷區(qū)域的美觀表征快速改善。美觀考慮在大量臨床情況中，尤其是當(dāng)傷口在身體顯著的部位例如臉、頸和手上形成時(shí)是重要的。因此，在這些期望改善所形成的瘢痕美觀表征的部位抑制瘢痕形成(優(yōu)選地與加速傷口愈合相結(jié)合)代表了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
除了它的美觀效果外，皮膚瘢痕形成導(dǎo)致了大量使經(jīng)受這種瘢痕形成的患者痛苦的不良后果。例如，皮膚瘢痕形成與身體和機(jī)械的功能減弱有關(guān)，尤其是在收縮性瘢痕(例如肥厚性瘢痕)的情況下和/或跨越關(guān)節(jié)形成瘢痕的情況時(shí)。在這些情況下，對照于無瘢痕皮膚，瘢痕形成皮膚改變的機(jī)械性質(zhì)和瘢痕收縮的效果使受到如此影響的關(guān)節(jié)(關(guān)節(jié)連接)運(yùn)動(dòng)受到很大限制。因此，優(yōu)選的實(shí)施方案是使用本發(fā)明適合的藥物和方法來預(yù)防、減少或抑制覆蓋機(jī)體關(guān)節(jié)的傷口的瘢痕形成(優(yōu)選地也加速這些傷口的愈合)，另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是，使用本發(fā)明適合的藥物和方法促進(jìn)傷口的加速愈合，和/或預(yù)防、減少或抑制具有增加的形成收縮瘢痕危險(xiǎn)的傷口瘢痕形成。
瘢痕形成的程度，由此由瘢痕造成的整形或其他損傷的程度也會受到很多因素，例如傷口形成部位的張力的影響。例如，已知相對高張力下的皮膚(例如遍布胸或與張力線有關(guān)的)傾向于比機(jī)體其他部位形成更嚴(yán)重的瘢痕。這樣在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用本發(fā)明適合的藥物和方法促進(jìn)傷口的加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制位于高皮膚張力部位的傷口瘢痕形成。很多外科方法可用于瘢痕修復(fù)以使傷口和瘢痕重排，以至于減少它們經(jīng)受的張力。大概這些中最熟知的是“Z字成形術(shù)”，其中調(diào)換兩個(gè)V形的皮膚薄片組織以使張力線旋轉(zhuǎn)。這樣在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用本發(fā)明這樣的藥物和方法促進(jìn)傷口的加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制外科修復(fù)毀容瘢痕過程中傷口的瘢痕形成。
病理瘢痕形成比相對嚴(yán)重的正常瘢痕形成具有更顯著的不良后果。病理瘢痕普遍的實(shí)例包括肥厚性瘢痕和瘢痕瘤。可認(rèn)識到某些類型的傷口或某些個(gè)體傾向于形成病理瘢痕。例如加勒比黑人、日本人或蒙古人種，或那些具有病理瘢痕家族史的個(gè)體可能被認(rèn)為具有增加的形成肥厚性瘢痕或瘢痕瘤的風(fēng)險(xiǎn)。兒童的傷口，尤其是兒童燒傷也與增加的肥厚性瘢痕形成有關(guān)。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是使用適合的藥物和方法來促進(jìn)傷口的加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制具有增加的病理瘢痕形成風(fēng)險(xiǎn)的傷口的瘢痕形成。
盡管已經(jīng)經(jīng)歷了病理瘢痕形成的個(gè)體會經(jīng)受另外過多的瘢痕形成的傾向，但是通常臨床上必須外科修復(fù)肥厚性瘢痕或瘢痕瘤，其伴隨有隨后形成病理瘢痕形成的風(fēng)險(xiǎn)。因而，本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案是使用適合的藥物和方法來促進(jìn)加速傷口的愈合和/或預(yù)防、減少或抑制由外科修復(fù)病理瘢痕產(chǎn)生的傷口瘢痕形成。
可認(rèn)識到，燒傷造成的傷口(出于本發(fā)明的目的，也可包括涉及熱的液體或氣體的燙傷)會在受到如此痛苦的個(gè)體上大面積擴(kuò)展。因此，燒傷可產(chǎn)生覆蓋患者機(jī)體上大部分的瘢痕形成，從而增加了形成的瘢痕覆蓋具有高的美觀重要性的區(qū)域(例如臉、頸、臂或手)或機(jī)械重要性區(qū)域(尤其是覆蓋或圍繞關(guān)節(jié)的區(qū)域)的風(fēng)險(xiǎn)。兒童經(jīng)常遭受熱的液體造成的燒傷(例如打翻的鍋、壺或類似的)并且由于兒童相對小的身體尺寸，尤其可能造成覆蓋身體大部分的大面積損傷。本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案是使用適合的藥物和方法來促進(jìn)傷口的加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制燒傷產(chǎn)生的傷口瘢痕形成。
如上所述，響應(yīng)于燒傷的傷口愈合經(jīng)常與不利的瘢痕形成結(jié)果有關(guān)，例如形成肥厚性瘢痕。相對大尺寸的燒傷的進(jìn)一步后果是它們尤其易發(fā)生并發(fā)癥，例如感染和由于缺乏功能性的上皮層造成的脫水。根據(jù)上文，可理解的是，本發(fā)明適合的藥物和方法可用于燒傷的治療，以減少由傷口產(chǎn)生的瘢痕形成的水平和/或加速功能性的上皮屏障的重建。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，利用單體例如那些包括序列ID號3的本發(fā)明的藥物和方法能促進(jìn)上皮再形成。因此這些方法和藥物在涉及上皮層損傷的所有損傷的治療中尤其有效。這些損傷示例有，但不限于上皮受到損傷的皮膚損傷。但是可理解的是，本發(fā)明的這樣的方法和藥物也可用于其他類型的上皮受到損傷的傷口，例如涉及呼吸道上皮、消化道上皮或圍繞內(nèi)部組織或器官的上皮(例如腹膜上皮)的損傷。
涉及腹膜(覆蓋內(nèi)部器官和/或體腔內(nèi)部的上皮)的傷口愈合經(jīng)常引發(fā)粘連。這種粘連是涉及婦科或腸組織手術(shù)的普通結(jié)果。本發(fā)明人相信，本發(fā)明方法和藥物(利用適合的單體，例如包括序列ID號3的那些)加速腹膜再生而減少瘢痕形成的能力，可減少腹膜各部分互相之間不當(dāng)連接的發(fā)生，因而減少了粘連的發(fā)生。因此，使用本發(fā)明這樣的方法和藥物預(yù)防腸或婦科粘連形成了代表本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。事實(shí)上，在涉及腹膜的任何傷口愈合中使用本發(fā)明這些方法和藥物是優(yōu)選的實(shí)施方案。
本發(fā)明的方法或藥物可用于預(yù)防，例如在無傷口存在但以其他方式會產(chǎn)生瘢痕的傷口或形成慢性傷口的部位。通過實(shí)施例，可將本發(fā)明的藥物施用到遭受選擇性操作(例如手術(shù))造成的傷口的部位，或被認(rèn)為具有提高的創(chuàng)傷風(fēng)險(xiǎn)的部位。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物可在大約創(chuàng)傷時(shí)或在傷口形成前(例如創(chuàng)傷前直到6小時(shí)期間)立即施用到部位，或藥物可在創(chuàng)傷前更早的時(shí)間施用(例如傷口形成前直到48小時(shí)內(nèi))。技術(shù)人員理解的是，傷口形成前施用的最優(yōu)選時(shí)間將根據(jù)大量因素來決定，所述因素包括所選藥物的制劑和施用途徑、施用藥物的劑量、傷口形成的尺寸和性質(zhì)以及患者的生物學(xué)狀況(根據(jù)例如患者的年齡、健康和發(fā)生愈合并發(fā)癥或不利瘢痕形成傾向等來確定)。本發(fā)明的方法和藥物的預(yù)防性應(yīng)用是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，在外科傷口的情況下，特別優(yōu)選用于促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成。
如果在傷口形成后施用本發(fā)明的方法和藥物，也能促進(jìn)傷口加速愈合和/或抑制瘢痕形成。優(yōu)選地，這種施用應(yīng)在傷口形成后盡可能早地進(jìn)行，但是本發(fā)明的藥劑能在直到愈合過程完成前的任何時(shí)間(即甚至如果傷口已經(jīng)部分愈合，本發(fā)明的藥物也可用于剩下的未愈合部分的加速傷口愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成)促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成?？衫斫獾兀墒褂帽景l(fā)明方法和藥物促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成的“窗口”，取決于所討論的傷口的性質(zhì)(包括發(fā)生損傷的程度、損傷區(qū)域的尺寸)。因此在大的損傷的情況下，本發(fā)明的方法和藥物在愈合反應(yīng)中的施用可相對晚一些，但是仍然能促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法和藥物可例如在傷口形成后的第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)施用，但如果傷口發(fā)生后十天或更長時(shí)間內(nèi)施用，仍然可促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成。
為了促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成，本發(fā)明的方法和藥物根據(jù)需要可施用一或多次。例如治療有效量的藥物可根據(jù)需要經(jīng)常給傷口施用，直到完成愈合過程。通過實(shí)例，本發(fā)明的藥物可在傷口形成后至少前三天給傷口一天一次或一天兩次施用。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了包括本發(fā)明藥物兩次施用的方案，第一次在傷口形成前和第二次在傷口形成后，尤其有利于減少瘢痕形成。優(yōu)選地，這樣的給藥方案可包括就在傷口形成前第一次施用和創(chuàng)傷后24小時(shí)第二次施用。
最優(yōu)選地，本發(fā)明的方法和藥物可在傷口形成前后都施用。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明藥物在傷口形成前立即施用，接著在創(chuàng)傷后的時(shí)間內(nèi)每天施用這些藥劑，可特別有效的促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成。
出于本說明書的目的，“藥劑”或“本發(fā)明藥劑”是指具生物學(xué)或治療活性的單體TGF-β。優(yōu)選地，這些藥劑可為野生型的單體TGF-β，和更優(yōu)選地可為能促進(jìn)傷口加速愈合和/或抑制瘢痕形成的單體TGF-β，其中優(yōu)選的實(shí)例包括以序列ID號3列出的單體。可理解地，所有這些藥劑可根據(jù)本發(fā)明摻合到藥物里，可用于本發(fā)明的方法或用途。
可理解地，本發(fā)明藥物應(yīng)用于傷口的量依賴于大量因素，例如藥物中存在的藥劑的生物活性和生物利用率，在其他因素中還依賴于藥劑的性質(zhì)和藥物施用的模式。決定藥物的適合治療量的其他因素可包括 A)藥劑在受治療個(gè)體體內(nèi)的半衰期。
B)待治療的特定狀態(tài)(例如急性或慢性傷口)。
C)個(gè)體的年齡。
施用的頻率也受到上文提及的因素，尤其是在受治療個(gè)體體內(nèi)所選藥劑的半衰期的影響。
一般地，當(dāng)將本發(fā)明的藥物用于治療現(xiàn)存的傷口時(shí)，藥物應(yīng)在傷口一發(fā)生(或在傷口未立刻顯現(xiàn)的情況下，例如在機(jī)體內(nèi)部部位的那樣，傷口一經(jīng)診斷出就施用)時(shí)就施用。用本發(fā)明的方法或藥物進(jìn)行治療應(yīng)持續(xù)到愈合過程已經(jīng)被加速和/或瘢痕形成已經(jīng)被預(yù)防、減少或抑制，直到臨床醫(yī)生滿意為止。
施用頻率依賴于使用藥劑的生物半衰期。典型地，應(yīng)將含有本發(fā)明藥物的乳膏或軟膏施用到靶組織，以使藥劑在傷口上的濃度保持在適合產(chǎn)生治療效果的水平。這需要每天一次或甚至每天幾次施用。
本發(fā)明的藥物可通過能達(dá)到期望的促進(jìn)傷口愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成效果的任何途徑施用，但是優(yōu)選藥物在傷口部位局部施用。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成可通過在傷口部位注射施用本發(fā)明的藥劑實(shí)現(xiàn)。例如，在真皮傷口的情況下，本發(fā)明的藥劑可通過真皮內(nèi)注射的方式施用。因此本發(fā)明的優(yōu)選藥物包含本發(fā)明藥劑的可注射溶液(例如在上皮損傷部位或可能損傷部位邊緣的周圍注射)。本發(fā)明實(shí)施方案中使用的適合的制劑在下文考慮。
可選擇地或另外地，本發(fā)明的藥物也可通過局部的形式施用以促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成。這樣施用可作為傷口區(qū)域的初期和/或后續(xù)護(hù)理后的一部分起作用。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過本發(fā)明藥劑對傷口的局部施用(或在對形成傷口的組織或部位預(yù)防性施用的情況下)尤其改善了促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成。
含有本發(fā)明藥劑的組合物或藥物可采取很多不同的形式，尤其依賴于它們被使用的方式。因此，例如它們可以為液體、軟膏、乳劑、凝膠、水凝膠、粉末或氣溶膠的形式。所有這些組合物適合對傷口局部施用，是對個(gè)體(人或動(dòng)物)施用本發(fā)明藥劑的優(yōu)選方式。
本發(fā)明的藥劑可以由無菌敷料或貼片的形式提供，其可用于覆蓋傷口或所治療上皮損傷的其他部位。
可理解地，包含本發(fā)明藥劑的組合物的賦形劑應(yīng)被患者很好地耐受，使得藥劑對傷口釋放。這種賦形劑優(yōu)選是生物可降解、生物可溶解、生物可吸收和/或非炎性的。
包含本發(fā)明藥劑的藥物和組合物可以很多方式使用。因此，例如為了促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成，組合物可應(yīng)用于傷口內(nèi)部和/或周圍。如果組合物應(yīng)用于“現(xiàn)存的”傷口，那么藥劑學(xué)可接受的賦形劑將是相對“溫和的”，即賦形劑是生物可相容的、生物可溶解和非炎性的。
本發(fā)明的藥劑，或編碼這種藥劑的核酸(下文進(jìn)一步考慮)，可摻入緩釋或延遲釋放的裝置。這些裝置可例如放在或插入皮下，藥劑或核酸可在數(shù)天、數(shù)周或甚至數(shù)月內(nèi)釋放。這種裝置對于需要長期促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成的患者(例如經(jīng)受慢性傷口的那些)尤其有用。當(dāng)用于通常要求頻繁施用(例如通過其他途徑至少每天施用)的藥劑或核酸施用時(shí)，該裝置尤其有利。
本發(fā)明藥劑的每日劑量可以單次施用(例如局部制劑的每日應(yīng)用或每日注射)?？蛇x擇地，本發(fā)明的藥劑一天內(nèi)可能需要施用兩次或多次。進(jìn)一步可選擇地，緩釋裝置可用于對不需要施用重復(fù)劑量的患者提供本發(fā)明藥劑的最佳劑量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明藥劑施用的藥學(xué)賦形劑可為液體，適合的藥學(xué)組合物將采取溶液的形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥學(xué)可接受的賦形劑是固體，適合的組合物采取粉末或片劑的形式，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明藥劑可配制成為藥學(xué)可接受的經(jīng)皮貼片的一部分。
固體賦形劑可包括可作為調(diào)味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、填充劑、助流劑、壓縮輔助劑、粘合劑或片劑崩解劑的一種或多種物質(zhì)；也可是包囊材料。在粉末中，賦形劑是細(xì)碎的固體，所述固體與細(xì)碎的本發(fā)明的藥劑混合。在片劑中，本發(fā)明藥劑以適合比例與具有必要壓縮特性的賦形劑混合，以期望的形狀和尺寸壓制。優(yōu)選地，粉末和片劑含有達(dá)到99％的本發(fā)明藥劑。適合的固體賦形劑包括，例如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔點(diǎn)蠟和離子交換樹脂。
液體賦形劑可用于制備溶液、懸浮液、乳劑、糖漿劑、酏劑和加壓的組合物。本發(fā)明的藥劑可在藥學(xué)可接受的液體賦形劑，例如水、有機(jī)溶劑、藥學(xué)可接受的油或脂肪或其混合物中溶解或懸浮。液體賦形劑可含有其他適合的藥學(xué)添加劑例如增溶劑、乳化劑、緩沖液、防腐劑、甜味劑、調(diào)味劑、懸浮劑、增稠劑、色素、粘度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或滲透調(diào)節(jié)劑。口服和腸胃施用的液體賦形劑的適合實(shí)例包括水(部分包含上文的添加劑，例如纖維素衍生物、優(yōu)選羧甲基纖維素鈉溶液)、醇(包括單羥基醇和多羥基醇，例如乙二醇)和它們的衍生物以及油(例如分餾的椰子油和花生油)。通常優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物或方法利用的制劑中，單體TGF-β，例如TGF-β3在不含醇時(shí)提供。這些無醇制劑由于其相對“溫和”的性質(zhì)，對于傷口部位(或傷口將形成的部位)使用尤其是優(yōu)選的。對于腸胃外施用，賦形劑也可為油，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯。無菌液體賦形劑在用于腸胃外使用的無菌液體組合物中是有利的。加壓組合物的液體賦形劑可為鹵代烴或其它藥學(xué)可接受的推進(jìn)劑。
液體藥學(xué)組合物的無菌溶液或懸浮液可以例如以肌內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)、基質(zhì)內(nèi)(角膜)或皮下注射的方式使用。無菌溶液也可靜脈施用。本發(fā)明藥劑可制備成無菌固體組合物，可在施用時(shí)用無菌水、鹽水或其它適合的無菌可注射介質(zhì)溶解或懸浮。賦形劑傾向于包括必要和惰性的粘合劑、懸浮劑、潤滑劑和防腐劑。
在期望以口服攝取的方式施用本發(fā)明藥劑的情況下，可理解地，所選的藥劑將優(yōu)選為具有提高程度的抵抗降解的藥劑。例如，本發(fā)明藥劑可被保護(hù)(例如用上文所述的技術(shù))，以便降低其在消化道中的降解速率。
本發(fā)明藥劑的組合物適合用于促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制角膜內(nèi)的瘢痕形成。角膜傷口可由意外傷害(如上文考慮的)或外科手術(shù)(例如角膜的激光手術(shù))造成的眼外傷引起。在這種情況下本發(fā)明優(yōu)選的藥物是滴眼劑的形式。
本發(fā)明藥劑可應(yīng)用于一系列“內(nèi)部的”傷口(即傷口發(fā)生在機(jī)體內(nèi)，而不是在外表面上)。因此，例如可配制本發(fā)明的藥物供吸入用于肺或其它呼吸道上皮產(chǎn)生的傷口。
已知的，例如那些藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)使用的方法(例如在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)等中)，可用于建立包括本發(fā)明藥劑的組合物的特殊制劑和這些組合物施用的精確治療方案(例如活性藥劑的每日劑量和施用的頻率)。
本發(fā)明的藥劑能促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成的適合的每日劑量，依賴于一系列因素包括(但不限于)傷口組織的性質(zhì)、治療傷口的面積和/或深度、傷口的嚴(yán)重性和形成病理性瘢痕或慢性傷口的誘病因素的存在或缺乏。
通過實(shí)例，在單次發(fā)病治療中可施用給傷口或上皮損傷部位的活性藥劑的量可優(yōu)選地為約50-200ng/cm線性傷口或cm2上皮損傷(如果注射施用)，或約100-300ng/cm線性傷口或cm2上皮損傷(如果局部施用)。
通過進(jìn)一步的實(shí)例，可施用給傷口或上皮損傷部位的活性藥劑的優(yōu)選量可為約50ng/cm線性傷口或cm2上皮損傷(如果注射施用)或約100ng/cm線性傷口或cm2上皮損傷(如果局部施用)。
通過實(shí)例，可局部施用給傷口或上皮損傷部位活性藥劑的總量可優(yōu)選地為約50ng/100μL每厘米線性傷口或cm2上皮損傷，一日一次連用三天，因而提供的總劑量是150ng/厘米線性傷口或cm2上皮損傷。
在給急性傷口或上皮損傷部位局部施用的情況下，活性藥劑適合的量可優(yōu)選為約100ng/線性傷口或cm2上皮損傷，一日一次連用三天，因而提供的總劑量是300ng/cm線性傷口或cm2上皮損傷。
沒有有損于上文，治療傷口或其它上皮損傷部位需要的本發(fā)明的藥劑量典型地為每24小時(shí)每厘米線性傷口或上皮損傷施用1pg到1mg藥劑，盡管這個(gè)數(shù)字可根據(jù)上文概括的因素向上或向下修正。藥劑可優(yōu)選地以1pg/100μL-1mg/100μL的藥劑溶液的形式提供，24小時(shí)期間每厘米線性傷口或上皮損傷施用100μL這種溶液。
更優(yōu)選地，藥劑以10pg/100μL-100μg/100μL的溶液施用，24小時(shí)期間每厘米線性傷口或上皮損傷施用100μL這種溶液。
最優(yōu)選地，藥劑以1ng/100μL-1000ng/100μL的溶液施用，24小時(shí)期間每厘米線性傷口或上皮損傷施用100μL這種溶液。
一般地，包括本發(fā)明藥劑的組合物應(yīng)被配制使得當(dāng)給傷口施用時(shí)藥劑濃度達(dá)到每厘米線性傷口或上皮損傷0.79pM至0.79mM。優(yōu)選地，藥劑以每厘米線性7.9pM至0.079mM的濃度提供。
本發(fā)明藥劑的(例如序列ID號3的肽)施用濃度可為0.79pM至0.79mM。優(yōu)選地，本發(fā)明藥劑的施用濃度可為7.9pM至0.079mM。最優(yōu)選地，本發(fā)明藥劑的施用濃度可為0.79nM至0.79μM。
純粹通過實(shí)例，當(dāng)皮內(nèi)注射施用并以100μL每厘米線性傷口邊緣給藥，含有濃度為10pg/100μL至100μg/100μL的本發(fā)明活性藥劑(例如序列ID號3的肽)的可注射溶液適合于用來促進(jìn)真皮傷口加速愈合和/或抑制瘢痕形成。
在序列ID號3的單體肽的情況下，施用給傷口的優(yōu)選劑量為約1ng/100μL-1000ng/100μL，每cm線性傷口邊緣施用約100μL的這種溶液。
本發(fā)明的藥劑可作為單一療法(例如通過單獨(dú)使用本發(fā)明的藥物)用于促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成?？蛇x擇地，本發(fā)明的藥物或方法可用于與其它促進(jìn)傷口愈合或抑制瘢痕的化合物或治療結(jié)合?？捎糜谧鳛檫@些組合療法的部分的適合治療為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的藥物，尤其是包括序列ID號3的肽的那些可在糖存在時(shí)方便地配制。這種糖可為還原或非還原糖和/或其磷酸酯或其磷酸酯衍生物。這些糖的實(shí)例可選自，但不限于選自麥芽糖、甘露糖、海藻糖、阿拉伯醣、甘露醇、蔗糖、果糖、右旋糖和葡萄糖。優(yōu)選的糖可選擇由麥芽糖和海藻糖組成的組。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物，尤其是本發(fā)明實(shí)施方案的那些可具有的pH為5至7。
可理解地，通過包括編碼這些分子的核酸序列的細(xì)胞表達(dá)技術(shù)，單體TGF-β肽可代表有利的施用藥劑。這些細(xì)胞表達(dá)的方法尤其適合醫(yī)療應(yīng)用，其中需要長期的肽的治療效果，例如在期望其長時(shí)間增強(qiáng)有缺陷的傷口愈合反應(yīng)的情況下。尤其優(yōu)選的是，通過細(xì)胞表達(dá)施用的TGF-β單體包括序列ID號3定義的肽。
給組織例如傷口施用本發(fā)明肽藥劑的很多已知方法具有如下缺點(diǎn)由于肽藥劑在體內(nèi)的半衰期短，即使幾天的過程也很難達(dá)到本發(fā)明藥劑在治療部位上的持續(xù)水平。藥劑的半衰期短出于很多原因，包括 (i)被蛋白酶和類似物的降解。
(ii)被結(jié)合蛋白的清除。
(iii)被胞外基質(zhì)分子結(jié)合和抑制藥劑活性。
而且，用于促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成的藥劑需要在適合的賦形劑內(nèi)施用，并且經(jīng)常以包含藥劑和賦形劑的組合物的形式提供。正如所討論的，優(yōu)選地這些賦形劑是非炎性、生物可相容的、生物可吸收的并且必須不能使藥劑降解或失活(貯存或使用中)。然而，經(jīng)常難以提供令人滿意的賦形劑以將藥劑遞送到具有待治療傷口的組織。
排除或減輕這些問題的便利方法是，通過基因治療的方式提供治療有效量的本發(fā)明藥劑到待治療的區(qū)域。
由于遺傳密碼子的簡并性，清楚地是，編碼適合本發(fā)明使用的藥劑的核酸序列可變化或改變，而基本上不會影響編碼產(chǎn)物的序列，因此可提供其功能性的變體?？捎糜诰幋a序列ID號1-3所定義的肽的可能的核酸序列對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是非常明顯的，適合的實(shí)例如序列ID號4-7所分別提供的。
基因治療遞送系統(tǒng)比大多數(shù)常規(guī)的遞送系統(tǒng)更可能非常適合在更長時(shí)間內(nèi)在傷口上達(dá)到本發(fā)明藥劑的持續(xù)水平。適合促進(jìn)傷口加速愈合和/或抑制瘢痕形成的本發(fā)明藥劑在傷口部位由細(xì)胞持續(xù)表達(dá)，所述細(xì)胞已用本發(fā)明第九方面公開的DNA分子轉(zhuǎn)化。因此，即使本發(fā)明藥劑在體內(nèi)的半衰期很短，治療有效量的藥劑也可從治療組織持續(xù)地表達(dá)。
而且，基因治療遞送系統(tǒng)可用于提供DNA分子(和由此的本發(fā)明藥劑)，而不需要使用常規(guī)的藥學(xué)賦形劑，例如那些接觸傷口的軟膏或乳劑中需要的。
優(yōu)選地，適合的基因治療遞送系統(tǒng)是這樣的DNA分子能被表達(dá)(當(dāng)遞送系統(tǒng)施用到患者時(shí))產(chǎn)生被包括序列ID號1-3的組所定義的肽。DNA分子可包含在適合的載體內(nèi)形成重組載體。載體例如可為質(zhì)粒、粘?；蚴删w。這些重組載體在本發(fā)明的基因治療遞送系統(tǒng)中，對于用適合的DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞非常有用。
重組載體也可包括其它功能性元件。例如，重組載體可被設(shè)計(jì)以使載體在細(xì)胞核內(nèi)自主復(fù)制。在這種情況下，誘導(dǎo)DNA復(fù)制的元件需要在重組載體內(nèi)?？蛇x擇地，重組載體可被設(shè)計(jì)以將載體和重組DNA分子整合進(jìn)細(xì)胞的基因組。在這種情況下，利于靶向整合的(例如通過同源重組)DNA序列是期望的。重組載體也可含有編碼用作克隆過程中可選擇標(biāo)記物的基因的DNA。
重組載體也可進(jìn)一步根據(jù)需要包含控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)子。
DNA分子可(但不必須)整合進(jìn)受治療個(gè)體細(xì)胞的DNA內(nèi)。未分化細(xì)胞可被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，引起遺傳改變的子細(xì)胞的產(chǎn)生。在這種情況下，需要對個(gè)體的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，例如用特異的轉(zhuǎn)錄因子、基因激活子或更優(yōu)選地用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其可轉(zhuǎn)錄響應(yīng)于在傷口中發(fā)現(xiàn)的特異信號的基因?？蛇x擇地，遞送系統(tǒng)可設(shè)計(jì)為利于受治療個(gè)體未分化細(xì)胞的不穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。在這種情況下，因?yàn)楫?dāng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞死亡或停止表達(dá)蛋白時(shí)(理想地當(dāng)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)傷口加速愈合并減少瘢痕形成時(shí))DNA分子的表達(dá)將終止，所以表達(dá)調(diào)控的重要性變小。
遞送系統(tǒng)可給個(gè)體提供沒有整合進(jìn)載體的DNA分子。例如，DNA分子可整合進(jìn)脂質(zhì)體或病毒顆粒?？蛇x擇地，“裸”DNA分子可通過適合的方式例如直接內(nèi)吞攝取插入個(gè)體的細(xì)胞。
DNA分子可通過轉(zhuǎn)染、感染、微注射、細(xì)胞融合、原生質(zhì)體融合或基因槍轟擊的方式轉(zhuǎn)移到個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)。例如，轉(zhuǎn)移可通過用包被的金顆粒、包含DNA分子的脂質(zhì)體、病毒載體(例如腺病毒)的基因槍轉(zhuǎn)染和通過直接應(yīng)用質(zhì)粒DNA到局部傷口或注射來直接提供DNA攝取(例如內(nèi)吞)的方式進(jìn)行。
本發(fā)明藥劑的細(xì)胞表達(dá)可以是通過傷口周圍無損傷區(qū)域的邊緣的細(xì)胞，或可選擇地通過治療性引入傷口的細(xì)胞(例如培養(yǎng)的與傷口愈合反應(yīng)有關(guān)的內(nèi)源或外源細(xì)胞)。
可理解地，被治療性誘導(dǎo)促進(jìn)傷口加速愈合和/或預(yù)防、減少或抑制瘢痕形成的細(xì)胞可體外操作，以使它們可表達(dá)增加水平的本發(fā)明藥劑，接著引入傷口區(qū)域。優(yōu)選地，這些細(xì)胞是體外培養(yǎng)用于制備或制造在促進(jìn)傷口愈合中使用的人造皮膚或皮膚取代物的細(xì)胞。更優(yōu)選地，細(xì)胞是自體同源的細(xì)胞，盡管可理解地任何適合細(xì)胞都可用。
因此，本發(fā)明第十七方面中提供了包含被誘導(dǎo)表達(dá)本發(fā)明藥劑的細(xì)胞的藥物。這些細(xì)胞可優(yōu)選地表達(dá)單體TGF-β3。
本發(fā)明藥劑細(xì)胞表達(dá)的誘導(dǎo)可通過將核酸整合進(jìn)細(xì)胞的方式實(shí)現(xiàn)，所述核酸可使本發(fā)明適合使用的藥劑表達(dá)。
現(xiàn)在，本發(fā)明將通過實(shí)例參考以下實(shí)驗(yàn)方案和研究，以及附加的附圖做進(jìn)一步描述

圖1說明在還原和非還原條件下，通過SDS-PAGE比較單體和二聚體形式的TGF-β3的結(jié)果； 圖2列出用于定位實(shí)驗(yàn)大鼠切入性傷口的模板； 圖3概括了施用到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷口部位的治療； 圖4顯示創(chuàng)傷后三天，用單體或二聚體TGF-β3治療的實(shí)驗(yàn)傷口的外觀評定結(jié)果； 圖5概括了施用到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷口部位的治療； 圖6顯示創(chuàng)傷后70天，用單體或二聚體TGF-β3治療的實(shí)驗(yàn)瘢痕的外觀評定結(jié)果； 圖7示出顯示創(chuàng)傷后70天，實(shí)驗(yàn)瘢痕的外觀的代表性肉眼下圖像； 圖8表現(xiàn)創(chuàng)傷后70天，實(shí)驗(yàn)瘢痕結(jié)構(gòu)的代表性顯微鏡下圖像； 圖9說明被成功轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的TGF-β3單體的產(chǎn)生； 圖10說明在實(shí)驗(yàn)蛋白再折疊的情況下，二聚體和單體TGF-β3的產(chǎn)生；和 圖11說明通過超濾/疏水相互作用色譜法分離TGF-β3蛋白。
關(guān)于重要的氨基酸或核酸序列的信息在“序列信息”部分提供(包括本發(fā)明適合使用的人TGF-β同工型的活性片段的氨基酸序列，以及編碼TGF-β同工型全長肽的DNA分子的序列，和編碼野生型TGF-β3的活性片段的DNA，和用于產(chǎn)生cDNA的引物的DNA序列，所述cDNA編碼本發(fā)明適合使用的人TGF-β同工型)。
實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)施例 1.TGF-β單體蛋白的產(chǎn)生、再折疊和純化方法 1.1核苷酸序列 編碼全長TGF-β蛋白的DNA序列如序列ID號4-6顯示。全長TGF-β蛋白由信號肽(斜體顯示)、前體肽(粗體顯示)以及活性片段(正常文本顯示)構(gòu)成。編碼野生型TGF-β3活性片段的核苷酸序列在序列ID號7中顯示。
1.2cDNA的產(chǎn)生 來自人切入性傷口的總RNA(創(chuàng)傷后第5天采集)用′DNA-Free′(Ambion)處理，以便除去任何污染的DNA。用總RNA作為模板，三種哺乳動(dòng)物TGF-β同工型即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3中每一種的cDNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)產(chǎn)生。RT-PCR反應(yīng)混合物由

QRT-PCR Core Reagent Kit、一步法(Stratagene)制備。將1微克RNA加入50μL溶液中，所述溶液包含一步QRT-PCR緩沖液、0.2mMdNTP、3.5mM MgCl2、1μL StrataScript逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶2.5單位、0.4μM有義引物(圖1)、0.4μM反義引物(如序列信息中所顯示)。反應(yīng)在熱循環(huán)器(Hybaid PCR Expresses)中發(fā)生，在以下條件下運(yùn)行45℃ 30分鐘，95℃ 10分鐘，接著95℃ 30秒的40個(gè)循環(huán)，65℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘。最后的步驟是72℃ 10分鐘。PCR樣品在2％(w/v)瓊脂糖凝膠中跑膠，以檢驗(yàn)條帶的尺寸，和用Wizard PCR Prep Kit(Promega)純化。
1.3質(zhì)粒的構(gòu)建 使用的pET-3d載體來自pBR322載體，并且包含一個(gè)LacUV5控制的T7啟動(dòng)子和一個(gè)抗氨芐西林抗性標(biāo)記物基因。
三個(gè)TGF-β同工型的cDNA片段(1.2部分中產(chǎn)生的)被亞克隆進(jìn)pET-3d載體的NcoI和Bam HI位點(diǎn)(分別是5′-3′)。產(chǎn)生的連接接著被轉(zhuǎn)化進(jìn)XL10 Gold細(xì)胞(Stratagene)并進(jìn)行菌落PCR分析來定位包含插入物的克隆。使最后的克隆生長并用

Spin Miniprep Kit(Qiagen)將它們的質(zhì)粒DNA提取進(jìn)水中。質(zhì)粒用T7啟動(dòng)子引物(5′-TAA TAC GAC TCACTA TAG GG-3′)和T7終止子引物(5′-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3′)測序和檢驗(yàn)。
1.4轉(zhuǎn)化和克隆 將編碼每一種TGF-β同工型的質(zhì)粒DNA(來自1.3部分)10μL(50ng/μl)加入1mL冷的(4℃)感受態(tài)R.coli(大腸桿菌)BL21(DE3)pLysSSinglesTM細(xì)胞(Novagen)。20分鐘后細(xì)胞在42℃的水浴中溫育30秒，熱激細(xì)胞。將100μL Psi培養(yǎng)基加入細(xì)胞/質(zhì)?；旌衔镏?，37℃搖90分鐘。將50μL和100μL的等分試樣涂布到含有100μg/mL氨芐西林(Sigma)的LB瓊脂平板上，在37℃溫育18小時(shí)。單個(gè)克隆被培養(yǎng)，產(chǎn)生細(xì)胞凍存物，-80℃儲存。分析細(xì)胞凍存物的質(zhì)粒DNA，以檢驗(yàn)正確的轉(zhuǎn)化。
1.5表達(dá) 復(fù)蘇凍存的轉(zhuǎn)化了每一種TGF-β同工型的E.coli細(xì)胞(來自1.4部分)的安瓿，接種到含有100mL LB培養(yǎng)基和100μg/mL氨芐西林的封口的Erlenmeyer燒瓶里。燒瓶振蕩溫育，37℃過夜，將5mL這種過夜的培養(yǎng)物加入到2升的Erlenmeyer燒瓶(500mL LB培養(yǎng)基/amp)并在37℃振蕩溫育。每小時(shí)取2mL肉湯樣品，追蹤其生長和TGF-β同工型的表達(dá)(誘導(dǎo)后)。生長由分光光度計(jì)測量在波長600nm的吸收來確定。當(dāng)測得的吸收是0.6Abs時(shí)，通過加入異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，Sigma)至終濃度1mM來誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)TGF-β同工型。培養(yǎng)物再多溫育4小時(shí)。0.5mL肉湯樣品離心沉淀(Sorvall Biofuge 10,000rpm離心10min)，棄去上清液。沉淀在50μL十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)樣品緩沖液中重懸浮，并在95℃水浴中加熱10分鐘。將10μL樣品加到SDS-PAGE上。SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色(如A.T Andrews描述的，1986)用

Mighty Small SE 245Dual Gel Caster(Amersham)進(jìn)行。凝膠厚度是1mm，含有15％(v/v)聚丙烯酰胺凝膠。
1.6細(xì)胞收集和包涵體的分離 來自1.5部分的細(xì)胞通過在帶有4315轉(zhuǎn)頭的Hettich Rotina 46R離心機(jī)中，于4℃ 5000g離心10分鐘而沉淀。于4℃進(jìn)行細(xì)胞破碎和每一種不溶性(包涵體)TGF-β同工型的回收。細(xì)胞在pH 8.3的50mL 100mMTris/HCl(Sigma)和10mM EDTA(Sigma)中懸浮，用Sanjo Soniprep 150超聲破碎。加入0.2％(w/w)Triton X-100(Sigma)，將懸浮液攪拌1小時(shí)。懸浮液12,000g離心40分鐘。沉淀在以15,000g離心40分鐘之前，在室溫下于pH 8.3的50mL 100mM Tris/HCl和10mM EDTA中重懸浮。
1.7包涵體的溶解 來自1.6部分的沉淀在40mL 8M尿素1％(w/w)DL-二硫蘇糖醇(DTT)中重懸浮，并在Heidolph Diax 900勻漿機(jī)中破碎。懸浮液加蓋并攪拌1小時(shí)以溶解包涵體，將TGF-β同工型還原成它們變性的單體形式。接著懸浮液在4℃ 12,000g離心30分鐘。將上清液透析以使緩沖液從8M尿素(ICN Biomedical)換成10％(v/v)醋酸。當(dāng)緩沖液交換到10％(v/v)醋酸時(shí)，溶于8M尿素的E.coli蛋白從溶液沉淀出來。將1％(w/v)DTT(Sigma)加入懸浮液中，加蓋并攪拌30分鐘以便還原緩沖液交換過程中TGF-β單體間形成的任何二硫鍵。離心懸浮液以便分離可溶和不溶的蛋白。尿素溶解和緩沖液交換步驟取出的樣品(醋酸可溶和不溶物質(zhì))，接著用SDS-PAGE分析。
1.8超濾 來自1.7部分的10％(v/v)醋酸物質(zhì)用10kDa膜在Vivoflow50(Vivascience)中進(jìn)行超濾。這樣做的目的是減少10％(v/v)醋酸懸浮液的體積到3mL，以及除去低分子量的蛋白(＜10kDa)。
1.9再折疊和純化 溶解的TGF-β1、2和3蛋白首先用超濾濃縮，接著跑經(jīng)尺寸排阻色譜法(SEC)柱子。來自SEC包含TGF-β蛋白的部分接著被匯集和凍干。凍干的單體TGF-β1、2和3在含有10mM DTT的8M尿素中溶解，直到達(dá)到終濃度10mg/mL。在攪拌的同時(shí)，將TGF-β1、2和3蛋白溶液逐滴加入再折疊溶液(1M 3-(-吡啶并)-1-丙烷磺酸鹽(NDSB-201)、20％(v/v)二甲基亞砜(DMSO，Sigma)、2％(w/v)3-(3-膽酰胺丙基)二甲銨基-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)、1M NaCl(Sigma)、1％(w/v)還原型谷胱甘肽(GSH，Sigma)和0.05M

Base(Sigma)pH 9.3)直到TGF-β1、2和3蛋白達(dá)到0.2mg/mL的終濃度。重要的是用濃NaOH/HCl將pH保持在9.2-9.4的范圍內(nèi)。溶液用石蠟封口膜(Parafilm)封口，石蠟封口膜上打孔以允許單體蛋白氧化，并在8℃攪拌。144小時(shí)后將溶液15,000g離心40分鐘，去除形成的沉淀，pH用冰醋酸調(diào)整為pH 3.5。
1.10再折疊單體蛋白的純化 產(chǎn)物再折疊TGF-β物質(zhì)接著用標(biāo)準(zhǔn)的色譜技術(shù)進(jìn)一步純化，然后是表征前超濾濃縮相關(guān)部分(即包含單體TGF-β蛋白)。
2.體外和體內(nèi)表征和評定單體TGF-β蛋白的生物活性的方法 通過很多方法來表征和評定TGF-β單體蛋白的生物活性，所述方法包括SDS-PAGE、氨基酸序列分析(通過LCMS)和體內(nèi)生物活性測定(用下面描述的大鼠皮膚傷口愈合和瘢痕形成模型)。
2.1體外表征TGF-β3單體 2.1.1純化的單體TGF-β3的非還原和還原SDS-PAGE分析 2.1.1.1方法 純化的野生型TGF-β3單體用SDS-PAGE測定純度和分子質(zhì)量而進(jìn)行評價(jià)。將3μg純化的TGF-β3單體(還原和非還原的樣品)、3μg二聚體TGF-β3陽性對照(還原和非還原)和10μL Invitrogen Mark 12分子量標(biāo)準(zhǔn)品加樣到聚丙烯酰胺凝膠(10％-20％(v/v)丙烯酰胺梯度)上。一旦電泳完成，凝膠用考馬斯藍(lán)染色。
2.1.1.2結(jié)果 非還原和還原的SDS-PAGE分析結(jié)果在圖1中顯示，圖示二聚體TGF-β3跑到凝膠上的期望位置(還原的單體為約13kDa和非還原的樣品為25kDa)。對還原和非還原樣品，單體TGF-β跑到凝膠上期望的約13kDa(理論上是12.5kDa)的位置。用對約1μg蛋白敏感的考馬斯藍(lán)染色沒有檢測到其它的蛋白條帶。
2.1.2氨基酸序列分析 2.1.2.1方法 將50微升純化的單體TGF-β3在真空下干燥，然后重懸浮于20μl含有50mM NH4HCO3和10％(v/v)乙腈的溶液。20μg測序級胰蛋白酶(Trypsin，Promega)在10μl試劑盒提供的重懸浮緩沖液(Promega)中重懸浮，得到的胰蛋白酶濃度是2μg/μl。再將其稀釋到50mM NH4HCO3和10％(v/v)乙腈中，得到的胰蛋白酶終濃度是0.2μg/μl。通過加入和單體TGF-β3為1∶20(w/w)比例的胰蛋白酶來過夜完成消化。消化通過加入蟻酸(Fluka)到終濃度0.1％(v/v)來終止。接著樣品稀釋到1pmole/μl，然后肽用nano-flow RP-LCMS(臨界系統(tǒng)，Dionex與Q-ToF2聯(lián)機(jī)，微量)的方法分析。色譜分析在75μm C18柱(LC填料)上用從5％到55％的乙腈(Romil)梯度45分鐘完成。MS分析采用數(shù)據(jù)依賴分析的形式，其中儀器測量從LC洗脫的肽離子的m/z，并選擇MSMS分析的合適離子，其中利用碰撞引起的分解使肽離子片段化以提供序列信息。
2.1.2.2結(jié)果 氨基酸序列分析證實(shí)TGF-β3的‘野生型’單體具有期望的氨基酸序列(對應(yīng)于序列ID號3)。
2.2體內(nèi)TGF-β3單體生物活性的評定 文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)表明包含TGF-β3的二聚體TGF-β加速了創(chuàng)傷或損傷后的皮膚愈合和減少瘢痕形成(Shah，M等1995)。下面的實(shí)例研究了單體TGF-β3在成年雄鼠中對切入性傷口愈合(創(chuàng)傷后3天)和瘢痕形成(創(chuàng)傷后70天)的生物作用。
2.2.1單體‘野生型’和突變的TGF-β3蛋白對傷口愈合的效果(切口創(chuàng)傷的第3天) 2.2.1.1方法 雄性大鼠(Sprague Dawley)用氟烷麻醉，剃去其背毛。傷口位置用標(biāo)準(zhǔn)專用模板和皮膚標(biāo)記墨水如圖2顯示的進(jìn)行標(biāo)記。樣品在無菌賦形劑緩沖液中稀釋到圖3圖表中概括的濃度，所述緩沖液含有0.25M麥芽糖(Sigma)、0.002％(v/v)醋酸和0.33％(v/v)異丙醇。全部樣品經(jīng)無菌過濾且不含內(nèi)毒素。每個(gè)治療組用四只大鼠。來自每個(gè)治療組的100μL樣品(圖3)皮內(nèi)注射進(jìn)標(biāo)記的傷口部位A和B(除了不接受治療的大鼠-“未實(shí)驗(yàn)的”)。用11號解剖刀片在傷口部位A和B做成完整厚度為1cm的長切口。全部動(dòng)物分開籠養(yǎng)。24小時(shí)后動(dòng)物接受樣品的第二個(gè)劑量。3天后給傷口拍照并用肉眼的直觀模擬記分系統(tǒng)(Visual Analogue Scoring system)分析(根據(jù)Beausang，E等.1998改進(jìn))。用Mann Whitney U/Student T檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。p＜0.05的值被認(rèn)為是顯著的。
2.2.1.2結(jié)果 3天后用肉眼的VAS系統(tǒng)考察切入性傷口(見圖4)。在這種10分標(biāo)準(zhǔn)下，0分代表完全愈合的傷口，10分代表愈合極差的傷口。數(shù)據(jù)顯示 50ng/100μL或100ng/100μL的‘野生型’單體TGF-β3的治療與無治療(未實(shí)驗(yàn)的對照)和安慰劑治療比較，降低了VAS分?jǐn)?shù)(即改善了傷口的肉眼外觀)。100ng/100μL劑量的治療與無治療(未實(shí)驗(yàn)的對照)比較，顯著改善了(p＜0.01)傷口的外觀。令人驚奇地，注意到單體野生型TGF-β比二聚體形式表現(xiàn)出更強(qiáng)的效力。
2.2.2單體‘野生型’TGF-β3蛋白對瘢痕形成的效果(切口創(chuàng)傷后70天) 2.2.2.1方法 雄性大鼠(Sprague Dawley)用氟烷麻醉，剃去其背毛。傷口位置用標(biāo)準(zhǔn)模板和皮膚標(biāo)記墨水如圖5顯示的進(jìn)行標(biāo)記。樣品在無菌賦形劑緩沖液中稀釋到圖5圖表中概括的濃度，所述緩沖液含有0.25M麥芽糖(Sigma)、0.002％(v/v)醋酸和0.33％(v/v)異丙醇。全部樣品經(jīng)無菌過濾且不含內(nèi)毒素。每個(gè)治療組用四只大鼠。來自每個(gè)治療組的100μL樣品(圖5)皮內(nèi)注射進(jìn)標(biāo)記的傷口部位A和B(除了不接受治療的大鼠-“未實(shí)驗(yàn)的”)。用11號解剖刀片在傷口部位A和B做成完整厚度為1cm的長切口。全部動(dòng)物分開籠養(yǎng)。24小時(shí)后動(dòng)物接受樣品的第二個(gè)劑量。70天后給瘢痕拍照并用肉眼的直觀模擬記分系統(tǒng)分析(根據(jù)Beausang，E等.1998改進(jìn))。如上面描述產(chǎn)生的瘢痕肉眼外觀的代表性例子在圖7顯示。
肉眼分析后，并在處理成蠟塊用于組織學(xué)評定之前，切除傷口并置于10％緩沖鹽水中。蠟塊被切成5μm的連續(xù)切片，置于載玻片上。載玻片用Masson三色法(Massons Trichrome)染色、分析。用Mann WhitneyU/Student T檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。p＜0.05的值被認(rèn)為是顯著的。如上面描述產(chǎn)生的瘢痕顯微鏡下外觀的代表性例子在圖8顯示。
2.2.2.2用肉眼VAS對70天的切入性傷口進(jìn)行評定 70天后用肉眼的VAS系統(tǒng)考察切入性傷口。10分代表不好的瘢痕，0分代表正常皮膚。圖6總結(jié)了傷口70天的VAS分析結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示 單體‘野生型’TGF-β3(50ng/100μL和100ng/100μL的劑量)與安慰劑治療和未實(shí)驗(yàn)的傷口比較，減少了瘢痕形成。100ng/100μL的劑量與安慰劑治療的傷口比較，這種減少是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p＜0.01)。
50ng/100μL的二聚體TGF-β3與安慰劑治療和未實(shí)驗(yàn)的傷口比較，減少了瘢痕形成。與安慰劑治療的傷口比較，這種減少是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p＜0.01)。
3.生產(chǎn)生物活性單體優(yōu)選條件的開發(fā) 發(fā)明人研究了是否可以建立產(chǎn)生正確折疊的、生物活性TGF-β單體的改進(jìn)方法。下面的實(shí)例例證了本發(fā)明方法對TGF-β3單體再折疊的應(yīng)用。
進(jìn)行篩選再折疊試劑的研究(見3.12)。接著研究了純化正確再折疊單體的方法(3.13)。
這些研究使發(fā)明人意識到，可通過遵循以下的方法來建立生產(chǎn)生物正確折疊的TGF-β單體的改進(jìn)方法，其包括 將溶解的、未折疊單體生長因子加入到一種溶液中，所述溶液包含 (i)2-(環(huán)己基氨基)-乙磺酸(CHES)或其功能性類似物；和 (ii)低分子量巰基/二硫化物氧化還原系統(tǒng)；且 在溶液中孵育生長因子直到形成二聚體生物活性生長因子。
實(shí)驗(yàn) 3.1cDNA的產(chǎn)生 來自人切入性傷口的總RNA(創(chuàng)傷后5天取出)用DNA-Free(Ambion)處理，以便除去任何污染的DNA。用總RNA作為模板，TGF-β3的cDNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)產(chǎn)生。RT-PCR反應(yīng)混合物由

QRT-PCR Core Reagent Kit、一步法(Stratagene)制備。將1微克RNA加入50μL溶液中，所述溶液包含一步QRT-PCR緩沖液、0.2mMdNTP、3.5mM MgCl2、1μL StrataScript逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶2.5單位、0.4μM有義引物(5′GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACTACT GC 3′)、0.4μM有義引物(5′-CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCAGCT ACA TTT ACA AGA C 3′)。反應(yīng)在熱循環(huán)器(Hybaid PCR Express)中發(fā)生，在以下條件下運(yùn)行45℃ 30分鐘，95℃ 10分鐘，接著95℃ 30秒的40個(gè)循環(huán)，65℃1分鐘和72℃1分鐘。最后的步驟是72℃ 10分鐘。PCR樣品在2％(w/w)瓊脂糖凝膠中跑膠，以檢驗(yàn)條帶的尺寸，和用Wizard PCR Prep Kit(Promega)純化。
3.2載體克隆和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化 pET-24d載體來自pBR322載體，并包含一個(gè)LacUV5控制的T7啟動(dòng)子和一個(gè)抗卡那霉素標(biāo)記基因。
TGF-β3的cDNA片段(1.1部分中產(chǎn)生)用0.75μL Nco1(New EnglandBiolabs)和0.75μL BamH1(New England Biolabs)與1×BamH1緩沖液(New England Biolabs)在15μL反應(yīng)液(Nuclease Free Water，Novagen)中37℃消化4小時(shí)。1微升pET-24d質(zhì)粒(Novagen)用同樣的方法消化。消化的cDNA和大的質(zhì)粒片段經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，并用SpinPrep Gel DNA提取試劑盒(Novagen)回收。
純化的cDNA和質(zhì)粒片段用T4連接酶試劑盒(Novagen)連接。連接的cDNA/質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)HMS 174(DE3)(Novagen HMS 174(DE3)轉(zhuǎn)化試劑盒)。轉(zhuǎn)化體通過在含有50μg/mL卡那霉素(Invitrogen)的Luria肉湯(LB)瓊脂平板上涂布來選擇。選擇3個(gè)克隆進(jìn)行限制性消化和/或表達(dá)。
3.3用于產(chǎn)物表達(dá)的克隆篩選 克隆在搖瓶培養(yǎng)基中生長，并在OD600為0.65-0.85的指數(shù)期用1mM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，其中所述培養(yǎng)基含有半濃度′Terrific Broth′(6g/L植物蛋白胨(Becton Dickinson)、12g/L酵母提取物(Becton Dickinson)、2g/L甘油(JT Baker)、1.16g/L磷酸二氫鉀(JT Baker)、6.25g/L磷酸氫二鉀(JT Baker)，用蒸餾水適量到1升)。加入IPTG 3小時(shí)后取出誘導(dǎo)后樣品，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析產(chǎn)物的誘導(dǎo)和表達(dá)?？寺?-4誘導(dǎo)前/后樣品等分試樣和Mark 12分子量標(biāo)準(zhǔn)品(Invitogen-分子量范圍2.5-200kDa)在

Novex 12％Bis-Tris Gel，1.0mm(Invitrogen)上于120毫安、200伏跑膠約40-50分鐘，接著用考馬斯藍(lán)染色。在這些培養(yǎng)物的每一種中，大小在6-14.4kDa的蛋白(即TGF-β3單體)被清晰地誘導(dǎo)出來(見圖9)，其中克隆2表達(dá)最大量的TGF-β3蛋白。
3.4細(xì)胞凍存物 克隆1-4在搖瓶中半濃度Terrific Broth中生長到OD600為大約1，通過加入甘油到20％(v/v)而作為甘油儲液儲存。等分1.2mL肉湯到12x 2mL冷凍管(含有0.3mL甘油)中，然后-70℃儲存。
3.5TGF-β3基因序列確認(rèn) 在加入甘油前取出用于細(xì)胞凍存物的培養(yǎng)樣品，利用QiagenMiniPrep Kit進(jìn)行質(zhì)粒分離。給分離的質(zhì)粒測序，用一個(gè)T7啟動(dòng)子引物(5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3′)和一個(gè)T7終止子引物(5′-GCTAGT TAT TGC TCA GCG G-3′)檢驗(yàn)。
3.6種子培養(yǎng)物 因?yàn)榭寺?表達(dá)最大量的TGF-β3蛋白，所以復(fù)蘇細(xì)胞凍存物的安瓿(來自3.4部分)，并接種到2升封口的(baffled)Erlenmeyer燒瓶，該燒瓶含有500mL HySoy培養(yǎng)基(12g/L蛋白胨(Quest International)、24g/L酵母提取液(Becton Dickinson)、10g/L NaCl(Sigma)和10g/L甘油(Sigma)及50μg/mL卡那霉素。燒瓶37℃、200rpm振蕩溫育，周期性取樣測OD550。當(dāng)培養(yǎng)物的OD達(dá)到3.21U/mL(7小時(shí)后)時(shí)，細(xì)胞肉湯用于接種150L發(fā)酵罐(100L工作體積)。
3.7發(fā)酵 900毫升細(xì)胞肉湯(來自3.6部分)用于接種150L發(fā)酵罐(WHE)，該發(fā)酵罐中含有90L分批培養(yǎng)基(0.6g/L K2HPO4、0.4g/L KH2HPO4、1.25g/L NH4SO4、12g/L蛋白胨、24g/L酵母提取液和10g/L甘油)。發(fā)酵操作參數(shù)控制如下溫度設(shè)定值37℃；pH設(shè)定值7.0(用4N氫氧化銨和4N磷酸保持)和溶解氧(DO)最初校準(zhǔn)為100％。罐的排出壓力為7psi，攪拌速度和空氣流速分別是200-400rpm和每分鐘每體積培養(yǎng)基1體積空氣(vvm或slpm)。以下列優(yōu)先順序通過調(diào)節(jié)發(fā)酵設(shè)定值參數(shù)，而將DO保持在20％以上攪拌速度(最大400rpm)、通風(fēng)量(最大1.5vvm)、吸氧量(最大33.3Ipm)和背壓(最大12psi)。泡沫用Pluronic L-61(25％v/v)控制。當(dāng)培養(yǎng)物的OD達(dá)到10U/mL時(shí)，以45mL/min的起始流速進(jìn)行甘油進(jìn)料(50％v/v)。當(dāng)OD達(dá)到40U/mL時(shí)，加入IPTG到終濃度0.2mM，誘導(dǎo)細(xì)胞。
3.8收集 誘導(dǎo)4小時(shí)后，發(fā)酵罐冷卻到10℃，并將空氣流速和攪拌速度分別減小到0.3vvm和100rpm。終止起泡和pH控制，并將背壓調(diào)節(jié)為3psi。通過用Westfalia CSA 8連續(xù)式離心機(jī)在10℃連續(xù)離心來收集培養(yǎng)物。離心機(jī)以15,000rpm操作，流速為3升每分鐘，采集細(xì)胞漿液。
3.9細(xì)胞裂解和IB回收 發(fā)酵細(xì)胞體(來自3.8部分)用裂解緩沖液(6.1g/L TrizmaBase(Tris)、3.7g/L乙二胺四乙酸(EDTA)、58.44g/L NaCl和10g/L Triton X-100，pH 8.0)1∶5稀釋，并使用手提式勻漿器重懸浮。將重懸浮的細(xì)胞體通過高壓勻漿器兩次(參數(shù)壓力10,000psig；流速450mL/min和溫度15℃)。然后將勻漿細(xì)胞裂解液5,000xg、4℃離心(桶式離心機(jī)，固定角轉(zhuǎn)頭)20分鐘。棄去上清液，留下不溶的(包涵體)TGF-β3。包涵體(IB)沉淀用手提式勻漿器在洗滌緩沖液(6.1g/L Tris和3.72g/L EDTA，pH 8.0)中重懸浮，并離心(5,000xg、20分鐘、4℃)。
3.10包涵體溶解 來自3.9部分的沉淀用溶解緩沖液(6.1g/L Tris、15.4g/L DL-二硫蘇糖醇(DTT)和360.4g/L尿素，pH 8.0)1∶10稀釋，用手提式勻漿器重懸浮。懸浮液加蓋并室溫?cái)嚢?0-75分鐘以溶解包涵體并還原TGF-β3到它們的單體形式。在第二次溫育60-75分鐘之前，重懸浮沉淀的pH用NaOH/醋酸調(diào)節(jié)到pH 9.4-9.6。
3.11凈化/超濾和滲濾 來自3.10部分的溶解的材料在切向流過濾(TFF)系統(tǒng)(Millipore)中被凈化、濃縮和滲濾。初期的凈化和濃縮用預(yù)處理的凈化TFF膜(MilliporePellicon 1000kDa，再生纖維素，篩網(wǎng)V)完成。凈化的TGF-β3在透過液中收集。換到超濾/滲濾(UF/DF)膜(Millipore Pellicon 5kDa，再生纖維素，篩網(wǎng)C)，接著TGF-β3在6置換體積(diavolume)溶解緩沖液(6.1g/L Tris、15.4g/L DTT和360.4g/L尿素，pH 9.5)中清洗。
3.12再折疊篩選基質(zhì)1 3.12.1方法 來自1.12部分的凈化材料中的TGF-β3蛋白含量用RC DCTM蛋白質(zhì)分析法(BioRad)結(jié)合SDS-PAGE、考馬斯藍(lán)染色和密度測定法定量。TGF-β3材料在一系列再折疊緩沖液中稀釋(見表1和2)。6天時(shí)間內(nèi)每天取1mL樣品，并在非還原條件下用SDS-PAGE分析。樣品等分試樣和Mark 12分子量標(biāo)準(zhǔn)品(Invitogen-分子量范圍2.5-200kDa)在

Novex 12％Bis-Tris Gel，1.0mm(Invitrogen)上于120毫安、200伏跑膠約40-50分鐘。然后蛋白樣品用Novex印跡裝置(Invitrogen)電泳轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜(Invitrogen)。膜用5％(w/v)脫脂奶粉和1％(v/v)聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯(吐溫20；Sigma)在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中封閉。清洗膜(PBS，0.1％(v/v)吐溫20)，在一抗(抗-TGF-β3，MAB643(R&D systems)，其用PBS和0.1(v/v)吐溫20以1∶500稀釋)中溫育1小時(shí)。一抗溫育后，硝化纖維膜在清洗緩沖液(PBS，1％(v/v)吐溫20)中清洗。然后硝化纖維膜在二抗(與堿性磷酸酶軛合的羊抗小鼠IgG(Abeam PO397)，其用PBS和0.1％(v/v)吐溫20以1∶2000稀釋)中溫育另外1小時(shí)。在用Western Blue穩(wěn)定的堿性磷酸酶底物(Promega)顯影之前，再次清洗膜(PBS，1％(v/v)吐溫20)。
MAB 643抗體檢測到正確折疊的單體和二聚體TGF-β3種類。
3.12.2結(jié)果 表1和表2總結(jié)了在50個(gè)不同實(shí)驗(yàn)條件下，檢測再折疊的TGF-β3得到的結(jié)果。
發(fā)明人確定了，下面描述的條件(即實(shí)驗(yàn)條件12、19、36、37、42、43和44)產(chǎn)生正確再折疊的二聚體TGF-β3。
1.0.7M 2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸(CHES)、2mM還原型谷胱甘肽(GSH)、0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(實(shí)驗(yàn)條件12)。
2.30mM牛磺脫氧膽酸鹽、0.7M CHES、2mM GSH、0.4mM GSSG、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(實(shí)驗(yàn)條件19)。
3.1M NDSB-201、2mM還原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(實(shí)驗(yàn)條件36)。
4.0.7M CHES、2mM還原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(實(shí)驗(yàn)條件37)。
5.30mM?；敲撗跄懰猁}加1M NDSB-221、2mM還原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(實(shí)驗(yàn)條件42)。
6.30mM?；敲撗跄懰猁}加0.7M CHES、2mM還原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(實(shí)驗(yàn)條件43)。
7.30mM?；敲撗跄懰猁}、0.7M CHES、2mM GSH、2mM GSSG、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(實(shí)驗(yàn)條件44)。
舉例來說，圖10示出了實(shí)驗(yàn)條件12的效力。
表1再折疊篩選基質(zhì)和結(jié)果 表2.再折疊篩選基質(zhì)和結(jié)果 3.13超濾/疏水相互作用色譜 選擇的再折疊溶液用超濾(膜為平板微孔Pellicon 5kDa，0.1m2，再生纖維素，篩網(wǎng))濃縮5倍。在稀釋緩沖液(2.72g/L醋酸鈉、264.28g/L硫酸銨、100g/L醋酸和210.7g/L鹽酸精氨酸，pH 3.3)里1∶1稀釋之前，濃縮的再折疊物質(zhì)的pH用冰醋酸調(diào)節(jié)到pH 2.5-2.8。丁基瓊脂糖凝膠4快流速柱(Amersham，床高16cm)用四柱體積的緩沖液A(2.72g/L醋酸鈉、132.14g/L硫酸銨和100g/L醋酸，pH 3.3)平衡。在以100cm/hr的流速(整個(gè)過程都用這個(gè)流速)加樣到丁基瓊脂糖凝膠柱之前，再折疊物質(zhì)經(jīng)0.22μM膜(微孔Millipak過濾器)過濾。然后柱子用四柱體積的緩沖液A清洗。TGF-β3蛋白用緩沖液B(2.72g/L醋酸鈉、100g/L醋酸和300g/L乙醇，pH 3.3)洗脫離柱。在分離單體蛋白之前，包含TGF-β3蛋白單體和二聚體形式的第一個(gè)峰被匯集(見圖11)。
序列信息
TGF-β1(序列ID號1)
ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGP
CPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGR
KPKVEQLSNMIVRSCKCS
TGF-β2(序列ID號2)
ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAG
ACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTP
KIEQLSNMIVKSCKCS
TGF-β3(序列ID號3)
ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGP
CPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTP
KVEQLSNMVVKSCKCS
編碼全長TGF-β1的DNA(序列ID號4)，顯示信號肽(斜體顯示)、前體肽(粗體顯示)以及活性片段(正常文本顯示)
編碼全長TGF-β2的DNA(序列ID號5)，顯示信號肽(斜體顯示)、前體肽(粗體顯示)以及活性片段(正常文本顯示)
編碼全長TGF-β3的DNA(序列ID號6)，顯示信號肽(斜體顯示)、前體肽(粗體顯示)以及活性片段(正常文本顯示)
序列ID號7-編碼野生型人TGF-β3活性片段的DNA
GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC
TGC TGT GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG
GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC
AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC
ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG
AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG
GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT GTT GGG AGG ACC
CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT
TGT AAA TGT AGC
產(chǎn)生TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3的cDNA的有義和反義引物
TGF-β1
有義引物-5′GTT ACA CCA TGG CCC TGG ACA CCA ACT ATT 3′
反義引物-3′CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT GCA CTT 5′
TGF-β2
有義引物-5′GTT ACA CCA TGG CTT TGG ATG CGG CCT ATT
反義引物-3′CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT GCA TTT G 5′
TGF-β3
有義引物-5′GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACT GC3′
反義引物-5′CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT ACA TTT ACAAGA C 3′
權(quán)利要求
1.TGF-β單體或其生物活性片段或衍生物作為藥物的用途。
2.TGF-β3單體或其生物活性片段或衍生物作為藥物的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的用途，其中所述TGF-β單體具有大約12kDa的分子量。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的用途，其用于加速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成的藥物的制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的用途，其中所述TGF-β3單體或片段或衍生物，是包含序列ID號3的野生型TGF-β3單體或其生物活性片段或衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的用途，其中所述傷口是真皮傷口。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的用途，其中所述傷口是眼部傷口。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7任一項(xiàng)所述的用途，其中所述傷口是急性傷口。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述傷口是燒傷。
10.根據(jù)權(quán)利要求4到7任一項(xiàng)所述的用途，其中所述傷口是慢性傷口。
11.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的用途，其用于促進(jìn)上皮再生的藥物的制備。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述上皮包括表皮。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述上皮包括眼上皮。
14.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的用途，其用于預(yù)防和/或治療纖維化疾病的藥物的制備。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述纖維化疾病選自肺纖維化、肝纖維化、硬皮病、皮膚纖維化、肌肉纖維化、放射纖維化、腎臟纖維化、眼纖維化和子宮纖維化。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的用途，其中所述單體或其生物活性片段或衍生物以0.78pM至0.78mM的濃度提供。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物具有的pH約5至7。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物基本上不含醇。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的用途，其中所述TGF-β單體或其生物活性片段或衍生物通過一種方法被折疊成其生物活性形式，所述方法包括
將溶解的、未折疊的單體TGF-β(或其片段或衍生物)加入到一種溶液中，該溶液含
(i)2-(環(huán)己基氨基)-乙磺酸(CHES)或其功能性類似物；和
(ii)低分子量巰基/二硫化物氧化還原系統(tǒng)；且
在所述溶液中孵育所述TGF-β直到形成具生物活性的單體TGF-β。
20.加速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成的方法，包括給需要這種治療的患者施用治療有效量的單體TGF-β或其生物活性片段或衍生物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述TGF-β3單體或片段是包含序列ID號3的野生型TGF-β3單體或其生物活性片段或衍生物。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21所述的方法，其中所述傷口是真皮傷口。
23.根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21所述的方法，其中所述傷口是眼部傷口。
全文摘要
本發(fā)明提供了單體TGF-β或其片段或其衍生物作為藥物的用途。這些藥物優(yōu)選地包括單體TGF-β3或其片段或其衍生物。提供的藥物可用于加速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成、促進(jìn)上皮再生、或預(yù)防和/或治療纖維化疾病。
文檔編號A61P17/00GK101605555SQ200780016269
公開日2009年12月16日 申請日期2007年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月11日
發(fā)明者馬克·威廉·詹姆斯·弗格森, 菲利普·戴維·梅勒斯, 修·杰勒德·萊弗蒂, 尼克·奧克萊斯頓, 沙倫·奧凱恩, 愛瑪·阿特金森 申請人:瑞諾弗有限責(zé)任公司