專(zhuān)利名稱(chēng)：：在動(dòng)物中疫苗接種滴度的增強(qiáng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可增強(qiáng)針對(duì)疫苗的抗體的滴度的組合物和疫苗的組合，以及4吏用該組合的方法。
背景技術(shù)：
：免疫應(yīng)答包含兩個(gè)不同的系統(tǒng)先天性系統(tǒng)和獲得性(抗體介導(dǎo)的)系統(tǒng)。先天性系統(tǒng)是一種進(jìn)化上古老的系統(tǒng)，它使用多種策略來(lái)預(yù)防感染。它們包括由皮膚提供的上皮細(xì)胞屏障、胃腸道和肺內(nèi)襯和乳腺。另外，先天性系統(tǒng)包括胃(或反芻動(dòng)物的皺胃)的酸性屏障和胃、胰腺和小腸的消化酶。最后，先天性系統(tǒng)包括白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。這些細(xì)胞首先通過(guò)獨(dú)特標(biāo)志物在病原體表面上的呈現(xiàn)來(lái)識(shí)別病原體，然后吞噬和殺死病原體。先天性系統(tǒng)提供初次免疫應(yīng)答，并提供獲得性抗體系統(tǒng)作出應(yīng)答和形成與特定病原體斗爭(zhēng)所需的抗體所需的時(shí)間。通常，人或動(dòng)物需要一周至數(shù)周來(lái)形成抗體應(yīng)答。在該干預(yù)時(shí)間中，生物體依靠先天性系統(tǒng)來(lái)排斥感染。獲得性免疫系統(tǒng)可以響應(yīng)于特定病原體、毒素、化學(xué)試劑或被生物體識(shí)別為抗原的(即免疫系統(tǒng)認(rèn)為該抗原是非自身的)任意分子，形成抗體。當(dāng)病原體感染人或動(dòng)物時(shí)，與病原體有關(guān)的特定細(xì)胞標(biāo)志物呈遞給抗體產(chǎn)生細(xì)胞。獲得性免疫系統(tǒng)然后經(jīng)歷稱(chēng)作"克隆擴(kuò)增"的過(guò)程。具體而言，這允許大量生成產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，所述抗體針對(duì)與該病原體有關(guān)的特定抗原?？贵w由T-細(xì)胞和B-細(xì)胞合成。T-細(xì)胞在胸腺中成熟，并呈遞結(jié)合在它們的胞外表面上的抗體。T-細(xì)胞然后自由地在血液中循環(huán)，并穿過(guò)淋巴組織。T-細(xì)胞通過(guò)結(jié)合的抗體結(jié)合病原體，從而導(dǎo)致病原體的4識(shí)別和隨后的破壞。相反，由B-細(xì)胞生成的抗體分泌進(jìn)血液，它們?cè)谄渲凶杂裳h(huán)。當(dāng)B-細(xì)胞生成的抗體結(jié)合病原體時(shí)，它們啟動(dòng)導(dǎo)致該病原體的識(shí)別和殺死的事件級(jí)聯(lián)。響應(yīng)于免疫接種生成的抗體歸類(lèi)于抗體同種型。三種最重要的抗體同種型包括IgM,IgGl和IgG2。其它同種型包括、但不限于IgA，IgD，IgG3，IgG4和IgE同種型，和在家禽內(nèi)的IgY同種型。適應(yīng)性IgM應(yīng)答是T-和B-細(xì)胞響應(yīng)于抗原生成的第一抗體；但是，它是具有有限的抗原親和力和特異性的相對(duì)"較弱的"抗體。更"有力的"抗體應(yīng)答包含在IgGl和IgG2同種型內(nèi)；但是，IgGl和IgG2同種型的形成需要更長(zhǎng)的時(shí)間段。懷孕個(gè)體中的IgG同種型應(yīng)答是特別重要的，因?yàn)樗鼈兪窃诔錾鷷r(shí)通過(guò)初乳從母親傳遞給后代、并從而將被動(dòng)免疫傳遞給新生兒的抗體同種型。人類(lèi)醫(yī)學(xué)和家畜產(chǎn)業(yè)中經(jīng)常采用針對(duì)疾病的疫苗接種(也稱(chēng)作免疫接種)。例如，為了針對(duì)病原體接種，給動(dòng)物施用非傳染性病原體形式的疫苗，或僅僅施用病原體的一部分。獲得性免疫系統(tǒng)通過(guò)生成抗體而對(duì)該疫苗作出響應(yīng)。如果隨后將動(dòng)物暴露于活病原體，響應(yīng)于該疫苗而生成的抗體會(huì)被迅速動(dòng)員起來(lái)，然后識(shí)別和把向該病原體，以進(jìn)行破壞。家畜產(chǎn)業(yè)依賴于針對(duì)家畜特異性疾病的免疫接種方案，以使由真菌、病毒和細(xì)菌感染引起的發(fā)病率和死亡率最小化。例如，在乳品產(chǎn)業(yè)中，經(jīng)常針對(duì)大腸桿菌接種動(dòng)物，因?yàn)檫@是最常見(jiàn)的乳腺感染形式之一(即乳腺炎)，并造成生產(chǎn)損失，和在嚴(yán)重情況下的奶牛損失。現(xiàn)有的疫苗接種方案會(huì)產(chǎn)生幾個(gè)問(wèn)題。例如，疫苗接種方案的功效隨個(gè)體而異。具體而言，有些個(gè)體會(huì)響應(yīng)于特定免疫接種方法形成高滴度(抗體的高血清濃度)，而其它個(gè)體則不會(huì)。由于抗體滴度和免疫系統(tǒng)對(duì)感染的應(yīng)答之間存在直接關(guān)聯(lián)，有些個(gè)體仍然對(duì)病原體感染是易感的，盡管它們已經(jīng)接種過(guò)疫苗。結(jié)果，仍然需要提高疫苗的功效，以降低動(dòng)物群體的疾病發(fā)生率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)疫苗的功效的組合和使用該組合的方法。本發(fā)明的組合使用具有下述組分的組合物P-1,3(4)-內(nèi)切葡聚糖水解酶，P-1，3(4)葡聚糖，硅藻土，礦物土和葡甘露聚糖。將該組合物飼喂給將要接受疫苗接種或正在接受疫苗接種的動(dòng)物。該組合通過(guò)增加針對(duì)疫苗的抗體的血清濃度(滴度)來(lái)增加疫苗的功效。甚至在從動(dòng)物飲食撤出該組合物后，仍然保持增加的抗體血清濃度。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，它們證實(shí)了所述組合物對(duì)中性粒細(xì)胞L-選擇蛋白的表達(dá)的影響，如實(shí)施例l所述。圖2顯示了蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，它們證實(shí)了未加熱的和加熱的(造粒的)形式的所述組合物對(duì)中性粒細(xì)胞L-選擇蛋白的表達(dá)的影響，如實(shí)施例2所述。圖3的圖總結(jié)了所述組合物對(duì)大鼠中性粒細(xì)胞中編碼L-選擇蛋白的mRNA的表達(dá)的影響，如實(shí)施例3所述。圖4顯示了蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，它們證實(shí)了所述組合物對(duì)中性粒細(xì)胞白介素-iP(IL-1P)的表達(dá)的影響，如實(shí)施例4所述。圖5的條形圖總結(jié)了用于定量針對(duì)J5疫苗的IgGl滴度的ELISA結(jié)果，如實(shí)施例6所述。圖6的條形圖總結(jié)了用于定量針對(duì)J5疫苗的IgG2滴度的ELISA結(jié)果，如實(shí)施例6所述。圖7的條形圖解釋了低劑量(15克/天)和高劑量(30克/天)的組合物對(duì)肉牛中白介素-1P的表達(dá)的影響，如實(shí)施例6所述。圖8顯示了蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，它們證實(shí)了所述組合物對(duì)肉牛中中性粒細(xì)胞L-選擇蛋白的表達(dá)的影響，如實(shí)施例6所述。圖9的條形圖總結(jié)了用于定量總IgGl和IgG2滴度的ELISA結(jié)果，如實(shí)施例7所述。優(yōu)選實(shí)施方案的描述根據(jù)要求，本文公開(kāi)了本發(fā)明的組合物的詳細(xì)實(shí)施方案；但是，應(yīng)當(dāng)理解，公開(kāi)的實(shí)施方案僅僅是本發(fā)明的示例，它們可以以不同方式來(lái)實(shí)施。因此，本文公開(kāi)的具體細(xì)節(jié)不應(yīng)當(dāng)被理解為限制性的，而是僅僅作為權(quán)利要求的基礎(chǔ)，并作為教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員以事實(shí)上任意適當(dāng)方式不同地采用本發(fā)明組合物的代表性基礎(chǔ)。本發(fā)明提出了增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能的組合和使用該組合的方法。一般而言，本發(fā)明的組合使用具有下述組分的組合物p-l，3(4)-內(nèi)切葡聚糖水解酶，p-l，3(4)葡聚糖，硅藻土，礦物土和葡甘露聚糖。所述組合物與疫苗組合使用，所以動(dòng)物對(duì)組合物的攝入增強(qiáng)疫苗的功效。如這里所定義的，疫苗會(huì)刺激免疫系統(tǒng)，包括當(dāng)施用給動(dòng)物時(shí)抗體的產(chǎn)生。疫苗的增強(qiáng)的功效的一個(gè)跡象是動(dòng)物血清中增加的針對(duì)疫苗抗原的抗體滴度。所述組合可以有效地用于祠養(yǎng)許多物種的個(gè)體或動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)和禽類(lèi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合用于家畜哺乳動(dòng)物。所述組合可以同樣好地用于反芻動(dòng)物和非反芻動(dòng)物。反芻動(dòng)物的實(shí)例包括、但不限于牛，綿羊，山羊，奶牛，鹿，野牛和水牛。非反芻動(dòng)物包括豬，馬，母豬等。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將該組合物的組合用于綿羊和牛家畜。在一個(gè)實(shí)施方案中，在動(dòng)物正在接受疫苗接種的期間，將該組合物祠喂給動(dòng)物。一個(gè)典型的疫苗接種方案需要在確定的時(shí)間段施用至少一個(gè)、通常幾個(gè)劑量的疫苗，以使免疫系統(tǒng)的刺激和抗體的產(chǎn)生最大化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，從開(kāi)始疫苗接種方案之前每日給動(dòng)物飼喂組合物，繼續(xù)至開(kāi)始疫苗接種方案后。在替代實(shí)施方案中，可以在開(kāi)始疫苗接種方案之后或在開(kāi)始該方案的同時(shí)，給動(dòng)物祠喂該組合物0所述組合的疫苗可以引起對(duì)病原體、毒素、藥物或其它分子的應(yīng)答。所述疫苗可以是DNA疫苗，其中將編碼抗原的DM分子注射進(jìn)動(dòng)物，導(dǎo)致抗原的合成和隨后對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合的疫苗刺激針對(duì)造成疾病的病原體的抗體的產(chǎn)生。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疫苗剌激針對(duì)造成乳腺炎的病原體的抗體的產(chǎn)生。J5疫苗是一種這樣的可商業(yè)得到的乳腺炎疫苗(可從Pfizer得到)。人和動(dòng)物通常接種疫苗來(lái)對(duì)抗的、且可以從增強(qiáng)功效的方案獲益的病原體和疾病的其它實(shí)例包括、但不限于，傳染性牛鼻氣管炎(IBR)，副流感3型(PI3)，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，輪狀病毒，冠狀病毒，彎曲桿菌屬，巴斯德氏菌屬，傳染性結(jié)膜炎，沙門(mén)氏菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，鉤端螺旋體病，布氏菌病，新城病，禽痘，丹毒，禽霍亂，馬立克氏病病毒(MDV)，傳染性支氣管炎病毒(IBV)，禽腦脊髓炎，球蟲(chóng)病，鼻肺炎，馬流行性感冒，馬鏈球菌，馬病毒性動(dòng)脈炎，馬單核細(xì)胞埃里希體病，腦脊髄炎，西尼羅河腦炎，狂犬病，細(xì)小病毒，腺病毒，博德特氏菌屬，萊姆病，賈第蟲(chóng)屬，百日咳，麻滲病毒，甲型肝炎和乙型肝炎，白喉和脊髓灰質(zhì)炎。所述組合的組合物的組分可以通過(guò)本領(lǐng)域普遍已知的方法制備，且可以從商業(yè)來(lái)源得到。P-1，3(4)-內(nèi)切葡聚糖水解酶從長(zhǎng)枝木霉(7Wc力ocTer鵬/0/7《/6r"力/a"邁)菌抹的深層發(fā)酵生成。桂藻土可作為可商業(yè)得到的酸洗滌的產(chǎn)物得到，其含有95M二氧化硅(Si02)，它的剩余組分未測(cè)定，但是主要由分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AssociationofAnalyticalChemists)(A0AC，2002)定義的灰分(礦物質(zhì))組成。0-l，3(4)葡聚糖和葡甘露聚糖可以來(lái)自源自初級(jí)滅活酵母(釀酒酵母)的酵母細(xì)胞壁提取物的商業(yè)制品，其化學(xué)組成如表l所示8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在該組合物中使用的礦物土(鋁硅酸鹽)可以是多種可商業(yè)得到的粘土中的任一種，包括、但不限于，蒙脫石，膨潤(rùn)土和沸石。在該組合的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，P-l，3(4)-內(nèi)切葡聚糖水解酶、硅藻土、葡聚糖和葡甘露聚糖和礦物土各自以約0.05-3%、1-40%、1-20%和40-92%的重量比相組合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，P-1，3(4)-內(nèi)切葡聚糖水解酶、硅藻土、葡聚糖和葡甘露聚糖和礦物土各自以0.1-3%、5-40%、2-15%和40-80°/。的重量比相組合。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，卩-1，3(4)-內(nèi)切葡聚糖水解酶、硅藻土、葡聚糖和葡甘露聚糖和礦物土各自以0.2-3%、20-40°/。、4-10%和50-70°/。的重量比相組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物是干燥的、自由流動(dòng)的粉末，其適合直接包含進(jìn)可商業(yè)得到的祠料、食品，或作為完全混合的食物或飲食的增補(bǔ)劑。該粉末可以與固體或液體飼料或與水相混合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將組合物制成顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)直接摻入祠料時(shí)，所述組合物可以以約0.1至約20kg/噸(2000磅)飼料的量加入。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物以約0.5kg至約10kg/噸飼料的量加入動(dòng)物飼料或食物中。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物可以以約1至約5kg/噸飼料的量加入到飼料中。當(dāng)以飼料干物質(zhì)的百分比表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的組合物可以以約o.oi至約2.5%(按重量計(jì))、優(yōu)選約0.0125%至約2%(按重量計(jì))的量加入到動(dòng)物飼料或食物中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物以約0.05至約1.5%(按重量計(jì))、優(yōu)選約0.0625%至約1°/。(按重量計(jì))的量加入到動(dòng)物伺料或食物中。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物以約0.1至約0.7%(按重量計(jì))、優(yōu)選約0.125°/。至約0.5°/。(按飼料重量計(jì))的量加入?；蛘?，本組合的組合物可以以每天約0.01克至約1克/千克活體重、優(yōu)選約0.012克至約0.5克/千克活體重、更優(yōu)選約0.016克至約0.37克/千克活體重的量，作為添加劑直接飼喂哺乳動(dòng)物或禽動(dòng)物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物可以以每天約0.05克至約0.20克/千克活體重的量提供用于許多物種。作為實(shí)例，所述組合物可以在約2克/頭/天至約8克/頭/天的范圍內(nèi)提供給綿羊。對(duì)于牛動(dòng)物，所述組合物可以在約10克/頭/天至約60克/頭/天的范圍內(nèi)提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，飼喂的組合物的量可以隨動(dòng)物物種、動(dòng)物大小和加入該組合物的飼料的類(lèi)型而變化?，F(xiàn)在提供實(shí)例來(lái)解釋具有某種程度特異性的組合物的概念。實(shí)施例1用綿羊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其目的是測(cè)定組合物的增加免疫抑制動(dòng)物中的中性粒細(xì)胞L-選擇蛋白(一種先天性免疫系統(tǒng)標(biāo)志物)的表達(dá)的能力。將動(dòng)物(每組6頭)分成2組對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組接受高能量食物，其由可隨意得到的剁碎的干草、每天每頭l磅磨碎的玉米和每天每頭l磅烘焙的小麥粗粉(millrun)組成，持續(xù)28天。在這期間，它們也接受每天2次注射地塞米松(一種免疫抑制性藥物)。實(shí)驗(yàn)組接受每天攝入組合物(5克/頭/天)，持續(xù)28天，并接受相同的飲食和地塞米松注射作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組的組合物是65.8%(重量)的礦物土，0.20%(重量)的內(nèi)切葡聚糖水解酶，9.0%(重量)的葡聚糖和葡甘露聚糖，和25%(重量)的鍛燒過(guò)的硅藻土。在研究結(jié)束時(shí)，回收血樣，使用Percoll梯度離心純化中性粒細(xì)胞。使用蛋白印跡技術(shù)和對(duì)L-選擇蛋白特異性的抗體，評(píng)估中性粒細(xì)胞中L-選擇蛋白表達(dá)的量。如圖1上圖所示，沒(méi)有接受組合物的動(dòng)物具有低的且可變的L-選擇蛋白表達(dá)。如圖1下圖所示，接受組合物的動(dòng)物表現(xiàn)出L-選擇蛋白表達(dá)的一致增加。上圖代表6頭對(duì)照免疫抑制動(dòng)物。下圖代表6頭實(shí)驗(yàn)免疫抑制動(dòng)物，它們?cè)陲嬍持薪邮芩鼋M合物。實(shí)施例2在該研究中，當(dāng)在造粒的飲食中提供實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)組合物時(shí)，檢查綿羊中先天性免疫系統(tǒng)的刺激?；A(chǔ)飲食由21.55%大麥、10.0%蕓苔、5%酒糟、40%磨碎的玉米、1.50%石灰石、0.01%硫酸錳、0.01%微維生素E、4.0%糖蜜、0.25%單鈣(mono-cal)、0,25°/。氯化鉀、0.60%氯化鈉、0.03%亞硒酸鈉、15.79%小麥粗粉、0.01%硫酸鋅、0.75%硫酸銨和0.25%硫酸鈷組成。當(dāng)將實(shí)驗(yàn)組合物加入到該飲食中時(shí)，其含量為0.6%，替代小麥粗粉的那部分。將28頭綿羊分給4種處理，包括對(duì)照組，接受粉末形式的實(shí)驗(yàn)組合物的組，接受造粒形式的實(shí)驗(yàn)組合物的組(其中顆粒在160。F的溫度制備)，和接受造粒形式的實(shí)驗(yàn)組合物的組(其中顆粒在180flF的溫度制備)通過(guò)每天注射地塞米松，免疫抑制所有動(dòng)物。除了施用通過(guò)在高溫制備顆粒來(lái)生產(chǎn)的顆粒形式的組合物以外，使用與實(shí)施例1相同的方法，進(jìn)行研究。進(jìn)行該研究的原理是，確定加熱組合物(在顆粒形成中需要)是否會(huì)滅活組合物的增強(qiáng)先天性免疫的能力。如圖2所示，沒(méi)有接受組合物的綿羊(對(duì)照)在中性粒細(xì)胞中表達(dá)非常低水平的L-選擇蛋白。提供甚至造粒的(加熱的)形式的實(shí)驗(yàn)組合物仍然會(huì)顯著增強(qiáng)中性粒細(xì)胞L-選擇蛋白的表達(dá)。在圖2中，最上面的圖代表飼喂不含組合物的對(duì)照飲食的免疫抑制動(dòng)物中的中性粒細(xì)胞L-選擇蛋白表達(dá)。第二幅圖(粉末)代表如實(shí)施例1所述的接受未加熱的自由混合形式的實(shí)驗(yàn)組合物的免疫抑制動(dòng)物中的L-選擇蛋白表達(dá)(實(shí)驗(yàn)組)。第三幅圖和第四幅圖代表接受造粒ii形式的實(shí)驗(yàn)組合物的免疫抑制動(dòng)物中的中性粒細(xì)胞L-選擇蛋白表達(dá)。在圖3中使用的顆粒通過(guò)加熱至160°F來(lái)制備，圖4顆粒在生產(chǎn)飼料過(guò)程中加熱至180。F。實(shí)施例3用大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來(lái)研究組合物是否具有增強(qiáng)非反芻動(dòng)物模型的先天性免疫的能力。在該研究中，將大鼠分配給2個(gè)處理組之一一個(gè)對(duì)照組(未添加的飲食)和一個(gè)實(shí)驗(yàn)組，其中以1%飼料干重將實(shí)施例1的組合物加入飲食中。在該實(shí)驗(yàn)中，給大鼠飼喂含有或不含實(shí)驗(yàn)組合物的商業(yè)化的磨碎的大鼠食物。在該研究中沒(méi)有釆用使用地塞米松注射的免疫抑制。14天后，通過(guò)心臟穿刺從麻醉的大鼠采取血樣。使用Percoll梯度離心，從血樣分離中性粒細(xì)胞，使用TriZol分離總RNA。然后通過(guò)定量反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRT-PCR)，使用為大鼠L-選擇蛋白試驗(yàn)特別開(kāi)發(fā)的引物，測(cè)定中性粒細(xì)胞RM樣品中編碼大鼠L-選擇蛋白的信使RNA(mRNA)的濃度。通過(guò)將它們顯示為p-肌動(dòng)蛋白mRNA的比例，標(biāo)準(zhǔn)化L-選擇蛋白mRNA的量，所述P-肌動(dòng)蛋白mRNA以相當(dāng)恒定的水平在所有細(xì)胞中表達(dá)。如圖3所示，與實(shí)施例l和2的結(jié)果相一致，所述組合物使L-選擇蛋白mRNA的表達(dá)增強(qiáng)了超過(guò)6-倍(P<0.05)。該研究證實(shí)，通過(guò)實(shí)施例1和2的蛋白印跡顯示的L-選擇蛋白的增強(qiáng)表達(dá)，可以由編碼該蛋白的mRNA的增加造成。這暗示著，所述組合物會(huì)改變編碼L-選擇蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄速率。實(shí)施例4中性粒細(xì)胞，先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，能發(fā)出信號(hào)并從而通過(guò)白介素-1P(IL-1p)的分泌上調(diào)獲得性免疫系統(tǒng)對(duì)抗體的產(chǎn)生。為了研究所述組合物的誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞增加IL-1P的合成的能力，評(píng)估從與實(shí)施例1所述相同的綿羊采取的中性粒細(xì)胞中IL-1P的濃度。為了完成該研究，使用了蛋白印跡和對(duì)IL-1P特異性的抗體。如圖4所示，沒(méi)有每天提供組合物的動(dòng)物含有實(shí)質(zhì)上不可檢測(cè)水平的IL-1P;但是，給動(dòng)物提供組合物會(huì)造成IL-1P表達(dá)的顯著增加(P<0.05)。在圖4中，上圖代表6頭對(duì)照飼喂的免疫抑制動(dòng)物。下圖代表6頭實(shí)驗(yàn)組合物飼喂的免疫抑制動(dòng)物，它們接受組合物。使用蛋白印跡分析和對(duì)IL-1P特異性的抗體，測(cè)定IL-1P的濃度。這些數(shù)據(jù)表明，組合物具有不僅增加先天性免疫的標(biāo)志物(例如，L-選擇蛋白；實(shí)施例1，2和3)而且也增加上調(diào)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵信號(hào)傳遞分子(即，IL-IP)的表達(dá)的能力。實(shí)施例5該實(shí)驗(yàn)的目的是，測(cè)定在給圍產(chǎn)奶牛飼喂組合物之后哪些基因在中性粒細(xì)胞中差異化表達(dá)。在該研究中，檢查了組合物增加IL-1P在中性粒細(xì)胞中表達(dá)的機(jī)理。圍產(chǎn)奶牛是一種良好的模型，因?yàn)槿焉飸?yīng)激導(dǎo)致免疫抑制，使得奶牛對(duì)感染特別易感。在該實(shí)驗(yàn)中，將8頭圍產(chǎn)奶牛分配給不具有實(shí)驗(yàn)組合物的對(duì)照飲食，將8頭牛分配給在它們的飲食中接受實(shí)施例1的組合物的實(shí)驗(yàn)組(56克/天/頭)。給動(dòng)物飼喂飲食約28天，直到分娩。在分泌后12-15小時(shí)，通過(guò)頸靜脈穿刺回收500ml血樣，通過(guò)大規(guī)模Percoll梯度離心制備中性粒細(xì)胞。使用TriZol方法從中性粒細(xì)胞分離RNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，采用差別染色的基于核苷酸的染料(Cy3和Cy5)，使得從2個(gè)不同處理(對(duì)照和實(shí)驗(yàn))組合成的互補(bǔ)DNA(cDNA)摻入不同顏色。然后將來(lái)自實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組的cDNA樣品應(yīng)用于BoTL-5微陣列載玻片。該微陣列在密西根州立大學(xué)的動(dòng)物功能基因組學(xué)中心(CenterforAnimalFunctionalGenomics)制備，在栽玻片上含有l(wèi)500個(gè)基因(各自一式三份排列)。然后使從實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組樣品產(chǎn)生的cDNA竟?fàn)幣c陣列上的1500個(gè)基因的結(jié)合，再通過(guò)對(duì)比陣列上每個(gè)斑點(diǎn)處Cy3和Cy5信號(hào)的相對(duì)豐度，評(píng)估基因的相對(duì)表達(dá)。然后統(tǒng)計(jì)13分析數(shù)據(jù)，以鑒別差別表達(dá)的那些基因(其中P<0.05的那些基因)。結(jié)果表明，超過(guò)20個(gè)基因在取自實(shí)驗(yàn)組的牛中性粒細(xì)胞中差別表達(dá)(P〈0.05)。白介素轉(zhuǎn)化酶(ICE)是一種這樣的上調(diào)節(jié)基因。這使用QRT-PCR和對(duì)牛ICE序列特異性的引物予以證實(shí)。ICE是無(wú)活性的前IL-10向有活性的分泌型IL-1P轉(zhuǎn)化過(guò)程中的限速酶。因而，通過(guò)它的增加中性粒細(xì)胞ICE活性的表達(dá)和引起的IL-1P的分泌的能力，所述組合物可以上調(diào)適應(yīng)性免疫(即，例如增加抗體滴度)。實(shí)施例6為了測(cè)試組合物增強(qiáng)疫苗的功效的假設(shè)，檢查了疫苗接種后滴度的形成。將18頭肉牛(每組6頭牛)分配給3種處理之一對(duì)照，處理l，(15克組合物在飲食中/頭/天)和處理2(30克組合物/頭/天)。動(dòng)物的飲食由隨意提供的草灰飲食組成，其中含有提供14%粗蛋白、3%粗脂肪和20%粗纖維的每天添加劑(表2)。在整個(gè)試驗(yàn)中，給動(dòng)物提供12磅該添加劑/頭/天。將實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)組合物直接混合進(jìn)該添加劑，從而將15克/頭/天和30克/頭/天的預(yù)期攝入分布遞送給處理1和2中的牛。給動(dòng)物施用這些飲食處理56天，然后從處理1和2的飲食撤去組合物。所有動(dòng)物維持相同的不含組合物的對(duì)照飲食，直到第84天。在實(shí)驗(yàn)的第7、21和35天，給所有動(dòng)物施用大腸桿菌J5疫苗(Pfizer)。該疫苗接種(即，3次注射，間隔14天)遵循生產(chǎn)商的推薦。該疫苗在乳品業(yè)中商業(yè)化地用作降低大腸桿菌狀乳腺炎可能性的措施。該疫苗和大多數(shù)其它疫苗的限制是滴度變化和有限的應(yīng)答。在第0、l4、28、"和56天，使用頸靜脈穿刺采取血樣，在這些天，從動(dòng)物的飲食去除組合物。所有動(dòng)物維持共同的不含組合物的飲食，直到第84天。也在第82天釆取血樣，以測(cè)定在從飲食中撤走后是否維持組合物誘導(dǎo)的滴度的任何變化。通過(guò)離心，從所有動(dòng)物制備血清。使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，評(píng)估3種不同的免疫球蛋白級(jí)分(IgM，IgGl和IgG2)中對(duì)大腸桿菌J5疫苗接種特異性的抗體的濃度。為了測(cè)定IgM、IgGl和IgG2免疫球蛋白級(jí)分中的大腸桿菌J5滴度，培養(yǎng)大腸桿菌培養(yǎng)物(從JeanneBurton博士得到，密西根州立大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系動(dòng)物功能基因組學(xué)中心)，收獲，并用于包被96孔平板。隨后，將來(lái)自動(dòng)物的血清樣品(1:5000稀釋)加入包被的平板的各個(gè)孔中，溫育i小時(shí)，以使動(dòng)物血清中的抗體結(jié)合大腸桿菌J5抗原。用含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌ELISA平板。將特異性結(jié)合牛IgM、IgGl或IgG2(BethLaboratories,Montgomery,TX)的第二抗體(辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合的羊抗牛)加入洗滌過(guò)的平板。給第二抗體綴合辣根過(guò)氧化物酶。用第二抗體溫育另外1小時(shí)后，再次用PBS和吐溫-20洗滌平板。將過(guò)氧化物酶底物TMB(四甲基聯(lián)苯胺)加入平板，通過(guò)使用ELISA平板讀數(shù)器測(cè)量在450nm的吸光度，定量得到的顯色反應(yīng)。如表3所示，實(shí)驗(yàn)組合物對(duì)與IgM抗體同種型有關(guān)的大腸桿菌J5滴度的發(fā)展沒(méi)有影響(在P>0.05的閾值)。但是，所述組合物刺激和維持IgGl和IgG2抗體同種型的J5滴度，如圖5和6和表4和5所示。在已經(jīng)接受處理1和處理2的動(dòng)物中，IgGl滴度在第56天增加(P<0.05)(表4和圖5)。在第82天之前，對(duì)照動(dòng)物中的滴度已經(jīng)落回實(shí)驗(yàn)前(第0天)水平。但是，已經(jīng)飼喂處理1或處理2的動(dòng)物具有與對(duì)照動(dòng)物相比升高的J5滴度(P<0.05)。實(shí)際上，在56天后從飲食去除本發(fā)明組合物后，已經(jīng)接受處理1或2的動(dòng)物沒(méi)有表現(xiàn)出IgGl滴度的損失(表4和圖5)。如表5和圖6所示，關(guān)于IgG2級(jí)分，加入15g/頭/天(處理l)或30g/頭/天(處理"的組合物造成了在42天J5IgG2滴度的逐步增加(即與對(duì)照相比，高劑量使滴度增加了57%，低劑量使滴度增加了30%),盡管該效應(yīng)不是統(tǒng)計(jì)上顯著的P<0.05(P值是O.16)。56天后，處理2(組合物的高劑量)造成了J5滴度的顯著升高(P<0.05)。處理1(組合物的低劑量)在該時(shí)間點(diǎn)造成了IgG2級(jí)分內(nèi)J5滴度的升高，盡管該效應(yīng)不是統(tǒng)計(jì)上顯著的，閾值為P<0.05(P值是0.12)。在研究的第82天，在從飲食撤去組合物后，飼喂高劑量組合物的動(dòng)物具有IgG2級(jí)分內(nèi)的升高的滴度(與對(duì)照相比增加了14%);但是，該效應(yīng)不是顯著的，閾值為P<0.05(P值是0.09)。這些數(shù)據(jù)表明，在從飲食撤去組合物后，所述組合物具有增加IgGl級(jí)分的滴度的能力，并且具有維持IgGl級(jí)分的滴度的能力(P〈0.05)。所述組合物也具有增加IgG2級(jí)分內(nèi)的滴度的發(fā)展的能力(P<0.05)。l吏用針對(duì)IL—1P的ELISA(R+DSystemsMinneapolis,MN))，也檢查了來(lái)自對(duì)照、處理1和處理2動(dòng)物的血清樣品中的IL-1p濃度。如圖7所示，結(jié)果表明，28天后，處理1和處理2增加了IL-1P的血清濃度。56天后，低劑量的組合物也顯著升高了IL-1P的血清濃度(P<0.05)。在研究的第56天，高劑量的組合物造成了血清IL-1P的大量增加；但是，該效應(yīng)不是顯著的P<0.05(P值=0.23)。盡管不希望受理論的約束，所述組合物可以刺激先天性免疫系統(tǒng)(辨余，通過(guò)中性粒細(xì)胞激活)和中性粒細(xì)胞，然后通過(guò)IL-1P的分泌刺激獲得性免疫系統(tǒng)。IL-1p特異性地增加B-細(xì)胞的提高IgG2滴度的發(fā)展速率和維持IgGl級(jí)分內(nèi)的滴度的能力。使用如圖8所示的蛋白印跡，也評(píng)估了中性粒細(xì)胞L-選擇蛋白的蛋白濃度。關(guān)于大鼠研究(實(shí)施例4)，也測(cè)定L-選擇蛋白的mRNA濃度，但是使用牛特異性的引物。測(cè)得與對(duì)照處理相比，處理l(15g實(shí)驗(yàn)組合物/頭/天)和處理2(30g實(shí)驗(yàn)組合物/頭/天)增加了(P<0.05)中性粒細(xì)胞L-選擇蛋白的濃度。表2成分添加劑百分比(作為飼料基礎(chǔ))棉花殼32.5玉米25.0小麥粗粉6.25蕓莒粗粉7.50酒糟8.73石灰石0.75Dynamate0.25氧化鎂0.15苜蓿粗粉14.0尿素0.50莫納菌素鈉0.01硫酸鋅0.01硒0.04氯化鈉0,30糖蜜4.00表3研究的天數(shù)對(duì)照(在450nm的吸光度)處理l(在450nm的吸光度)處理2(在450nm的吸光度)第14天0.4770.4040.391第28天0.7360.4090.424第42天0.8420.4050.408第56天1.970.7171.6517表4研究的天數(shù)對(duì)照(在450nm的吸光度)處理l(在450nm的吸光度)處理2(在450認(rèn)的吸光度)第o天0.0350.0360.033第28天0.0650.0450.035第42天0.0580.0650.109第56天0.238a0.543b0.471b第82天0.033a0.549b0.573b不具有共同上標(biāo)的行內(nèi)的值的差異是顯著的(P<0.05閾值)。表5研究的天數(shù)對(duì)照(在450nm的吸光度)處理l(在450nm的吸光度)處理2(在450nm的吸光度)第o天0.0790.1040.091第28天0.2200.2290.215第42天0.2280.2960.358笫56天0.306a0.401a0.681b第82天0.1780.1790.252不具有共同上標(biāo)的行內(nèi)的值的差異是顯著的(P<0.05閾值)。實(shí)施例7用綿羊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來(lái)研究實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)組合物響應(yīng)于在實(shí)施例6中采用的J5大腸桿菌疫苗接種而增強(qiáng)適應(yīng)性免疫的能力。將動(dòng)物(12只動(dòng)物/處理)分配給3種處理對(duì)照，處理l(每天每頭3克實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)組合物)或處理2(每天每頭6克實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)組合物)。給動(dòng)物伺喂這些飲食75天，在實(shí)驗(yàn)的第7、21和35天，接種PfizerJ5疫苗。在第0、35和75天采取血樣。在從飲食撤走處理1或處理2組合物后第90天，也釆取血樣，以測(cè)定該組合物是否具有維持滴度的能力。18在該研究中，使用識(shí)別IgGl和IgG2綿羊同種型的第二抗體(HRP綴合的兔抗羊IgG:BethLaboratories,Montgomery,Texas)。表6和圖9顯示了來(lái)自組合的綿羊IgGl和IgG2級(jí)分的數(shù)據(jù)。在進(jìn)行ELISA的該研究中使用的方法與在實(shí)施例6中所述的方法相同，例外是，改用抗羊IgG抗體(VMRD，Pullman,WA)。在第35天，高劑量的實(shí)驗(yàn)組合物造成總IgGl和IgG2滴度的升高。在第75天，低和高劑量的組合物造成J5滴度的逐步升高。具體而言，低劑量造成滴度17%增加，高劑量造成J5滴度31%增加。在第90天，與對(duì)照祠喂動(dòng)物相比，處理1中的動(dòng)物不具有滴度的升高。但是，在接受高劑量的組合物的處理2中的動(dòng)物表現(xiàn)出J5滴度的24%升高。這些數(shù)據(jù)支持了實(shí)驗(yàn)6的觀察，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)組合物的施用增加了IgGl和IgG2級(jí)分內(nèi)滴度的發(fā)展，并在從飲食撤去實(shí)驗(yàn)組合物后維持滴度另外15天。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本發(fā)明用于增加組合的IgG級(jí)分的J5滴度，盡管P值大于P<0.05閾值。應(yīng)當(dāng)理解，已經(jīng)描述的本發(fā)明的組合物的實(shí)施方案是本發(fā)明組合物的原理的一些應(yīng)用的解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以作出許多改進(jìn)，而不背離該組合物的真實(shí)精神和范圍。本文所述的不同特征可以以任意組合使用，而不限于本文特別指出的已有組合。權(quán)利要求1.一種用于增強(qiáng)疫苗功效的組合，其包含疫苗；包含β-葡聚糖、β-1，3(4)-內(nèi)切葡聚糖水解酶、鍛燒過(guò)的硅藻土、礦物土和葡甘露聚糖的組合物；且其中與在沒(méi)有所述組合物情況下抗體的滴度相比，所述組合物增加針對(duì)疫苗的抗體的滴度。2.權(quán)利要求1的組合，其中所述組合物和所述疫苗施用給家畜。3.權(quán)利要求1的組合，其中所述組合物以按所述祠料的干重計(jì)約0，01%至約2.5%的重量比的范圍加入動(dòng)物飼料中。4.權(quán)利要求l的組合，其中所述組合物以約0.01克/千克所述動(dòng)物體重至約1克/千克所述動(dòng)物活體重的范圍加入動(dòng)物祠料中。5.權(quán)利要求l的組合，其中所述疫苗和組合物施用給牛家畜。6.權(quán)利要求1的組合，其中所述組合物以每頭動(dòng)物每天約10克至約60克的范圍施用給牛家畜。7.權(quán)利要求1的組合，其中所迷疫苗和組合物施用給綿羊。8.權(quán)利要求l的組合，其中所述組合物以每只動(dòng)物每天約2克至約IO克的范圍施用給綿羊。9.權(quán)利要求1的組合，其中所述疫苗刺激抗乳腺炎的抗體的產(chǎn)生。10.權(quán)利要求l的組合，其中所述疫苗是PfizerJ5疫苗。11.權(quán)利要求1的組合，其中與在沒(méi)有所述組合物時(shí)所述IgGl或IgG2抗體的滴度相比，所述組合物增加IgGl或IgG2類(lèi)抗體的滴度。12.權(quán)利要求1的組合，其中與在沒(méi)有所述組合物時(shí)所述IgGl抗體的滴度相比，所述組合物增加IgGl類(lèi)抗體的滴度。13.權(quán)利要求1的組合，其中與在沒(méi)有所述組合物時(shí)所述IgG2抗體的滴度相比，所述組合物增加IgG2類(lèi)抗體的滴度。14.權(quán)利要求1的組合，其中與在沒(méi)有所述組合物時(shí)所述IgGl或IgG2抗體的滴度相比，在從所述動(dòng)物的飲食中撤走所迷組合物后維持所述IgGl或IgG2類(lèi)抗體的滴度。15.權(quán)利要求1的組合，其中與在沒(méi)有所述組合物時(shí)所述IgGl抗體的滴度相比，在從所述動(dòng)物的飲食中撤走所述組合物后維持所述IgGl類(lèi)抗體的滴度。16.—種增強(qiáng)疫苗的功效的方法，其包含a.提供一個(gè)或多個(gè)接種疫苗的個(gè)體；和b.給該個(gè)體施用包含p-葡聚糖、p-1，3(4)-內(nèi)切葡聚糖水解酶、鍛燒過(guò)的硅藻土、礦物土和葡甘露聚糖的組合物。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述組合物每天施用給所述個(gè)體。18.權(quán)利要求16的方法，其中所述組合物以按所述飼料的干重計(jì)約0.01%至約2.5°/。的重量比的范圍加入個(gè)體的飼料中。19.權(quán)利要求16的方法，其中所述組合物以約0.01克/千克所述動(dòng)物活體重至1克/千克活體重的范圍加入所述個(gè)體的飼料中。20.權(quán)利要求16的方法，其中與在沒(méi)有所述組合物時(shí)所述IgGl或IgG2抗體的滴度相比，所述組合物增加IgGl或IgG2類(lèi)抗體的滴度。21.權(quán)利要求16的方法，其中與在沒(méi)有所述組合物時(shí)所述IgG2抗體的滴度相比，所述組合物增加IgG2類(lèi)抗體的滴度。22.權(quán)利要求16的方法，其中所述個(gè)體是牛，疫苗和所述組合物施用給所述牛。23.權(quán)利要求16的方法，其中所述個(gè)體是牛家畜，所述組合物以每頭動(dòng)物每天約IO克至約60克的范圍施用給所述牛家畜。24.權(quán)利要求16的方法，其中所述個(gè)體是綿羊，疫苗和所述組合物施用給所述綿羊。25.權(quán)利要求16的方法，其中所述個(gè)體是綿羊，所述組合物以每只動(dòng)物每天約2克至約IO克的范圍施用給所述綿羊。26.權(quán)利要求16的方法，其中所迷一個(gè)或多個(gè)接種疫苗的個(gè)體已經(jīng)接種過(guò)疫苗，該疫苗刺激抗乳腺炎的抗體的產(chǎn)生。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述疫苗是PHzerJ5疫苗。全文摘要本發(fā)明涉及加入到動(dòng)物飼料中的組合物，其與疫苗組合使用以增強(qiáng)疫苗的功效。在其它效應(yīng)中，所述組合物提高針對(duì)該疫苗的抗體的滴度。文檔編號(hào)A61K31/715GK101466386SQ200780022219公開(kāi)日2009年6月24日申請(qǐng)日期2007年4月19日優(yōu)先權(quán)日2006年4月26日發(fā)明者N·E·福斯伯格,S·B·龐特尼申請(qǐng)人:奧姆尼根研究有限責(zé)任公司