用于檢測鴨腺病毒2型的引物對及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及禽病檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測鴨腺病毒2型的引物對及 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺病毒是全世界家禽和野禽常見的傳染性原。國際病毒分類委員會（ICTV)已 規(guī)定了腺病毒分類的基本特征，該報告將腺病毒分為哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。 禽腺病毒在血清學(xué)上與哺乳動物腺病毒不同，基因結(jié)構(gòu)也有差異。禽腺病毒分為I、II、 III亞群，目前國內(nèi)外專家學(xué)者對禽腺病毒的研究集中在I和III亞群。鴨腺病毒2型 (Duck adenovirus 2，DADV2)屬于I亞群暫定種，最早是1977年匈牙利的J. F. Bouquet等 在番鴨中分離出來的，它與已知的雞和火雞的病毒沒有關(guān)系，但可在雞和鴨的細胞中生長。 (J. F. Bouquet a，Y. Moreau，J. B. McFerran & T. J. Connor，1982. Isolation and characterisation of an adenovirus isolated from muscovy ducks, Avian Pathology, 11:2，301-307)近年來相繼在廣東、浙江、福建地區(qū)發(fā)生了，造成了較大的經(jīng)濟損失。鴨腺 病毒2型主要在番鴨呼吸道和消化中進行自我復(fù)制，在細胞中復(fù)制也會形成包涵體。病鴨 表現(xiàn)為精神萎靡、沉郁、排淺黃白色糞便嚴(yán)重的甚至?xí)劳?。病理癥狀為肝臟腫大，斑駁狀 出血、白色點狀壞死，胰腺白點壞死，心包積水，法氏囊縮小等。鴨腺病毒2型傳播方式包括 垂直傳播和水平傳播，垂直傳播由親代傳播到子代，水平傳播則是通過糞便、飼料等進行傳 播。一般發(fā)病天齡在15-40之間，一旦傳入鴨群，能夠迅速感染鴨群，并且很難清除，鴨腺病 毒2型對惡劣的環(huán)境有很強的抵抗能力。
[0003] 常規(guī)的診斷方法依靠電鏡、免疫染色或病毒分離。這些方法費時、費力且敏感性較 差，一般需要時長要幾天甚至更長時間，對試劑要求多，非特異性強。對于鴨腺病毒2型，目 前國內(nèi)沒有報道相應(yīng)的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了鑒別鴨腺病毒2型的引物對。
[0005] 該鑒別鴨腺病毒2型的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1~2所示。
[0006] 該對引物是根據(jù)DADV2 GR株（Genbank KJ469653. 1 )的高度保守區(qū)域52K基因 設(shè)計的，通過實驗發(fā)現(xiàn)，該引物對能夠特異性鑒別鴨腺病毒2型，以該引物對進行PCR擴增， 能夠擴增出一條634bp的條帶，其他病毒則無擴增序列。
[0007] 本發(fā)明還提供一種鑒別鴨腺病毒2型的方法，是使用SEQ ID N0:1~2所示的鑒別 鴨腺病毒2型的引物對，以待檢樣品基因組為模板，進行PCR擴增，能夠擴增出634 b的基 因片段產(chǎn)物，表明待檢樣品含有鴨腺病毒2型。
[0008] 其中待檢樣品基因組抽提優(yōu)選使用taco核酸自動抽提儀及配套試劑，抽提簡便 快速尚效。
[0009] 本發(fā)明還提供一種鑒別鴨腺病毒2型的PCR試劑盒，包括DNA聚合酶，SEQ ID NO: 1~2所示的引物對，dNTP的混合物和無菌雙蒸水。
[0010] 本發(fā)明還提供上述鑒別鴨腺病毒2型的PCR試劑盒使用時的反應(yīng)程序，其特征在 于，包括：95°C預(yù)變性5min ;擴增：94°C變性30sec，53°C退火30sec，72°C延伸1 min，共30 個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0011] 擴增產(chǎn)物加到1%(質(zhì)量百分比)瓊脂糖凝膠中，將瓊脂糖凝膠放入電泳儀中進行電 泳約30min，在成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，即可直觀地看出待檢樣品中是否含有鴨腺病毒2型。
[0012] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明鑒別鴨腺病毒2型的引物對，特異性強，可準(zhǔn)確高效地鑒別出待檢樣品是否含 有鴨腺病毒2型，而包括禽腺病毒、細小病毒、坦布蘇、新城疫等在內(nèi)的禽類病毒并不能擴 增出DNA片段。該引物對靈敏度高，至少能檢測出0. 2558ng的樣品DNA。本發(fā)明的引物及 PCR檢測方法檢測時間短，整個PCR過程只需要2個小時左右；簡便、經(jīng)濟、不需要購買昂貴 的實驗儀器及試劑，有利于及時發(fā)現(xiàn)病鴨是否感染該病毒，采取相應(yīng)措施，避免造成更大的 經(jīng)濟損失。
[0013]
【附圖說明】
[0014]圖1是實施例1中多個病料樣品使用本發(fā)明引物對進行擴增后的電泳結(jié)果。
[0015] 圖2是實施例2中多種禽病毒與鴨腺病毒2型采用本發(fā)明引物對進行CR擴增后 的電泳結(jié)果。
[0016] 圖3是實施例3中不同濃度鴨腺病毒2型采用本發(fā)明引物檢測的靈敏度實驗結(jié) 果。
【具體實施方式】
[0017] 實施例1 1.實驗材料： (1)病料：從廣東、浙江等地鴨場采集的病料6份，包括肝臟、胰腺、心包液、法氏囊組 織、咽喉試紙、糞便試紙，分別依次編號為ZL、LY、SY、ZJ、RM、HZ。其中ZL經(jīng)鑒定確為鴨腺 病毒2型感染，作為陽性對照。
[0018] (2)試劑： taco核酸自動抽提儀及配套試劑，Premix Taq酶（TaKaRa公司），ddH20 (超純水）， GoldView 核酸染料，10XTAE ;Marker DL2000(TaKaRa 公司）。
[0019] (3)引物的設(shè)計和合成： 上游引物 PI :TAC GCA GGG CAA GGT ATC AAG (SEQ ID N0:1); 下游引物P2 :CGC TCA TTC GCT TCT GTC TGT (SEQ ID N0:2)。
[0020] 2 ?實驗方案： (1 )DNA模板的制備：從鴨場采集的病料經(jīng)過研磨處理，離心，取上清，用taco核酸自動 抽提儀及配套試劑抽提DNA模板備用，步驟如下所示： a.準(zhǔn)備專用的96孔板； b?在 96 孔板的 1# (7#)中加入 200 y L 95% 酒精和 500 y L Lysis Buffer ; C?在 96 孔板的 2#、3# (8#、9#)中加入 750 y L Buffer A ; d?在 96 孔板的 4#、5# (10#、11#)中加入 750 yL Buffer B; e. 在 96 孔板的 6# (12#)中加入 100 y L Elution Buffer ; f. 在96孔板的2# (8#)中加入50 y L磁珠； g. 在96孔板的1# (7#)中加入100 y L待檢樣品或陰陽性對照； h. 將上述96孔板放入taco核酸自動抽提儀中進行核酸抽取。
[0021] (2)PCR反應(yīng)：以上述核酸DNA作為模板，配制25 y L體系：rTaq酶12. 5 y L，ddH20 9. 5yL，上游引物PI 0. 5yL，下游引物P2 0. 5yL和模板2yL; PCR 反應(yīng)條件：94 °C 5min ;94 °C 30sec，53 °C 30sec，72 °C lmin，30 個循環(huán)； 72°C lOmin ;4°C保存。
[0022] (3)瓊脂糖凝膠電泳 配制 50XTAE 溶液（pH 8. 5, 2MTris-醋酸，lOOmMEDTA) a. 稱量下列試劑，置于1L燒杯中； Tris 242g Na2EDTA 2H20 37. 2g b. 加入800mL去離子水，充分攪拌溶解； c. 加入57. lmL醋酸，充分攪拌； d. 加去離子水定容至1L ; 使用時稀釋50倍。
[0023] 將PCR擴增產(chǎn)物各加5yL到1%瓊脂糖凝膠中，將瓊脂糖放入電泳儀中進行電泳 約30min，在成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，結(jié)果如示意圖1所示。
[0024] 實施例2 :特異性實驗 對細小病毒疫苗、新城疫病毒液、坦布蘇病毒液、C型肺病毒液、呼腸孤病毒液、新型呼 腸孤病毒液、禽腺病毒1型病毒液等多種病毒的培養(yǎng)液進行核酸抽提，其中新城疫病毒液、 坦布蘇病毒液、C型肺病毒液、呼腸孤病毒液、新型呼腸孤病毒液為RNA病毒，使用TaKaRa公 司的AMV反轉(zhuǎn)錄酶XL按以下20 y L體系進行反轉(zhuǎn)錄： 模板 RNA 4 y L ; 5X Reverse Transcriptase Ruffer 4 u L ； DNTP Mixture (lOmM each) 2 u L ； RNase Inhibitor 0. 5 u L ； Radom Primer (50 u M) 1u L ； AMV Revers Transcriptase 2 u L ； DEPC H20 6. 5uL〇
[0025] 25°C lOmin ;42°C 60min ;72°C 15min ;4°C保存。以實施例 1 中的 ZL 作為陽性對 照，將上述抽提的DNA及反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進行特異性實驗，采用同實施例1同樣的引物 方法進行PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示，陰陽性對照成立，其他的病毒并不能用該引物擴增，證 明了本發(fā)明的引物具有很強的特異性。
[0026] 實施例3 :敏感性實驗 將上述實施例1中的樣品ZL所抽提的DNA做稀釋，分別稀釋為JXIO^IXIO2、 1X 10 3、1X 10 4、1X 10 5、1X 10 6共六個梯度，原始DNA濃度為12. 79ng/ y L，模板2 y L的DNA量分別為：2. 558ng、0. 2558ng、25. 58pg、2. 558pg、0. 2558pg、0. 02558pg。采用實施例1 中PCR步驟程序，用本發(fā)明引物做PCR，從圖3可看出將抽提的DNA稀釋至100倍，DNA含量 為0. 2558ng時PCR檢測為強陽性，稀釋至1000倍，DNA含量為25. 58pg時能檢測到弱陽性， 表明本發(fā)明的引物及PCR檢測方法至少能檢測出0. 2558ng的模板DNA，具有很好的靈敏性。
【主權(quán)項】
1. 鑒別鴨腺病毒2型的引物對，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0:l~2所示。2. -種鑒別鴨腺病毒2型的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1所述的鑒別鴨腺病毒 2型的引物對，以待檢樣品基因組為模板，進行PCR擴增，能夠擴增出634 bp的基因片段產(chǎn) 物，表明待檢樣品含有鴨腺病毒2型。3. -種鑒別鴨腺病毒2型的PCR試劑盒，其特征在于，包括DNA聚合酶，權(quán)利要求1所 述的引物對，dNTP的混合物和無菌雙蒸水。4. 權(quán)利要求3所述的鑒別鴨腺病毒2型的PCR試劑盒使用時的反應(yīng)程序，其特征在于， 包括：95°C預(yù)變性5min ;擴增：94°C變性30sec，53°C退火30sec，72°C延伸I min，共30個 循環(huán)；最后72°C延伸IOmin。
【專利摘要】本發(fā)明公開了鑒別鴨腺病毒2型的引物對及試劑盒，該引物對核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1~2所示。該對引物特異性強，可準(zhǔn)確高效地鑒別出待檢樣品是否含有鴨腺病毒2型，而包括禽腺病毒、細小病毒、坦布蘇、新城疫等在內(nèi)的禽類病毒并不能擴增出DNA片段；靈敏度高，至少能檢測出0.2558ng的樣品DNA。本發(fā)明的引物及PCR檢測試劑盒，檢測時間短，整個PCR過程只需要2個小時左右；簡便、經(jīng)濟、不需要購買昂貴的實驗儀器及試劑，有利于及時發(fā)現(xiàn)病鴨是否感染該病毒，采取相應(yīng)措施，避免造成更大的經(jīng)濟損失。
【IPC分類】C12Q1/70, C12R1/93, C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105039587
【申請?zhí)枴緾N201510188800
【發(fā)明人】林麗苗, 操勝, 招麗嬋, 覃健萍, 周慶豐, 王占新, 孫石開
【申請人】廣東溫氏食品集團股份有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年4月20日