專利名稱：非催化形式的乙酰肝素酶及其肽在逆轉(zhuǎn)類肝素的抗凝血作用中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的方法和組合 物。更具體而言，本發(fā)明提供非活性形式的哺乳動(dòng)物的乙酰肝素酶或其 肽在通過抑制類肝素抗凝血活性來治療與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀中 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在本申請全文中所提到的所有公開文獻(xiàn)，包括其中引用的所有參考 文獻(xiàn)，都以參考的方式全部引入本文。
內(nèi)皮的一個(gè)主要生理學(xué)作用是通過其滲透性阻擋層性能保持脈管系 統(tǒng)的完整和提供非血栓源性表面。因此，內(nèi)皮細(xì)胞表面起到凝血反應(yīng)的 主要調(diào)節(jié)部位的作用。在正常情況下，襯著血管的脈管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷 通過通常稱作"凝血級聯(lián)反應(yīng)"的一系列事件引發(fā)止血反應(yīng)。所述級聯(lián) 反應(yīng)在可溶性纖維蛋白原向不溶性纖維蛋白的轉(zhuǎn)化中終結(jié)，所述不溶性 纖維蛋白與血小板一同形成阻止血液組分外滲的局部凝塊或血栓。然后 傷口愈合將會(huì)發(fā)生，隨之凝塊溶解并且血管完整性和流動(dòng)得以恢復(fù)。
在損傷和凝塊形成之間發(fā)生的事件是精密調(diào)控并且相關(guān)聯(lián)的系列反 應(yīng)，涉及在血液中循環(huán)的無活性的酶原形式的血漿凝血蛋白和輔因子的 數(shù)量?；钚悦笍?fù)合物聚集在損傷處，繼而被活化為絲氨酸蛋白酶，每個(gè) 絲氨酸蛋白酶相繼催化隨后的酶原，以使蛋白酶活化。每一步的酶級聯(lián) 反應(yīng)都會(huì)導(dǎo)致后繼步驟效果的放大。簡而言之，凝塊形成由通過凝血酶 使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白所介導(dǎo)。凝血酶由在內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)
胞和造血細(xì)胞表面上的凝血酶原酶復(fù)合物(包括Xa因子、Va因子和凝血 酶原)產(chǎn)生。各種調(diào)節(jié)機(jī)制將會(huì)運(yùn)行，從而將凝塊的形成限制在生理調(diào)控的止血，例如血管損傷所需的條件下。這種凝塊的生理限制的一個(gè)關(guān)鍵 因素是內(nèi)皮表面的非血栓源性。在組織因子依賴機(jī)制啟動(dòng)后，最初較小 量的凝血酶會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)源性凝血途徑的正反饋放大，其目的是產(chǎn)生足夠量 的用于使纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化的凝血酶。此外，凝血酶還通過在 受到擾亂的內(nèi)皮細(xì)胞表面以及在成纖維細(xì)胞和造血細(xì)胞上的凝血酶原酶
復(fù)合物(包含Xa因子和Va因子)由凝血酶原產(chǎn)生[Autin L等.Proteins 63:440-450(2006)]。
細(xì)胞表面的抗凝血性在早前已經(jīng)歸因于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPG)。 HSPG是由與重復(fù)的己糖醛和D-葡糖胺二糖單元通過共價(jià)氧連 接的核心蛋白構(gòu)成的大分子，其中所述重復(fù)單元包含已經(jīng)顯示出可在細(xì) 胞內(nèi)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和組織中發(fā)揮抗凝血活性的硫酸化側(cè)鏈。細(xì)胞表 面和臨床施用的HSPG分子早前已經(jīng)顯示與凝血系統(tǒng)的組分(包括Xa因 子和天然凝血酶抑制劑抗凝血酶III(ATin))結(jié)合。
此外，細(xì)胞表面HSPG還可以促進(jìn)諸如FVIII等凝血因子的分解代 謝[Sarafanov A.G.等.J. Biol. Chem. 276:11970-11979 (2001)]。諸如組織因 子途徑抑制劑等其它凝血抑制劑也通過HSPG與內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜的外表面 結(jié)合[Ho G.等.J. Biol. Chem. 272:16838-16844 (1997)]。 HSPG還是交聯(lián)諸 如層粘連蛋白、膠原等各種組分從而有助于血管壁完整性的內(nèi)皮下的基 膜的重要成分[Iozzo R.V. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:646-656 (2005)]。在內(nèi) 皮上或在內(nèi)皮下的基膜中的凝血反應(yīng)的啟動(dòng)將需要阻止HSPG的抗凝血 活性。目前已經(jīng)鑒定的具有特異的硫酸乙酰肝素降解活性的唯一的哺乳 動(dòng)物酶是P-D-內(nèi)切糖苷酶乙酰肝素酶，下文中將會(huì)對其進(jìn)行更加詳細(xì)的 討論。
雖然有效的凝血會(huì)限制損傷位置的血液損失，但是靜脈或動(dòng)脈中血 栓的不當(dāng)形成卻是殘疾和死亡的一個(gè)常見原因。異常凝血活性可以導(dǎo)致 和/或源于諸如心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、心房纖維性顫動(dòng)、中風(fēng)、腎 損傷、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)、彌漫性血管內(nèi)凝血、敗血癥、肺 栓塞和深靜脈血栓形成等的病理或治療。凝塊在人造器官、旁路和諸如 人造心臟瓣膜等假體的外來表面上的形成也是難以解決的。中風(fēng)是死亡的一個(gè)主要原因，也是導(dǎo)致永久殘疾的常見原因。急性病灶性腦缺血導(dǎo)致的中風(fēng)的神經(jīng)功能缺損最常由血栓栓塞導(dǎo)致。血栓可以由心臟病源和動(dòng)脈粥樣化產(chǎn)生。原位血栓可以在大的腦外腦供血管中發(fā)生。研究指出，腦動(dòng)脈阻塞后超出有限的時(shí)間間隔則會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的不可逆神經(jīng)損傷和持續(xù)的神經(jīng)功能缺損。
目前在治療這些病理學(xué)和其它血栓形成性疾病和栓塞性疾病中所使
用的經(jīng)批準(zhǔn)的抗凝劑包括硫酸雜多糖肝素和低分子量肝素(LMWH)。這些
藥劑可以腸胃外施用，并且可以迅速、完全地抑制凝血。
肝素是由肥大細(xì)胞產(chǎn)生、并且由通過糖苷鍵連接的D-葡糖胺的交替衍生物(N-硫酸化D-葡糖胺或N-乙?；疍-葡糖胺)和糖醛酸(L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸)的聚合物構(gòu)成的線性多糖[Casu B.和Lindahl U.， Adv.Carbohydr. Chem. Biochem. 57: 159-206 (2001); Robinson HC.等.J. Biol.Chem. 253: 6687-6693 (1978)]。肝素在結(jié)構(gòu)上與硫酸肝素(HS)相關(guān)，但是具有較高的N-硫酸基和O-硫酸基含量[Casu B.和Lindahl U. (2001)出處同上]。肝素主要的抗凝血作用已被歸因于其催化AT與其目標(biāo)蛋白酶凝血酶(IIa因子)與Xa因子(FXa)之間的抑制反應(yīng)的能力[Bourin MC.和Lindahl U.， Biochem. 289: 313-330 (1993)]，而低分子量肝素(LMWH)的主要作用則是因?yàn)锳T介導(dǎo)的對FXa活性的抑制[Hemker H.C.和Beguin S.Haemostasis 20: 81-92 (1990)]。如上所述，肝素和LMWH通常在一些疾病范圍內(nèi)用作抗凝劑。它們的水平通常根據(jù)從患者身上抽取的血樣基于由常規(guī)水平推斷的參數(shù)來間接監(jiān)測。這些參數(shù)包括活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間和抗Xa活性(用于監(jiān)測LMWH)。這些測試可以評價(jià)凝血級聯(lián)反應(yīng)中不同因子的凝血情況以及肝素和LMWH通過AT活化的抑制作用。
然而，肝素和LMWH因它們的效力而存在缺點(diǎn)。由運(yùn)動(dòng)的簡單應(yīng)力及相伴的與物體的接觸所引起的或在外科手術(shù)處的失去控制的出血是一個(gè)主要并發(fā)癥，在接受連續(xù)輸注的患者中有1% 7%，在接受間斷的大丸劑藥物的患者中有8% 14%觀察到了這一并發(fā)癥。為了使這一風(fēng)險(xiǎn)最小化，需要不斷抽取樣品以使間接體內(nèi)(^Ww)凝血時(shí)間能夠得到連續(xù)監(jiān)
8測，這顯著增加了治療成本，并為患者帶來不便。此外，使用肝素治療
的患者中約有5%(多達(dá)30。/。)患上免疫介導(dǎo)性血小板減少癥(HIT)，這可能并發(fā)出血(作為血小板計(jì)數(shù)降低的后果)或者動(dòng)脈和靜脈血栓形成，后者因血管內(nèi)血小板結(jié)塊而引起。這一并發(fā)癥出現(xiàn)在多達(dá)20%的HIT患者中，可能導(dǎo)致大約50%病例出現(xiàn)嚴(yán)重發(fā)病和死亡。因此，目前對于提供用于迅速、有效地逆轉(zhuǎn)不同的類肝素的抗凝血作用的物質(zhì)和方法有著強(qiáng)烈需求。更具體地說，就緊急的臨床需要而言，對于可以抑制這些臨床高度豐富的抗凝劑的解毒劑存在著需求。這些需求可能出現(xiàn)在因LMWH用藥過量所導(dǎo)致的廣泛性出血(例如腦)或者因其它醫(yī)學(xué)原因所導(dǎo)致的使用LMWH治療的個(gè)體出血失控的過程中。
如上所述，能夠部分解聚HS鏈并通常被稱作乙酰肝素酶的哺乳動(dòng)物內(nèi)切糖苷酶已經(jīng)在許多細(xì)胞類型和組織中得到了鑒定，所述細(xì)胞類型和組織主要有癌細(xì)胞、免疫系統(tǒng)的活化細(xì)胞、血小板和胎盤[Parish CR等.Biochim. Biophys. Acta. 1471: 0M99-108 (2001); Vlodavsky I和FriedmannY. J. Clin. Invest. 108: 341-347 (2001); Nakajima M.等.J. Cell Biochem, 36:157-167 (1988); Dempsey LA.，等.Trends Biochem. 25: 349-351 (2000)]。有趣的是，只鑒定到一種編碼活性酶的乙酰肝素酶cDNA序列，表明該酶是哺乳動(dòng)物組織中的顯性的P-D-內(nèi)切葡萄糖苷酸酶[Vlodavsky I.,等.Nat.Med. 5:793-802 (1999); Hulett MD，等.Nat. Med. 5:803-809 (1999); KussiePH.,等.Biochem. Biophys, Res. Commun. 261: 183-187 (1999); ToyoshimaM.和Nakajima M.， J. Biol. Chem. 274: 24153-24160 (1999)]。雖然乙酰肝素酶發(fā)揮各種生物活性，包括降解內(nèi)皮下基膜、刺激新脈管形成、促進(jìn)細(xì)胞粘著和調(diào)控基因表達(dá)[Vlodavsky I.等.Semin. Cancer Biol. 12:121-129(2002); Vlodavsky I.等.Pathophysiol. Haemost. Thromb. 35:116-127(2006)]，但是對于乙酰肝素酶在凝血反應(yīng)的調(diào)控中的可能作用還沒有進(jìn)行詳細(xì)的研究。乙酰肝素酶被合成為潛伏形式的65kDa前體，該前體的活化涉及位于該分子的N-端區(qū)域(Glu，-Ser，和Gln"Mys"s)的兩個(gè)潛在位點(diǎn)的蛋白水解切割，導(dǎo)致形成兩個(gè)蛋白亞基8 kDa多肽和50 kDa多肽，它們發(fā)生異源二聚并形成活性乙酰肝素酶[McKenzie E.等.Biochemical J. 373: 423-435 (2003); Levy-Adam F.等.Biochem. Biophy. Res.Commun. 308: 885-891 (2003)]。乙酰肝素酶的一個(gè)主要生理來源是血小板[Hulett M.D.等.Nat. Med. 5:803-809 (1999); Freeman C.禾口 Parish C.R.Biochem. J. 330:1341-1350 (1998)]。所述50 kDa和8 kDa乙酰肝素酶多肽由還含有大量65 kDa酶原的血小板通過生物化學(xué)純化[Hulett (1999)，出處同上；Freeman (1998)，出處同上]。此外，乙酰肝素酶基因早前曾由人血小板克隆[Hulett (1999)，出處同上]。由活化的血小板或血小板衍生的微粒釋放的乙酰肝素酶是生物活性的，可以刺激血管生成和調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞活性[Brill A.等.Cardiovasc. Res. 63:226-235 (2004); Myler H.A,和WestJ丄.J. Biochem. 131:913-922 (2002)]。
大分子肝素的剪接在培養(yǎng)的肥大細(xì)胞中經(jīng)證明是主要通過乙酰肝素酶活性進(jìn)行的[JacobssonK.G.和Lindahl U. Biochm. J. 246: 409-415 (1987);GongF.等.J. Biol. Chem. 278: 35152-35158 (2003)]。獲得的降解產(chǎn)物與商購肝素的大小相對應(yīng)[Gong (2003) ibid.]。
關(guān)于血小板乙酰肝素酶的早期研究顯示可以在包含肝素的抗凝血酶(AT)結(jié)合序列的寡糖中切下葡萄糖苷酸鍵[Ogren S.和Lindahl U.， J. Biol.Chem. 250: 2690-2697 (1975)]。肥大細(xì)胞瘤乙酰肝素酶已經(jīng)暗示與肝素的細(xì)胞內(nèi)后生物合成修飾有關(guān)[Gong(2003)，出處同上]。由于大分子肝素在肥大細(xì)胞中的乙酰肝素酶切割會(huì)生成包含AT結(jié)合序列的產(chǎn)物，因此推測肥大細(xì)胞乙酰肝素酶不同于血小板乙酰肝素酶[Ogren (1975)，出處伺上；Thunberg，L.等.J. Biol. Chem. 257: 10278-10282(1982)]。然而，當(dāng)由血小板和肥大細(xì)胞克隆出同樣的乙酰肝素酶時(shí)，這一推測受到了爭論[Gong(2003)，出處同上]。大分子肝素的AT結(jié)合區(qū)域顯示出可以逃避乙酰肝素酶的降解，而對于AT具有高親合力的寡糖的切割卻非常無效[Gong(2003)，出處同上；Pikas DS.等.J. Biol. Chem. 273: 18770-18777 (1998)]。為弄清乙酰肝素酶的底物特異性而進(jìn)行的多種嘗試指出了硫酸化的重要性，然而這些嘗試卻無法得到一個(gè)統(tǒng)一的結(jié)論[Pikas (1998)，出處同上；Okada Y.等.J. Biol. Chem. 277: 42488-42495 (2002)]。早期[Jacobsson和Lindahl (1987) ibid.]和最近[Pikas (1998)，出處同上；Okada (2002)，出處
10同上]的研究都明確指出(3-D-葡萄糖醛酸鍵作為乙酰肝素酶的革巴。
本發(fā)明人中的一些人的近期研究表明，乙酰肝素酶的酶活性可以部
分抑制類肝素的抗凝血活性[Nasser N丄等.J. Thromb. Haemost. 4:560-565 (2006)]。更具體而言，該研究顯示乙酰肝素酶能夠降解肝素和LMWH， 因而可以抑制肝素和LMWH的抗凝血活性，這分別由加入人血漿時(shí)對 APTT和抗Xa活性的影響降低所證明。
因此，本發(fā)明人推斷乙酰肝素酶的酶活性可能是抑制肝素的抗凝血 作用的原因。然而，這種機(jī)制依賴于在最適宜乙酰肝素酶酶活性的酸性 條件(pH < 6.0)下活性酶與類肝素的較長的培養(yǎng)時(shí)間(數(shù)小時(shí))[Nasser (2006)，出處同上]。相反，在正常生理?xiàng)l件下(例如中性pH)，促凝的生 理活性應(yīng)在幾分鐘內(nèi)即發(fā)揮作用，所以可能涉及不依賴于其酶活性的其 它模式的乙酰肝素酶作用。因此，需要能快速發(fā)揮逆轉(zhuǎn)類肝素抗凝血活 性(特別是在生理?xiàng)l件下)的解毒劑。
鑒于此，本發(fā)明人近期提出利用這些發(fā)現(xiàn)，通過測量在規(guī)定條件下 血漿APTT或酶所發(fā)揮的抗Xa活性的降低，作為量化乙酰肝素酶活性的 間接方法[Nasser(2006)，出處同上]。
然而，當(dāng)本發(fā)明人進(jìn)一步檢驗(yàn)乙酰肝素酶在凝血調(diào)節(jié)中的作用時(shí)， 驚訝并出乎意料地發(fā)現(xiàn)，如本發(fā)明所示，非活性形式的乙酰肝素酶(即乙 酰肝素酶酶原)通過非酶促機(jī)制對于凝血反應(yīng)的類肝素介導(dǎo)調(diào)控具有深刻 的抑制作用，最重要的是，在生理?xiàng)l件下尤其如此。本發(fā)明人指出，乙 酰肝素酶酶原不直接影響凝血蛋白活性，但是該蛋白(和其特異性肽)明顯 地通過不涉及乙酰肝素酶酶活性的機(jī)制而對凝血蛋白酶的類肝素介導(dǎo)調(diào) 控具有深刻的影響。
更具體而言，乙酰肝素酶酶原逆轉(zhuǎn)了普通肝素(unfractionatedheparin) 對內(nèi)源性凝血途徑和對凝血酶活性的抗凝血活性。另外，乙酰肝素酶酶 原消除了低分子量肝素的X因子抑制活性。非活性乙酰肝素酶的促凝血 作用也通過包含其主要功能的肝素結(jié)合序列的肽得以發(fā)揮。最后，乙酰 肝素酶對VII因子活化由類肝素自動(dòng)活化的蛋白酶的活性的作用表明在 此系統(tǒng)中存在完全拮抗的乙酰肝素酶作用?？傊?，乙酰肝素酶促凝血活性也在接受低分子量肝素治療的患者的血漿樣品中得到了證實(shí)，這表明 存在這種分子作為類肝素治療用解毒劑的可能應(yīng)用。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于抑制類肝素抗凝血活性的 組合物，所述組合物包含非活性形式的乙酰肝素酶或者其包含肝素結(jié)合 位點(diǎn)的任何片斷和肽。
在另一個(gè)目的中，本發(fā)明提供利用非活性形式的乙酰肝素酶及其肽，
特別是SEQIDNO: 1的肽治療患有與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的對象 的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述非活性形式的乙酰肝素酶，特別是 具有由SEQIDNO: 1表示的氨基酸序列的肽在制備用于治療與凝血相關(guān) 的病理性臨床癥狀的藥物組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的這些目的和其它目的將隨著描述的進(jìn)行而變得越來越清楚。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面中，本發(fā)明涉及用于抑制類肝素抗凝血活性的組合物。 本發(fā)明的所述組合物包含作為活性成分的真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至 少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽，所述真核內(nèi)切糖苷酶優(yōu)選 為非活性內(nèi)切糖苷酶，更優(yōu)選為非活性形式的乙酰肝素酶。該組合物可 以選擇進(jìn)一步包含藥用可接受的載體、稀釋賦形劑和/或添加劑。
本發(fā)明還涉及用于抑制有需要的對象的類肝素抗凝血活性的組合 物。這種組合物包含作為活性成分的真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一 個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽，所述組合物可以選擇進(jìn)一步包 含藥用可接受的載體、稀釋賦形劑和/或添加劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于治療和防止與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的 組合物。這種組合物包含作為活性成分的真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至 少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽，所述組合物可以選擇進(jìn)一 步包含藥用可接受的載體、稀釋賦形劑和/或添加劑。
在第二方面中，本發(fā)明涉及用于治療患有與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的患者的方法和/或防止對象患上與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的方 法，所述方法包括對所述對象施用抑制有效量的真核內(nèi)切糖苷酶或者其 包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽或者包含它們的任何 組合物的步驟。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于抑制類肝素抗凝血活性的方法。該方法包括 如下步驟(a)在適當(dāng)?shù)男纬苫旌衔锏臈l件下，使抑制有效量的真核內(nèi)切 糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽或者包 含它們的任何組合物與所述類肝素接觸；
(b)在適當(dāng)?shù)臈l件下，向步驟(a)獲得的混合物中加入哺乳動(dòng)物體液樣 品(優(yōu)選為血漿)，并經(jīng)歷適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段；和(c)通過適當(dāng)?shù)姆椒ú⑴c適當(dāng)?shù)?對照相比較，檢驗(yàn)所述類肝素對所述樣品的抗凝血活性。
根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝 素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽在抑制類肝素抗凝血活性(優(yōu)選在有需 要的對象中抑制類肝素抗凝血活性)用組合物的制備中的應(yīng)用。
此外，本發(fā)明還涉及真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合 域的任何突變體、片斷或肽在抑制類肝素抗凝血活性用組合物的制備中 的應(yīng)用。
參考附圖及其附帶說明可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。


圖1類肝素的抗凝血活性的機(jī)制
低分子量類肝素(上方)結(jié)合抗凝血酶(AT)，并調(diào)節(jié)其能夠結(jié)合并抑制 活性Xa因子的構(gòu)象。普通肝素(下方)與AT和凝血酶形成三元復(fù)合物， 由此抑制其酶活性。
圖2乙酰肝素酶酶原逆轉(zhuǎn)肝素對于aPTT反應(yīng)的抗凝血作用 在aPTT分析中，凝塊通過內(nèi)源性凝血途徑在正常血漿中產(chǎn)生。凝塊 的形成受到肝素的顯著抑制，lu/ml的肝素可以實(shí)現(xiàn)完全的凝血抑制。乙 酰肝素酶酶原使抗凝血肝素作用得到明顯逆轉(zhuǎn)(顯示了四個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè) 代表性實(shí)驗(yàn))?？s略詞cont.(對照)，N，coag.(無凝血)。
13圖3乙酰肝素酶酶原逆轉(zhuǎn)肝素對凝血酶活性的抗凝血作用 在凝血酶時(shí)間分析(TTA)中，凝塊在正常血漿中產(chǎn)生。凝塊的形成受
到肝素的顯著抑制，0.5u/ml的肝素可以實(shí)現(xiàn)完全的凝血抑制。乙酰肝素 酶酶原使抗凝血肝素作用得到明顯逆轉(zhuǎn)(顯示了三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性 實(shí)驗(yàn))?？s略詞cont.(對照)，sec.(秒)，N. coag.(無凝血)。 圖4乙酰肝素酶酶原逆轉(zhuǎn)肝素抗Xa活性
肝素抑制活化的凝血因子X(Xa)的活性。乙酰肝素酶酶原逆轉(zhuǎn)肝素 的抗Xa活性，使Xa活性恢復(fù)到正常水平?？s略詞act.(活性)，plas.(血 漿)。
圖5A 5B乙酰肝素酶酶原逆轉(zhuǎn)臨床樣品中的LMWH抗Xa活性
圖5A向來自12位獨(dú)立的經(jīng)LMWH治療的患者的血漿中加入乙酰 肝素酶酶原。然后在5分鐘內(nèi)測量Xa因子活性。每個(gè)樣品均在不存在(空 心柱)或存在(實(shí)心柱)|ig/ml重組乙酰肝素酶酶原的情況下進(jìn)行測量。每 一測量都進(jìn)行兩次(顯示的是兩次測量的平均值，各測量結(jié)果之間的差異 <10%)。可明顯看出Xa因子活性的顯著升高(經(jīng)LMWH治療的患者的基 礎(chǔ)水平為約140 O.D.)。
圖5B對在經(jīng)肝素治療的血漿和來自12位經(jīng)LMWH治療的患者的 血漿樣品的存在下乙酰肝素酶酶原對Xa因子活性的作用的總結(jié)(平均值 士S.D.)?？s略詞act(活性)，pat,(患者)，pla.(血漿)，cont.(對照)。
圖6乙酰肝素酶肝素的Lysl58—Aspl71(也以SEQ ID NO. 1表示)肝 素結(jié)合肽可以消除肝素的FXa抑制作用
肝素抑制活化的凝血因子X(Xa)的活性。乙酰肝素酶的 Lysl58-Asp171肝素結(jié)合(HB)肽以劑量依賴方式消除了肝素的FXa抑制 作用，由此將Xa活性恢復(fù)到正常水平。作為對照的亂序(scrambled)的肽 沒有作用?？s略詞act.(活性)，cont.(對照)，scr.(亂序的)，pep.(肽)。
圖7乙酰肝素酶的Lysl58-Asp171肝素結(jié)合肽可以消除LMWH的 FXa抑制作用
肝素和LMWH都抑制了活化的凝血因子X(Xa)的活性。乙酰肝素酶 的Lysl58-Aspl71肝素結(jié)合(HB)肽消除了肝素和LMWH的FXa抑制作
14用，由此將Xa活性恢復(fù)到正常水平。作為對照的亂序的肽沒有作用?？s 略詞act.(活性)，cont.(對照)，scr.(亂序的)，pep.(肽)。
具體實(shí)施例方式
在詳細(xì)說明本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式之前，應(yīng)該知道的是，本發(fā) 明不限于應(yīng)用在下面描述中給出或附圖所示的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有其 它實(shí)施方式，或者能夠以各種方式實(shí)踐或進(jìn)行。此外，應(yīng)該知道的是， 此處所用的措辭和術(shù)語是出于說明性目的，不應(yīng)認(rèn)為是出于限制目的。
止血特別是凝血是受嚴(yán)密調(diào)控的生理過程，涉及一系列的分子活化 和抑制事件以及不同生物表面的重要貢獻(xiàn)。此外，特異性血漿蛋白通過 控制作為催化劑的凝血絲氨酸蛋白酶和類肝素來控制凝塊形成的速率。 關(guān)于這一點(diǎn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑是在肝素或硫酸皮膚素存在下可以分別有效阻 斷凝血酶和FXa的AT和肝素輔因子II [Du H.Y,等.Thromb. Res. 119:377-384 (2007); Taylor K.R,禾口 Gallo R丄.FASEB J. 20:9-22 (2006)]，由 此AT-肝素系統(tǒng)具有重大的臨床和治療重要性。
基于能夠結(jié)合包括AT等堿性蛋白的細(xì)胞膜連接的HS分子的表達(dá)， 幾種類型的內(nèi)皮細(xì)胞可以提供非血栓形成性表面，由此可以抑制凝血酶 和可能的FXa活性[Labarrere C.A.等.J. Heart Lung Transplant. 11:342-347 (1992)]。其它細(xì)胞類型(例如成纖維細(xì)胞)也產(chǎn)生抗凝血類肝素[BrandU.T. 等.Thromb. Res. 51:187-196(1988)]。相反，與HS相關(guān)的反應(yīng)的平衡需要 使它們失效或受阻，這些活性以前被歸因于血小板活化時(shí)釋放的堿性蛋 白/肽。特別是，已經(jīng)證明血小板因子4可以顯著阻止或抑制AT-肝素復(fù) 合物的抗凝血作用[SchoenP.等.Thromb. Haemost. 66:435-441 (1991)]。如 本發(fā)明人中的一些人以前所證明，在血小板中發(fā)現(xiàn)的另一種具有高度特 異性的類肝素結(jié)合蛋白是乙酰肝素酶，它可以起到水解類肝素，由此消 除它們的抗凝血活性的作用[Nasser(2006)，出處同上]。然而，通過乙酰 肝素酶降解類肝素的需要在非生理?xiàng)l件(酸性pH)下的較長的培養(yǎng)時(shí)間(數(shù) 小時(shí))[Nasser(2006)，出處同上]，因此對于這是否是乙酰肝素酶能夠抵消 類肝素活性的唯一方法是存在疑問的。在超過50年的臨床應(yīng)用中，肝素是一種重要并且得到廣泛應(yīng)用的抗 凝血?jiǎng)溆糜谘ㄋㄈ约膊〉念A(yù)防或治療和大量其它應(yīng)用，例如深
靜脈血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈 介入(PCI)、血栓栓塞性疾病、動(dòng)脈血管栓塞、脈管和心臟手術(shù)、以及體
外循環(huán)(血透析、血過濾和心臟手術(shù)過程中的心肺分流術(shù))等的治療和預(yù) 防。不幸的是，肝素可以導(dǎo)致嚴(yán)重的不利事件，例如失去控制的出血或
諸如肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HIT)等癥狀。
在選定的接觸肝素的患者群體(例如心臟手術(shù))中，有高達(dá)50%的患 者會(huì)產(chǎn)生肝素依賴性抗體。所有接觸肝素的患者中有高達(dá)5。/。會(huì)患上HIT。 據(jù)報(bào)道，在患有HIT的患者中，有半數(shù)至三分之二的患者出現(xiàn)了血栓栓 塞性并發(fā)癥，其中包括診斷時(shí)患有或不患有血栓形成的那些患者。臨床 數(shù)據(jù)己顯示，在患有血栓性并發(fā)癥的患者中有接近20%失去了一個(gè)肢體， 有約30%在沒有適當(dāng)?shù)奶娲苑歉嗡刂委煹那闆r下死亡。
在本發(fā)明中，檢驗(yàn)了主要在生理?xiàng)l件下乙酰肝素酶前體對凝血功能 的作用。本發(fā)明首次顯示非活性酶原形式的乙酰肝素酶和乙酰肝素酶衍 生的肝素結(jié)合肽可以迅速逆轉(zhuǎn)或抵消類肝素介導(dǎo)的抗凝血活性。
如后面的實(shí)施例所示，乙酰肝素酶酶原對于主要凝血活性不具有作 用。然而，乙酰肝素酶酶原明顯通過非酶促機(jī)制對凝血反應(yīng)的類肝素介 導(dǎo)調(diào)控具有深刻的抑制作用。此外，本發(fā)明進(jìn)一步顯示，包含乙酰肝素 酶中的肝素結(jié)合域的氨基酸序列的肽可以轉(zhuǎn)變類肝素的抗凝血作用。因 此，乙酰肝素酶酶原及其肽可以在類肝素存在下起到促進(jìn)凝塊形成的促 凝血因子的作用。
下述觀察結(jié)果支持本發(fā)明提出的新發(fā)現(xiàn)的乙酰肝素酶在止血中的非
酶促作用(i)在本研究中所使用的酶處于其無活性的酶原狀態(tài)，其在生
理pH下是穩(wěn)定的。(ii)發(fā)現(xiàn)血小板乙酰肝素酶在pH 6.0而非在pH 7.4下 降解內(nèi)皮細(xì)胞HS，雖然在pH 7.4下檢測到了 25。/。最大活性[Yahalom J. 等,J. Clin. Invest. 74:1842-1849 (1984); Ihrcke N.S.等.J. Cell Physiol. 175:255-267(1998)]。然而，乙酰肝素酶在pH 7.4下的失活不影響肝素結(jié) 合[Yahalom(1984)，出處同上；Ihrcke (1998)，出處同上]。(iii)濃度低于5 pg/ml的乙酰肝素酶不具有促凝血作用(未顯示)。因此，乙酰肝素酶的 活性促凝血濃度可以根據(jù)表示乙酰肝素酶的肝素螯合活性而相對于肝素
進(jìn)行化學(xué)計(jì)算Oig/ml范圍)。(iv)乙酰肝素酶酶原的肝素中和作用非常迅 速，比預(yù)期的肝素降解快得多，即使后者是在最優(yōu)化的條件下進(jìn)行。(v) 由活性血小板衍生的乙酰肝素酶將普通肝素減小至大約LMWH的大小 [Gong R J. Biol. Chem. 278:35152-35158 (2003)]，此情況下的普通肝素作 為AT抑制FXa的輔因子仍具有高活性。與此觀點(diǎn)一致的是，以前的研 究顯示，乙酰肝素酶切割類肝素上與AT結(jié)合序列不同的靶結(jié)構(gòu)[Gong (2003)，出處同上]。(vi)如本發(fā)明所示，由乙酰肝素酶衍生的肽也可以防 止類肝素的FXa抑制輔因子活性。顯然，這一分析沒有包括乙酰肝素酶 的任何酶促部分。
乙酰肝素酶在局部止血反應(yīng)的調(diào)控中的貢獻(xiàn)應(yīng)該考慮這些過程的生 理環(huán)境。因?yàn)橐阴８嗡孛甘怯裳“逶诨罨瘯r(shí)釋放的，所以活性酶應(yīng)作 用于血管損傷處暴露的內(nèi)皮下的基膜并由此加速其分解或破壞(與原發(fā)性 止血的啟動(dòng)相反的過程)。因此，不受限于任何理論，基于本發(fā)明的數(shù)據(jù) 和所提及的信息，本發(fā)明人提出乙酰肝素酶在止血過程中的功能獨(dú)立于 其酶活性，并被表示為穩(wěn)定凝塊形成期的類肝素螯合活性，這與上述的 先前考慮相一致。支持乙酰肝素酶酶原的促凝性質(zhì)的進(jìn)一步證據(jù)來自乙 酰肝素酶轉(zhuǎn)基因小鼠的數(shù)據(jù)，基于例如aPPT分析中的短凝血時(shí)間，所述 小鼠的血漿凝結(jié)功能得以提高[Nasser(2006)，出處同上]。
更具體而言，本發(fā)明證明無酶促活性的乙酰肝素酶可以逆轉(zhuǎn)普通肝 素和LMWH的抗凝血作用。此外，來自經(jīng)LMWH治療的患者的血漿對 FXa抑制的反轉(zhuǎn)表明，各種形式的乙酰肝素酶(或其衍生的肽)可以在臨床 環(huán)境(包括經(jīng)LMWH治療的患者)中起到類肝素的解毒劑的作用。低分子 量類型的類肝素因其高功效和改善的藥物動(dòng)力學(xué)而受到臨床應(yīng)用的青睞 [Wong G.C. JAMA 289:331-342 (2003)]，因此乙酰肝素酶可以提供一種新 的內(nèi)源性的安全拮抗成分，通過該成分可以控制LMWH的臨床應(yīng)用。雖 然包括硫酸魚精蛋白或血小板因子4在內(nèi)的其它類肝素抵消物質(zhì)已經(jīng)被 使用且獲得了不同程度的成功，但是它們不具有逆轉(zhuǎn)LMWH活性的效果
17[Massonnet-Castel S.等.Haemostasis 16:139-146 (1986)]。這些物質(zhì)可以導(dǎo) 致血液動(dòng)力學(xué)改變和其它臨床并發(fā)癥[Kanbak M.等.Anaesth. Intensive Care 24:559-563 (1996); Kimmel S.E.等.Anesth Analg 94:1402-1408 (2002)]，或者會(huì)因在肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥發(fā)病機(jī)制中涉及血小板因 子4而存在臨床方面的問題[Rauova L.等.Blood 107:2346-2353 (2006)]。 應(yīng)該進(jìn)一步注意的是，以前在患者中測試過高活性細(xì)菌性乙酰肝素酶I 酶的肝素中和潛力，但是據(jù)顯示由于其安全性較差因而無法與精蛋白等 效[Stafford-Smith M.等.Anesthesiology 103:229-240 (2005)]。
更具體地說，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的乙酰肝素酶酶原的促凝血作用可以用于 在缺乏適當(dāng)解毒劑的情況下逆轉(zhuǎn)抗凝血?jiǎng)┑呐R床作用，或者可以幫助抵 消出血并發(fā)癥和與類肝素的抗凝血活性相關(guān)的任何其它癥狀。
因此，在第一方面中，本發(fā)明涉及用于抑制類肝素抗凝血活性的組 合物。本發(fā)明的所述組合物包含作為活性成分的真核內(nèi)切糖苷酶或者其 包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽。該組合物可以選擇 進(jìn)一步包含藥用可接受的載體、稀釋賦形劑和/或添加劑。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明涉及用于抑制有需要的對象的類肝素抗 凝血活性的組合物。本發(fā)明的所述組合物包含作為活性成分的真核內(nèi)切 糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽。所述 組合物可以選擇進(jìn)一步包含藥用可接受的載體、稀釋賦形劑和/或添加劑。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于治療和防止與凝血 相關(guān)的病理性臨床癥狀的藥物組合物。這種組合物具體包含作為活性成 分的真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片 斷或肽，所述組合物可以選擇進(jìn)一步包含藥用可接受的載體、稀釋賦形 劑和/或添加劑。
如上所述，本發(fā)明的所述組合物旨在用于抑制類肝素抗凝血活性。 本說明書和所附權(quán)利要求書部分中所使用的術(shù)語"抑制"及其派生詞是 指壓制或限制活性的自由表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，至少 大約20% 90%，優(yōu)選至少大約40% 90%，更優(yōu)選至少大約80% 90% 的類肝素抗凝血活性被本發(fā)明所使用的非活性乙酰肝素酶或所述肽消除。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物中所包含的作為活性成分 的真核內(nèi)切糖苷酶可以是非活性內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié) 合域的任何突變體、片斷或肽。
更具體而言，非活性內(nèi)切糖苷酶可以優(yōu)選為65 Kd的潛伏形式的哺 乳動(dòng)物乙酰肝素酶酶原。作為選擇，非活性內(nèi)切糖苷酶可以是變異的乙 酰肝素酶分子或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何變異體、片斷或肽， 它們不具有乙酰肝素酶內(nèi)切糖苷酶催化活性。
本說明書和所附權(quán)利要求書部分中所使用的短語"乙酰肝素酶催化 活性"或其等價(jià)短語"乙酰肝素酶活性"是指對于肝素或硫酸乙酰肝素 蛋白多糖底物具有特異性的動(dòng)物內(nèi)切糖苷酶水解活性，其含義與通過卩-消除來降解肝素或硫酸乙酰肝素的細(xì)菌酶(乙酰肝素酶I、 II和III)的活性 相對。
"功能性片斷"是指分子的"片斷"、"變異體"、"類似物"或"衍
生物"。分子的"片斷"，例如本發(fā)明所使用的65kDa非活性乙酰肝素酶
的任何氨基酸序列或其任何突變體，意指所述分子的任何氨基酸亞類(包 括至少一個(gè)肝素結(jié)合域)。所述分子的"變異體"意指與整個(gè)分子或其片
斷充分相似的天然分子。分子的"類似物"是來自相同物種或不同物種 的類似分子。"功能性"是指具有同樣的生物功能，例如逆轉(zhuǎn)類肝素的抗 凝血活性所需的功能。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，內(nèi)切糖苷酶或其任何突變體、片斷或肽 中所包含的肝素結(jié)合域可以包含哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶的殘基 LyS158-Asp171、 Gln270-Lys280和Lys川-Arg432中任何一種的氨基酸序列。應(yīng) 該注意，根據(jù)一個(gè)特別的實(shí)施方式，哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶可以優(yōu)選是人 乙酰肝素酶。因此，優(yōu)選的肝素結(jié)合域位于人乙酰肝素酶的三個(gè)區(qū)域中。 一個(gè)區(qū)域包含氨基酸殘基Lys"s至AspW(也表示為SEQ ID NO:l)，第二 區(qū)域包含氨基酸殘基Lys^至Lys^(也表示為SEQ ID NO:2)，第三區(qū)域 包含氨基酸殘基Lys411至Arg"、也表示為SEQ ID NO:3)，或者其任何功 能上等價(jià)的片斷、衍生物和變異體。衍生物的實(shí)例是由SEQIDN0:4表
19示的具有一個(gè)額外半胱氨酸的Lys"s至Asp171。
應(yīng)該理解的是，本說明書和所附權(quán)利要求書部分所使用的所有氨基
酸位置(Lys158至Asp171 、Lys262至Lys280和Lys411至Arg"2)是指由GenBank Accession No. AF144325表示的人乙酰肝素酶的氨基酸序列的位置。
在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，本發(fā)明由此提供了包含作為活性劑的至 少一種如本發(fā)明所定義的肽的組合物。因此，所述組合物將包含作為活 性劑的肽，所述肽包含乙酰肝素酶中的肝素結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列，具 體而言，所述肽包含Lys"s至Asp171、 Lys262至Ly,、 Lys411至Arg432中 的任何一種，和其任何功能上等價(jià)的片斷或衍生物。
根據(jù)另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物中所包含的優(yōu)選 的活性成分可以是肽，優(yōu)選長度為大約1 40個(gè)氨基酸的肽，更優(yōu)選長 度為大約5 20個(gè)氨基酸的肽，最優(yōu)選長度為大約10 20個(gè)氨基酸殘基 的肽，包含人乙酰肝素酶的殘基Lys，Asp171、殘基Gln，-Lys，和殘基 Lys川-Arg啦中任何一種的氨基酸序列(也分別由SEQIDNO: 1、 2、 3和4 表示)。優(yōu)選的是，所述肽包含由SEQIDNO: 1、 2、 3、 4中的任何一個(gè) 所表示的氨基酸序列或者其任何類似物或衍生物。更優(yōu)選的是，所述肽 包含由SEQIDNO: 1所表示的氨基酸序列或者其任何片斷、類似物或衍 生物，例如SEQ ID NO: 4所表示的肽。
此處所使用的術(shù)語類似物和衍生物是指包含SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4中任何一個(gè)的氨基酸序列中的1 40個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選為大約5 20個(gè)氨基酸，最優(yōu)選為大約10 20 個(gè)氨基酸殘基的肽，所述肽可以具有不影響所述肽抑制類肝素抗凝血活 性能力的任何插入、缺失、取代和修飾(下文稱作"衍生物")。衍生物應(yīng) 該保持與所述氨基酸序列的最低同源性，例如20% 90%，優(yōu)選為40% 75%，更優(yōu)選為甚至低于30%的同源性。應(yīng)該知道的是，此處所使用的 術(shù)語"插入"是指向本發(fā)明的肽中加入任意的氨基酸殘基(可以為l 50個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選為20 1個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選為1 10個(gè)氨基 酸殘基)。
此外，可以使用各種相同或不同的氨基酸殘基在本發(fā)明所使用的肽
20的N-端和/或C-端延長所述肽。作為這種延長的一個(gè)實(shí)例，可以使用相同 或不同的疏水性氨基酸殘基(一個(gè)或多個(gè))在所述肽的N-端和/或C-端延長 所述肽，所述疏水性氨基酸殘基可以是天然或合成的氨基酸殘基(一個(gè)或 多個(gè))。合成的氨基酸殘基的一個(gè)實(shí)例是D-丙氨酸。
這種延長的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例可以提供為使用半胱氨酸殘基同時(shí)在
肽的N-端和/或C-端延長的肽。當(dāng)然，這種延長可能會(huì)因雙硫鍵形成所引 起的Cys-Cys環(huán)化而導(dǎo)致構(gòu)象受限。
另一個(gè)實(shí)例可以是結(jié)合一個(gè)N-端賴氨酰-棕櫚酰尾，賴氨酰起到接頭 的作用，而棕櫚酸則起到疏水錨的作用。
另外，可以使用芳香族氨基酸殘基(一個(gè)或多個(gè))來延長用作本發(fā)明組 合物的活性成分的肽，所述芳香族氨基酸殘基可以是天然或合成的氨基 酸殘基(一個(gè)或多個(gè))。優(yōu)選的芳香族氨基酸殘基可以是色氨酸。作為選擇， 可以使用在天然乙酰肝素酶的氨基酸序列的相應(yīng)位置存在的氨基酸在肽 的N-端和/或C-端延長所述肽。
然而，根據(jù)本發(fā)明，可以使用各種相同或不同的、不是天然或合成 的氨基酸的有機(jī)部分，在本發(fā)明的肽的N-端和/或C-端延長所述肽。作為 這種延長的一個(gè)實(shí)例，可以使用N-乙?；陔牡腘-端和/或C-端延長所 述肽。
線性肽結(jié)構(gòu)的缺乏會(huì)使它們?nèi)菀资艿饺搜逯械牡鞍酌傅膿p害并使 它們與耙位的親合力降低，因?yàn)橹挥泻苌俚目赡軜?gòu)象具有活性。因此， 需要優(yōu)化肽結(jié)構(gòu)，例如通過制造本發(fā)明的各種肽的不同衍生物來優(yōu)化。
為了改善肽結(jié)構(gòu)，本發(fā)明的肽可以通過它們的N-端偶聯(lián)一個(gè)月桂基 -半胱氨酸(1^)殘基和/或通過它們的C-端偶聯(lián)一個(gè)半胱氨酸(C)殘基，或 者連接適于將所述肽與免疫用佐劑(一個(gè)或多個(gè))偶聯(lián)的其它殘基(一個(gè)或 多個(gè))，下文中將對此進(jìn)行更加詳細(xì)的說明。
應(yīng)該注意的是，本發(fā)明所使用的肽及其衍生物可以全部帶有正電、 負(fù)電或者是中性的，并且可以是二聚體形式、多聚體形式或者處于受限 構(gòu)象。受限構(gòu)象可以通過內(nèi)部橋接、短程環(huán)化(short-range cyclization)、延 長或其它化學(xué)修飾而獲得。對于本發(fā)明所使用的和本文所披露的每一單條肽序列，本發(fā)明包含
相應(yīng)的逆反序列(retro-inverso sequence),其中肽鏈的方向已經(jīng)反轉(zhuǎn)，并且 其中所有氨基酸都屬于D-系列。
需要理解的是，本發(fā)明還包括更長的肽，其中堿性Lys158至Asp171 氨基酸殘基(由SEQ ID NO: 1表示)中的部分或全部被包含在氨基酸序列 中。較長的肽也可以是串聯(lián)重復(fù)所得到的肽，其中(本發(fā)明所使用的具有 1 40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為具有大約5 20個(gè)氨基酸，最優(yōu)選為具有大約 10 20個(gè)氨基酸殘基的肽的)堿性肽序列重復(fù)大約2次 大約100次。
有趣的是，應(yīng)該注意本發(fā)明人最近證明(WO 2005/071070)，這些肽， 特別是SEQ ID NO: 1的十四氨基酸肽顯示出與固定的肝素和HS的高親 合力和物理相互作用。此外，通過干擾乙酰肝素酶催化活性，這些肽能 夠顯著抑制乙酰肝素酶酶活性，因此也可以使用這些肽作為用于治療由 乙酰肝素酶催化活性所導(dǎo)致或與乙酰肝素酶催化活性相關(guān)的疾病和紊亂 的乙酰肝素酶抑制劑，所述疾病和紊亂例如是癌癥、炎性疾病、自身免 疫疾病或腎病。這一作用最可能歸因于對乙酰肝素酶和肝素/HS底物之間 相互作用的抑制。本發(fā)明人最近進(jìn)行的NMR研究清楚地確定，Lys158、 Lys'"和Lys^是乙酰肝素酶-肝素/HS相互作用的重要介體。因此，應(yīng)該 知道的是，這些殘基可能與非活性乙酰肝素酶或其肽對于類肝素抗凝血 活性的抑制特別相關(guān)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物旨在用于抑制諸如肝素、低 分子量肝素(LMWH)、普通肝素(UFH)或其任何功能性片斷和衍生物等類 肝素的抗凝血活性。
應(yīng)該注意的是，本發(fā)明進(jìn)一步包括類肝素或"肝素樣分子"的抑制。 此處所使用的術(shù)語肝素樣分子是指這樣的分子，該分子具有抗凝血活性 和與肝素非常相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因而可認(rèn)為所述分子對于需要肝素的患
者而言是一種可能的替代性治療。肝素樣分子包括但不限于低分子量肝 素和肝素類似物等。術(shù)語低分子量肝素包括分子量小于8,000道爾頓的肝 素分子。術(shù)語肝素類似物包括諸如肝素胺(hepramine)及其鹽等類肝素、 以及軟骨素及其鹽，等等。此處所用的術(shù)語肝素是指標(biāo)準(zhǔn)商購肝素及其
22衍生物。術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)肝素包括平均分子量為大約8,000道爾頓 大約 30,000道爾頓的普通肝素分子的混合物或者其任何亞組分。另外，還考 慮到的是，此處所使用的術(shù)語肝素包括生物活性的肝素分子，它們可以 是從哺乳動(dòng)物源分離的、化學(xué)改性的，或者是部分或全部從頭合成的。 術(shù)語肝素衍生物包括肝素的鹽和肝素片斷等。
肝素施用是用于急性靜脈血栓形成、在手術(shù)后(特別是矯形外科手術(shù) 后)并臥床的患者中預(yù)防血栓形成和沖洗靜脈通道(intravenous line)以使 其保持通暢的標(biāo)準(zhǔn)抗血栓形成治療法。然而，肝素和LMWH會(huì)因它們的 效力而存在缺點(diǎn)。由運(yùn)動(dòng)的簡單應(yīng)力及相伴的與物體的接觸所引起的或 在外科手術(shù)處的失去控制的出血是一個(gè)主要并發(fā)癥。此外，約有5%(高 達(dá)30%)的使用肝素治療的患者和約有2。/。的接受普通肝素(UFH)的患者 患上免疫介導(dǎo)性血小板減少癥(HIT)，這可能并發(fā)出血(作為血小板計(jì)數(shù)降 低的后果)或者動(dòng)脈和靜脈血栓形成，后者因血管內(nèi)血小板結(jié)塊而引起。 這一并發(fā)癥出現(xiàn)在多達(dá)20%的HIT患者中，可能導(dǎo)致大約50%病例出現(xiàn) 嚴(yán)重發(fā)病和死亡。在HIT病例中使用肝素的治療導(dǎo)致止血并發(fā)癥嚴(yán)重惡 化，因此在該病例中應(yīng)該中斷肝素治療。另一方面，肝素的中斷可能會(huì) 使需要抗血栓形成治療的患者處于極大的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)之中，因?yàn)槟壳?還不存在具有直接、有效的抗血栓形成能力的替代性治療。此外，諸如 低分子量肝素或類肝素等替代性治療可能不具有相容性，因?yàn)樗鼈兣c抗 肝素抗體的潛在交叉反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致HIT的進(jìn)一步惡化。肝素誘導(dǎo)的血小板 減少癥(HIT)在30% 75%的病例中會(huì)并發(fā)動(dòng)脈性或靜脈性的反常血栓形 成綜合征(paradoxical thrombotic syndrome, HITTS)。 HITTS意味著相關(guān) 的死亡率和發(fā)病率，其中有腦梗塞和/或心肌梗塞和截肢。 一些患者患有 單純血小板減少癥(HIT)而其它患者患有HITTS的原因尚不清楚。
因此，肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HIT)是一種危及生命的免疫疾病。 當(dāng)患者患上原因不明但與近期肝素治療相關(guān)的血小板減少癥和/或形成血 栓的并發(fā)癥時(shí)，應(yīng)考慮進(jìn)行HIT的診斷。血小板減少癥和血栓形成通常 在未接受過治療的個(gè)體開始治療后5 10天出現(xiàn)，但是對于以前接觸過 藥物的個(gè)體，并發(fā)癥的發(fā)展會(huì)更快一些。據(jù)報(bào)道，血小板計(jì)數(shù)通常在20,000 L 100,000/pL之間。然而，對于其血小板計(jì)數(shù)下降30% 50% 的任何接觸過藥物的個(gè)體，在沒有其它明確鑒定的病因的情況下，應(yīng)該 考慮進(jìn)行所述診斷。不像藥物誘導(dǎo)性血小板減少癥或免疫介導(dǎo)性血小板 減少癥的大多數(shù)其它原因，出血在HIT中并不常見。然而，有30% 50% 的患有HIT的患者卻反常地患上血栓癥——一種被稱作肝素誘導(dǎo)的血小 板減少癥并伴血栓形成(HITT)的并發(fā)癥。患有HITT的患者可能會(huì)患上靜 脈或動(dòng)脈血栓癥。靜脈血栓栓塞并發(fā)癥比動(dòng)脈血栓栓塞更為常見。以血 小板減少癥作為其唯一HIT表現(xiàn)形式(也被稱作單純HIT)的患者通?；加?未被診斷的靜脈血栓癥。動(dòng)脈血栓癥常見于導(dǎo)管插入或外科手術(shù)損傷的 血管，但在中風(fēng)、心肌梗塞和外周壞疽中也都有報(bào)道。
如果患者以前曾經(jīng)接觸過肝素，則可能會(huì)使通常在開始接受肝素5天 或5天以上才患上的HIT更快地發(fā)生。肝素與血小板因子4(PF4)結(jié)合， 在血小板表面和內(nèi)皮細(xì)胞表面上形成高反應(yīng)性抗原性復(fù)合物，由此增加 肝素依賴性抗體的靶數(shù)。易感患者于是會(huì)針對肝素-PF4抗原性復(fù)合物產(chǎn) 生抗體(IgG)。免疫球蛋白，通常是IgG—旦產(chǎn)生，就與血小板表面上的 肝素-PF4免疫復(fù)合物結(jié)合。然后，IgG的Fc部分會(huì)通過與血小板Fc受 體結(jié)合而活化所述血小板。隨著網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對活化的血小板、血小板 小顆粒聚集體和IgG包覆的血小板的消耗，將發(fā)展成血小板減少癥。然 而多數(shù)破壞都是在血栓形成狀態(tài)下發(fā)生的，所述血栓形成狀態(tài)是血小板 活化、促凝血微粒產(chǎn)生和凝血酶產(chǎn)生額外增多的結(jié)果。
因此，HIT是臨床實(shí)踐中廣泛使用的藥物的一種嚴(yán)重的副作用。通 過任何途徑或以任何劑量接觸肝素的所有患者都處在不同程度的患上 HIT及其潛在的破壞性血栓形成并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)之中。這包括以全治療劑 量和低預(yù)防劑量接受UFH的患者，所述低預(yù)防劑量包括肝素沖洗中和肝 素涂層導(dǎo)管上的微量UFH。接受LMWH的患者也處于HIT風(fēng)險(xiǎn)之中， 盡管其風(fēng)險(xiǎn)程度較低。每年美國接受UFH或LMWH的患者達(dá)1200萬， HIT的臨床問題因而變得愈發(fā)明顯。
顯然，低分子種類的類肝素由于其高功效和改善的藥物動(dòng)力學(xué)而受 到臨床應(yīng)用的青睞[Bussey H，等，24(8 Pt 2):103S-107S (2004)]。然而，
24LMWH臨床應(yīng)用的一個(gè)急需解決的問題在于缺乏適當(dāng)?shù)慕舛緞?。此外?br> 當(dāng)前用作UFH的解毒劑的硫酸魚精蛋白不能有效逆轉(zhuǎn)LMWH活性，并 可導(dǎo)致血液動(dòng)力學(xué)改變和其它嚴(yán)重的副作用[Chawla LS,等.，Obes. Surg. May;14(5):695-698 (2004);Mixon TA， Semin Thromb H函st. 30(3):369-377 (2004)]。新型直接凝血酶抑制劑也沒有特異性解毒劑[Warkentin TE， Can. J. Anaesth. 49(6):S 11-25 (2002)]。
因此，在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物特別旨在用于抑 制有需要的對象，優(yōu)選的是患有與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的哺乳動(dòng) 物對象的類肝素抗凝血活性。更具體而言，這種臨床癥狀可以是與類肝 素的抗凝血作用相關(guān)或由類肝素的抗凝血作用導(dǎo)致的癥狀，例如，失去 控制的出血或免疫介導(dǎo)性血小板減少癥(HIT)。
還應(yīng)注意的是，抑制類肝素的抗凝血活性對于需要外科手術(shù)介入的 患者也是需要的(作為手術(shù)前或手術(shù)后的治療)。特別是對于那些接受類肝 素作為常規(guī)治療的患者。
本發(fā)明的組合物可以包含游離形式的活性物質(zhì)，并可直接施用于受 治療的對象。作為選擇，根據(jù)活性分子的大小而使其在施用前結(jié)合載體 是理想的。治療制劑可以以任何常規(guī)劑型施用。制劑通常包含至少一種 如上所述的活性成分及其一種或一種以上可接受的載體。
每種載體在能夠與其它成分相容并且對于患者無害的意義上來說， 其在藥學(xué)和生理學(xué)上都應(yīng)該是可接受的。制劑包括適于口服給藥、直腸 給藥、經(jīng)鼻給藥或腸胃外給藥(包括皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi) 給藥)的那些制劑。制劑可以以單位劑量形式方便地提供，并且可以通過 藥劑學(xué)領(lǐng)域中任何廣為人知的方法制備。所有這些化合物的性質(zhì)、利用 度及來源和施用，包括對對象產(chǎn)生理想效果所必需的有效量，都是本領(lǐng) 域己知的，此處無需進(jìn)一步描述。
適于注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散液和用于臨時(shí)制備 無菌水溶液或分散液的無菌粉末。在所有情況下，所述形式必須是無菌 的，并且必須是達(dá)到容易注射性程度的流體。所述形式在制造和存儲(chǔ)條 件下必須是穩(wěn)定的，并且必須在防止諸如細(xì)菌和真菌等微生物污染活動(dòng)的條件下保存。
通過將需要量的在適當(dāng)溶劑中的活性化合物與以上所列各種其它成 分混合，然后根據(jù)需要進(jìn)行過濾滅菌，由此制備無菌注射溶液。通常， 可以通過將各種無菌活性成分加入到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自以上所列 物質(zhì)的所需其它成分的無菌媒介物中來制備分散液。
在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是 真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，所述技術(shù)由活性成分和任何其它所需成分的 預(yù)先無菌過濾的溶液得到活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
應(yīng)該注意的是，上述這些情況適用于本發(fā)明所述的所有組合物。
更具體而言，所述非催化性65 Kd乙酰肝素酶、其突變體、片斷或 肽，或者包含它們的具有類肝素抑制活性的任何物質(zhì)或組合物都可以通 過本發(fā)明的方法全身施用，例如通過諸如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射等 腸胃外等方法施用。在另一個(gè)實(shí)例中，可以通過任何適當(dāng)?shù)耐緩剑?靜脈內(nèi)、皮下、透皮、局部、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、結(jié)膜下或諸如口腔粘膜、 鼻內(nèi)粘膜或眼內(nèi)粘膜等粘膜施用而將藥物組合物引入某一部位。此外， 本發(fā)明的組合物可以通過選自腸胃外、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、粘膜、舌下和直 腸施用和它們的任何組合的途徑施用。
對于需要治療的區(qū)域的局部施用可以通過例如手術(shù)期間局部輸注、 局部涂抹和直接注射到所需位置等來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域中熟知的方法制造，例如可以 通過常規(guī)混合、溶解、?；?、糖衣丸制作、粉碎、乳化、膠囊化、包埋 或凍干等方法制造。
如上所述，用于本發(fā)明應(yīng)用的藥物組合物可以使用一種或多種包括 賦形劑和輔料的生理可接受的載體以常規(guī)方式配制，所述載體有利于將 活性成分加工到可藥用的制劑中。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選擇的施用途徑。
對于注射，本發(fā)明的活性成分可以在水溶液中，優(yōu)選在諸如Hanks 氏溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液等生理相容性緩沖液中配制。對 于跨粘膜施用，可以在制劑中使用適于透過屏障層的滲透劑。這些滲透 劑是本領(lǐng)域中通常己知的滲透劑。
26用于局部施用的藥物組合物可以包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液劑和粉劑。常規(guī)藥物載體、水基粉末或油性基料和增稠劑等可能是需要的或者理想的。
對于口服施用，藥物制劑可以是例如溶液劑、糖漿劑或懸浮劑等液體形式，也可以是片劑和膠囊劑等固體形式。對于吸入施用，組合物可以以滴劑或氣溶膠噴霧劑的形式方便地遞送。對于注射施用，制劑可以以單位劑量形式提供(例如在安瓿瓶中提供)，或者以在加入有防腐劑的多劑量容器中的形式提供。
對于口服施用，可以通過將活性化合物與本領(lǐng)域內(nèi)熟知的藥用可接受的載體結(jié)合而容易地對所述化合物進(jìn)行配制。這些載體使本發(fā)明的化合物能被配制成片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊劑、液劑、凝膠劑、糖漿劑、
漿劑(slurry)和懸浮劑等而用于患者口服攝入。
用于口服使用的藥學(xué)制劑可以利用固體賦形劑制得，并且可選擇研磨獲得的混合物并在根據(jù)需要而加入適當(dāng)輔料后加工顆?；旌衔?，以獲得片劑或糖衣丸的內(nèi)核。具體而言，適當(dāng)?shù)馁x形劑可以是諸如糖(包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇)等填料，諸如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉等纖維素制劑；和/或諸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等生理可
接受的聚合物。增稠劑、芳香劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑也可能是需要的。
如果需要，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯垸酮、瓊脂或藻酸或其鹽(例如藻酸鈉)等。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽的可以口內(nèi)施用的劑型。術(shù)語"口內(nèi)施用"包括通過口腔或上喉部(例如頰部(例如內(nèi)頰層)、齒齦、腭、舌、扁桃體、牙周組織、唇，以及口腔和咽的粘膜)內(nèi)部任何表面吸附進(jìn)行的施用。這些術(shù)語例如包括舌下施用和含服施用。
作為選擇，施用組合物可以是諸如片劑、膠囊劑或者微粒(諸如粉末或香粉等)等固體形式。固體劑型可以通過手工或機(jī)械混合固體形式的遞
27送劑化合物和固體形式的真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽來制備。
對于通過鼻吸施用，用于本發(fā)明應(yīng)用的活性成分，即真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽，可以利用諸如二氯二氟甲垸、三氯氟甲烷、二氯-四氟乙垸或二氧化碳等適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑，方便地從加壓組合件或噴霧器中以氣溶膠噴霧物的形式遞送。在加壓氣溶膠的情況中，劑量單位可以通過設(shè)置閥來確定，以遞送經(jīng)計(jì)量的量。用在分配器中的例如明膠等的膠囊和藥盒可以被配制成包含所述化合物和諸如乳糖或淀粉等適當(dāng)?shù)姆勰┗系姆勰┗旌衔铩?br> 此處所述的制劑可以配制成用于腸胃外施用，例如通過大劑量注射
(bonus injection)或連續(xù)輸注施用。注射用制劑可以以單位劑量的形式提供(例如在安瓿瓶中提供)，或者以在可選地添加有防腐劑的多劑量容器中的形式提供。組合物可以是在油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳液，并且可以包含諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑等配方劑。
用于腸胃外施用的藥物組合物包括水溶形式的活性制劑的水溶液。另外，活性成分的懸浮液可以制備為適當(dāng)?shù)挠突蛩⑸鋺腋∫?。適當(dāng)?shù)挠H脂性溶劑或媒介物包括諸如芝麻油等脂肪油、或者諸如油酸乙酯等合成脂肪酸酯、甘油三酸酯或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可以包含能夠提高懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。可選擇的是，懸浮液還可以包含適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑或者能夠提高活性成分溶解性的物質(zhì)，以便能夠制備高度濃縮的溶液。
作為選擇，在使用前活性成分可以為粉末形式，用于與諸如無菌、無熱原的水基溶液等適當(dāng)媒介物構(gòu)成懸浮液。
本發(fā)明的藥物組合物還可以通過例如使用諸如可可油或其它甘油酯等常規(guī)栓劑基料配制成直腸用組合物，例如栓劑或保留灌腸劑。
因此，本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳液和含有脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可以由各種組分(包括但不限于預(yù)制液體、自乳化固體和自乳化半固體)制成。
適用于本發(fā)明的情況中的藥物組合物包括其中包含有能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)期目的的有效量的活性成分的組合物。更具體而言，治療有效量是指可以有效防止、緩解或改善被治療的對象的疾病癥狀或者延長被治療對象的生命的活性成分的量。
治療有效量的確定完全處在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。
可以有效治療特定疾病、癥狀或紊亂的本發(fā)明的治療或藥物組合物的量將取決于疾病、癥狀或紊亂的性質(zhì)，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。另外，可以選擇采用體外分析和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來幫助確定最佳劑量范圍。制劑中所要采取的精確劑量還取決于施用途徑和疾病、癥狀或紊亂的嚴(yán)重性，并且應(yīng)該根據(jù)從業(yè)人員的判斷和每位患者的情況來確定。有效劑量可以根據(jù)由體外或動(dòng)物模型測試系統(tǒng)得到的劑量響應(yīng)曲線外推獲得。
此處所用的"有效量"是指為實(shí)現(xiàn)選定結(jié)果而必需的量。例如，本發(fā)明組合物的有效量為能夠用于抑制類肝素的抗凝血活性從而能夠用于治療所述病狀的量。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，乙酰肝素酶酶原的優(yōu)選有效量可以在
0.1 ng/ml 0.1mg/ml范圍內(nèi)，優(yōu)選為在1 j^g/ml l(Hig/ml范圍內(nèi)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，其中肽(優(yōu)選為SEQIDNO: 1的肽)為本發(fā)明所用，肽的優(yōu)選有效量可以在100 0.001 mg/ml范圍內(nèi)，優(yōu)選在1 0.01 mg/ml
范圍內(nèi)。
在第二方面中，本發(fā)明涉及用于抑制有需要的對象的類肝素抗凝血活性的方法。本發(fā)明的方法包括對所述對象施用抑制有效量的真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽或者包含它們的任何組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于治療患有與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的對象和/或防止對象患上與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的方法，所述方法包括對所述對象施用抑制有效量的真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽或者包含它們的任何組合物的步驟。
根據(jù)所述方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的方法中所使用的真核內(nèi)切糖苷酶可以是非活性內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽。更具體而言，這種肝素結(jié)合域包含哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶的殘基Lys158-Asp171、 Gln"Q-Lys，和Lys"'-Arg432中任何一種的氨基酸序列。
根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的方法所使用的非活性內(nèi)切糖苷酶可以是65 Kd的潛伏形式的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶酶原，或者作為選擇，非活性內(nèi)切糖苷酶可以是缺乏乙酰肝素酶內(nèi)切糖苷酶催化活性的變異的乙酰肝素酶分子。
根據(jù)另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的方法使用包含哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶的殘基Lys158-Asp171、 Gln，-Lys，和Lys"'-Arg432中任何一種
的氨基酸序列的肽來抑制類肝素抗凝血活性。
在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法使用包含由SEQIDNO: 1、 2、 3、 4中的任一個(gè)表示的氨基酸序列的肽(優(yōu)選為SEQID NO: 1的肽)或其類似物或衍生物來抑制有需要的對象的類肝素抗凝血活性。這種衍生物的一個(gè)非限制性實(shí)例是SEQ ID NO: 4的肽。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，由本發(fā)明的方法抑制的類肝素可以是肝素、低分子量肝素(LMWH)、普通肝素(UFH)，或者它們的任何功能性片斷。
根據(jù)另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的方法旨在治療患有與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀(優(yōu)選為與類肝素的抗凝血作用相關(guān)或者由類肝素的抗凝血作用引起的癥狀)的哺乳動(dòng)物對象。更具體而言，這種癥狀可以是失去控制的出血。應(yīng)該注意的是，本發(fā)明的方法也可以適用于與使用類肝素相關(guān)的其它并發(fā)癥，例如免疫介導(dǎo)性血小板減少癥(HIT)的治療。
根據(jù)一個(gè)特別的實(shí)施方式，本發(fā)明的方法也可以用于防止與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀。這特別適用于手術(shù)癥狀，特別是適用于為避免、減少或防止出血而使用類肝素治療的那些對象的手術(shù)癥狀。因此，根據(jù)這一實(shí)施方式，所述方法包括對需要外科手術(shù)介入的對象在手術(shù)前和/或手術(shù)后施用治療有效量的真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽或者包含它們的任何組合物。應(yīng)該進(jìn)一步注意的是，本發(fā)明的組合物可以局部使用，或者以任何其它適當(dāng)?shù)氖┯猛緩绞褂谩?br> 30應(yīng)該進(jìn)一步注意的是，本發(fā)明的組合物和方法也適用于防止和減少 任何損傷引起的出血，即活生物的任何損傷組織的出血。損傷組織可以 是諸如胃的內(nèi)壁或骨折等體內(nèi)組織、或皮膚表面等，還可以是諸如脾等 軟組織或者諸如骨等硬組織。損傷可以是病變、外傷或創(chuàng)傷，或者由感 染或外科手術(shù)形成的損傷。
本發(fā)明的方法所使用的藥物組合物可以以劑量單位的形式制備，并 且可以通過藥劑學(xué)領(lǐng)域中任何熟知的方法制備。另外，所述藥物組合物 可以進(jìn)一步包含藥用可接受的添加劑，例如藥用可接受的載體、賦形劑 或穩(wěn)定劑，和可選擇的其它治療組分。當(dāng)然，可接受載體、賦形劑或穩(wěn) 定劑在其所采用的劑量和濃度下對于接受者是無毒的。
本發(fā)明的組合物的治療劑量的大小當(dāng)然會(huì)隨患者組群(年齡、性別 等)、要治療的癥狀的性質(zhì)和施用途徑而變化，這些情況都應(yīng)由主治醫(yī)師 確定。
雖然本發(fā)明的方法特別用于治療人類的與類肝素的抗凝血活性相關(guān) 的病理性臨床癥狀，但是也包括對其它哺乳動(dòng)物的治療。
"治療"是指治療性處置。需要治療的對象是患有任何與凝血相關(guān) 的病理性紊亂的哺乳動(dòng)物對象。"患者"或"有需要的對象"是指為防止、 克服或緩解這種負(fù)擔(dān)而需要施用真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝 素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽，或者包含這種化合物或其衍生物的 任何藥物組合物的任何哺乳動(dòng)物。用于治療目的的"哺乳動(dòng)物"或"哺 乳動(dòng)物的"是指任何被劃分為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包括人、研究用動(dòng)物、 家畜和動(dòng)物園動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物或?qū)櫸?，例如狗、馬、貓和奶牛等。在一 個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述哺乳動(dòng)物對象是人類對象。
提供"防止性治療"或"預(yù)防性治療"是指以保護(hù)性方式發(fā)揮抵抗 或防止某些事，特別是癥狀或者疾病的作用。
本發(fā)明的方法應(yīng)該適用于患有與凝血相關(guān)的紊亂，特別是由類肝素 引起的與凝血相關(guān)的紊亂的對象。如此處所述，術(shù)語"病理性癥狀"是 指其中存在正常功能受到干擾的癥狀。這種癥狀是引起受到影響的人或 者與受到影響的人接觸的那些人出現(xiàn)不適、機(jī)能障礙或者痛苦的身體或
31精神上的任何異常癥狀。有時(shí)該術(shù)語用于泛指包括損傷、傷殘、綜合征、 癥狀、異常行為和結(jié)構(gòu)和機(jī)能的非典型變化，而在其它情況中它們可能 被認(rèn)為是可區(qū)分的類別。應(yīng)該注意的是，術(shù)語"疾病"、"紊亂"、"癥狀" 和"病"在此處是等同使用的。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于抑制類肝素抗凝血活性的方法。該方法包括 如下步驟(a)在適當(dāng)?shù)男纬苫旌衔锏臈l件下，使抑制有效量的真核內(nèi)切 糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽或者任
何包含它們的組合物與所述類肝素接觸；(b)在適當(dāng)?shù)臈l件下，向步驟(a) 獲得的混合物中加入哺乳動(dòng)物體液樣品(優(yōu)選血漿)，并經(jīng)歷適當(dāng)?shù)臅r(shí)間； 和(c)通過適當(dāng)?shù)姆椒ú⑴c適當(dāng)?shù)膶φ障啾容^，檢驗(yàn)所述類肝素對所述樣 品的抗凝血活性。
應(yīng)該知道的是，本發(fā)明所述的這一方法也可以用于在治療的任何時(shí) 間點(diǎn)監(jiān)測被治療的患者和/或確定所需要的真核內(nèi)切糖苷酶或者其任何突 變體、片斷或肽的精確量，以便成功抑制被治療的有需要的對象的類肝 素抗凝血活性。應(yīng)該進(jìn)一步注意的是，本方法能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測需要施用于 有需要的對象的理想濃度。
對于凝血的作用的檢驗(yàn)可以如本發(fā)明也采用的一樣，使用不同的非 常確實(shí)的凝血分析來進(jìn)行。這種適當(dāng)?shù)姆治龅囊粋€(gè)實(shí)例可以是凝血酶原 時(shí)間(PT)測試，該測試測量在血樣中形成凝塊所需的時(shí)間。在體內(nèi)，凝血 過程涉及一系列連續(xù)的化學(xué)反應(yīng)。最終步驟之一是凝血酶原向凝血酶轉(zhuǎn) 化。凝血酶原是由肝產(chǎn)生的幾個(gè)凝血因子之一。PT測試評價(jià)這些因子的 綜合功能和在合理的時(shí)間范圍內(nèi)身體產(chǎn)生凝塊的能力。
另一種優(yōu)選的分析可以是活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPPT)。該
測試是篩査患者出血傾向以評價(jià)對于促凝血紊亂的療效的一種有用并且 有效的方法，并且作為幾種特定凝血因子分析程序的基礎(chǔ)。aPTT己經(jīng)被 廣泛地用作監(jiān)測和調(diào)控肝素治療所需的測試。
另一種測試可以是凝血酶時(shí)間(TT)分析，所述分析反映在加入凝血 酶時(shí)血漿樣品凝血所需的時(shí)間。所述測試是測量纖維蛋白原向纖維蛋白 轉(zhuǎn)化和影響凝血系統(tǒng)的這一最終階段的因子所必需的測試。
32抗凝血酶(以前稱作抗凝血酶ni)是一種重要的天然抗凝血?jiǎng)Ｆ涔?br> 能在于抑制凝血過程中所產(chǎn)生的各種絲氨酸蛋白酶的活性。這不僅包括
顧名思義的凝血酶，還包括FXa、 FIXa、 IXa，并且很多情況下也可能包 括FVIIa。
抗凝血酶自身起到比較低效的凝血抑制劑的作用。肝素使其抑制活 性大大提高(大約5,000倍)。實(shí)際上，肝素的抗凝血活性幾乎完全通過抗 凝血酶來介導(dǎo)，因而具有抗凝血酶缺陷的患者比較耐受肝素的抗凝血作 用。因此，作為進(jìn)一步的凝血測試，對于本發(fā)明的組合物的逆轉(zhuǎn)作用的 檢驗(yàn)可以是對患者血漿中的抗凝血酶活性(AT)進(jìn)行的測量。所述測量可 以是對抗凝血酶的顯色分析，其中向測試樣品中加入固定的過量純化凝 血酶。在存在肝素的條件下培養(yǎng)之后，利用特定的發(fā)色底物測量殘存的(非 失活的)凝血酶。正常范圍為83°/。 115%。
應(yīng)該注意的是，也可以利用其它凝血分析，例如蛋白S和蛋白C活 性測試。蛋白S(PS)是一種維生素K依賴性凝血蛋白，其作為無活性的前 體而在肝臟內(nèi)合成。當(dāng)谷氨酸殘基被維生素K依賴性羧化酶羧化后獲得 活性形式，由此可使所述分子能夠與鈣離子結(jié)合。然而，不像該家族中 的其它凝血因子，PS不是絲氨酸蛋白酶的酶原。PS活性分析基于可增強(qiáng) 活化蛋白C的抗凝血作用的PS的輔因子活性。這種增強(qiáng)由富含Va因子 的系統(tǒng)的凝血時(shí)間的延長來反映，所述Va因子是活化蛋白C的一種生理 學(xué)底物。蛋白C是維生素K依賴性凝血因子家族中的一個(gè)成員。不像其 促凝血的同族物II因子、VII因子、IX因子和X因子，蛋白C在凝血已 經(jīng)開始后通過下調(diào)凝血酶的產(chǎn)生起到天然抗凝血?jiǎng)┑淖饔?。蛋白C由與 內(nèi)皮細(xì)胞表面上的血栓調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的凝血酶所活化?；罨鞍證(APC) 隨后與其位于血小板表面上的輔因子蛋白S結(jié)合，在血小板表面上，APC 可以使Va因子和VIIIa因子降解并失活。當(dāng)不存在蛋白C時(shí)，凝血酶的 生成相對來說將變得不受抑制，會(huì)使高凝狀態(tài)隨之發(fā)生。
應(yīng)該注意的是，利用各種介體的血小板凝集測試也可以用于評價(jià)本 發(fā)明所使用的非活性乙酰肝素酶及其肽的促凝作用。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明方法所使用的真核內(nèi)切糖苷酶可以是非活性內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或 肽。
根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，非活性內(nèi)切糖苷酶可以優(yōu)選為65 Kd 的潛伏形式的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶酶原，或者作為選擇，可以是缺乏乙 酰肝素酶內(nèi)切糖苷酶催化活性的變異的乙酰肝素酶分子。
應(yīng)該注意的是，本發(fā)明的所有方法和組合物所使用的非活性65 Kd
形式的乙酰肝素酶或者其任何片斷可以作為下述物質(zhì)提供純化的重組
的乙酰肝素酶蛋白、融合乙酰肝素酶蛋白、編碼非活性65 Kd形式的乙 酰肝素酶的核酸構(gòu)建體、表達(dá)所述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞、內(nèi)源性表達(dá)非活 性65 Kd形式的乙酰肝素酶的細(xì)胞、細(xì)胞系和組織，或者它們的任何裂 解物。還應(yīng)知道的是，在本發(fā)明的方法和組合物使用肽時(shí)，所述肽可以 以本領(lǐng)域中已知的任何方法合成生產(chǎn)、純化和分離。作為選擇，所述肽 可以重組生產(chǎn)。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的方法可以使用非活性內(nèi)切糖苷 酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽。所述域可 以優(yōu)選包含人乙酰肝素酶的殘基LyS158-Asp171、殘基Gln，-Lys，和殘基 Lys4"-Arg432(也分別由SEQ ID NO. 1 、 SEQ ID NO.2和SEQ ID N0.3表示) 中任何一種的氨基酸序列。應(yīng)該注意的是，所有的所述氨基酸位置(Lys158 至Asp171、Lys262至Lys280和Lys411至Arg"2)均指由GenBank Accession No. AF144325表示的人乙酰肝素酶的氨基酸序列。
根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的方法可以使用包含人乙酰 肝素酶的殘基Lys"s-Asp'"、殘基Gln，-Lys，和殘基Lys411-Arg432中任何 一種的氨基酸序列的肽。優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法使用包含由SEQ ID NO:l表示的氨基酸序列的肽或者其任何類似物或衍生物。在一個(gè)實(shí)例中， SEQ ID NO: 4是SEQ ID NO: 1的衍生物。
根據(jù)另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的方法旨在抑制諸如肝素、 低分子量肝素(LMWH)、普通肝素(UFH)或其任何功能性片斷等不同類肝 素的抗凝血活性。
根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽在用于抑制類肝素抗凝血活性的組合 物的制備中的應(yīng)用。
此外，本發(fā)明還涉及真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合 域的任何突變體、片斷或肽在用于抑制有需要的對象的類肝素抗凝血活 性的組合物的制備中的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步提供真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域 的任何突變體、片斷或肽在用于治療和防止與凝血相關(guān)的病理性臨床癥 狀的組合物的制備中的應(yīng)用。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所使用的真核內(nèi)切糖苷酶可以是非 活性內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或
肽。這種肝素結(jié)合域可以包含哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶的殘基Lys158-Asp171、 Gln，-Lys，和Lys411-Arg432中任何一種的氨基酸序列。
更具體而言，非活性內(nèi)切糖苷酶可以優(yōu)選為65 Kd的潛伏形式的哺 乳動(dòng)物乙酰肝素酶酶原，或者作為選擇，可以是缺乏乙酰肝素酶內(nèi)切糖 苷酶催化活性的變異的乙酰肝素酶分子。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明使用包含哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶的 殘基Lys158-Asp171、 Gln，-Lys，和Lys411-Arg432中任何一種的氨基酸序列 的肽。優(yōu)選的是包含由SEQIDNO: 1表示的氨基酸序列的肽或者其任何 類似物或衍生物，以用于抑制類肝素抗凝血活性。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方 式，類肝素可以是肝素、低分子量肝素(LMWH)、普通肝素(UFH)或者其 任何功能性片斷。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明使用非活性形式的乙酰肝素酶或 其肽來抑制類肝素的抗凝血活性和治療有需要的對象，優(yōu)選的是，治療 患有與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的哺乳動(dòng)物對象。這種與凝血相關(guān)的 病理性臨床癥狀可以是與類肝素的抗凝血作用相關(guān)或由類肝素的抗凝血 作用導(dǎo)致的紊亂。例如，可以是失去控制的出血或免疫介導(dǎo)性血小板減 少癥(HIT)。
應(yīng)該注意的是，本發(fā)明還包括為防止出血，使用乙酰肝素酶酶原或 其肽作為對患者(特別是那些進(jìn)行任何外科手術(shù)介入時(shí)定期接受類肝素的
35患者)的預(yù)防性手術(shù)前或手術(shù)后治療。
應(yīng)該知道的是，本發(fā)明還提供制造用于治療由類肝素的抗凝血作用 導(dǎo)致的與凝血相關(guān)的病理性癥狀的藥物的方法。因此，本發(fā)明的方法包
括如下步驟(a)提供治療有效量的真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè) 肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽；(b)將所述非活性形式的乙酰肝素 酶酶原與藥用可接受的載體、稀釋劑、賦形劑和/或添加劑中的至少一種 混合。
如所披露和描述的，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明不限于此處所述的具體 實(shí)施例、方法步驟和組合物，因?yàn)檫@些方法步驟和組合物可以在某種程 度上加以改變。還應(yīng)理解的是，此處所使用的術(shù)語僅為描述具體實(shí)施方 式而不是出于限制的目的而使用，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅由附錄的權(quán)利要 求書及其等效方式所限定。
必需注意的是，除非有內(nèi)容明確指出，否則本說明書和所附的權(quán)利 要求書中所使用的單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"所述"包括復(fù)數(shù)形式 的所指對象。
在本說明及其后面的實(shí)施例和權(quán)利要求的全文中，除非上下文另有 要求，否則單詞"包含"和"包括"及其變化形式應(yīng)被理解為意指涵蓋 所述整體或步驟或者整體組或步驟組，而不應(yīng)理解為排除任何其它整體 或步驟或者整體組或步驟組。
以下實(shí)施例代表了本發(fā)明人在實(shí)施本發(fā)明的各方面時(shí)所使用的技 術(shù)。應(yīng)該知道的是，雖然這些技術(shù)是用于本發(fā)明實(shí)踐的優(yōu)選實(shí)施方式的 示例，但是根據(jù)本發(fā)明所披露的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到可以 進(jìn)行大量修改，而不會(huì)偏離本發(fā)明的要旨和預(yù)期的范圍。
實(shí)施例
實(shí)驗(yàn)程序
人重組非活性65 Kd乙酰肝素酶
潛伏的65 kDa乙酰肝素酶蛋白由中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的條件培 養(yǎng)基純化，所述中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞可以穩(wěn)定地表達(dá)在哺乳動(dòng)物 pSecTag載體(Invitrogen)中的人乙酰肝素酶基因構(gòu)建體(在蛋白C-末端含
36有Myc和His標(biāo)記)。所述細(xì)胞在補(bǔ)充有10%FCS、谷氨酰胺、丙酮酸鹽 和抗生素的DMEM中生長。對于乙酰肝素酶的純化，使所述細(xì)胞在不含 血清的DMEM中過夜生長，并在Fractogel EMD S(V(MERCK)柱上純化 所述條件培養(yǎng)基(約1升)。使用1 M的NaCl洗脫結(jié)合的材料，并通過親 和色譜法在抗Myc標(biāo)記抗體(Santa Cruz Biotechnology)柱上進(jìn)一步純化。 通過此兩步驟程序，我們獲得了純度至少為95%的乙酰肝素酶制劑。 肽
利用符合商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的N-(9-芴基)甲氧羰?；?Fmoc)策略，在ABIMED AMS 422多肽合成儀(Langenfdd，德國)上合成肽。肽鏈在2-氯三苯甲基 氯樹脂(Novabiochem)上進(jìn)行組裝。將粗肽通過反相高效液相色譜法在半 制備型氧化硅C-18柱(250mm x 10 mm; Lichrosorb RP-18, Merck)上純 化為同質(zhì)。通過在水中的0.1%的三氟乙酸與在水中的70%的乙腈中的 0.1%的三氟乙酸(體積比)之間形成的線性梯度完成洗脫。在完全酸解之 后，通過氨基酸分析(Dionex自動(dòng)氨基酸分析儀，Sunnyvale,加利福尼亞 州)確定產(chǎn)物的組成。通過質(zhì)譜法(VG Tofspec; Laser Desorption Mass Spectrometry(激光解吸質(zhì)譜法)；Fison Instruments,曼徹斯特，英國)確定 分子量。
肝素UFH和LMWH
商購豬腸肝素(UFH)從Kamada Ltd(Beit Kama,以色列)獲得。低分 子量肝素(Enoxaparin)從Aventis(Strasbourg)購得。
凝血分析 * aPTT——通過將混合的正常血漿與aPTT試劑(FSL肌動(dòng)蛋白，Dade Behring)混合，進(jìn)行樣品的活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPTT)的自動(dòng)確 定，重復(fù)兩次。在恰好10分鐘之后，在SysmexCA1500分析儀上確定凝
血時(shí)間。
* Xa活性-使用LMWH Kit(Chromogenics)，在Sysmex CA1500
分析儀上進(jìn)行抗Xa活性的光度確定，以評價(jià)LMWH在人血漿中的活性。
* PT-使用Innovin試劑(Dade Behring)，在Sysmex CA1500分析
儀上確定凝血酶原時(shí)間(PT)。*蛋白C——通過Berichrom Protein C kit確定蛋白C活性，并通過 顯色Berichrom Antithrombin III kit(皆來自Dade Behring)測量ATIII。
*血小板凝集-利用Payton Aggregocorder型血小板凝集計(jì)
(PaytonAssociates)對正常供體血小板測量血小板凝集。
*蛋白S——使用Liatest kit(Diagnostica Stago)測量游離的蛋白S。 所有凝血分析都受到外部質(zhì)量控制程序(NEQUAS，謝菲爾德，英國)的控 制。
實(shí)施例1
乙酰肝素酶酶原對于凝血功能不具有直接作用
為檢驗(yàn)乙酰肝素酶在凝血過程中的可能作用，本發(fā)明人進(jìn)行了各種 凝血測試，其中包括活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPTT，測試內(nèi)源性凝 血途徑)、凝血酶原時(shí)間(PT，測試外源性凝血途徑)、凝血酶時(shí)間(TT，測 試凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白生成)以及蛋白C和蛋白S(二者都是凝血抑制 劑)。
接下來測試了乙酰肝素酶對由各種介體(例如ADP、膠原、凝血酶) 刺激的血小板凝集的作用。如表1所示，所有這些凝血功能都未受乙酰 肝素酶酶原存在的影響，它們都處在正常范圍內(nèi)。
表1.乙酰肝素酶酶原不直接影響凝血功能
凝血分析，因子確定乙酰肝素酶 (10 pg/ml) *正常范圍/正常值
凝血酶原時(shí)間(PT)10.610.03 12.43 (秒)
活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPTT)29.425 34 (秒)
凝血酶時(shí)間(TT)17.314 21 (秒)
蛋白c活性11175% 151%
蛋白s活性10554% 138%
抗凝血酶III10374% 114%
Xa因子活性102100%
血小板凝集乙酰肝素酶不發(fā)生作用*顯示的是所進(jìn)行的2 4個(gè)實(shí)驗(yàn)中的單個(gè)代表性的實(shí)驗(yàn)。 實(shí)施例2
乙酰肝素酶酶原逆轉(zhuǎn)肝素誘導(dǎo)的aPTT和TT響應(yīng)的縮短 血液凝固響應(yīng)的范圍需要由細(xì)胞表面HSPG所代表的內(nèi)皮的微環(huán)境
38中的抗凝血組分和相關(guān)凝血抑制劑的平衡。血小板在活化時(shí)釋放的乙酰 肝素酶可以起到生理促凝劑的作用。因此，本發(fā)明人在不支持其酶活性 的條件(例如使用無活性的乙酰肝素酶酶原，在中性pH下)下，測試了乙 酰肝素酶對于凝血活性的類肝素介導(dǎo)下調(diào)的作用。兩種凝血分析均受到 了類肝素的影響測量內(nèi)源性凝血途徑的活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間
(aPTT)和測量凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白原向纖維蛋白的轉(zhuǎn)化的凝血酶時(shí)間 (TT)。如圖1所示，在這兩種情況下，肝素都與天然凝血酶抑制劑抗凝 血酶ni(ATIII)和凝血酶形成三元復(fù)合物，導(dǎo)致凝血酶失活。肝素顯著降 低了aPTT和TT響應(yīng)。因此，本發(fā)明人接下來檢測了乙酰肝素酶對肝素 誘導(dǎo)的aPTT和TT縮短的作用。圖2和圖3清楚地證明了，在乙酰肝素 酶酶原的存在下，這些響應(yīng)得到顯著逆轉(zhuǎn)，特別是在低肝素濃度的情況 下。正如所預(yù)期的，肝素和乙酰肝素酶酶原都沒有影響PT響應(yīng)，這表明 內(nèi)源性凝血途徑(未示出)中的肝素/乙酰肝素酶調(diào)節(jié)模式具有特異性。顯 然，復(fù)合物是在肝素和增加凝血酶的抑制作用所必需的ATIII之間形成 的，因此影響了纖維蛋白的產(chǎn)生，這得到圖2所示的結(jié)果所證明，也由 圖1的方案所展示。如圖3所示，在乙酰肝素酶酶原的存在下，該復(fù)合 物受到顯著的干擾。乙酰肝素酶酶原顯著地防止了肝素誘導(dǎo)的凝血酶時(shí) 間(測量凝血酶活性)的延長，因此可以部分破壞肝素的抗凝血酶作用。
乙酰肝素酶酶原通過恢復(fù)體外和使用LMWH治療的人類患者的血 漿中的Xa因子活性來逆轉(zhuǎn)肝素的抗凝血作用
如圖l所示，ATIII活性的另外一種模式是具有活化凝血因子X(Xa) 的抑制復(fù)合物的形成。該因子將聯(lián)合Va因子和凝血酶原，從而在內(nèi)皮上 形成凝血酶原酶復(fù)合物，導(dǎo)致凝血酶生成和隨后的凝塊形成。普通肝素 或低分子量類肝素(LMWH)與AT結(jié)合，并誘導(dǎo)構(gòu)象改變，導(dǎo)致Xa因子 的結(jié)合和Xa因子活性的抑制。
近年來LMWH由于具有的突出的抗凝血活性和與普通肝素相比具 有改善的藥物動(dòng)力學(xué)而廣泛用作抗凝血?jiǎng)?。然而，就緊急的臨床需求而 言，至今仍未有可以抑制這些臨床高度豐富的抗凝劑的解毒劑。這些需求可能出現(xiàn)在因LMWH用藥過量所導(dǎo)致的廣泛性出血(例如腦)或者因其
它醫(yī)學(xué)原因所導(dǎo)致的使用LMWH治療的個(gè)體出血失控的過程中。因此， 本發(fā)明人接下來測量了乙酰肝素酶酶原對類肝素的抗凝血活性的作用。 如所預(yù)期的，低分子量肝素顯著降低了 Xa因子活性(圖4)。然而，雖然 單獨(dú)乙酰肝素酶酶原對FXa活性不具有作用(表l)，但是在AT的存在下， 增加劑量的乙酰肝素酶酶原逆轉(zhuǎn)了肝素的抑制作用，將FXa活性恢復(fù)到 了正常水平(圖4)。在使用普通肝素治療的血漿中也觀察到了乙酰肝素酶 的類似效果(未示出)。
為了評估乙酰肝素酶酶原作為LMWH的解毒劑的可能臨床作用，接 下來測試了乙酰肝素酶對來自使用LMWH治療的患者的血漿中的Xa因 子間接體內(nèi)活性的作用，其中將所述血漿與IO ^g/ml的乙酰肝素酶酶原 溫育。如圖5所示，乙酰肝素酶酶原以劑量依賴性方式，顯著提高了從 12位不同的接受LMWH治療的患者獲得的樣品中的Xa因子活性。因此， 乙酰肝素酶酶原降低了個(gè)體患者血漿樣品中LMWH的FXa抑制作用， 甚至在高水平的LMWH情況下也是如此。總之，接受治療的患者中 LMWH的FXa抑制活性的水平被降低大約50%(圖5B)。
實(shí)施例4
包含殘基Lysl58-Asp17'的肝素結(jié)合域的乙酰肝素酶衍生肽完全逆轉(zhuǎn) 肝素的Xa因子抑制作用
應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，使用乙酰肝素酶酶原(其為非活性形式的乙酰肝素酶) 的結(jié)果清楚地表明了乙酰肝素酶的促凝血活性不能歸因于其酶活性。不 受任何理論的束縛，本發(fā)明人因此推測，無酶活性的乙酰肝素酶仍可結(jié) 合類肝素，并通過其與血漿殘余抗凝血?jiǎng)?例如ATIII)的螯合和/或競爭來 中和它們的抗凝血活性。三種潛在的肝素結(jié)合域得到了鑒定，其中有一 個(gè)位于50-kDa活性乙酰肝素酶亞基的N端。與該區(qū)域(Lys"S-Asp171，也 由SEQIDNO: 1表示)對應(yīng)的肽與肝素和硫酸乙酰肝素物理結(jié)合。此外， 如本發(fā)明人以前所證明的(WO 2005/071070)，這一特定的肽以劑量響應(yīng)的 方式抑制乙酰肝素酶的酶活性，可以推定這通過與硫酸乙酰肝素底物的 競爭來實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明人接下來測試了Lys"S-Aspm(SEQIDNO. 1)
40肝素結(jié)合肽是否能夠消除肝素的Xa因子抑制作用。如圖6所示，
Lys158-Asp171肝素結(jié)合肽(也由SEQ ID NO: 1表示)完全逆轉(zhuǎn)了肝素、 LMWH和UFH的Xa因子抑制作用(圖7)，盡管這是在較高濃度(l mg/ml) 下實(shí)現(xiàn)的，而作為對照的亂序的肽無此效果。
乙酰肝素酶酶原的這些促凝血作用可以在缺乏適當(dāng)?shù)慕舛緞┑那闆r 下用于逆轉(zhuǎn)抗凝血?jiǎng)┑呐R床作用(例如當(dāng)使用LMWH時(shí))，或者可以幫助 對抗出血并發(fā)癥。
權(quán)利要求
1. 一種用于抑制類肝素抗凝血活性的組合物，所述組合物包含作為活性成分的真核內(nèi)切糖苷酶或者所述真核內(nèi)切糖苷酶的包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽，所述組合物可以選擇進(jìn)一步包含藥用可接受的載體、稀釋劑、賦形劑和/或添加劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物用于抑制有需要的對象 的類肝素抗凝血活性。
3. 如權(quán)利要求2所述的組合物，所述組合物用于治療和防止與凝血 相關(guān)的病理性臨床癥狀，其中所述組合物包含作為活性成分的真核內(nèi)切 糖苷酶或者所述真核內(nèi)切糖苷酶的包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變 體、片斷或肽，所述組合物可以選擇進(jìn)一步包含藥用可接受的載體、稀 釋劑、賦形劑和/或添加劑。
4. 如權(quán)利要求1、 2和3任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述真核內(nèi)切 糖苷酶是非活性內(nèi)切糖苷酶或者所述非活性內(nèi)切糖苷酶的包含至少一個(gè) 肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽。
5. 如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述非活性內(nèi)切糖苷酶是65Kd的潛伏形式的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶酶原和缺乏乙酰肝素酶內(nèi)切糖苷酶催 化活性的變異的乙酰肝素酶分子中的任何一種。
6. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述肝素結(jié)合域包含哺乳動(dòng)物 乙酰肝素酶的殘基LyS158-Asp171、 Gln，-Ly嚴(yán)和Lys"'-Arg432中的任何一種的氨基酸序列。
7. 如權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述肽是包含人乙酰肝素酶的 殘基Lys"s-Asp^、殘基Gln，-Lys^和殘基Lys411-Arg432中的任何一種的氨基酸序列的肽。
8. 如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述肽包含由SEQIDNO: 1、 SEQIDNO:4表示的氨基酸序列或者所述由SEQIDNO: 1、 SEQIDNO:4表示的氨基酸序列的任何片斷類似物或衍生物。
9. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述類肝素是肝素、低分子量肝素和普通肝素以及它們的任何功能性片斷中的任何一種。
10. 如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述有需要的對象是患有與 凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的哺乳動(dòng)物對象。
11. 如權(quán)利要求3和IO任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述與凝血相關(guān) 的病理性臨床癥狀是與類肝素的抗凝血作用相關(guān)或由類肝素的抗凝血作 用導(dǎo)致的癥狀。
12. 如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述癥狀是失去控制的出血、 免疫介導(dǎo)性血小板減少癥和手術(shù)前或手術(shù)后癥狀中的任何一種。
13. —種用于抑制有需要的對象的類肝素抗凝血活性的方法，所述 方法包括對所述對象施用抑制有效量的真核內(nèi)切糖苷酶或者所述真核內(nèi) 切糖苷酶的包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽，或者包 含所述真核內(nèi)切糖苷酶、突變體、片斷或肽的任何組合物。
14. 一種用于治療和防止與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的方法，所 述方法包括對有需要的對象施用抑制有效量的真核內(nèi)切糖苷酶或者所述 真核內(nèi)切糖苷酶的包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽， 或者包含所述真核內(nèi)切糖苷酶、突變體、片斷或肽的任何組合物。
15. 如權(quán)利要求13和14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述真核內(nèi)切糖 苷酶是非活性內(nèi)切糖苷酶或者所述非活性內(nèi)切糖苷酶的包含至少一個(gè)肝 素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述非活性內(nèi)切糖苷酶是65Kd的潛伏形式的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶酶原和缺乏乙酰肝素酶內(nèi)切糖苷酶催 化活性的變異的乙酰肝素酶分子中的任何一種。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述肝素結(jié)合域包含人乙酰肝 素酶的殘基LyS158-Asp171、殘基Gln^-Ly嚴(yán)和殘基Lys411-Arg432中任何一 種的氨基酸序列。
18. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述肽是包含人乙酰肝素酶的 殘基Lys"8-Asp^、殘基Gln，-Ly嚴(yán)和殘基Lys411-Arg432中任何一種的氨 基酸序列的肽。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述肽包含由SEQIDNO: 1、SEQ ID NO: 4表示的氨基酸序列或者所述由SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的任何片斷類似物或衍生物。
20. 如權(quán)利要求13和14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述類肝素是肝 素、低分子量肝素和普通肝素以及它們的任何功能性片斷中的任何一種。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述有需要的對象是患有與凝 血相關(guān)的病理性臨床癥狀的哺乳動(dòng)物對象。
22. 如權(quán)利要求14和21任一項(xiàng)所述的方法，其中所述與凝血相關(guān) 的病理性臨床癥狀是與類肝素的抗凝血作用相關(guān)或由類肝素的抗凝血作 用導(dǎo)致的癥狀。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述病理性臨床癥狀是失去控 制的出血和免疫介導(dǎo)性血小板減少癥中的任何一種。
24. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀 的防止包括對需要外科手術(shù)介入的對象在手術(shù)前和/或手術(shù)后施用治療有 效量的真核內(nèi)切糖苷酶或者所述真核內(nèi)切糖苷酶的包含至少一個(gè)肝素結(jié) 合域的任何突變體、片斷或肽，或者任何包含所述真核內(nèi)切糖苷酶、突 變體、片斷或肽的組合物。
25. —種用于抑制類肝素抗凝血活性的方法，所述方法包括如下步驟:(a) 在適當(dāng)?shù)男纬苫旌衔锏臈l件下，使抑制有效量的真核內(nèi)切糖苷酶 或者所述真核內(nèi)切糖苷酶的包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片 斷或肽或者任何包含所述真核內(nèi)切糖苷酶、突變體、片斷或肽的組合物 與所述類肝素接觸；(b) 在適當(dāng)?shù)臈l件下，向步驟(a)中獲得的混合物中加入哺乳動(dòng)物體液 樣品，并經(jīng)歷適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，所述哺乳動(dòng)物體液樣品優(yōu)選為血漿；(c) 通過適當(dāng)?shù)姆椒ú⑴c適當(dāng)?shù)膶φ障啾容^，檢驗(yàn)所述類肝素對所述 樣品的抗凝血活性。
26. 真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變 體、片斷或肽在用于抑制類肝素抗凝血活性的組合物的制備中的應(yīng)用。
27. 如權(quán)利要求26所述的真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素 結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽在用于抑制有需要的對象的類肝素抗凝血活性的組合物的制備中的應(yīng)用。
28. 如權(quán)利要求27所述的真核內(nèi)切糖苷酶或者其包含至少一個(gè)肝素 結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽在用于治療和防止與凝血相關(guān)的病理性 臨床癥狀的組合物的制備中的應(yīng)用。
29. 如權(quán)利要求26、 27和28任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述真核內(nèi) 切糖苷酶是非活性內(nèi)切糖苷酶或者所述非活性內(nèi)切糖苷酶的包含至少一 個(gè)肝素結(jié)合域的任何突變體、片斷或肽。
30. 如權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中所述非活性內(nèi)切糖苷酶是65Kd的潛伏形式的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶酶原和缺乏乙酰肝素酶內(nèi)切糖苷酶催 化活性的變異的乙酰肝素酶分子中的任何一種。
31. 如權(quán)利要求30所述的應(yīng)用，其中所述肝素結(jié)合域包含哺乳動(dòng)物 乙酰肝素酶的殘基LyS158-Asp171、 Gln"0-Lys，和Lys411-Arg432中的任何一 種的氨基酸序列。
32. 如權(quán)利要求31所述的應(yīng)用，其中所述肽是包含哺乳動(dòng)物乙酰肝 素酶的殘基LyS158-Asp171、 Gln，-Ly嚴(yán)和Lys411-Arg432中的任何一種的氨 基酸序列的肽。
33. 如權(quán)利要求32所述的應(yīng)用，其中所述肽包含由SEQIDNO: 1、 SEQ ID NO: 4表示的氨基酸序列或者所述由SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的任何片斷、類似物或衍生物。
34. 如權(quán)利要求26所述的應(yīng)用，其中所述類肝素是肝素、低分子量 肝素和普通肝素以及它們的任何功能性片斷中的任何一種。
35. 如權(quán)利要求27所述的應(yīng)用，其中所述有需要的對象是患有與凝 血相關(guān)的病理性臨床癥狀的哺乳動(dòng)物對象。
36. 如權(quán)利要求28和35任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述與凝血相關(guān) 的病理性臨床癥狀是與類肝素的抗凝血作用相關(guān)或由類肝素的抗凝血作 用導(dǎo)致的癥狀。
37. 如權(quán)利要求36所述的應(yīng)用，其中所述病理性臨床癥狀是失去控 制的出血和免疫介導(dǎo)性血小板減少癥中的任何一種。
38. 如權(quán)利要求28所述的應(yīng)用，其中所述防止與凝血相關(guān)的病理性 臨床癥狀包括對需要外科手術(shù)介入的對象的手術(shù)前和/或手術(shù)后治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過非活性形式的真核內(nèi)切糖苷酶或者所述真核內(nèi)切糖苷酶的包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的任何片斷或肽抑制類肝素抗凝血活性。更具體而言，本發(fā)明通過使用非活性形式的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶或者所述哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶的包含至少一個(gè)肝素結(jié)合域的肽，提供用于抑制類肝素抗凝血活性和治療與凝血相關(guān)的病理性臨床癥狀的組合物和方法。
文檔編號A61K38/43GK101489583SQ200780026153
公開日2009年7月22日 申請日期2007年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月11日
發(fā)明者伊斯拉埃爾·弗洛達(dá)夫斯基, 內(nèi)塔·伊蘭, 弗隆尼亞·利維-亞當(dāng), 本-齊翁·卡茨 申請人:哈達(dá)斯特醫(yī)學(xué)研究服務(wù)與開發(fā)有限公司;特拉維夫索拉斯基醫(yī)療中心醫(yī)療研究基金會(huì)