替換ipq表位的重組蛋白及其編碼核苷酸的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及GPC3-HBsAg重組蛋白及其編碼核苷酸和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷脂酰肌醇蛋白聚糖（glypican)家族是存在于細(xì)胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白 多糖的新家族。迄今已報(bào)告有五種磷脂酰肌醇蛋白聚糖（磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，磷脂酰 肌醇蛋白聚糖2,磷脂酰肌醇蛋白聚糖3,磷脂酰肌醇蛋白聚糖4,和磷脂酰肌醇蛋白聚糖5) 是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成員。該家族的成員有大小均一（約60kDa)的核心蛋白，共 有特異、高度保守的半胱氨酸序列，并通過糖基磷脂酰肌醇（GPI)錨定結(jié)合到細(xì)胞膜上。
[0003] Motomura等人發(fā)現(xiàn)GPC3在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)出GPC3特異性的抗腫瘤免疫，但GPC3 不會在小鼠體內(nèi)導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，具有GPC3特異性的殺傷性T細(xì)胞 (CTL)可以向表達(dá)GPC3的腫瘤組織發(fā)生定向迀移，而不引起自身免疫性的破壞。因此，GPC3 誘導(dǎo)的特異性CTL定向移動(dòng)發(fā)揮抗腫瘤免疫作用可以作為治療HCC及黑色瘤的一種可能手 段。并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)CTL表位可在小鼠體內(nèi)被CTL所識別并誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫，該發(fā) 現(xiàn)對以GPC3為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療有重要的意義。
[0004] HBsAg疫苗與傳統(tǒng)的疫苗相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：1.無需免疫佐劑，即能誘導(dǎo)出高效 而特異的細(xì)胞免疫和體液免疫；2.HBsAg本身不能復(fù)制，也無感染性；3.HBsAg在體外能被 大量擴(kuò)增，并易于濃縮和純化。上述特點(diǎn)表明，HBsAg具有減毒活病毒疫苗的免疫原性，但 無其缺點(diǎn)。以特異性的外源抗原（基因）插入HBsAg或以外源CTL表位替代HBsAg上特 異性的內(nèi)源CTL表位能否在體內(nèi)誘導(dǎo)出高效而特異的細(xì)胞免疫，越來越成為疫苗研究的熱 點(diǎn)?，F(xiàn)已證明，在保留其有效的包裝蛋白表位基礎(chǔ)上，在HBsAg基因開放性閱讀框架（open reading frame，0RF)上定位突變掉內(nèi)源性CTL表位并建立核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，構(gòu)建好 的重組質(zhì)粒允許插入一個(gè)或多個(gè)外源表位，在保留HBsAg部分生物學(xué)和免疫學(xué)特性的基礎(chǔ) 上，還能保證外源性表位具有免疫活性。
[0005] 非專利文獻(xiàn)王文敬等，GPC-3CTL表位表達(dá)載體構(gòu)建，南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009， 29 (8)，1548-1550 ;公開了 一種構(gòu)建編碼GPC3-HBsAg重組蛋白表達(dá)載體，其采用GPC3的 CTL表位分別替換HBsAg中的FLG、LLD和SIL表位而獲得表達(dá)載體，并具有一定免疫原性。 但是，本領(lǐng)域中HBsAg存在多個(gè)CTL表位，替換的表位不同，免疫原性相差較大，因此選擇合 適的HBsAg的CTL表位用于替換，對獲得的重組蛋白的免疫原性具有決定性的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一方面是提供一種GPC3_HBsAg重組蛋白，其以重組的乙肝表面抗原 (HBsAg)為分子骨架，利用外源CTL表位替換HBsAg內(nèi)源性CTL表位；所述其他外源CTL表 位為GPC3的CTL表位。
[0007] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在所述重組的乙肝表面抗原（HBsAg)中，一個(gè)、 二個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)HBsAg內(nèi)源性CTL表位被一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)GPC3的CTL表位所 替換。
[0008] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組的乙肝表面抗原（HBsAg)的氨基酸序列 如SEQ ID NO :1所示；在所述SEQ ID NO :1序列中，HBsAg內(nèi)源性CTL表位相應(yīng)地被GPC3 CTL表位所替換。
[0009] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼JffisAg內(nèi)源性CTL表位選自下表中的一 個(gè)、二個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)表位，具體如表1所示：
[0010] 表1 HBsAg蛋白中內(nèi)源性CTL表位
[0011]
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HBsAg內(nèi)源性CTL表位選自包含IPQ表 位的一個(gè)或更多個(gè)表位，進(jìn)一步地所述HBsAg內(nèi)源性CTL表位選自IPQ以及FLL、LLC、LLD、 LLV、SIL和/或LLP表位中的一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)表位。
[0013] 所述GPC3 CTL表位選自下表中一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)表位，具體如表2所不：
[0014]表 2 GPC3 CTL 表位
[0015]

[0016] 在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述GPC3 CTL表位選自EHLSLEEL、 FFQRLQPGL、FYSALPGH 和 / 或 IYDMENVLL 中一個(gè)或多個(gè)表位。
[0017] 在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組蛋白序列如SEQ ID NO :2所示，其 為采用GPC3 CTL表位EHLSLEEL替換HBsAg內(nèi)源性CLT表位IPQ、LLD和SIL得到的重組 蛋白。
[0018] 在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組蛋白序列如SEQ ID NO :3所示，其 為采用GPC3 CTL表位EHLSLEEL替換HBsAg內(nèi)源性CLT表位IPQ和LLD得到的重組蛋白。
[0019] 在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組蛋白序列如SEQ ID NO :4所示，其 為采用GPC3 CTL表位EYILSLEEL替換HBsAg內(nèi)源性CLT表位IPQ和SIL得到的重組蛋白。
[0020] 在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組蛋白序列如SEQ ID NO :5所示，其 為采用GPC3 CTL表位EYILSLEEL替換HBsAg內(nèi)源性CLT表位IPQ得到的重組蛋白。
[0021 ] 本發(fā)明的第二方面是提供編碼上述重組蛋白的核苷酸序列。在本領(lǐng)域中，根據(jù)上 述重組蛋白的氨基酸序列而獲得編碼核苷酸序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如，根據(jù)密 碼子規(guī)則獲得編碼上述重組蛋白的RNA或DNA序列，例如，編碼SEQ ID NO :1氨基酸序列的 核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示。
[0022] 本發(fā)明的第三方面是所述重組蛋白在制備腫瘤疫苗中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的第四方面是所述重組蛋白在制備治療/預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明中所述腫瘤的種類沒有特別限定，優(yōu)選為表達(dá)GPC3的腫瘤，具體選自，包 括但不限于食道癌、乳癌、甲狀腺癌、直腸癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤（黑素瘤）、惡性淋巴 瘤、骨肉瘤、成嗜鉻細(xì)胞瘤、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、腦瘤、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性 白血病、腎癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、睪丸癌、甲狀腺癌、膀胱癌或肉瘤等。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面將舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保護(hù)的技 術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求 書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0026] 下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南（Sambrook J，et al. 2008. Molecular Cloning :A Laboratory Manual，3rd Ed.)中 所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件來進(jìn)行。
[0027] 實(shí)施例1重組HBsAg載體質(zhì)粒的構(gòu)建
[0028] 根據(jù)基因工程技術(shù)，采用PCR定位突變技術(shù)對HBsAg基因進(jìn)行改造，從而獲得一段 改良的HBsAg基因片段，其序列如SEQ ID NO :6所示，其編碼的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。然后，將上述HBsAg基因片段插入pcDNA3. 1+質(zhì)粒中，從而獲得重組HBsAg載 體質(zhì)粒。
[0029] 上述HBsAg基因片段也可以通過合成獲得，并通過PCR技術(shù)進(jìn)行大量擴(kuò)增。
[0030] 實(shí)施例2編碼重組蛋白的DNA分子及表達(dá)載體的構(gòu)建
[0031] (I)SOEing PCR 擴(kuò)增
[0032] 按照非專利文獻(xiàn)王文敬等，GPC-3 CTL表位表達(dá)載體構(gòu)建，南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009, 29 (8)，1548-1550公開的方法；以構(gòu)建好的重組HBsAg質(zhì)粒為模板，進(jìn)行SOEing PCR 擴(kuò)增。
[0033] PCR 反應(yīng)體系：CldH2O 21yl，5XPCR Buffer 8yl，dNTPs(10mmol/L)lyl，模板 DNAl y I (IOOng)，引物組（每個(gè)引物對的濃度為IOy mol/L) 4 y I，Elongase Iy I。反應(yīng)條 件