專利名稱：：內(nèi)包生理活性多肽或蛋白質(zhì)的高分子聚合物膠束及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種含有高含量的生理活性多肽或蛋白質(zhì)的、可向生物體給藥的、在生物體中穩(wěn)定的高分子膠束及其制造方法。
背景技術(shù)：
：由于基因操作技術(shù)的進(jìn)步，用細(xì)胞培養(yǎng)法能夠使許多生理活性多肽及蛋白質(zhì)獲得穩(wěn)定提供，應(yīng)用于疾病治療及預(yù)防。然而，由于這些多肽在生物體內(nèi)一般非常迅速地受到酶分解、代謝等的作用，因此其半衰期較短，作為藥劑進(jìn)行給藥時(shí)，經(jīng)常達(dá)不到充分的效果。為解決此問題，迄今為止人們進(jìn)行了許多高分子修飾及緩釋性制劑等的研究。例如，目前臨床使用的高分子修飾技術(shù)，可以例舉聚乙二醇(PEG)化。在干擾素等方面，在某種程度上可以延長其在生物體內(nèi)的半衰期、提高效果的持續(xù)性。給藥次數(shù)的減少實(shí)際上減輕了患者的負(fù)擔(dān)，但是這些高分子修飾蛋白質(zhì)，一般由于修飾導(dǎo)致其活性降低，產(chǎn)生難以很好地控制修飾部位及修飾率再現(xiàn)性的問題。其次，目前微膠囊作為緩釋化技術(shù)被應(yīng)用于臨床。這一技術(shù)是將在生物體內(nèi)分解的聚乳酸或聚乳酸乙醇酸共聚物作為基料使用，通過將藥物密封于微粒子內(nèi)，可以達(dá)到緩釋效果。然而，粒子直徑一般為微米級(jí)，不適合靜脈內(nèi)給藥。將這些微膠囊的粒子直徑減小到納米尺寸，又有報(bào)告表明由于表面修飾而抑制了靜脈內(nèi)給藥后的肝臟及脾臟的細(xì)網(wǎng)內(nèi)皮系的攝取(Adv.DrugDeliv.Rev.il.31-48(1995))?？墒怯蛇@些方法所得到的粒子直徑至少是數(shù)百納米(Int.J.Pharm.149.43-49(1997))，且表面修飾很費(fèi)工夫，具有難以很好地控制臟器分布的再現(xiàn)性的問題。使用磷脂質(zhì)的脂質(zhì)體，也是目前臨床上應(yīng)用的緩釋性技術(shù)的例子(Pharm.Tech.Japan12,99-110(2003))。脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)是，磷脂質(zhì)是生物體成分，故而其毒性及抗原性低，通過改變脂質(zhì)組成，可以密封水溶性藥物、脂溶性藥物、高分子、蛋白質(zhì)、核酸等許多生理活性物質(zhì)。然而，這些脂質(zhì)體的藥物保持率未必足夠。即，單位脂質(zhì)體藥劑中可密封的藥物量不足，目前期望能開發(fā)出效率更好的方法。加之，其在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性不足，難以進(jìn)行工業(yè)化制造等的問題還沒有完全得到解決。為解決這些問題，作為目前臨床上正在研究的緩釋性技術(shù)，可以列舉高分子膠束(Br.丄Cancer21.678-697(2005);Br.J.Cancer1240-1246(2005))。高分子膠束可以使用親水性高分子和疏水性高分子構(gòu)成的嵌段共聚物制造。由于高分子膠束在水中一般形成以疏水性鏈段為核心的膠束，所以其相比于脂溶性藥物的內(nèi)包化、可溶化及緩釋化，具有優(yōu)越的性質(zhì)(日本專利第2777530號(hào)公報(bào))。為使這樣的高分子膠束適應(yīng)于水溶性藥物的內(nèi)包化及緩釋化，人們進(jìn)行了各種研究。例如，在將水溶性的化合物阿霉素封入于高分子膠束的方面，提出了通過使藥物化學(xué)性地結(jié)合于疏水性高分子的側(cè)鏈上來達(dá)到封入的方法(日本專利第2694923號(hào)公報(bào))。并且，作為另一種方法，公開了對于具有電荷性性質(zhì)的藥物，例如對于帶正電的堿性多肽等，在嵌段共聚物中的疏水性鏈段的側(cè)鏈上導(dǎo)入帶負(fù)電的官能團(tuán)(日本專利第2690276號(hào)公報(bào))；或者通過使具有聚乳酸或聚乳酸乙醇酸等的羰基的生物分解性高分子共存(WO2005/023230)，通過在高分子膠束和多肽二者之間導(dǎo)入靜電相互作用，以達(dá)到高效率封入的方法。然而，其不能應(yīng)用于分子量大的水溶性藥物，尤其是蛋白質(zhì)及多肽。上述日本專利第2690276號(hào)公報(bào)在其實(shí)施方式中，盡管給出了了將蛋白質(zhì)內(nèi)包于膠束的例子，但是可以認(rèn)為，其膠束不具有疏水性部分，只以電荷作用形式形成，膠束自身的穩(wěn)定性弱，實(shí)際上其在對生物體內(nèi)給藥的情況下會(huì)立即被破壞。作為內(nèi)包高分子電解質(zhì)的膠束的穩(wěn)定性方法，在由包含親水性鏈段及電荷性鏈段的嵌段共聚物與高分子電解質(zhì)一起形成的核殼結(jié)構(gòu)的聚離子復(fù)合膠束方面，公開了其穩(wěn)定化方法，即，至少將一個(gè)巰基擔(dān)載在形成核心部的電荷性鏈段上，該電荷性鏈段之間通過在它們所擔(dān)載的巰基所形成的二硫鍵的架橋穩(wěn)定作用而實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定化(日本專利特開2001-146556號(hào)公報(bào))。但是，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，由于靜脈內(nèi)注射給藥后的稀釋作用及與血清蛋白質(zhì)之間的相互作用，使得膠束分解，并可預(yù)測其與在分子內(nèi)具有SS鍵的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生相互作用，這會(huì)引起了該蛋白質(zhì)的失活及膠束的不穩(wěn)定化，因此該方法不適用于廣泛的蛋白質(zhì)及多肽。如上所述，為提高通過生理活性多肽及蛋白質(zhì)的治療效果，有必要對生理活性多肽及蛋白質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定高效地內(nèi)包，并使高分子膠束能夠在控制速度下游離。目前還未能得到免疫應(yīng)答輕微、可應(yīng)用于廣泛的生理活性多肽及蛋白質(zhì)上的方法。再者，迄今為止提出的如下列舉的技術(shù)是為了提高生理活性多肽及蛋白質(zhì)的治療效果而進(jìn)行的滿足上述要求的嘗試，結(jié)果并沒有全部成功。(a)日本特表2004-525939號(hào)公報(bào)，涉及以聚氨基酸的嵌段和聚乙二醇(PEG)之類的聚烯基乙二醇型的親水聚合物的嵌段作為基料的納米粒子的膠體懸浮液。由于藥物(蛋白質(zhì)和多肽)的納米粒子化是基于對藥物納米粒子的吸附，所以在納米粒子表面存在著蛋白質(zhì)及多肽。即，可以認(rèn)為在生物體內(nèi)，由于消化酶等的攻擊，納米粒子表面的蛋白質(zhì)等會(huì)較快地分解、失活。加之，考慮到由于內(nèi)包的蛋白質(zhì)及多肽的等電點(diǎn)，未必形成納米粒子，因此可以認(rèn)為游離會(huì)以較快速度發(fā)生，達(dá)不到持續(xù)性的效果。(b)歐洲專利公報(bào)EP1084172B1號(hào)涉及在膽固醇存在下，使用了棕櫚酰聚L-賴氨酸聚乙二醇及棕櫚酰聚L-鳥氨酸聚乙二醇的尤其是核酸的輸送。該技術(shù)所得到的微粒子的粒子直徑最小也為數(shù)百納米，在靜脈內(nèi)給藥后快速集積于細(xì)網(wǎng)內(nèi)皮系上，所以，難以達(dá)到持續(xù)性的效果。(c)日本特開平11-269097號(hào)公報(bào)涉及一種用具有以生物體內(nèi)分解性聚合物為疏水性鏈段的、以聚氨基酸為親水性鏈段的嵌段共聚物作為基料的、具有臟器指向性及緩釋效果等功能的微粒子。其特征為親水性鏈段使用的是具有生物體內(nèi)分解性的聚氨基酸，但是可以預(yù)測到其與聚乙二醇相比，免疫原性高，在靜脈內(nèi)給藥后與血清蛋白質(zhì)的相互作用也會(huì)增加。該7微粒子的血中滯留性也縮短，不能達(dá)到長時(shí)間的效果。(d)美國專利第6090925號(hào)公開了一種對于欲進(jìn)行內(nèi)包的低分子化合物和多肽的水溶液，添加聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮的醋酸或磷酸等緩沖液，使其與具有接近該緩沖液pH的等電點(diǎn)的血清白蛋白等高分子共存，通過加熱-冷卻過程而形成微顆粒的方法。由于包含70。C左右的加熱過程，可以認(rèn)為其難以適用于熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)等。
發(fā)明內(nèi)容生理活性多肽及蛋白質(zhì)不限于堿性，例如干擾素a、G-CSF、胰島素等，也存在許多等電點(diǎn)為弱酸性至中性的。至今還沒有得到可應(yīng)用于這樣廣泛的生理活性蛋白質(zhì)及多肽類的、可穩(wěn)定高效地內(nèi)包的、且能夠在控制速度下游離的高分子膠束組合物。本發(fā)明的目的在于提供滿足這樣要求的嵌段聚合物組合物及其制造方法。本發(fā)明人鑒于上述現(xiàn)狀，進(jìn)行了銳意研究。通過應(yīng)用具有由聚乙二醇構(gòu)成的親水性鏈段和由從酸性氨基酸、其疏水性衍生物以及酸性氨基酸與其疏水性衍生物的混合物中選出的聚氨基酸構(gòu)成的疏水性鏈段的嵌段共聚物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了將生理活性多肽及蛋白質(zhì)高效率地內(nèi)包于高分子膠束中的方法。進(jìn)而，考慮到生理活性多肽及蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，對制備高分子膠束時(shí)的pH進(jìn)行調(diào)整，成功實(shí)現(xiàn)了更為高效的內(nèi)包。而且，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)此方法不限于酸性或堿性，還可適用于許多生理活性多肽及蛋白質(zhì)，通過替換所使用的嵌段共聚物，并通過調(diào)節(jié)其疏水性鏈段和多肽或蛋白質(zhì)的疏水性相互作用，能調(diào)整藥物的內(nèi)包率以及釋放速度，尤其是發(fā)現(xiàn)了嵌段共聚物中的疏水性側(cè)鏈的構(gòu)造對藥物游離速度起到相當(dāng)大的影響作用，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明申請包含以下實(shí)施方式。1.一種內(nèi)包蛋白質(zhì)或多肽的、由具有由聚乙二醇構(gòu)成的親水性鏈段和由從酸性氨基酸、其疏水性衍生物以及酸性氨基酸與其疏水性衍生物的混8合物組成的群組中選出的聚氨基酸構(gòu)成的疏水性鏈段的嵌段共聚物所構(gòu)成的高分子膠束組合物。2.根據(jù)1所述的組合物，上述酸性氨基酸的疏水性衍生物為酸性氨基酸烷基酯或酸性氨基酸垸基酰胺。3.根據(jù)l所述的組合物，上述酸性氨基酸為天冬氨酸或谷氨酸。4.根據(jù)1所述的組合物，其嵌段共聚物為下式(I)或(II)所記載的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>上述各式中Ri及R3各自獨(dú)立，表示氫原子或可被保護(hù)的官能團(tuán)被置換的或者未被置換的低級(jí)垸基；R2表示氫原子、飽和或不飽和的C廣C29脂肪族羰基或者芳香族羰基；R4表示羥基、飽和或不飽和的C廣C3o脂肪族氧基或者芳香族-低級(jí)垸氧基；Rs表示-O-或者-NH-;&表示氫原子、苯基、-(CH2)4-苯基、未置換或者被氨基或羧基置換了的C4d6垸基、或芐基；R7表示亞甲基，n為102500的整數(shù)，x為10300的整數(shù)，m為0300的整數(shù)(但是，m存在時(shí)，(COCHNH)的單元和(COR7CHNH)的單元是隨機(jī)存在的；&可以是在一個(gè)嵌段共聚物內(nèi)的各氨基酸單元中的任意選擇，是隨機(jī)存在的，但R6是氫原子的情況為R6全體的60y。以下)，y表示1或2的整數(shù)，Li表示從由-NH-、-0-、-0_Z-NH-、-CO-、_CH2-、-O-Z-S-Z-及-OCO-Z-NH-(此處，Z是獨(dú)立的C廣C6烯基。)組成的群組中選出的連結(jié)基，L2表示從-OCO-Z-CO-及-NHCO-Z-CO-(此處，Z為CC6烯基)中選出的連結(jié)基。5.根據(jù)4所述的組合物，上述嵌段共聚物的聚氨基酸側(cè)鏈的酯化或酰胺化率為40100%。6.根據(jù)15中任意一項(xiàng)所述的組合物，上述蛋白質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)(pl)為31L5。7.根據(jù)16中任意一項(xiàng)所述的高分子膠束組合物的制備方法，其包含將上述嵌段共聚物和上述生理活性多肽或蛋白質(zhì)混合，通過將該混合液的pH調(diào)整為與該生理活性蛋白質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)(pl)不同的pH，使該生理活性蛋白質(zhì)或多肽內(nèi)包于由該嵌段共聚物構(gòu)成的膠束的疏水性核中的工序；此處，該生理活性多肽或蛋白質(zhì)的pl，該嵌段共聚物的疏水性鏈段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的等電點(diǎn)(pl')以及與上述pl不同的pH的關(guān)系為pI〉pH〉p1，，所以在該pH下，該嵌段共聚物的疏水性鏈段帶負(fù)電，且該生理活性多肽或蛋白質(zhì)帶正電。8.根據(jù)7所述的方法，上述pH與上述水溶性高分子藥物的pl相離1以上。根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)⑸砘钚远嚯囊约暗鞍踪|(zhì)之類的高分子量的藥物高效地內(nèi)包于高分子膠束內(nèi)，而且具有能調(diào)節(jié)其游離速度的優(yōu)點(diǎn)。圖1表示從各種IgG內(nèi)包高分子膠束游離出來的IgG的游離率的經(jīng)時(shí)變化。圖2表示各種干擾素(X內(nèi)包高分子膠束在給藥于生物體內(nèi)后的干擾素a的血漿中濃度的經(jīng)時(shí)變化。圖3表示FITC標(biāo)記溶菌酶內(nèi)包高分子膠束或FITC標(biāo)記溶菌酶溶液在靜脈內(nèi)給藥于大鼠后的血漿中濃度的經(jīng)時(shí)變化。圖4表示干擾素cx內(nèi)包高分子膠束或干擾素a溶液在靜脈內(nèi)給藥于大鼠后的血漿中濃度的經(jīng)時(shí)變化。圖5表示干擾素a內(nèi)包高分子膠束或干擾素cx溶液在靜脈內(nèi)給藥于大鼠后的血漿中濃度的經(jīng)時(shí)變化。圖6表示人粒性白細(xì)胞集落刺激因子內(nèi)包高分子膠束或人粒性白細(xì)胞集落刺激因子溶液在靜脈內(nèi)給藥于大鼠后的血漿中濃度的經(jīng)時(shí)變化。圖7表示人粒性白細(xì)胞集落刺激因子內(nèi)包高分子膠束或人粒性白細(xì)胞集落剌激因子溶液在靜脈內(nèi)給藥于大鼠后的血漿中濃度的經(jīng)時(shí)變化。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施方式為用具有由聚乙二醇構(gòu)成的親水性鏈段和由從酸性氮基酸、其疏水性衍生物以及酸性氨基酸與其疏水性衍生物的混合物組成的群組中選出的聚氨基酸構(gòu)成的疏水性鏈段的嵌段共聚物，能高效地將生理活性多肽和蛋白質(zhì)內(nèi)包于高分子膠束中。本發(fā)明的其它較佳實(shí)施方式為根據(jù)欲內(nèi)包的生理活性多肽及蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pl)，通過調(diào)整制備高分子時(shí)的pH，可以使生理活性多肽及蛋白質(zhì)更高效地內(nèi)包于由形成高分子膠束的嵌段共聚物構(gòu)成的該膠束的疏水性核中。為使生理活性多肽及蛋白質(zhì)更高效地內(nèi)包于聚合物膠束內(nèi)，最好將高分子膠束制備時(shí)的pH調(diào)整為與生理活性多肽及蛋白質(zhì)的pl不同的值。高分子膠束的制備時(shí)的pH，只要不使生理活性多肽及蛋白質(zhì)發(fā)生變性，最好相離于該生理活性多肽及蛋白質(zhì)的pl，具體而言最好相離1以上。并且，為使生理活性多肽及蛋白質(zhì)更高效地進(jìn)行內(nèi)包，在高分子膠束制備時(shí)的pH下，最好是嵌段共聚物的疏水性鏈段、即形成聚合膠束的核的部分和生理活性多肽與蛋白質(zhì)之間帶相反的電荷。例如，在高分子膠束制備時(shí)的pH下，當(dāng)生理活性多肽及蛋白質(zhì)帶正電荷時(shí)，嵌段共聚物的疏水性鏈段最好帶負(fù)電荷；當(dāng)生理性多肽及蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷時(shí)，嵌段共聚物的疏水性鏈段最好帶正電荷。在這樣的較佳狀態(tài)下，例如，生理活性多肽及蛋白質(zhì)的pl、嵌段共聚物的疏水性鏈段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的等電點(diǎn)(pl')以及高分子膠束制備時(shí)的pH的關(guān)系為pl〉pH>pl，的時(shí)候，在該pH條件下，嵌段共聚物的疏水性鏈段帶負(fù)電，且該生理活性多肽及蛋白質(zhì)帶正電。再者，酸性氨基酸的天冬氨酸、谷胺酸的等電點(diǎn)分別為2.77和3.22。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施方式，如果能夠特定生理活性多肽及蛋白質(zhì)的pl，就可以適宜地選定符合上述條件的嵌段共聚物的疏水性鏈段及決定高分子膠束制備時(shí)的pH，能夠適用于具有廣范圍的pl的各種生理活性多肽及蛋白質(zhì)。例如，當(dāng)欲內(nèi)包pl為堿性側(cè)的生理活性多肽及蛋白質(zhì)時(shí)，選定疏水性鏈段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的pl'為相比于該pl的酸性側(cè)的嵌段共聚物，進(jìn)而適宜地選定在該pl和pl'值之間的pH，通過在該pH下進(jìn)行膠束形成，從而可高效地進(jìn)行內(nèi)包。反之，當(dāng)欲內(nèi)包藥物的pl在酸性側(cè)的時(shí)，選定上述pl'為相比于該pl在更酸性側(cè)或更堿性側(cè)的嵌段共聚物，進(jìn)而適宜地選定在該pl值和pl'值之間的pH，通過在該pH下進(jìn)行膠束形成，即可高效地進(jìn)行內(nèi)包。本發(fā)明的嵌段共聚物的疏水性鏈段的pH最好在中性區(qū)域，例如在pH58的范圍中具有帶負(fù)電的官能團(tuán)。通過利用這樣的嵌段共聚物，膠束形成時(shí)的pH就可選定中性區(qū)的pH，就可以避免在極端的酸性或堿性條件下處理欲內(nèi)包的生理活性多肽及蛋白質(zhì)。12在考慮高分子膠束制備時(shí)的pH、生理活性多肽及蛋白質(zhì)的pi以及疏水性鏈段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的pl'時(shí)，生理活性多肽及蛋白質(zhì)向高分子膠束的內(nèi)包是通過準(zhǔn)備形成高分子膠束的嵌段共聚物和欲內(nèi)包的生理活性多肽及蛋白質(zhì)的水性混合物，然后如上所述根據(jù)該藥物的pl及嵌段共聚物的疏水性鏈段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的pl'適當(dāng)?shù)剡x定該混合物的pH，便能進(jìn)行該混合物的pH的調(diào)整。在一個(gè)較佳的實(shí)施方式中，將嵌段共聚物溶解于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中，例如，二氯甲烷、氯仿、乙醚、二丁醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯等非水溶性有機(jī)溶劑，甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、乙腈、丙酮、四氯呋喃等水溶性有機(jī)溶劑或它們的混合溶劑中。任意地，將該溶劑風(fēng)干，例如在氮?dú)饬鳝h(huán)境下干固成膜狀，此外，必要時(shí)可通過減壓干固除去有機(jī)溶劑。向這樣處理后的嵌段共聚物中，添加、混合所要內(nèi)包的水溶性高分子藥物的水溶液。最后慢慢地將混合液的pH調(diào)整到所要的pH，在形成高分子膠束的同時(shí)將生理活性多肽及蛋白質(zhì)內(nèi)包。高分子膠束的形成，例如，可通過攪拌上述嵌段共聚物和生理活性多肽及蛋白質(zhì)的混合液進(jìn)行。高分子膠束的形成最好為施加如超聲波那樣的能量來進(jìn)行。在使用超聲波時(shí)，例如使用BIODISRUPTOR(日本精機(jī))，可以在4檔位，冷凍的同時(shí)進(jìn)行。照射時(shí)間只要使生理活性多肽及蛋白質(zhì)不變性，就沒有特別限制，通過間歇為l秒、5秒10分鐘、最好5秒2分鐘的照射即可。另外，在另一個(gè)較佳的實(shí)施方式中，通過研缽等將干燥狀態(tài)的嵌段共聚物制成均一的粉體，向該粉體中添加粉末狀的生理活性多肽及蛋白質(zhì)或添加溶解于少量溶液的生理活性多肽及蛋白質(zhì)后，進(jìn)行平穩(wěn)地混合，添加適宜的緩沖液，攪拌2小時(shí)到24小時(shí)，通過超聲波處理即可。進(jìn)一步，在其它實(shí)施方式中，在最初制備了空膠束后，只通過添加生理活性多肽及蛋白質(zhì)后進(jìn)行攪拌或靜置，就可以制備成內(nèi)包生理活性多肽及蛋白質(zhì)的高分子膠束。具體而言，向嵌段共聚物中添加適宜的緩沖液，13如上所述進(jìn)行超聲波處理制備出空膠束，向其中添加溶解于同種緩沖液的生理活性多肽及蛋白質(zhì)或添加稀釋于該緩沖液的生理活性多肽及蛋白質(zhì)，通過用攪拌器平穩(wěn)地?cái)嚢杌蜢o置即可進(jìn)行。此時(shí)的攪拌時(shí)間和靜置時(shí)間最好為2小時(shí)到24小時(shí)，溫度為4"C到3(TC，尤其是最好為4"C。該方法由于無需用超聲波處理生理活性多肽及蛋白質(zhì)即可，從生理活性多肽及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的觀點(diǎn)考慮是有利的。任何情況下的適宜的緩沖液，最好都滿足上述的pI和pH的關(guān)系。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以高效地內(nèi)包于聚合膠束中的生理活性多肽及蛋白質(zhì)沒有特別限制，優(yōu)選為水溶性的，分子量為1，500以上，最好為2，000以上的生理活性多肽及蛋白質(zhì)。作為生理活性多肽及蛋白質(zhì)的例子，可以列舉干擾素ou(3、Y、促紅細(xì)胞生成素、G-CSF、生長激素、白細(xì)胞介素類、腫瘤壞死因子、粒性白細(xì)胞，巨噬細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、肝細(xì)胞增殖因子、TGF-p超家族、EGF、FGF、IGF-I等。并且，只要不損壞其活性，當(dāng)然就包含列舉的上述蛋白質(zhì)的衍生物，例如一個(gè)以上的氨基酸被置換、添加、消除了的衍生物。生理活性多肽及蛋白質(zhì)，尤其在基因重組生產(chǎn)的情況下，由于糖鏈的有無及高階結(jié)構(gòu)的差異，即使是同種蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)也不同。因此，考慮到高分子膠束的制備時(shí)的pH、生理活性多肽及蛋白質(zhì)的pl以及疏水性鏈段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的pl',在制備高分子膠束的時(shí)候，最好根據(jù)等電點(diǎn)電泳等求得所要內(nèi)包的蛋白質(zhì)等的等電點(diǎn)后，再?zèng)Q定內(nèi)包時(shí)的pH。為膠束化而使用的生理活性多肽及蛋白質(zhì)的量沒有特別限制，一般而言相對于嵌段共聚物的水溶性高分子藥物的重量可使用0.0150%重量、最好使用0.110%重量。可用于形成本發(fā)明的內(nèi)包藥物的聚合物膠束的聚合物是由由聚乙二醇構(gòu)成的親水性鏈段和由從酸性氨基酸、其疏水性衍生物以及酸性氨基酸與其疏水性衍生物的混合物中選出的聚氨基酸構(gòu)成的疏水性鏈段所構(gòu)成的嵌段共聚物。作為一個(gè)實(shí)施方式，可以列舉具有帶電荷的官能團(tuán)的疏水性鏈段。所謂的"具有帶電荷的官能團(tuán)的疏水性鏈段"是指，為形成由嵌段共聚物構(gòu)成的聚合物膠束的核，該鏈段整體具有必要的疏水性，其疏水性起因于隨機(jī)存在于其鏈段內(nèi)的該疏水性部分，并且在其鏈段內(nèi)也存在具有負(fù)電荷的區(qū)域。本發(fā)明的嵌段共聚物的疏水性鏈段，通過疏水性相互作用，可以穩(wěn)固地保持住所要內(nèi)包的高分子藥物，在疏水性鏈段具有電荷的情況下，通過靜電的相互作用也可以保持住高分子藥物。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了通過嵌段共聚物的疏水性鏈段中的疏水基的構(gòu)造，控制被內(nèi)包的生理活性多肽及蛋白質(zhì)和嵌段共聚物的疏水性相互作用，可以調(diào)節(jié)釋放速度。并非特別拘泥于理論，如以后的實(shí)施方式所實(shí)證的那樣，向形成膠束的嵌段共聚物的疏水性段中導(dǎo)入的疏水基，在具有垸基那樣的線性構(gòu)造的時(shí)侯，相比于具有芐基及苯乙酸那樣的平面構(gòu)造的時(shí)候，能夠更好地將生理活性多肽及蛋白質(zhì)保持于膠束核內(nèi)，因此可使其進(jìn)行長時(shí)間的緩釋。換言之，通過調(diào)節(jié)向嵌段共聚物的疏水性段中導(dǎo)入的疏水基的構(gòu)造，可以改變生理活性多肽及蛋白質(zhì)的釋放速度。例如，想調(diào)快藥物的釋出速度時(shí)，即可提高具有芐基及苯乙酸那樣的平面構(gòu)造的疏水基的導(dǎo)入率；想調(diào)慢藥物的釋出速度時(shí)，即可提高具有垸基那樣的線性構(gòu)造的疏水基的導(dǎo)入率。進(jìn)而，如果希望中間性的釋出速度，可以通過改變具有芐基及苯乙酸那樣的平面構(gòu)造的疏水基和具有烷基那樣的線性構(gòu)造的疏水基的導(dǎo)入率的比例，適宜地調(diào)節(jié)釋出速度。對于本發(fā)明有用的嵌段共聚物的具體例中包含如下情況。雖然并非特別限定，親水性鏈段由聚乙二醇(或聚環(huán)氧乙烷)構(gòu)成，可任意含有多糖、聚乙烯基吡咯垸酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚氨基酸或它們的衍生物來由的鏈段。此處，多糖可列舉出普魯蘭多糖、葡聚糖、果聚糖、半乳聚糖等。另一方面，作為整體，疏水性鏈段可列舉出酸性氨基酸，特別是聚天冬氨酸及/或其衍生物、聚谷氨酸及/或其衍生物。具體而言，雖然并非限定，可列舉出例如聚(天冬氨酸e-芐酯)、聚(天冬氨酸P-節(jié)酯-共-天冬氨酸)、聚(天冬氨酸P-垸酯)、聚(天冬氨酸3-垸酯-共-天冬氨酸)、聚(天冬氨酸e-烯丙酯)、聚(天冬氨酸e-烯丙酯-共-天冬氨酸)、聚(天冬氨酸e-烯丙酯)、聚(天冬氨酸e-芳垸酯-共-天冬氨酸)、聚(天冬氨酸P-芳垸酯)、聚(谷氨酸Y-芐酯)、聚(谷氨酸，芐酯-共-谷氨酸)、聚(谷氨酸Y-烷酯)、聚(谷氨酸Y-烷酯-共-谷氨酸)、聚(谷氨酸Y-芳烷酯)、聚(谷氨酸Y-芳垸酯-共-谷氨酸)、聚(天冬酰胺P-烷酯-共-天冬氨酸)、聚(谷酰胺Y-芳烷酯-共-谷氨酸)等聚(酸性氨基酸衍生物)。疏水性鏈段具有疏水性側(cè)鏈，因此具有疏水性。相關(guān)的疏水性側(cè)鏈的例子有芐基、苯基、垸基，可列舉出例如未置換或被氨基或羧基置換的C4d6烷基、-(CH2)4-苯基以及它們的任意組合。如上述，由于通過調(diào)節(jié)聚(氨基酸衍生物)鏈段中導(dǎo)入的疏水性側(cè)鏈的構(gòu)造能夠調(diào)節(jié)內(nèi)包藥物的游離速度，因此在需要較高的游離速度時(shí)，疏水性側(cè)鏈最好選擇苯基或芐基;而當(dāng)需要較慢的游離速度時(shí)，疏水性側(cè)鏈最好選擇烷基，例如C4C16院基o這樣的聚(氨基酸衍生物)鏈段是可以由其自身公知的聚乙二醇-共-聚天冬氨酸芐酯或聚乙二醇-共-聚谷氨酸芐酯制備出來。聚乙二醇-共-聚天冬氨酸芐酯或聚乙二醇-共-聚谷氨酸芐酯的制備以一端被保護(hù)、另一端為氨基的聚乙二醇，例如MeO-PEG-CH2CH2CH2-NH2作為起始劑，在脫水后的有機(jī)溶劑中，添加N-羧基-L-天冬氨酸P-芐酯(BLA-NCA)或N-羧基-L-谷氨酸Y-芐酯(BLG-NCA)以達(dá)到所期望的聚合度(氨基酸單體的數(shù)量)，使之反應(yīng)即可得到。上述得到的嵌段聚合物的末端在乙酰氯或無水醋酸的作用下進(jìn)行乙?；螅ㄟ^堿加水分解，除去芐基，得到聚乙二醇-共-聚天冬氨酸或聚乙二醇-共-聚谷氨酸后，在有機(jī)溶劑中，添加芐醇以達(dá)到所期望的酯化率，在縮合劑，例如N-N，-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或N-N，-二異丙基碳二亞胺(DIPC)存在下使之反應(yīng)，由此可以得到具有部分芐酯的嵌段共聚物。進(jìn)一步，例如，如果用1-辛醇代替芐醇進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，可以得到聚乙二醇-共-聚天冬氨酸辛酯、聚乙二醇-共-聚谷氨酸辛酯。同樣若使用1-十二醇和l-十六醇時(shí)，就能夠分別得到聚乙二醇-共-聚天冬氨酸十二烷基酯和聚乙二醇-共-聚天冬氨酸十六烷酯。另外，通過酰胺鍵導(dǎo)入疏水性側(cè)鏈時(shí)，如上述那樣，對聚乙二醇-共-聚天冬氨酸芐酯或聚乙二醇-共-聚谷氨酸芐酯進(jìn)行乙?；螅ㄟ^堿加水分解而除去芐基后的羧基，使其與具有氨基的疏水性側(cè)鏈反應(yīng)，或者使聚乙二醇-共-聚天冬氨酸芐酯與具有一級(jí)胺的化合物進(jìn)行反應(yīng)，利用氨解作用將酯鍵變換成酰胺鍵即可導(dǎo)入。進(jìn)一步，為達(dá)到最初所期望的酰胺化率，在有機(jī)溶劑中，將l-辛胺等添加入聚乙二醇-共-聚天冬氨酸芐酯中，經(jīng)過一定時(shí)間反應(yīng)之后，通過對未變換的芐酯施加大過剩量的1,8-二氨基辛烷等，就可以制得疏水基末端被氨基置換的疏水性側(cè)鏈和未被氨基置換的疏水基側(cè)鏈混合在一起的聚(氨基酸衍生物)鏈段。酯化或酰胺化的比率為全體氨基酸單體的40%100%。天冬氨酸、谷氨酸可以是具有任一種光學(xué)活性型的天冬氨酸、谷氨酸，或它們的混合物。以上的親水性鏈段和疏水性鏈段是通過其自身公知的鍵，例如酯鍵、酰胺鍵、亞胺基、碳-碳鍵、醚鍵而能連接的。特別是，容易制造的，本發(fā)明中能很好地使用的嵌段聚合物可以列舉出下式(1)及(2)中所示的物質(zhì)。17<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>可以保護(hù)的官能團(tuán)可列舉羥基、縮醛基、縮酮基、醛基、糖殘基、馬來酰亞胺基、羧基、氨基、巰基、活性酯基等。Ri及R3表示可保護(hù)的官能團(tuán)被置換的低級(jí)垸基的情況下，親水性鏈段可以按照W096/33233、W096/32434、WO97/06202中記載的方法。低級(jí)垸基是指碳數(shù)為例如7個(gè)以下，最好是4個(gè)以下的直鏈或分支鏈，包括例如甲基、乙基、丙基、異歷龍丁紐豆丁甚每ky、j、乂ijz卞ro如上述那樣，膠束形成是可以通過將例如嵌段共聚物和生理活性多肽和蛋白質(zhì)溶解在適宜的緩沖液中進(jìn)行攪拌而進(jìn)行的?？漳z束的形成最好是在施加如超聲波那樣的能量進(jìn)行的。使用超聲波時(shí)，可以使用例如BIODISRUPTOR(日本精機(jī))，在4檔位，在冷凍下同時(shí)進(jìn)行。照射時(shí)間只要不使生理活性多肽及蛋白質(zhì)發(fā)生變性就沒有特別限定，可以通過照射間歇為1秒鐘、5秒10分鐘之間，最好是5秒2分鐘之間的照射而進(jìn)行。另外，其它的方法是用研缽等將干燥狀態(tài)的嵌段共聚物制成均一的粉體，向其中添加粉末狀的生理活性多肽及蛋白質(zhì)或添加溶解于少量溶液中的生理活性多肽和蛋白質(zhì)之后，進(jìn)行平穩(wěn)地混合，添加適宜的緩沖液，在4"C下攪拌2小時(shí)~24小時(shí)，在冷凍同時(shí)進(jìn)行超聲波處理即可。進(jìn)一步，作為其他方法，向嵌段聚合物中添加適宜的緩沖液，如前述那樣進(jìn)行超聲波處理而制備出空膠束，向其中添加溶解于相同緩沖液的生理活性多肽及蛋白質(zhì)，或添加稀釋于該緩沖液中的生理活性多肽及蛋白質(zhì)，通過攪拌器進(jìn)行平穩(wěn)地?cái)嚢杌蚴蛊潇o置即可。此時(shí)的攪拌時(shí)間和靜置時(shí)間最好是2小時(shí)至5天，溫度為4"至3(TC，特別優(yōu)選4。C。該方法由于無需對生理活性多肽及蛋白質(zhì)進(jìn)行超聲波處理即可制得，從生理活性多肽及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的觀點(diǎn)考慮是有利的。任何情況下，適宜的緩沖液最好是滿足前述的pl和pH的關(guān)系。這樣，關(guān)于制備出的內(nèi)包生理活性多肽及蛋白質(zhì)的高分子膠束，其粒子直徑只要是能進(jìn)行生物體給藥的尺寸就行，沒有特別限定，但是優(yōu)選l(Him，最好是5pm以下。特別是在靜脈給藥的情況下，優(yōu)選500nm以下，最好是300nm以下。必要時(shí)，將含有內(nèi)包生理活性多肽及蛋白質(zhì)的高分子膠束的水溶液經(jīng)過所期望的孔徑的親水性濾膜進(jìn)行過濾。本發(fā)明的內(nèi)包生理活性多肽及蛋白質(zhì)的高分子膠束在向生物體內(nèi)給藥的情況下，不問其給藥途徑，可以列舉靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、關(guān)節(jié)內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、眼內(nèi)給藥等。本發(fā)明的一個(gè)較佳的實(shí)施方式進(jìn)一步包含將各種糖類及/或各種聚乙二醇(Macrogol)加入除菌過濾前的內(nèi)包藥物的聚合物膠束水溶液(或水溶液)中的工序，由此即可制造。并不是進(jìn)行限定，可使用的糖類可列舉出麥芽糖、海藻糖、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露糖以及糊精等，可使用的聚乙二醇的分子量為約1000~約35000，可列舉出例如Macrogol1000、1540、4000、6000、20000、35000等。本發(fā)明的內(nèi)包生理活性多肽及蛋白質(zhì)的高分子膠束制劑，只要不影響到內(nèi)包的生理活性多肽及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，就能進(jìn)行凍結(jié)干燥。在進(jìn)行凍結(jié)干燥的情況下，使用水或水溶液將干燥制劑重新溶解成或再構(gòu)成含有內(nèi)包生理活性多肽及蛋白質(zhì)的高分子膠束的溶液。凍結(jié)干燥的情況下，可以將糖類加入到凍結(jié)干燥前的溶液中至其最終濃度達(dá)到0.115%(W/V);或者可以加入聚乙二醇以達(dá)到其最終濃度0.510%(w/v)。通常，嵌段共聚物和糖類或聚乙二醇的比率為各自重量的1:11:10或1:0.51:10。在較佳的實(shí)施方式中，親水性鏈段的末端上最好具有能與具有耙效應(yīng)能的分子相結(jié)合的官能團(tuán)。能與具有靶效應(yīng)能的分子相結(jié)合的官能團(tuán)可以列舉出，雖然并非特別限定，羥基、縮醛基、縮酮基、醛基、羧基、馬來酰亞胺基、氨基、巰基以及活性酯基等，官能團(tuán)可以被保護(hù)。具有耙效應(yīng)能的分子可以列舉出，雖然并非特殊限定，配基、抗體及其功能片段、蛋白質(zhì)、多肽等。向官能團(tuán)結(jié)合上具有靶效應(yīng)能的分子的情況下，可根據(jù)該分子的構(gòu)造進(jìn)行適宜選擇，能以公知的方法進(jìn)行結(jié)合。以下為比較例、實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行具體的說明。以下，例如在嵌段共聚物的PEG鏈的平均分子量為12,000、聚氮基酸鏈平均有40個(gè)殘基、向聚氨基酸側(cè)鏈導(dǎo)入的芐酯的導(dǎo)入率約為65%的情況下，在嵌段共聚物的后面標(biāo)記上12-40(65);同樣在辛酯等的導(dǎo)入率約為65。/。的情況下，標(biāo)記上12-40(65)。再者，約65%是指62%68%左右。1)內(nèi)包率的測定實(shí)施例1(內(nèi)包人IgG的膠束的制備1)嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚天冬氨酸芐酯(以下稱為PEG-PBLA。本聚合物中，未導(dǎo)入芐酯的天冬氨酸殘基是，其一般式(1)中的Rs是-O-，R6是氫原子。以下相同。另外，以下所有的嵌段共聚物,其一般式(1)的R^為CH3、U為-0"(CH2)3-NH、R2為COCH3。)。在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取10mg的PEG-PBLA12-50(65)，加入二氯乙垸進(jìn)行溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡?，進(jìn)一步在減壓下進(jìn)行l(wèi)小時(shí)左右的干燥。此處，添加62|iL的精制人IgG(MPBIOMEDICALS公司)(pl約為8)的20mM磷酸緩沖溶液(pH6，16.5mg/mL)，在4"C下輕輕攪拌同時(shí)，緩緩加入1.938mL的20mM磷酸緩沖溶液(pH6)或20mM的TAPS緩沖溶液(pH8)。在4。C下進(jìn)行徹夜攪拌之后，利用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit),在冷凍下，進(jìn)行約10秒鐘(照射間歇為一秒，輸出低)的超聲波照射之后，進(jìn)行凝膠過濾(西格瑪-奧德里奇公司，Sepharose(注冊商標(biāo))CL-4B:20x3Ocm)。根據(jù)BCAProteinAssay(PIERCE公司)確定回收的各餾分(洗脫液20mM磷酸緩沖液(pH7.4)，流速1.0mL/min，餾分體積lmL)中的IgG濃度。內(nèi)包率由下式求得。(膠束部分中的蛋白質(zhì)的量)X100內(nèi)包率(％)=-(所有部分中的蛋白質(zhì)的量的總和)在pH6條件下制備時(shí)得到的內(nèi)包率為94%。另一方面，在pH8條件下制備時(shí)得到的內(nèi)包率為41%。此結(jié)果表明，基于蛋白質(zhì)和PEG-PBLA12-50(65)的靜電相互作用，在遠(yuǎn)離內(nèi)包蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH條件下進(jìn)21行的膠束制備，相比于在等電點(diǎn)附近的pH條件下進(jìn)行的制備，能高效地將蛋白質(zhì)內(nèi)包。實(shí)施例2(內(nèi)包人IgG的膠束的制備2)嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚谷氨酸芐酯(以下稱為PEG-PBLG。本聚合物中，未導(dǎo)入芐酯的谷氨酸殘基是，其一般式(1)中的Rs是-O-，R6是氫原子。以下相同。)。在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取10mg的PEG-PBLG12-40(65)，加入lmL二氯甲烷溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡?，進(jìn)一步在減壓下干固1小時(shí)左右。此處，添加62pL的精制人IgG(MPBIOMEDICALS公司)(pi約為8)的磷酸緩沖溶液(pH6，16.5mg/mL)，在4'C下進(jìn)行輕輕攪拌的同時(shí)，加入L938mL的20mM磷酸緩沖溶液(pH6)或20mM的TAPS緩沖液(pH8)。在4。C下進(jìn)行徹夜攪拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)，在冷凍下進(jìn)行約10秒鐘(照射間歇為一秒，輸出低)的超聲波照射之后，進(jìn)行凝膠過濾(西格瑪-奧德里奇公司，Sepharose(注冊商標(biāo))CL-4B:2^x30cm)。用BCAProteinAssay(PIERCE公司)測定回收的各餾分(洗脫液20mM磷酸緩沖液(pH7.4)，流速1.0mL/min,餾分體積lmL)中的IgG濃度。內(nèi)包率由下式求得。(膠束部分中的蛋白質(zhì)的量)X100內(nèi)包率(o/。)=-(所有部分中的蛋白質(zhì)的量的總和)在pH6條件下制備時(shí)得到的內(nèi)包率為83%。另一方面，在pH8條件下制備時(shí)得到的內(nèi)包率為63%。此結(jié)果表明，基于蛋白質(zhì)和PEG-PBLG12-40(65)的靜電相互作用，在遠(yuǎn)離內(nèi)包蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH條件下進(jìn)行膠束的制備，相比于在等電點(diǎn)附近的pH條件下進(jìn)行的制備，能高效地將蛋白質(zhì)內(nèi)包。實(shí)施例3(內(nèi)包人IgG的膠束的制備3)嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚天冬氨酸辛酯(以下稱為PEG-POLA。本聚合物中，未導(dǎo)入辛酯的谷氨酸殘基是，其一般式(1)中的R5是-0，R6是氫原子。以下相同。)。在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取10mg的PEG-POLA12-40(65)，加入lmL二氯甲烷溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡?，進(jìn)一步在減壓下干固1小時(shí)左右。此處，添加62pL的精制人IgG(MPBIOMEDICALS公司)(pi約為8)的20mM磷酸緩沖溶液(pH6，16.5mg/mL)，在4。C下進(jìn)行輕輕攪拌的同時(shí)，慢慢加入1.938mL的20mM磷酸緩沖溶液(pH6)或20MmTAPS緩沖液(pH約為8)。在4。C下進(jìn)行徹夜攪拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)，在冷凍下進(jìn)行約10秒鐘(照射間歇為一秒，低)的超聲波照射之后，進(jìn)行凝膠過濾(西格瑪-奧德里奇公司，Sepharose(注冊商標(biāo))CL-4B:~20x30cm)。用氨基酸分析(Waters公司，AccQTag(商標(biāo))法)確定回收的各餾分(洗脫液20mM磷酸緩沖液(pH7.4)，流速1.0mL/min，餾分體積lmL)中的IgG濃度。內(nèi)包率由下式求得。(膠束部分中的蛋白質(zhì)的量)X100內(nèi)包率(％)=-(所有部分中的蛋白質(zhì)的量的總和)在pH6條件下制備時(shí)得到的內(nèi)包率為97%。另一方面，在pH8條件下制備時(shí)得到的內(nèi)包率為24%。此結(jié)果表明，基于蛋白質(zhì)和PEG-POLA12-40(65)的靜電相互作用，在遠(yuǎn)離內(nèi)包蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH條件下進(jìn)行的膠束制備，相比于在等電點(diǎn)附近的pH條件下進(jìn)行的制備，能高效地將蛋白質(zhì)內(nèi)包。比較例1(內(nèi)包人IgG的膠束的制備4)在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取10mg的PEG-PBLA12-50(100)，加入lmL二氯甲烷溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡睿M(jìn)一步在減壓下干固1小時(shí)左右。此處，添加62|iL的精制人IgG(MPBIOMEDICALS公司)(pi約為8)的20mM磷酸緩沖溶液(pH6，16.5mg/mL)，在4。C下進(jìn)行輕輕攪拌的同時(shí)，慢慢加入1.938mL的20mM磷酸緩沖溶液(pH6)或20MmTAPS緩沖液(pH約為8)。在4"C下進(jìn)行徹夜攪拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)，在冷凍下進(jìn)行約10秒鐘(照射間歇為一秒，輸出低)的超聲波照射之后，進(jìn)行凝膠過濾(西格瑪-奧德里奇公司，Sepharose(注冊商標(biāo))CL-4B:20x3Ocm)。用BCAProteinAssay(P正RCE公司)確定回收的各餾分(洗脫液20mM磷酸緩沖液(pH7.4)，流速1.0mL/min，餾分體積lmL)中的IgG濃度。內(nèi)包率由下式求得。(膠束部分中的蛋白質(zhì)的量)X100內(nèi)包率(％)=-(所有部分中的蛋白質(zhì)的量的總和)在pH6條件下制備時(shí)得到的內(nèi)包率為22%。另一方面，在pH8條件下制備時(shí)得到的內(nèi)包率為65%。此結(jié)果表明，在使用不包含羧基的PEG-PBLA12-50(100)的時(shí)候，即使在遠(yuǎn)離內(nèi)包蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH條件下進(jìn)行膠束的制備，由于沒有了靜電相互作用的參與，難以高效地將蛋白質(zhì)進(jìn)行內(nèi)包。也表明在等電點(diǎn)附近的pH條件下進(jìn)行制備，基于疏水性相互作用，可將蛋白質(zhì)內(nèi)包。比較例2(內(nèi)包人FITC標(biāo)記IgG的膠束的制備)嵌段共聚物使用3種，即聚乙二醇-共-聚天冬氨酸(平均殘基數(shù)約為50殘基，非酯化)的嵌段共聚物、PEG-PBLA12-50(65)或PEG-POLA12-40(65)。在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取20mg的聚合物，加入2mL二氯甲垸溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡?，進(jìn)一步在減壓下干固1小時(shí)左右。此處，添加100pL的FITC標(biāo)記人免疫球蛋白(FITC-IgG)的磷酸緩沖溶液(西格瑪-奧德里奇公司，20mg/mL)，在4'C下進(jìn)行輕輕攪拌的同時(shí)，慢慢加入1.9mL的20mM磷酸緩沖溶液(pH6)。在4"C下進(jìn)行徹夜攪拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)，在冷凍下進(jìn)行約10秒鐘(照射間歇為1秒，輸出低)的超聲波照射之后，進(jìn)行超離心(30,000rpm，1小時(shí)，4°C，貝克曼公司，MLA-130轉(zhuǎn)子)。將作為沉淀回收的膠束部分在20mM磷酸緩沖液(pH6)中懸浮，進(jìn)行凝膠過濾(西格瑪-奧德里奇公司，Sepharose(注冊商標(biāo))CL-4B:2^x30cm)。使用平板讀取器(大日本住友制藥，PowerScan(注冊商標(biāo))HT)(激發(fā)波長485nm士20nm，發(fā)射波長528nm士20nm)測定回收的各餾分(洗脫液20mM磷酸緩沖液(pH7.4)，流速1.0mL/min,餾分體積lmL)中的FITC-IgG濃度。內(nèi)包率由下式求得。(膠束部分中的蛋白質(zhì)的量)X100內(nèi)包率(％)=-(所有部分中的蛋白質(zhì)的量的總和)在使用聚乙二醇-共-聚天冬氨酸(平均殘基數(shù)約為50殘基，非酯化)的嵌段共聚物的情況下，內(nèi)包率為6%，另一方面，在使用PEG-PBLA12-50(65)或PEG-POLA12-40(65)的情況下，內(nèi)包率分別為51%、60%。此結(jié)果表明，使用含疏水性的置換基和含電荷性的基共存的、整體上由疏水性鏈段組成的聚合物的時(shí)候，能夠高效地將蛋白質(zhì)內(nèi)包，在內(nèi)包過程中除了靜電相互作用之外，疏水性相互作用等也參與了內(nèi)包。另外，與實(shí)施例1-3的結(jié)果相符的上述結(jié)果表明，嵌段共聚物的疏水性鏈段中的疏水基的構(gòu)造對內(nèi)包率的影響不大。實(shí)施例4(內(nèi)包FITC標(biāo)記牛血清白蛋白的膠束的制備)在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取40mg的PEG-PBLA12-50(65)，加入2mL二氯甲烷溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡?，進(jìn)一步在減壓下干固1小時(shí)左右。此處，添加200pL的FITC標(biāo)記牛血清白蛋白(西格瑪-奧德里奇公司)(pl約為5)水溶液(20mg/mL)，在4。C下進(jìn)行輕輕攪拌的同時(shí)，慢慢加入3.8mL的50mM檸檬酸緩沖溶液(pH3.5)或20mM磷酸緩沖液(pH6)。在4"下進(jìn)行徹夜攪拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)，在冷凍下進(jìn)行約10秒鐘(照射間歇為一秒，輸出低)的超聲波照射之后，進(jìn)行超離心(30,000rpm，1小時(shí)，4°C，貝克曼公司，MLA-130轉(zhuǎn)子)。使用平板讀取器(大日本住友制藥，PowerScan(注冊商標(biāo))HT)(激發(fā)波長485nm士20nm，發(fā)射波長528nm±20nm)確定上清中的FITC標(biāo)記牛血清白蛋白的濃度(洗脫液20mM磷酸緩沖液(pH7.4)，流速1.0mL/min,餾分體積lmL)中的FITC-IgG濃度。內(nèi)包率由下式求得。(超離心前蛋白質(zhì)的量一上清中蛋白質(zhì)的量)xioo內(nèi)包率(％)=-超離心前的蛋白質(zhì)的量在pH3.5條件下制備的情況下，內(nèi)包率為16%,另一方面，在pH6條件下制備的情況下，內(nèi)包率為7%。此結(jié)果表明，基于蛋白質(zhì)和PEG-PBLA12-50(65)的靜電相互作用，在遠(yuǎn)離內(nèi)包蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH條件下進(jìn)行的膠束制備，相比于在等電點(diǎn)附近的pH條件下進(jìn)行膠束的制備，能高效地將蛋白質(zhì)內(nèi)包。實(shí)施例5(內(nèi)包牛血紅蛋白的膠束的制備)在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取20mg的PEG-PBLA12-50(65)，加入2mL二氯甲垸溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡?，進(jìn)一步在減壓下干固1小時(shí)左右。此處，添加100pL的牛血紅蛋白(西格瑪-奧德里奇公司)(pl約為7)水溶液(20mg/mL)，在^C下進(jìn)行輕輕攪拌的同時(shí)，慢慢加入1.9mL的20mM磷酸緩沖液(pH6)或20mM磷酸緩沖液(pH7.4)。在4°C下進(jìn)行徹夜攪拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)，在冷凍下進(jìn)行約10秒鐘(照射間歇為一秒，輸出低)的超聲波照射之后，進(jìn)行凝膠過濾(西格瑪-奧德里奇公司，Sepharose(注冊商標(biāo))CL-4B:20x30cm)。使用平板讀取器(大日本住友制藥，PowerScan(注冊商標(biāo))HT)測定回收的各餾分(洗脫液20mM磷酸緩沖液(pH7.4)，流速1.0mL/min,餾分體積lmL)中的牛血紅蛋白濃度。內(nèi)包率由下式求得。(膠束部分中的蛋白質(zhì)的量)X100內(nèi)包率(％)=-(所有部分中的蛋白質(zhì)的量的總和)在pH6條件下制備的情況下，內(nèi)包率為19%，另一方面，在pH7.4條件下制備的情況下，內(nèi)包率為10%。此結(jié)果表明，基于蛋白質(zhì)和26PEG-PBLA12-50(65)的靜電相互作用，在相對于內(nèi)包蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的酸性條件下進(jìn)行的膠束制備，相比于在相對于等電點(diǎn)的堿性條件下進(jìn)行膠束的制備，能高效地將蛋白質(zhì)內(nèi)包。實(shí)施例6(內(nèi)包重組人干擾素-a的膠束的制備)在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取7.0mg的PEG-PBLA12-50(65)，加入0.7mL二氯甲烷溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡?，進(jìn)一步在減壓下干固1小時(shí)左右。此處，向其中添加重組人干擾素-a(pl約為6.0)的PBS溶液(IFN-a,PBLBiomedicalLaboratories)(0.2mg/mL35jiL)，接著添力口200|xL的0.1M的MES緩沖液(pH5.0)。在4"下緩慢混合使聚合物差不多溶解，接著添加20mM的MES緩沖液(pH5.0)，使全體積量為1.4mL，在4"C下進(jìn)行徹夜攪拌。攪拌完后，進(jìn)行超離心(30，000rpm，1小時(shí)，4°C，貝克曼公司，MLA-130轉(zhuǎn)子)。使用ELISA試劑盒(PBLBiomedicalLaboratories)測定上清中的IFN-a的濃度。另一方面，在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取2.6mg的PEG-PBLA12-50(65)，加入0.26mL二氯甲垸溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡?，進(jìn)一步在減壓下干固1小時(shí)左右。此處，向其中添加同上的重組人干擾素-(x(0.2mg/mL12.5|iL)，接著添加100|iL的0.1M的TAPS緩沖液(pH8.0)。在4X:下緩慢混合使聚合物差不多溶解，接著添加400pL的20mM的TAPS緩沖液(Ph8.0)，在4"C下進(jìn)行徹夜攪拌。攪拌完后，進(jìn)行超離心(30,000rpm，1小日寸，4°C，貝克曼公司，MLA-130轉(zhuǎn)子)。使用ELISA試劑盒(PBLBiomedicalLaboratories)測定上清中的IFN-a的濃度。從各個(gè)試驗(yàn)的測定值，根據(jù)下式求出內(nèi)包率。(制備時(shí)使用的蛋白質(zhì)的量一上清中蛋白質(zhì)的量)X100內(nèi)包率(o/。)=-制備時(shí)使用的蛋白質(zhì)的量在pH5.0條件下制備的情況下，內(nèi)包率為100%，另一方面，在pH8.0條件下制備的情況下，內(nèi)包率為3.6%。此結(jié)果表明，基于蛋白質(zhì)和PEG-PBLA12-50(65)的靜電相互作用，在相對于內(nèi)包蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的酸性條件下進(jìn)行的膠束制備，相比于在相對于等電點(diǎn)的堿性條件下進(jìn)行的制備，能高效地將蛋白質(zhì)內(nèi)包。實(shí)施例7(內(nèi)包木瓜蛋白酶的膠束的制備)在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取20mg的PEG-PBLA12-40(65)，加入2mL二氯甲垸溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡睿M(jìn)一步在減壓下干固1小時(shí)左右。此處，添加100pL的木瓜蛋白酶(西格瑪-奧德里奇公司)(pl約為8.8)的水溶液(20mg/mL)，接著添加200jiL的0.1MMES緩沖液(pH5.0)。在4。C下輕輕攪拌的同時(shí)，慢慢加入1.9mL的20mM磷酸緩沖液(pH6.0)或20mM的TAPS緩沖液(pH8.0)。在4。C下進(jìn)行徹夜攪拌后，使用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)在冷凍下進(jìn)行約10秒鐘(照射間歇為一秒，輸出低)的超聲波照射之后，進(jìn)行凝膠過濾(西格瑪-奧德里奇公司，Sepharose(注冊商標(biāo))CL-4B:~20x3Ocm)。用BCAProteinAssay(PIERCE公司)測定回收的各餾分(洗脫液20mM磷酸緩沖液(pH7.4)，流速1.0mL/min,餾分體積lmL)中的木瓜蛋白酶濃度。通過下式求出內(nèi)包率。(膠束部分中的蛋白質(zhì)的量)X100內(nèi)包率(％)=-(所有部分中的蛋白質(zhì)的量的總和)在pH6.0條件下制備的情況下，內(nèi)包率為27%，另一方面，在pH8.0條件下制備的情況下，內(nèi)包率為9%。此結(jié)果表明，基于蛋白質(zhì)和PEG-PBLA12-40(65)的靜電相互作用，在遠(yuǎn)離內(nèi)包蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH條件下進(jìn)行的膠束制備，相比于在等電點(diǎn)附近的pH條件下進(jìn)行的膠束制備，能高效地將蛋白質(zhì)內(nèi)包。2)從膠束中游離的蛋白質(zhì)的游離率的評價(jià)實(shí)施例8(從內(nèi)包人FITC標(biāo)記IgG的膠束中游離的游離評價(jià))嵌段共聚物使用PEG-PBLA12-50(65)或PEG-POLA12-40(50)。在玻璃樣品瓶中分別精細(xì)稱取20mg的聚合物，加入2mL二氯甲烷溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡睿M(jìn)一步在減壓下干固1小時(shí)左右。此處，添加100pL的FITC標(biāo)記人免疫球蛋白(FITC-IgG)(西格瑪-奧德里奇公司，20mg/mL)。輕輕攪拌同時(shí)，進(jìn)一步緩慢加入3.9mL的20mM磷酸緩沖液(pH6.0)。在4。C下進(jìn)行徹夜攪拌后，使用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)在冷凍下進(jìn)行約10秒鐘(照射間歇為一秒，輸出低)的超聲波照射之后，進(jìn)行超離心分離(30,000rpm，4°C，1小時(shí))而得到膠束。將回收的膠束在20mM磷酸緩沖液中(pH6)懸浮，向牛血清中添加[牛血清終濃度50%(v/v)]，在37。C下培育。為了評價(jià)內(nèi)包的FITC-IgG的游離，在預(yù)先決定的培育時(shí)間之后，將lmL樣品進(jìn)行凝膠過濾(西格瑪-奧德里奇公司，Sepharose(注冊商標(biāo))CL-4B:~20x30cm)。使用平板讀取器(大日本住友制藥，PowerScan(注冊商標(biāo))HT)(激發(fā)波長485nm士20nm，發(fā)射波長528nm士20nm)測定回收的各餾分(洗脫液20mM磷酸緩沖液(pH7.4)，流速1.0mL/min，餾分體積lmL)中的FITC-IgG的濃度。(0/)=(FITC標(biāo)記人IgG部分中的蛋白質(zhì)的量)XlOO、子咼；<0與緩沖液混合后即進(jìn)行凝膠過濾，回收的膠束部分中的蛋白質(zhì)的量(但是，上述緩沖液為20mM磷酸緩沖液(pH6)。)圖1表示游離率的經(jīng)時(shí)變化。該結(jié)果表明，內(nèi)包于膠束的蛋白質(zhì)即使在血清存在下不會(huì)在初期一下釋放出來，而是長時(shí)間緩慢地釋放。也表明游離速度依賴于疏水基的構(gòu)造。并非特別拘泥于理論，形成膠束的嵌段共聚物的疏水性鏈段中所導(dǎo)入的疏水基在具有如烷基那樣的線形構(gòu)造的時(shí)候，相比于具有如芐基那樣的平面構(gòu)造的時(shí)候，能穩(wěn)固地保持藥物，能夠達(dá)到控制藥物釋放的狀態(tài)。實(shí)施例9(干擾素-a的靜脈內(nèi)給藥試驗(yàn))嵌段共聚物使用PEG-PBLA12-50(65)或PEG-POLA12-40(50)。在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取10mg的聚合物，加入lmL二氯甲垸溶解。將該溶液在氮?dú)饬飨赂晒坛赡?，進(jìn)一步在減壓下干固3小時(shí)左右。此處，添加重組人干擾素-a的PBS溶液(IFN-a，PBLBiomedicalLaboratories)(0.2mg/mL，46|iL)。接著添加200jiL的0.2M的MES緩沖液(pH5.0)。在4'C下進(jìn)行緩緩攪拌，使聚合物差不多溶解，接著添加20mM的MES緩沖液(5.0)，使全體積量達(dá)到2mL，在4。C下進(jìn)行一晝夜攪拌。對樣品進(jìn)行超離心(30，000rpm，1小時(shí)，4°C，貝克曼公司，MLA-130轉(zhuǎn)子)，去除未內(nèi)包的IFN-a，將膠束作為沉淀回收。將該膠束在5%葡萄糖水溶液中懸浮，用于進(jìn)行以下的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將6周齡的Wistar系雄性大鼠按1組2只進(jìn)行劃分，將上述的被試驗(yàn)液以lxl04U/Kg的給藥量進(jìn)行尾靜脈給藥。在給藥后的5分鐘、1、3、6、9及24小時(shí)后，使用涂抹了肝素的注射器從頸靜脈采集約0.2mL血。之后立即進(jìn)行13800rpm、4。C下的離心分離(EF-1300，ECO-Fuge(商標(biāo))，TOMY精工)，將血漿進(jìn)行回收，在分析之前保存在-3(TC下。使用ELISA試劑盒(PBLBiomedicalLaboratories)，測定血漿中的濃度。測定結(jié)果如圖2所示。通過膠束化提高在血漿中的濃度的滯留性。進(jìn)一步根據(jù)非房室模型計(jì)算的藥物動(dòng)態(tài)參數(shù)如下所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>通過膠束化，AUC增加了17倍至35倍。該結(jié)果表明，內(nèi)包蛋白質(zhì)的膠束在血中不會(huì)在初期發(fā)生爆裂，而是在血中長時(shí)間滯留。另外，與在體外的試驗(yàn)結(jié)果相同，這也表明生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)游離速度依賴于疏水基的構(gòu)造。實(shí)施例10(內(nèi)包FITC標(biāo)記溶菌酶的膠束的大鼠靜脈內(nèi)給藥試驗(yàn))1)溶菌酶的FITC標(biāo)記將100mg溶菌酶(來自蛋白)(西格瑪-奧德里奇公司)溶解于2mL的lOOmM硼酸緩沖液(Ph8,5)之后，添加170nL的FITC(PIERCE)的50mg/mL的DMSO溶液。在室溫中進(jìn)行1小時(shí)攪拌之后，通過凝膠過濾(GEHealthcarebioscience公司，PD-10)(洗脫液20mM磷酸鈉緩沖液pH7.4)去除未反應(yīng)的FITC。進(jìn)一步，在4'C下在水中進(jìn)行透析之后，通過再一次凝膠過濾(西格瑪-奧德里奇公司，Sepharose(注冊商標(biāo))CL-4B)(洗脫液20mM磷酸鈉緩沖液pH7.4)進(jìn)行精制。2)內(nèi)包FITC標(biāo)記溶菌酶的膠束的制備和大鼠PK試驗(yàn)在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取40mg的嵌段共聚物、PEG-POLA12-40(65)，添加4mg的FITC標(biāo)記溶菌酶(29.2mg/mL，137pL)，接著添加500pL的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)。在4。C下攪拌一夜后，使用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)在冷凍下進(jìn)行約10秒鐘(照射間歇為1秒，輸出低)的超聲波照射。將通過超離心分離(80，000rpm，1小時(shí)，4°C，貝克曼公司，MLA-80轉(zhuǎn)子)而作為沉淀回收的膠束部分懸浮在20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)/5%乙二醇中之后，通過同樣的超離心操作而洗凈，再次在相同的緩沖液中懸浮之后，用于進(jìn)行以下的大鼠給藥試驗(yàn)。將6周齡的Wistar系雄性大鼠按1組3只進(jìn)行劃分，將上述的被試驗(yàn)液以10mg/Kg的FITC標(biāo)記溶菌酶的給藥量進(jìn)行尾靜脈給藥。在給藥后的5分鐘、1、3、6、9及24小時(shí)后，使用涂抹了肝素的注射器從頸靜脈采集約0.2mL血。立即進(jìn)行4。C下的離心分離(EF-1300，ECO-Fuge(商標(biāo))，TOMY精工)，將血漿進(jìn)行回收，在分析之前保存在-3(TC下。FITC標(biāo)記溶菌酶溶液(20mM磷酸鈉緩沖pH7.4/5。/。乙二醇)也進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。在以下的HPLC條件下，測定血漿中濃度。系統(tǒng)WatersAllianceSystem柱TosohTSK畫gelSuperSW3000(4.6^x300mm)(30°C)移動(dòng)相20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)流速0.25mL/min檢測熒光(Ex:492nm，Em:520nm)注射液體積10pL測定結(jié)果如圖3所示。與溶液給藥的情況相比，通過膠束化，AUC增加了約15倍。該結(jié)果表明內(nèi)包在膠束中的蛋白質(zhì)在血中不會(huì)初期爆裂出來，而是在血中長時(shí)間滯留。實(shí)施例11(內(nèi)包干擾素-a的膠束的靜脈給藥試驗(yàn)2)嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚天冬氨酸十二烷基酯(以下稱為PEG-PDLA。本聚合物中，未導(dǎo)入十二垸基酯的天冬氨酸殘基，其一般式(1)中的Rs表示-O-;&表示氫原子。以下相同。)或者聚乙二醇-共-聚天冬氨酸十六垸基酯(以下稱為PEG-PHLA。再者，未導(dǎo)入十六垸基酯的天冬氨酸殘基，其一般式(1)中的Rs表示-O-;&表示氫原子。以下相同。)在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取200mg的PEG-PDLA12-40(65)或PEG-PHLA12-40(65)，加入10mL的20mM的MES緩沖液(pH5.0)，在fC下激烈攪拌一夜。使用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)在冷凍下對聚合物分散液進(jìn)行約15分鐘(照射間歇為一秒，輸出低)的超聲波照射，使聚合物濃度達(dá)到20mg/mL，得到空的膠束溶液。向凍存管(家田化學(xué))移入0.65mL空膠束溶液，在此，加入65|iL的重組人干擾素-a的PBS溶液(IFN-a，PBLBiomedicalLaboratories)和50pL的0.1M的MES緩沖液(pH5.0)，輕輕移液后，在4。C下靜置4天。使用超濾管[MilliporeAmicon(注冊商標(biāo))ultra-4(截止分子量100,000)]在5%葡萄糖溶液中洗凈、濃縮，用于進(jìn)行以下的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將6周齡的Wistar系大鼠按1組3只進(jìn)行劃分，將上述的被試驗(yàn)液以lxl(^IU/Kg的給藥量進(jìn)行尾靜脈給藥。在給藥后的5分鐘、1、3、6及24小時(shí)后，使用涂抹了肝素的注射器從頸靜脈采集約0.2mL血。之后立即進(jìn)行13,800rpm、4。C下的離心分離(EF-1300,ECO-Fuge(商標(biāo))，TOMY精工)，將血漿進(jìn)行回收，在分析之前保存在-3(TC下。使用人干擾素-(xELISA試劑盒(PBLBiomedicalLaboratories)，測定血槳中的濃度。干擾素-cx內(nèi)包高分子膠束在生物體給藥之后的干擾素-a的血漿中濃度的經(jīng)時(shí)變化如圖4所示。通過膠束化，AUC在使用PEG-PDLA12-40(65)的情況下增加了32倍，在使用PEG-PHLA12-40(65)的情況下增加了27倍。實(shí)施例12(內(nèi)包干擾素-a的膠束的靜脈給藥試驗(yàn)3)嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚谷氨酸辛酯(以下稱為PEG-POLG。本聚合物中，未導(dǎo)入辛酯的谷氨酸殘基，其一般式(1)中的Rs表示-O-;&表示氫原子。以下相同。)。在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取150mg的PEG-POLG12-40(65)，加入5mL的20mM的MES緩沖液(pH5.0)，在4。C激烈攪拌一夜。使用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)在冷凍下對聚合物分散液進(jìn)行約15分鐘(照射間歇為一秒，輸出低)的超聲波處理，使聚合物濃度達(dá)到30mg/mL，得到空的膠束溶液。向凍存管(家田化學(xué))中移入0.6mL空膠束溶液，在此，加入90(iL的重組人干擾素-a溶液(IFN-a，PBLBiomedicalLaboratories)和llOpL的0.1M的MES緩沖液(pH5.0)，輕輕移液后，在4。C下靜置3天。向微管中分注入400jiL，加入20mM的MES緩沖液(pH5.0)使達(dá)到500laL之后，使用超濾管[MilliporeAmicon(注冊商標(biāo))ultra-4(截止分子量100,000)]在5%葡萄糖溶液中洗凈，濃縮，用于進(jìn)行以下的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將6周齡的Wistar系大鼠按1組2只進(jìn)行劃分，將上述的被試驗(yàn)液以lxl(^IU/Kg的給藥量進(jìn)行尾靜脈給藥。在給藥后的5分鐘、1、3、6及24小時(shí)后，使用涂抹了肝素的注射器從頸靜脈采集約0.2mL血。之后立即進(jìn)行13,800rpm、4。C下的離心分離(EF畫1300,ECO-Fuge(商標(biāo))，TOMY精工)，將血漿進(jìn)行回收，在分析之前保存在-3(TC下。使用人干擾素-oiELISA試劑盒(PBLBiomedicalLaboratories)，測定血漿中的濃度。干擾素-a內(nèi)包高分子膠束在生物體給藥之后的干擾素-a的血漿中濃度的經(jīng)時(shí)變化如圖5所示。通過膠束化，AUC增加了57倍。實(shí)施例13(內(nèi)包蜂毒肽的膠束的制備)嵌段共聚物使用的是PEG-POLA12-40(65)或PEG-POLG12-40(65)。在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取150mg的聚合物，加入5mL的20mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.4)，在4"C激烈攪拌一夜。使用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)在冷凍下對聚合物分散液進(jìn)行約15分鐘(照射間歇為一秒，輸出低)的超聲波處理，使聚合物濃度達(dá)到30mg/mL，得到空的膠束溶液。加入20mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.4)調(diào)整為10mg/mL(lmL)，加入堿性多肽的蜂毒肽(西格瑪-奧德里奇公司)(lmg)，在4。C下靜置一夜后，進(jìn)行凝膠過濾(GEHealthcarebioscience公司，Sepharose(注冊商標(biāo))CL-4B:10x30cm)。用BCAProteinAssay(PIERCE公司)測定回收的餾分(洗脫液20mM磷酸緩沖液(pH7.4)，流速L0mL/min,餾分體積lmL)中的蜂毒肽濃度。通過下式求出內(nèi)包率。(膠束部分中的蛋白質(zhì)的量)X100內(nèi)包率(％)=-(所有部分中的蛋白質(zhì)的量的總和)內(nèi)包率在使用PEG-POLA12-40(65)時(shí)為71%，在使用PEG-POLG12-40(65)時(shí)為48%。此結(jié)果表明，能夠高效內(nèi)包分子量約為2,800的多肽。實(shí)施例14(內(nèi)包人粒性白細(xì)胞集落刺激因子的膠束的大鼠靜脈內(nèi)給藥試驗(yàn)l)嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚天冬氨酸辛酰胺(以下稱為PEG-PONLA。本聚合物中，50%具有其一般式(1)中的115為-NH-、&為辛基的氨基酸殘基，另50。/。具有的R5為-NH-、R6為被氨基酸置換了的辛基的氨基酸殘基。以下相同。)。在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取30mg的PEG-PONLA12-40(50)，加入2mL含有5%葡萄糖的20mM磷酸緩沖溶液(Ph7.4)之后，利用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)，在冷凍下進(jìn)行約10分鐘(照射間歇為一秒，低)的超聲波照射，制備得空膠束。此處，加入重組人粒性白細(xì)胞集落剌激因子(G-CSF，GreeiiCross公司)(pl約為6.0)G00)ig/mL，1mL)，在4。C下靜置一晝夜。此后，使用超濾管[MilliporeAmicon(注冊商標(biāo))ultra-4(截止分子量100,000)]去除未內(nèi)包的G-CSF，制成以下的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用膠束。將6周齡的Wistar系雄性大鼠按1組3只(溶液時(shí)為1組6只)進(jìn)行劃分，將上述的被試驗(yàn)液以100pg/Kg的給藥量進(jìn)行尾靜脈給藥。在給藥后的5分鐘、1、3、6及24小時(shí)后，使用涂抹了肝素的注射器從頸靜脈采集約0.2mL血。之后立即進(jìn)行13,800rpm、4°C下的離心分離(EF-1300,ECO-Fuge(商標(biāo))，TOMY精工)，將血漿進(jìn)行回收，在分析之前保存在-30。C下。使用BayBio(注冊商標(biāo))HumanG-CSFELISAkit(RayBiotechinc)，測定血漿中的濃度。測定結(jié)果如圖6所示，根據(jù)非房室模型計(jì)算的藥物動(dòng)態(tài)參數(shù)如表2所示。通過膠束化，AUC增加了3倍，半衰期延長了2倍。表2表示將內(nèi)包人粒性白細(xì)胞集落刺激因子的高分子膠束或人粒性白細(xì)胞集落刺激因子溶液對大鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥時(shí)的藥物動(dòng)態(tài)參數(shù)。藥物動(dòng)態(tài)^一PEG-PONLA錄_溶敗12-40(50)膠束IilCinf(%劑量/mL'h)O22T1/2(h)2.64.1CI(mL/V只)134.4MRTmf(h〉1.92.8Vss(mL/只)2513實(shí)施例15(內(nèi)包人粒性白細(xì)胞集落刺激因子的膠束的大鼠靜脈內(nèi)給藥試驗(yàn)2)嵌段共聚物使用的是PEG-POLG。在玻璃樣品瓶中精細(xì)稱取30mg的PEG-POLG12-40(65)，加入2mL的20mM的MES緩沖液(pH5.0)之后，利用BIODISRUPTOR(日本精機(jī)制作所HighPowerUnit)，在冷凍下進(jìn)行約10分鐘(照射間歇為一秒，低)的超聲波照射，制備得空膠束。此處，加入重組人G-CSF溶液(GreenCross公司)(300嗎/mL，1mL)，在4"下靜置一晝夜。此后，使用超濾管[MilliporeAmicon(注冊商標(biāo))ultra-4(截止分子量100,000)]去除未內(nèi)包的G-CSF，在含有5%葡萄糖的20mM磷酸緩沖液(pH7.4)中稀釋，制成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用膠束。膠束，與實(shí)施例12同樣地作為G-CSF，以100pg/mL的給藥量對大鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。同樣地進(jìn)行采血，測定血漿中的濃度。測定結(jié)果如圖7所示，根據(jù)非房室模型計(jì)算得到的藥物動(dòng)態(tài)參數(shù)如表3所示。通過膠束化，AUC增加了15倍，半衰期延長了5倍，即使在給藥120小時(shí)之后也能檢出血漿中濃度。此結(jié)果表明，內(nèi)包蛋白質(zhì)的膠束即使在血中也不會(huì)發(fā)生初期爆裂，能長時(shí)間滯留在血中。表3表示將內(nèi)包人粒性白細(xì)胞集落刺激因子的高分子膠束或人粒性白細(xì)胞集落刺激因子溶液向大鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥時(shí)的藥物動(dòng)態(tài)參數(shù)。藥物動(dòng)態(tài)※^PEG-POLG參數(shù)_浴瓶12-4Q(65)膠束AUCinf(%劑量/niL'li)TO~Tl/2(h)2.614Cl(mL/h/只)130.卯MRTinfOi)1.912Vss(mL/只)2511至此為止的本發(fā)明的說明是以實(shí)例和說明為目的的例示。應(yīng)當(dāng)理解在不離開本發(fā)明的主旨及范圍的條件下可進(jìn)行種種改變。因此，可以理解本發(fā)明請求權(quán)利保護(hù)的范圍是包含了所有這樣的改變的。權(quán)利要求1.一種內(nèi)包蛋白質(zhì)或多肽的、由具有由聚乙二醇構(gòu)成的親水性鏈段和由從酸性氨基酸、其疏水性衍生物以及酸性氨基酸與其疏水性衍生物的混合物組成的群組中選出的聚氨基酸構(gòu)成的疏水性鏈段的嵌段共聚物所構(gòu)成的高分子膠束組合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，上述酸性氨基酸的疏水性衍生物為酸性氨基酸烷基酯或酸性氨基酸烷基酰胺。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，上述酸性氨基酸為天冬氨酸或谷氨酸。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，嵌段共聚物為下式(I)或(II)所記載的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>上述各式中Ri及R3各自獨(dú)立，表示氫原子或可被保護(hù)的官能團(tuán)被置換的或者未被置換的低級(jí)垸基；R2表示氫原子、飽和或不飽和的d~C29脂肪族羰基或者芳香族羰基；R4表示羥基、飽和或不飽和的C廣C3Q脂肪族氧基或者芳香族-低級(jí)垸氧基；Rs表示-O-或者-NH-;R6表示氫原子、苯基、-(CH2)4-苯基、未置換或者被氨基或羧基置換了的C4d6烷基、或芐基；R7表示亞甲基，n為102500的整數(shù)，x為10300的整數(shù)，m為0300的整數(shù)(但是，m存在時(shí)，(COCHNH)的單元和(COR7CHNH)的單元是隨機(jī)存在的；R6可以是在一個(gè)嵌段共聚物內(nèi)的各氨基酸單元中的任意選擇，是隨機(jī)存在的，但R6是氫原子的情況為R6全體的60M以下)，y表示1或2的整數(shù)，L,表示從由-NH-、-0-、-O-Z-NH-、-CO-、-CH2-、-O-Z-S-Z-及-OCO-Z-NH-(此處，Z是獨(dú)立的C廣C6烯基。)組成的群組中選出的連結(jié)基，L2表示從-OCO-Z-CO_及-NHCO-Z-CO-(此處，Z為C廣C6烯基)中選出的連結(jié)基。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，上述嵌段共聚物的聚氨基酸側(cè)鏈的酯化或酰胺化率為40100%。6.根據(jù)權(quán)利要求15中任意一項(xiàng)所述的組合物，上述蛋白質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)(pi)為311.5。7.—種權(quán)利要求16中任意一項(xiàng)所述的高分子膠束組合物的制備方法，其特征在于，包含將上述嵌段共聚物和上述生理活性蛋白質(zhì)或多肽混合，通過將該混合液的pH調(diào)整為與該生理活性蛋白質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)(pi)不同的pH，使該生理活性蛋白質(zhì)或多肽內(nèi)包于由該嵌段共聚物構(gòu)成的膠束的疏水性核中的工序；此處，該蛋白質(zhì)或多肽的pl，該嵌段共聚物的疏水性鏈段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的等電點(diǎn)(pl')以及與上述pI不同的pH的關(guān)系為pI〉pH>pI,，所以在該pH下，該嵌段共聚物的疏水性鏈段帶負(fù)電，且該蛋白質(zhì)或多肽帶正電；或者為pI，〉pH〉pI，所以在該pH下，該嵌段共聚物的疏水性鏈段帶正電，且該蛋白質(zhì)或多肽帶負(fù)電。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，上述pH與上述水溶性高分子藥物的pl相離1以上。全文摘要本發(fā)明提供一種由內(nèi)包生理活性多肽或蛋白質(zhì)的、由親水性鏈段和疏水性鏈段構(gòu)成的嵌段共聚物所形成的高分子膠束組合物。文檔編號(hào)A61K38/00GK101489574SQ20078002680公開日2009年7月22日申請日期2007年4月25日優(yōu)先權(quán)日2006年7月18日發(fā)明者加藤泰己,原田充訓(xùn),大內(nèi)美穗,天野優(yōu)子申請人:那野伽利阿株式會(huì)社