專利名稱：用于輸送一氧化氮的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0003本申請涉及H-NOX蛋白和應(yīng)用它們輸送一氧化氮(NO)的方法。H-NOX蛋白提供了一個新的治療工具，用于將NO輸送到人，并且，用于獸醫(yī)的目的，將NO輸送到動物。

背景技術(shù)：
0004NO在體內(nèi)許多重要的過程的控制中充當化學(xué)信使，所述重要過程包括血管舒張、神經(jīng)傳遞、炎癥、血小板凝集、以及胃腸和血管平滑肌緊張的調(diào)節(jié)。由于Lauder Brunton和William Murrell在1867年發(fā)現(xiàn)了硝酸甘油(GTN)能夠治療心臟病病癥如心絞痛，有機硝酸鹽已經(jīng)被廣泛地用于治療急性血管收縮病例。在最近幾十年內(nèi)，血管舒張的機理已經(jīng)被闡明。NO，其在內(nèi)皮細胞中合成，擴散到平滑肌細胞并且激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)以產(chǎn)生環(huán)GMP，并且因此誘導(dǎo)血管舒張。然后，有機硝酸鹽作用的臨床機理被認為是需要它們生物轉(zhuǎn)化為NO并且隨后激活sGC。然而，由于被稱為耐受的現(xiàn)象，有機硝酸鹽在24-48小時后在患者中失效。因而，對于慢性高血壓病例的治療，化合物如β-阻斷劑和ACE抑制劑被使用，雖然它們也具有局限性和副作用。因此，硝基血管擴張劑(nitrovasodilator)在治療急性情況中最有用，在所述急性情況中需要迅速的血管舒張以減輕癥狀如心絞痛和心肌梗塞。有機硝酸鹽的延長給藥導(dǎo)致降低的效力，并且脈管系統(tǒng)變得不反應(yīng)；這種耐受阻止它們在慢性和急性病例中的進一步應(yīng)用。因而，對于急性治療，采用非連續(xù)的硝基血管擴張劑應(yīng)用，具有有限的效果。對于慢性血管收縮病例，其它的治療途徑被使用，典型地使用有機硝酸鹽和NO不依賴的血壓藥劑的混合用藥法，成敗參半。
0005關(guān)于耐受機理的兩個主要競爭性理論平行進行，以探求導(dǎo)致NO釋放的硝酸鹽的生物轉(zhuǎn)化的機理。因為NO被認為是有機硝酸鹽的血管擴張效應(yīng)的介質(zhì)，所以從有機硝酸鹽釋放NO的機理可能受到抑制，導(dǎo)致耐受。但是有機硝酸鹽如何在組織中進行新陳代謝地釋放NO尚未被理解。而且，基于機理的耐受理論是有問題的，因為耐受也降低了內(nèi)源性NO和外源性NO氣體在介導(dǎo)血管舒張中的效力。因此，有機硝酸鹽的生物轉(zhuǎn)化機理顯得不同于耐受的原因。競爭性理論在于對于來自有機硝酸鹽的NO的反應(yīng)在靶組織中受到抑制，可能是因為NO的產(chǎn)生和該反應(yīng)的副產(chǎn)品最終抑制了對NO的反應(yīng)，或因為NO通路的急性激活具有使其對于進一步的刺激脫敏的反饋機制。此理論被稱為終末器官耐受(end-organtolerance)。最近，統(tǒng)一的理論被提出，其包括有機硝酸鹽生物轉(zhuǎn)化的方面以及終末器官對于NO的脫敏。實質(zhì)上，有機硝酸鹽的生物轉(zhuǎn)化表現(xiàn)為導(dǎo)致組織中較高水平的過氧化物(O2-)。過氧化物以擴散速度與NO反應(yīng)，產(chǎn)生過硝酸鹽(OONO)。該反應(yīng)主要俘獲并破壞基礎(chǔ)NO，阻止其活化sGC。降低的NO水平導(dǎo)致血管收縮，并且OONO-是損傷組織的強有力的氧化劑。用有機硝酸鹽如GTN的延長治療可能導(dǎo)致患者高血壓和組織損傷，而這可以用共同施用抗氧化劑如抗壞血酸鹽來緩和。因此，用于將NO輸送到器官和組織以減輕血管收縮的改善的治療劑是主要的治療目標。
0006已經(jīng)對應(yīng)用基于血紅蛋白的載體輸送NO進行了一些研究。然而，由于在O2的存在下它們與NO的反應(yīng)性——其導(dǎo)致基于血紅蛋白的載體的失活，因此基于血紅蛋白的載體受到限制。NO直接與結(jié)合到血紅蛋白的O2反應(yīng)，以形成高鐵血紅蛋白和硝酸鹽。血紅素鐵和NO被結(jié)合的氧原子氧化，并且該反應(yīng)發(fā)生地非常迅速，以致沒有觀測到NO置換O2(參見，如美國專利第6,455,676號)。
0007由于NO被持續(xù)產(chǎn)生和消耗，在體內(nèi)存在NO的自然周轉(zhuǎn)。當無細胞的血紅蛋白被施用時，NO產(chǎn)生和消耗之間的平衡被與無細胞的血紅蛋白的反應(yīng)所改變。NO和結(jié)合到血紅蛋白的O2之間的氧化反應(yīng)是不可逆的，這導(dǎo)致了NO、O2和血紅蛋白的破壞。NO結(jié)合到?jīng)]有O2結(jié)合的血紅蛋白在生理時標上實際上是不可逆的，因為亞硝酰基血紅蛋白的解離的半衰期(half-life)是5-6小時，因而有效地使作為無細胞的NO載體的血紅蛋白失活。一旦NO分子與血紅蛋白反應(yīng)，其被從信號分子庫中除去，因而引起某些不利情形。例如，NO結(jié)合到血紅蛋白(有或沒有結(jié)合的O2)可以防止血管舒張并潛在地導(dǎo)致高血壓，其有時在施用某些細胞外血紅蛋白溶液之后被觀測到。
0008還需要NO以介導(dǎo)某些炎癥反應(yīng)。例如，由內(nèi)皮產(chǎn)生的NO抑制血小板凝集。因此，在NO被無細胞的血紅蛋白(具有或沒有O2結(jié)合)結(jié)合時，血小板凝集可能增加。在血小板凝集時，它們釋放有效的血管收縮化合物如血栓烷A2和5-羥色胺。這些化合物可以與由血紅蛋白的清除引起的降低的NO水平協(xié)同起作用，以產(chǎn)生顯著的血管收縮。除了抑制血小板凝集，NO還抑制中性粒細胞附著到細胞壁，其反過來能夠?qū)е录毎趽p壞。內(nèi)皮細胞壁損壞在用某些血紅蛋白溶液輸注時被觀察到。由于從血漿中除去無細胞的血紅蛋白的血紅蛋白受體的存在，基于血紅蛋白的NO載體也被來自血漿的無細胞的血紅蛋白的快速清除所阻礙。無細胞的血紅蛋白還可以引起腎毒性，可能是由于腎小球中NO的耗盡，引起縊痕(或縮窄)和隨后的機能障礙。
0009由于目前的硝基血管擴張劑治療的局限性，對于輸送NO的另外的或可選的治療仍然具有重大的意義和需要。特別是，需要產(chǎn)生較小耐受的NO載體。此外，在O2存在下具有低的NO鈍化速率的NO載體是期望的，如具有低NO反應(yīng)性和/或?qū)2的低親和力的NO載體。具有適合用于特定的臨床或工業(yè)應(yīng)用的NO解離常數(shù)或NO解離速率的NO載體也是需要的。
發(fā)明簡述 0010本發(fā)明部分地基于這樣令人驚奇的發(fā)現(xiàn)——野生型和突變H-NOX蛋白具有比血紅蛋白低的多的NO反應(yīng)性，并且因此是令人滿意的NO載體。如果需要，突變可以被引入到H-NOX蛋白中，以改變它們的NO和O2配體的結(jié)合，以進一步使優(yōu)化作為NO載體的H-NOX蛋白的應(yīng)用。在一些實施方式中，作為NO載體的H-NOX蛋白的應(yīng)用比目前的血管擴張劑——如有機硝酸鹽——的應(yīng)用，產(chǎn)生更小的耐受。
0011在一方面，本發(fā)明以突變H-NOX蛋白為特征。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明提供分離的H-NOX蛋白，其包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白相比，所述突變改變NO解離常數(shù)或NO反應(yīng)性。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白NO反應(yīng)性低至少10倍。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白NO反應(yīng)性低至少100倍，如比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1000倍。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的對NO koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1至大約10s-1之間，如在37℃大約1×10-4s-1至大約0.012s-1或大約1×10-4s-1至大約1×10-3s-1。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，如在37℃至少大約10μM或至少大約50μM。
0012在一些實施方式中，本發(fā)明提供分離的H-NOX蛋白，其包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白相比，所述突變改變對NO的koff、k1或k2或改變O2解離常數(shù)。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1至大約10s-1之間，并且突變H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1至大約0.012s-1之間或大約1×10-4s-1至大約1×10-3s-1之間。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約10μM，如至少大約50μM。在一些實施方式中，突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍，如比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍或比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1000倍。
0013在一些實施方式中，本發(fā)明提供分離的H-NOX蛋白，其選自騰沖嗜熱厭氧菌(T.tengcongensis)H-NOX I5A、騰沖嗜熱厭氧菌N-NOX I5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXP115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX R135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、L2 F9W-F142Y、脫硫脫硫弧菌(D.desulfuricans)H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌(D.desulfuricans)H-NOXY139L、β1(1-385)、β1(1-385)I145Y、β1(1-385)I145H、β1(1-194)、β1(1-194)I145Y、β1(1-194)L9W-I145Y、β2(1-217)、β2(1-217)I142Y、肉毒梭菌(C.botulinum)H-NOX(1-175)、肉毒梭菌(C.botulinum)H-NOX(1-186)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX(1-183)、以及秀麗隱桿線蟲(C.elegans)H-NOXGCY-35(1-252)。在一些實施方式中，β1或β2蛋白源自褐鼠(R.norvegicus)或智人(H.sapiens)β1或β2蛋白。
0014在一些實施方式中，本發(fā)明提供分離的H-NOX蛋白，其選自騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX R135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團菌(L.pneumophilia)2F9W-F142Y、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOX Y139L、β1(1-385)I145H、β1(1-194)、β1(1-194)I145Y、β1(1-194)L9W-I145Y、β2(1-217)、β2(1-217)I142Y、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-186)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)、以及秀麗隱桿線蟲H-NOX GCY-35(1-252)。在一些實施方式中，β1或β2蛋白源自褐鼠(R.norvegicus)或智人(H.sapiens)β1或β2蛋白。
0015在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的0.1至10倍之間，如在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的0.5至2倍之間。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在智人血紅蛋白α的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，如在智人血紅蛋白α的NO解離常數(shù)0.1至10倍之間或在0.5至2倍之間的NO解離常數(shù)。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比智人血紅蛋白α的NO反應(yīng)性低至少10倍，如比智人血紅蛋白α的NO反應(yīng)性低至少100倍或1000倍。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20℃為大約700s-1以下，如在20℃為大約600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1以下。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，如37℃為至少大約10μM或至少大約50μM。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的對NO koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1至大約10s-1之間，并且H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的對NO koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1至大約10s-1之間，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20℃為大約700s-1以下(如在20℃，為大約600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20℃為大約700s-1以下(如在20℃，為大約600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的對NO koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1至大約10s-1之間，并且H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20℃為大約700s-1以下(如在20℃，為600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。
0016在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，與從其衍生的H-NOX蛋白相比，H-NOX蛋白包含一個或多個突變(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個突變)。在不同的實施方式中，與從其衍生的H-NOX蛋白相比，H-NOX蛋白包含少于20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、或2個突變。在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有至少一個不在遠側(cè)袋中的突變。在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的酪氨酸140(Tyr140)或嗜肺軍團菌2的苯丙氨酸142(Phe142)的殘基被任何其它氨基酸置換。在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有至少兩個突變，其中至少一個突變是相應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的酪氨酸140(Tyr140)或嗜肺軍團菌2的苯丙氨酸142(Phe142)的殘基被任何其它的氨基酸置換。在一些實施方式中，H-NOX蛋白中的突變對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌的Y140F突變或Y140L突變或嗜肺軍團菌2的F142Y突變。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，與相應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)相比，H-NOX蛋白中的至少一個C末端氨基酸(如至少大約50個連續(xù)的C-末端氨基酸或在大約25至大約200個連續(xù)的C-末端氨基酸之間)被除去。在一些實施方式中，H-NOX蛋白是包含H-NOX蛋白——如褐鼠或智人β1或β2蛋白——的前194、217或385個氨基酸的缺失。
0017在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白來源于哺乳動物蛋白(如，人蛋白如β1)。在分離的H-NOX蛋白的各種實施方式中，H-NOX蛋白來源于細菌蛋白(如，騰沖嗜熱厭氧菌蛋白)。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白共價結(jié)合到另一分子或部分，如聚乙二醇。血紅素可以結(jié)合或可以不結(jié)合到H-NOX蛋白。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，NO被結(jié)合到H-NOX蛋白。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX結(jié)構(gòu)域和另一蛋白質(zhì)如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部。
0018在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、野生型褐鼠sGC、或嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型脫硫脫硫弧菌β1H-NOX、野生型脫硫脫硫弧菌CG14885-PA H-NOX、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻(N.punctiforme)H-NOX、野生型新月柄桿菌(C.crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOXI145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、或褐鼠sGC β1 H-NOX C78E。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-385)、或褐鼠β1(1-385)I145Y。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、或智人β1 H-NOX(1-385)I145Y。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、智人β1 I140Y、或智人β1 I145Y。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、智人β1 H-NOX I140Y、智人B1 I145Y、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOXI145Y、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型脫硫脫硫弧菌β1 H-NOX、野生型脫硫脫硫弧菌CG14885-PA H-NOX、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌(C.crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任何一種，所述下列H-NOX蛋白以它們的基因名稱列出，之后是它們的種縮寫和Genebank標識符(如從2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月21日；或2007年5月22日起可獲得的下列蛋白序列)Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(giNP_650424.2，gi62484298)、gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi32566352，gi86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi71985505)、GCY1α3_Hs_20535603、GCY1α2-Hs_899477或GYCα-99B_Dm_729270(gi68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancientconserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signalingproteins，”BMG Genomics45-13)。在這些名稱中使用的種縮寫包括Ana-魚腥藻某種(Anabaena Sp)；Ccr-新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde-脫硫脫硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)；Mcsp-趨磁細菌某種(Magnetococcus sp.)；Mde-Microbulbiferdegradans；Npu-點形念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp-渾球紅假單胞菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone-沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch-霍亂弧菌(Vibrio cholerae)；Ce-秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)；Dm-黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)；Hpul-馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs-智人(Homosapiens)。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任何一種，所述下列H-NOX蛋白以它們的生物體名稱和Pfam數(shù)據(jù)庫登錄號(如從2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；或2007年5月21日起可獲得的下列蛋白序列)列出線蟲種(Caenorhabditis briggsae)Q622M5_CAEBR、線蟲種Q61P44_CAEBR、線蟲種Q61R54_CAEBR、線蟲種Q61V90_CAEBR、線蟲種Q61A94_CAEBR、線蟲種Q60TP4_CAEBR、線蟲種Q60M10_CAEBR、秀麗隱桿線蟲GCY37_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY31_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY36_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY32_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY35_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY34_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodonnigroviridis)Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4S6K5_TETNG、紅鰭東方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopuslaevis)Q6INK9_XENLA、智人(Homo sapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人(Homosapiens)GCYB2_HUMAN、智人(Homo sapiens)GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorillagorilla)Q9N193_9PRIM、紅猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、獼猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌長臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Mus musculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q6XE41_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX7_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX8_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)Q920Q1_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q54A43_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)Q80WY0_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WY4_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)Q8CH85_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WY5_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)GCYB1_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q8CH90_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)Q91XJ7_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX9_RAT、褐鼠(Rattusnorvegicus)GCYB2_RAT、褐鼠(Rattus norvegicus)GCYA2_RAT、狗(Canisfamiliaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野豬(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、雙斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、煙草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、煙草天蛾(Manduca sexta)O76340_MANSE、蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂(Apis mellifera)Q5FAN0_APIME、蜜蜂(Apis mellifera)Q6L5L6_APIME、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PESTQ7PYK9A_NOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7Q9W6_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7QF31_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiaestr)PEST Q7PFY2_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)GCYH_DROME、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)GCY8E_DROME、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)GCYDA_DROME、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)GCYDB_DROME、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)Q9VA09_DROME、擬暗果蠅(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、擬暗果蠅(Drosophila pseudoobscura)Q296C7_DROPS、擬暗果蠅(Drosophilapseudoobscura)Q296C8_DROPS、擬暗果蠅(Drosophila pseudoobscura)Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、魚腥藻某種(Anabaena sp)Q8YUQ7_ANASP、黃桿菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白細菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白細菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)Q9A451_CAUCR、隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5Q2DG60_ACICY、渾球紅假單胞菌(Rhodobacter sphaeroides)Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyiQ5LPV1_SILPO、脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)Q5X268_LEGPA、嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)Q5X2R2_LEGPA、嗜肺軍團菌嗜肺亞種(Legionella pneumophila subsppneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺軍團菌嗜肺亞種Q5ZSQ8_LEGPH、Colwelliapsychrerythraea(一種嗜冷細菌)Q47Y43_COLP3、大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanellaoneidensis)Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14Q1ZWE5_9VIBR、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulniftcus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)12G01 Q1VCP6_VIBAL、弧菌某種(Vibrio sp)DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、費歇爾弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)Q7MJS8_VIBVY、發(fā)光菌某種(Photobacterium sp)SKA34Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensisQ2SFY7_HAHCH、海洋螺菌屬某種(Oceanospirillum sp)MED92Q2BKV0_9GAMM、海洋細菌某種(Oceanobacter sp)RED65Q1N035_9GAMM、脫硫脫硫弧菌Q310U7_DESDG、奧氏嗜熱鹽絲菌(Halothermothrix orenii)H 168Q2AIW5_9FIRM、騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicum)Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破傷風梭狀芽胞桿菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以及拜季林斯基氏梭菌(Clostridiumbeijerincki)NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE。在分離的H-NOX蛋白的一些實施方式中，H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突變，所述基序包括人H-NOX蛋白的Tyr135、Ser137、和Arg139。
0019在一方面，本發(fā)明以編碼本文描述的突變H-NOX蛋白的任何一個或多個的重組核酸為特征。在具體的實施方式中，所述核酸包括在圖2-4D或8A-8DD中示出的核酸的任一個的片段或完整核酸序列。在一些實施方式中，所述核酸編碼包括H-NOX結(jié)構(gòu)域和另一蛋白質(zhì)如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部的融合蛋白。在一些實施方式中，所述核酸包括來自H-NOX核酸的至少大約下列任何個數(shù)的連續(xù)核苷酸50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多個，并且與其來源的H-NOX核酸相比，包含一個或多個突變(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個突變)。在各種實施方式中，與其來源的H-NOX核酸相比，突變H-NOX核酸包含少于大約下列任一個數(shù)的突變20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、或2個。本發(fā)明也以編碼突變H-NOX蛋白的任一核酸的簡并變體為特征。
0020仍在另一方面，本發(fā)明提供載體，其包括本文描述的突變H-NOX核酸的任一個或多個。在另一方面，本發(fā)明以包括本文描述的突變H-NOX核酸的任一個或多個的細胞為特征。在一方面，本發(fā)明以包括本文描述的任何載體的細胞為特征。
0021在一方面，本發(fā)明以產(chǎn)生H-NOX蛋白的方法為特征。該方法包括在適合產(chǎn)生突變H-NOX蛋白的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞具有編碼本文描述的突變H-NOX蛋白的任一種或多種的核酸。在一些實施方式中，本發(fā)明進一步包括純化突變H-NOX蛋白的步驟。
0022在一方面，本發(fā)明的特征在于包括一種或多種H-NOX蛋白——如本文描述的野生型或突變H-NOX蛋白的任一種——的藥物組合物。在一些實施方式中，所述藥物組合物包括藥學(xué)上可接受量的本文描述的H-NOX蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對NO koff、k1或k2在37℃為大約1x 10-4s-1至大約10s-1，并且H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。
0023在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在智人血紅蛋白α的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，如在智人血紅蛋白α的NO解離常數(shù)的0.1至10倍之間或在0.5至2倍之間的NO解離常數(shù)。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性被智人血紅蛋白α的NO反應(yīng)性低至少10倍，如比智人血紅蛋白α的NO反應(yīng)性低至少100倍或1,000倍。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白是野生型蛋白質(zhì)。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白是如本文所述的突變蛋白。在藥物組合物的各種實施方式中，H-NOX蛋白具有至少一個突變，所述突變與相應(yīng)的野生型蛋白相比，改變了NO解離常數(shù)、對NO的koff、對NO的k1、對NO的k2、O2解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、NO反應(yīng)性、血紅素的自氧化速率、或前述的兩種或多種的任何組合。在藥物組合物的一些實施方式中，H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌(T.tengcongensis)H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜嗜熱桿菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX R135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、嗜肺軍團菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1 H-NOX、智人β1 I140Y、智人β1 I145Y、智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1 H-NOX H105G、智人β1 H-NOX H105F、智人β1 H-NOX C78S、智人β1 H-NOX C78E、野生型褐鼠β1 H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1 H-NOX H105G、褐鼠β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、褐鼠sGC β1 H-NOX C78E、肉毒梭狀芽胞桿菌(C.botulinum)H-NOX(1-175)、肉毒梭狀芽胞桿菌H-NOX(1-186)、野生型丙酮丁醇梭桿菌(C.acetobutylicum)H-NOX、丙酮丁醇梭桿菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭桿菌H-NOX(1-183)、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35H-NOX、秀麗隱桿線蟲H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蠅(D.melangaster)β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154、野生型點形念珠藻(N.punctiforme)H-NOX、野生型新月柄桿菌(C.crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黃牛(B.Taurus)H-NOX、野生型褐鼠；野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉(O.latipes)H-NOX、野生型O.curivatus H-NOX、野生型紅鰭東方鲀(F.rubripes)H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾(M.sexta)H-NOX、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-31、秀麗隱桿線蟲gcy-32、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-33、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-34、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-35、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-36、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-37；野生型霍亂弧菌(V.cholera)H-NOX、野生型費氏弧菌(V.fischerii)H-NOX、和野生型點形念珠藻H-NOX。在藥物組合物的具體實施方式
中，H-NOX蛋白選自野生型褐鼠sGC、野生型褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-194)、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、以及嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y。在藥物組合物的一些實施方式中，所述藥物組合物包括一種或多種脂質(zhì)體或納米粒子，所述脂質(zhì)體或納米粒子包括或包封所述H-NOX蛋白。
0024在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、野生型褐鼠sGC、或嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGCβ1 H-NOX(1-385)、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA H-NOX、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭桿菌H-NOX。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、褐鼠sGC β1H-NOX H105G、褐鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、褐鼠sGCβ1 H-NOX C78S、或褐鼠sGC β1 H-NOX C78E。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-385)、或褐鼠β1(1-385)I145Y。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、或智人β1 H-NOX(1-385)I145Y。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、智人β1 I140Y、或智人β1 I145Y。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、智人β1 H-NOX I140Y、智人B1 I145Y、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGCβ1 H-NOX(1-385)、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOXH105G、褐鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、野生型褐鼠β1H-NOX、野生型黑腹果蠅β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA H-NOX、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭桿菌H-NOX。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任一種，所述下列H-NOX蛋白以它們的基因名稱列出，隨后是它們的種名縮寫和Genbank標識符(如從2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月21日或2007年5月22日起可獲得的下列蛋白質(zhì)序列)Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(giNP_650424.2、gi62484298)、gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi32566352、gi86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi71985505)、GCY1β3_Hs_20535603、GCY1β2-Hs_899477、或GYCα-99B_Dm_729270(gi68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancientconserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signalingproteins，”BMG Genomics 45-13)。在這些名稱中使用的種縮寫包括Ana-魚腥藻某種(Anabaena Sp)；Ccr-新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde-脫硫脫硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)；Mcsp-趨磁細菌某種(Magnetococcus sp)；Mde-Microbulbiferdegradans；Npu-點形念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp-渾球紅假單胞菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone-沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch-霍亂弧菌(Vibrio cholerae)；Ce-秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)；Dm-黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)；Hpul-馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs-智人(Homosapiens)。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任一種，所述下列H-NOX蛋白被以它們的生物體名稱和Pfam數(shù)據(jù)庫登錄號(如從2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；2007年5月21；或2007年5月22日起可獲得的下列蛋白序列)列出線蟲種Q622M5_CAEBR、線蟲種Q61P44_CAEBR、線蟲種Q61R54_CAEBR、線蟲種Q61V90_CAEBR、線蟲種Q61A94_CAEBR、線蟲種Q60TP4_CAEBR、線蟲種Q60M10_CAEBR、秀麗隱桿線蟲GCY37_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY31_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY36_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY32_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY35_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY34_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryziascurvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4S6K5_TETNG、紅鰭東方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人(Homo sapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、紅猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、獼猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌長臂猿(Hylobateslar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Musmusculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Musmusculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q6XE41_MOUSE、小鼠(Musmusculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野豬(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、雙斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、煙草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、煙草天蛾O76340_MANSE、蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂Q5FAN0_APIME、蜜蜂Q6L5L6_APIME、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PESTQ7PYK9_ANOGA、岡比亞按蚊Anopheles gambiae str)PEST Q7Q9W6_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7QF31_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiaestr)PEST Q7PFY2_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蠅GCYH_DROME、黑腹果蠅GCY8E_DROME、黑腹果蠅GCYDA_DROME、黑腹果蠅GCYDB_DROME、黑腹果蠅Q9VA09_DROME、擬暗果蠅(Drosophilapseudoobscura)Q29CE1_DROPS、擬暗果蠅Q296C7_DROPS、擬暗果蠅Q296C8_DROPS、擬暗果蠅Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、魚腥藻某種(Anabaenasp)Q8YUQ7_ANASP、黃桿菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白細菌(marinegamma proteobacterium)HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白細菌(HTCC2207Q1YTK4_9GAMM、新月柄桿菌Q9A451_CAUCR、隱藏嗜酸菌(Acidiphiliumcryptum)JF-5Q2DG60_ACICY、渾球紅假單胞菌(Rhodobacter sphaeroides)Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)PD1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺軍團菌Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺軍團菌Q5X268_LEGPA、嗜肺軍團菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺軍團菌嗜肺亞種(Legionella pneumophila subsp pneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺軍團菌嗜肺亞種Q5ZSQ8_LEGPH、Colwellia psychrerythraea(一種嗜冷細菌)Q47Y43_COLP3、大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6cQ3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradansQ21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01Q1VCP6_VIBAL、弧菌某種(Vibrio sp)DAT722 Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)Q87NJ1__VIBPA、費歇爾弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、創(chuàng)傷弧菌Q7MJS8_VIBVY、發(fā)光菌某種(Photobacterium sp)SKA34Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺菌屬某種(Oceanospirillum sp)MED92 Q2BKV0_9GAMM、海洋細菌某種(Oceanobacter sp)RED65 Q1N035_9GAMM、脫硫脫硫弧菌Q310U7_DESDG、奧氏嗜熱鹽絲菌(Halothermothrix orenii)H 168 Q2AIW5_9FIRM、騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptorsaccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭桿菌(Clostridiumacetobutylicum)Q97E73_CLOAB、Alkdliphilus metalliredigenes QYMFQ3C763_9CLOT、破傷風梭狀芽胞桿菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以及拜季林斯基氏梭菌NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突變，所述基序包括人H-NOX的Tyr135、Ser137和Arg139。
0025除非另外明確指出或由上下文指明，本文描述的所有野生型和突變H-NOX蛋白可以被用于本文描述的藥物組合物的任何一種。H-NOX蛋白可以具有或不具有血紅素和/或結(jié)合的NO并且可以共價結(jié)合或可以不共價結(jié)合到另一個分子或部分，如聚乙二醇。在一些實施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX結(jié)構(gòu)域和另一蛋白質(zhì)——如白蛋白(例如，人血清白蛋白)——的部分或全部。
0026在一方面，本發(fā)明提供使用H-NOX蛋白將NO輸送到個體(例如，哺乳動物，如靈長類(例如，人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、馬、豬、犬科動物或貓科動物)的方法。在一些實施方式中，所述個體遭受心血管病癥、高血壓、由高血壓加劇的病癥、血管收縮性病癥、中風、或功能性NO缺乏或處于心血管病癥、高血壓、由高血壓加劇的病癥、血管收縮性病癥、中風、或功能性NO缺乏的風險。在具體的實施方式中，由高血壓加劇的病癥是心力衰竭、腎功能衰竭或中風。
0027因此，在一些實施方式中，本發(fā)明提供向個體(如，人)輸送NO的方法，該方法通過用足以將有效量的NO輸送到所述個體的量對需要其的個體施用H-NOX蛋白。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃為大約1×10-4s-1至大約10s-1，并且H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。
0028在所述方法的一些實施方式中，在H-NOX蛋白施用到所述個體之前，NO結(jié)合到H-NOX蛋白。在所述方法的一些實施方式中，在將H-NOX蛋白施用到所述個體之前，NO不結(jié)合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白將NO從個體中一個位置輸送到個體中另一位置。在所述方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白被經(jīng)口施用、直腸施用、或被施用到個體的血液中。在所述方法的具體的實施方式中，所述H-NOX蛋白被施用到個體的血液中。在所述方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白被施用到個體至少兩次。
0029在所述方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在智人血紅蛋白α的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，如NO解離常數(shù)在智人血紅蛋白α的NO解離常數(shù)的0.1至10倍之間或在0.5至2倍之間。在所述方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比智人血紅蛋白α的NO反應(yīng)性低至少10倍，如比智人血紅蛋白α的NO反應(yīng)性低至少100倍或1,000倍。在所述方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白是野生型蛋白。在所述方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白是如本文所述的突變蛋白。在所述方法的各種實施方式中，H-NOX蛋白具有至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變了NO解離常數(shù)、對NO的koff、對NO的k1、對NO的k2、O2解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、NO反應(yīng)性、血紅素的自氧化速率、或前述的兩種或多種的任何組合。在所述方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌(T.tengcongensis)H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX R135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、嗜肺軍團菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1 H-NOX、智人β1 I140Y、智人β1 I145Y、智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1 H-NOX H105G、智人β1 H-NOX H105F、智人β1 H-NOX C78S、智人β1 H-NOX C78E、野生型褐鼠β1 H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1H-NOX H105G、褐鼠β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、褐鼠sGC β1 H-NOX C78E、肉毒梭狀芽胞桿菌(C.botulinum)H-NOX(1-175)、肉毒梭狀芽胞桿菌H-NOX(1-186)、野生型丙酮丁醇梭桿菌(C.acetobutylicum)H-NOX、丙酮丁醇梭桿菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭桿菌H-NOX(1-183)、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35H-NOX、秀麗隱桿線蟲H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蠅(D.melangaster)β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154、野生型點形念珠藻(N.punctiforme)H-NOX、野生型新月柄桿菌(C.crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黃牛(B.Taurus)H-NOX、野生型褐鼠；野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉(O.latipes)H-NOX、野生型弓背青鳉H-NOX、野生型紅鰭東方鲀(F.rubripes)H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾(M.sexta)H-NOX；野生型秀麗隱桿線蟲gcy-31、秀麗隱桿線蟲gcy-32、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-33、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-34、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-35、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-36、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-37；野生型霍亂弧菌(V.cholera)H-NOX、野生型費氏弧菌H-NOX、和野生型點形念珠藻H-NOX。在所述方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白選自野生型褐鼠sGC、野生型褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-194)、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、以及嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y。在所述方法的一些實施方式中，一種或多種脂質(zhì)體或納米粒子包括或包封所述H-NOX蛋白。
0030在所述方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、野生型褐鼠sGC、或嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y。在藥物組合物的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L。在所述方法的一些實施方式中，H-NOX蛋白不是野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PAH-NOX、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭桿菌H-NOX。在所述方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGC β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、或褐鼠sGC β1 H-NOX C78E。在所述方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-385)、或褐鼠β1(1-385)I145Y。在所述方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、或智人β1 H-NOX(1-385)I145Y。在所述方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、智人β1I140Y、或智人β1 I145Y。在所述方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、智人β1H-NOX I140Y、智人B1 I145Y、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGCβ1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA H-NOX、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭桿菌H-NOX。在所述方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任一種，所述下列H-NOX蛋白以它們的基因名稱列出，隨后是它們的種名縮寫和Genbank標識符(如從2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月21日或2007年5月22日起可獲得的下列蛋白質(zhì)序列)Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(giNP_650424.2、gi62484298)、gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi32566352、gi86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi71985505)、GCY1β3_Hs_20535603、GCY1β2-Hs_899477、或GYCα-99B_Dm_729270(gi68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancientconserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signalingproteins，”BMG Genomics 45-13)。在這些名稱中使用的種縮寫包括Ana-魚腥藻某種(Anabaena Sp)；Ccr-新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde-脫硫脫硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)；Mcsp-趨磁細菌某種(Magnetococcus sp)；Mde-Microbulbiferdegradans；Npu-點形念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp-渾球紅假單胞菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone-沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch-霍亂弧菌(Vibrio cholerae)；Ce-秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)；Dm-黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)；Hpul-馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs-智人(Homosapiens)。在所述方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任一種，所述下列H-NOX蛋白被以它們的生物體名稱和Pfam數(shù)據(jù)庫登錄號(如從2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；2007年5月21；或2007年5月22日起可獲得的下列蛋白序列)列出線蟲種Q622M5_CAEBR、線蟲種Q61P44_CAEBR、線蟲種Q61R54_CAEBR、線蟲種Q61V90_CAEBR、線蟲種Q61A94_CAEBR、線蟲種Q60TP4_CAEBR、線蟲種Q60M10_CAEBR、秀麗隱桿線蟲GCY37_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY31_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY36_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY32_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY35_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY34_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryziascurvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4S6K5_TETNG、紅鰭東方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人(Homo sapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、紅猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan trogiodytes)Q9N192_PANTR、獼猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌長臂猿(Hylobateslar)Q9N191H_YLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Musmusculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Musmusculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q6XE41_MOUSE、小鼠(Musmusculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野豬(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、雙斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、煙草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、煙草天蛾O76340_MANSE、蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂Q5FAN0_APIME、蜜蜂Q6L5L6_APIME、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PESTQ7PYK9_ANOGA、岡比亞按蚊Anopheles gambiae str)PEST Q7Q9W6_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7QF31_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiaestr)PEST Q7PFY2_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蠅GCYH_DROME、黑腹果蠅GCY8E_DROME、黑腹果蠅GCYDA_DROME、黑腹果蠅GCYDB_DROME、黑腹果蠅Q9VA09_DROME、擬暗果蠅(Drosophilapseudoobscura)Q29CE1_DROPS、擬暗果蠅Q296C7_DROPS、擬暗果蠅Q296C8_DROPS、擬暗果蠅Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、魚腥藻(Anabaena sp)Q8YUQ7_ANASP、黃桿菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白細菌(marinegamma proteobacterium)HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白細菌HTCC2207Q1YTK4_9GAMM、新月柄桿菌Q9A451_CAUCR、隱藏嗜酸菌(Acidiphiliumcryptum)JF-5Q2DG60_ACICY、渾球紅假單胞菌(Rhodobacter sphaeroides)Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)PD 1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺軍團菌Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺軍團菌Q5X268_LEGPA、嗜肺軍團菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺軍團菌嗜肺亞種(Legionella pneumophila subsppneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺軍團菌嗜肺亞種Q5ZSQ8_LEGPH、Colwellia psychrerythraea(一種嗜冷細菌)Q47Y43_COLP3、大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6cQ3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)QgEF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradansQ21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01Q1VCP6_VIBAL、弧菌某種(Vibrio sp)DAT722 Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、費歇爾弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、創(chuàng)傷弧菌Q7MJS8_VIBVY、發(fā)光菌某種(Photobacterium sp)SKA34Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺菌屬某種(Oceanospirillum sp)MED92 Q2BKV0_9GAMM、海洋細菌某種(Oceanobacter sp)RED65 Q1N035_9GAMM、脫硫脫硫弧菌Q310U7_DESDG、奧氏嗜熱鹽絲菌(Halothermothrix orenii)H 168 Q2AIW5_9FIRM、騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptorsaccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭桿菌(Clostridiumacetobutylicum)Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMFQ3C763_9CLOT、破傷風梭狀芽胞桿菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以及拜季林斯基氏梭菌NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE。在所述方法的一些實施方式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R中不具有突變，所述基序包括人H-NOX的Tyr135、Ser137和Arg139。
0031除非另外明確指出或由上下文指明，本文描述的所有野生型和突變的H-NOX蛋白以及所有藥物組合物可以被用于本文描述的輸送NO的任何方法。H-NOX蛋白可以具有或可以不具有血紅素和/或結(jié)合的NO并且可以共價結(jié)合或可以不共價結(jié)合到另外一個分子或部分，如聚乙二醇。在一些實施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX結(jié)構(gòu)域和另一蛋白質(zhì)——如白蛋白(例如，人血清白蛋白)——的部分或全部。
0032在一方面，本發(fā)明以包括一種或多種H-NOX蛋白的試劑盒為特征。在一些實施方式中，本發(fā)明提供試劑盒，該試劑盒包括H-NOX蛋白和使用該試劑盒將NO輸送到個體的說明。在一些實施方式中，H-NOX蛋白對NO的koff、k1或k2在37℃為大約1×10-4s-1至大約10s-1，并且H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。除非另外明確指出或由上下文指明，本文描述的所有野生型和突變H-NOX蛋白以及所有藥物組合物可以被用于本文描述的任何試劑盒。H-NOX蛋白可以具有或不具有血紅素和/或結(jié)合的NO并且可以共價結(jié)合或可以不共價結(jié)合到另外一個分子或部分，如聚乙二醇。在一些實施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX結(jié)構(gòu)域和另一蛋白質(zhì)——如白蛋白(例如，人血清白蛋白)——的部分或全部。
0033在一方面，本發(fā)明的特征在于用作藥劑的H-NOX蛋白(如本文描述的野生型或突變蛋白的任一種)。在一些實施方式中，本發(fā)明以H-NOX蛋白為特征，所述H-NOX蛋白用于將NO輸送到個體的方法。在一些實施方式中，H-NOX蛋白被用于治療輸送NO對其有益的任何病癥，如心血管病癥、高血壓、由高血壓加劇的病癥(如，心力衰竭、腎功能衰竭或中風)、血管收縮性病癥、中風或功能性NO缺乏。
0034在一些實施方式中，本發(fā)明以H-NOX蛋白(如本文描述的野生型或突變蛋白的任一種)在藥物——如用于向個體輸送NO的藥物——制備中的應(yīng)用為特征。在一些實施方式中，本發(fā)明以H-NOX蛋白在向個體輸送NO中的應(yīng)用為特征。在一些實施方式中，H-NOX蛋白被用于治療輸送NO對其有益的任何病癥，如心血管病癥、高血壓、由高血壓加劇的病癥(如，心力衰竭、腎功能衰竭或中風)、血管收縮病癥、中風或功能性NO缺乏。
附圖簡述 0035

圖1A是NO-結(jié)合的和O2-結(jié)合的H-NOX蛋白的遠側(cè)袋殘基的三維結(jié)構(gòu)圖(在血紅素之上)。NO-結(jié)合的和O2-結(jié)合的H-NOX蛋白的血紅素配位殘基也被示出(在血紅素之下)。圖1A基于由Pellicena，P.等人(2004年8月31日).“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble GuanylateCyclases，”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35)12854-12859報道的騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的三維結(jié)構(gòu)。
0036圖1B是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的三維結(jié)構(gòu)的立體側(cè)視圖，圖解說明了H-NOX結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征。蛋白折疊以帶狀圖(ribbon diagram)表示。血紅素、雙氧配體以及近端組氨酸以球棒模型顯示。根據(jù)圖5B中示出的命名法，α-螺旋被標記為A-G。β-折疊被標記1-4。圖1B來自Pellicena，P.等人(2004年8月31日)，“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to SolubleGuanylate Cyclases，”Proc Natl.AcadSci USA 101(35)12854-12859。
0037圖1C-1H是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的三維結(jié)構(gòu)圖，其舉例說明了示范性的騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的遠側(cè)袋殘基。在圖1C-1H中描述的下列殘基是構(gòu)成H-NOX遠側(cè)袋的主要殘基Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140、和Leu144，其被包含在螺旋A、D、E和G中。應(yīng)用PYMOL(DeLano Scientific，LLP)制作圖1C-1H。
0038圖2是下列H-NOX蛋白的序列對比，所述H-NOX蛋白結(jié)合或被預(yù)測結(jié)合O2和NO多數(shù)(Majority)(SEQ ID NO1)；Ce.gcy-31(SEQ ID NO2)；Ce.gcy-33(SEQ ID NO3)；Ce.gcy-35(SEQ ID NO4)；Dm.CG14885 HNOX(SEQID NO5)；Dm.CG4154 HNOX(SEQ ID NO6)；Ms.Beta3 HNOX(SEQ ID NO7)；Tt HNOX(SEQ ID NO8)；以及Ca HNOX(SEQ ID NO9)。這些H-NOX蛋白被預(yù)測結(jié)合O2以及NO，因為它們在相應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Y140的位置具有酪氨酸。在圖2中使用的氨基酸編編號是從H-NOX結(jié)構(gòu)域或全長蛋白質(zhì)中的第一個氨基酸起始，作為第1個殘基。采用程序MegAlign中的默認參數(shù)進行對比。圖2中使用的縮寫在下文參考圖4A-4D進行描述。
0039圖3A-3D是下列H-NOX蛋白的序列對比，所述H-NOX蛋白結(jié)合或被預(yù)測結(jié)合NO而不是O2多數(shù)(Majority)(SEQ ID NO10)；Dm.sGC β1蛋白(SEQ ID NO11)；sGCβ1蛋白(SEQ ID NO12)；hs.sGC β1蛋白(SEQ ID NO13)；hs.β2蛋白(SEQ ID NO14)；Ms.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO15)；Mm.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO16)；Np.β1HD-樣(SEQ ID NO17)；Tr.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO18)；岡比亞按蚊(Anopheles_gambiae)|XP_310919(SEQ ID NO19)；蜜蜂(Apis_mellifera)|NP_001011632(SEQ ID NO20)；Bt.sGC β1蛋白(SEQ IDNO21)；萊茵衣藻(Chlamydomonas_reinhardtii)|AAR02(SEQ ID NO22)；弓背青鳉(Oryzias_curvinotus)|BAC98396(SEQ ID NO23)；青鳉(Oryzias_latipes)|BAA76691(SEQ ID NO24)；紫球海膽(Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQ IDNO25)；以及Sus scrofa beta1|NP_001018042+(SEQ ID NO26)。采用程序MegAlign中的默認參數(shù)進行對比。圖3A-3D中使用的縮寫在下文參考圖4進行描述。
0040圖4A-4D是來自圖2和圖3A-3D的H-NOX蛋白的序列對比多數(shù)(Majority)(SEQ ID NO27)；Dm.sGC β1蛋白(SEQ ID NO11)；sGC β1蛋白(SEQ ID NO12)；hs.sGC β1蛋白(SEQ ID NO13)；hs.β2蛋白(SEQ ID NO14)；Mm.sGC β1蛋白(SEQ ID NO16)；Np.β1 HD-樣(SEQ ID NO17)；Tr.sGC β1蛋白(SEQID NO18)；萊茵衣藻(Chlamydomonas_reinhardtii)|AAR02(SEQ ID NO22)；弓背青鳉(Oryzias_curvinotus)|BAC98396(SEQ ID NO23)；紫球海膽(Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQ ID NO25)；野豬(Sus scrofa)β1|NP_001018042(SEQ ID NO26)；gcy-31a(SEQ ID NO2)；gcy-33(SEQ ID NO3)；Ca.HNOX(SEQ ID NO9)；T.β1HD-樣(SEQ ID NO8)，Ms.sGc β3蛋白(SEQ IDNO7)；CG14885(SEQ ID NO5)；和Dm.sGC短變體(SEQ ID NO6)。采用程序MegAlign中的默認參數(shù)產(chǎn)生該對比。對于圖2-4D，“Dm.sGC β1蛋白”表示黑腹果蠅β1 H-NOX，“sGC β1蛋白”表示褐鼠β1 H-NOX；“hs.sGC β1蛋白”表示智人β1H-NOX；“hs.β2蛋白”表示智人β2 H-NOX；“Mm.sGCβ1蛋白”表示小鼠β1H-NOX；“Np.β1HD-樣”表示點形念珠藻H-NOX；“Tr.sGC β1蛋白”表示紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)β1 H-NOX；“Anopheles_gambiae|XP_310919”表示岡比亞按蚊β1 H-NOX；“Apis_mellifera|NP_001011632”表示蜜蜂β1 H-NOX；“Bt.sGC β1蛋白”表示牛β1 H-NOX；“Chlamydomonas_reinhardtii|AAR02”表示萊茵衣藻β1H-NOX；“Oryzias_curvinotus|BAC98396表示弓背青鳉β1 H-NOX；“Oryzias_latipes|BAA76691”表示青鳉β1H-NOX；“Strongylocentrotus_purpuratus|X”表示紫球海膽β1 H-NOX；“Sus serofa β1|NP_001018042+”表示野豬β1 H-NOX；“gcy-31a”表示秀麗隱桿線蟲Gcy-31a H-NOX；“gcy-33”表示秀麗隱桿線蟲Gcy-33H-NOX，“gcy-35”表示秀麗隱桿線蟲Gcy-35 H-NOX；“Ca.HNOX”表示丙酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutiylicum)H-NOX；“T.β1HD-樣”表示騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX；“Ms.sGc β3蛋白”表示煙草天蛾β3H-NOX；“CG14885”表示黑腹果蠅CG14885 H-NOX；“Dm.sGC短變體”表示黑腹果蠅Gcy-88-E-S H-NOX，而“Dm.CG4154 HNOX”表示黑腹果蠅CG4154H-NOX。
0041圖5A是H-NOX家族的成員的序列對比。序列編號是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的編號。不變殘基用“V”表示，非常高度保守的殘基以“s”表示。騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Y140以“H.”表示。在其它的H-NOX蛋白中可以穩(wěn)定FeII-O2復(fù)合物的推測的遠側(cè)袋酪氨酸殘基是對于秀麗隱桿線蟲GCY-35是位置70；在黑腹果蠅CG14885-PA中是位置140；秀麗隱桿線蟲GCY-35的位置138；丙酮丁醇梭桿菌的位置140；根據(jù)騰沖嗜熱厭氧菌進行編號。登錄號為智人β1[gi2746083](SEQ ID NO28)、褐鼠β1[gi27127318](SEQ ID NO29)、黑腹果蠅β1[gi861203](SEQ ID NO30)、黑腹果蠅CG14885-PA[gi23171476](SEQ ID NO31)、秀麗隱桿線蟲GCY-35[gi52782806](SEQ ID NO32)、點形念珠藻[gi23129606](SEQ IDNO33)、新月柄桿菌[gi16127222](SEQ ID NO34)、沙雷氏菌[gi24373702](SEQ IDNO35)、嗜肺軍團菌(ORF 2)[CUCGC_272624](SEQ ID NO36)、丙酮丁醇梭桿菌[gi15896488](SEQ ID NO37)、以及騰沖嗜熱厭氧菌[gi20807169](SEQ IDNO38)。采用程序MegAlign、Lasergene、DNA Star(見萬維網(wǎng)“dnastar.com/products/megalign.php”)，生成對比。Clustal-W默認參數(shù)被采用。
0042圖5B是示例性H-NOX結(jié)構(gòu)域的序列對比。該對比頂部的二級結(jié)構(gòu)注解和編號對應(yīng)于來自騰沖嗜熱厭氧菌的H-NOX結(jié)構(gòu)域。α-螺旋以螺旋表示，而β-折疊以箭頭表示。遠側(cè)袋由α-螺旋αA、αD、αE以及αG限定。Pubmed/NCBI登錄號如下Ther_tengcongensis gi 20807169.(SEQ ID NO39)、Clos_acetobutylicum gi 15896488.(SEQ ID NO40)、Clos_tetani GI75543266(SEQ ID NO41)、Desu_desulfuricans gi 23475919.(SEQ ID NO42)、Vibr_vulnificus gi 27361734.(SEQ ID NO43)、Caul_crescentusgi 16127222.(SEQ ID NO44)、Micr_degradans gi 23027521.(SEQ ID NO45)、Vibr_cholerae gi 15601476.(SEQ ID NO46)、Shew_oneidensisgi 24373702(SEQ ID NO47)、Rat_beta1_sGC gi 27127318.(SEQ ID NO48)、Rat_beta2_sGC gi 21956635.(SEQ ID NO49)、Nost_punctiformegi 23129606.(SEQ ID NO50)以及Nost_sp.gi 17229770.(SEQ ID NO51)。共有序列被顯示在圖5B(SEQ ID NO52)的底部。采用程序MULTALIN(Corpet，F(xiàn).(1988)Nucleic Acids Res.1610881-10890)生成對比，并且采用程序ESPRIPT(Gouet，P.et al.(1999)Bioinformatics 15305-308.)制作圖5B。
0043圖6A和6B是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX結(jié)構(gòu)域的血紅素環(huán)境的三維結(jié)構(gòu)圖。圖6A和6B來自Pellicena，P等人2004年8月31日)，“Crystal Structure ofAn Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35)12854-12859。
0044圖7A-7F是對于Tt H-NOX(圖7A)、Tt Y140L(圖7B)、Tt W9F-Y140L(圖7C)、Tt F78Y-Y140L(圖7D)、L2 H-NOX和L2 F142Y(圖7E)以及β1(1-385)和β1(1-385)I145Y(圖7F)，在暴露于空氣(FeII-O2復(fù)合物；每個圖的底部圖線)之前和之后，在厭氧還原作用(FeII未連接復(fù)合物；每個圖的頂部圖線)后H-NOX蛋白的UV-可見光光譜圖。除了L2 F142Y和β1(1-385)I145Y的FeII和FeII-O2復(fù)合物之外，在還原并且暴露于空氣之后的野生型L2 H-NOX和β1-(1-385)H-NOX的光譜分別在圖7E和7F中的中間圖線中被示出，表明這些蛋白質(zhì)在加入遠側(cè)袋酪氨酸之前不結(jié)合O2。書寫在每一組曲線的左上角的兩個或三個數(shù)字代表圖中的圖線峰的波長。所述數(shù)字以其中相應(yīng)的圖線在圖中垂直出現(xiàn)的順序進行垂直書寫。例如，在圖7A中的430nm的值表示該圖中頂部圖線的波長的峰(其代表FeII未連接的復(fù)合物)，而圖7A中416nm的值表示該圖中底部圖線的波長的峰(其代表FeII-O2復(fù)合物)。在空氣的存在下，波長的偏位表示該蛋白質(zhì)結(jié)合O2。在空氣存在下，500和600nm之間的雙峰的形成也可表示O2結(jié)合。圖7A-7F來自Boon，E.M等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chem.Biol.153-59。
0045圖8A-gD包括編碼H-NOX蛋白的示例性核酸的多核苷酸序列及相應(yīng)的H-NOX蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NOS53-162)。
發(fā)明詳述 0046本發(fā)明部分地基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)——H-NOX蛋白具有比血紅蛋白低得多的NO反應(yīng)性。由于在O2存在下NO使H-NOX蛋白失活的可能性較低，這種固有的低NO反應(yīng)性(和高NO穩(wěn)定性)使野生型和突變H-NOX蛋白成為期望的NO載體。重要的是，在一些H-NOX蛋白中的遠側(cè)袋酪氨酸的存在(Pellicena，P.等人，(August 31，2004)，“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme DomainRelated to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl.Acad Sci USA101(35)12854-12859)提示了不期望的高NO反應(yīng)性，表明用作NO載體不可取。例如，通過類推，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)血紅蛋白——其具有結(jié)構(gòu)類似的遠側(cè)袋酪氨酸——與NO極其迅速地反應(yīng)，且被分枝桿菌(Mycobacterium)用于有效地清除和避免由受到感染的宿主產(chǎn)生的防御性NO(Ouellet，H.等人(2002年4月30日)，“Truncated Hemoglobin HbN ProtectsMycobacterium Bovis From Nitric Oxide，”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A99(9)5902-5907)。然而，我們驚訝地發(fā)現(xiàn)H-NOX蛋白實際上具有比血紅蛋白低得多的NO反應(yīng)性，這使它們用作NO載體成為可能。
0047此外，發(fā)現(xiàn)可以通過改變H-NOX蛋白對于NO或O2的親和性以使結(jié)合到H-NOX蛋白的NO的量最大并且減少被NO與結(jié)合到H-NOX蛋白的O2的反應(yīng)所氧化的H-NOX蛋白的量，來提高H-NOX蛋白作為NO載體的有效性。特別是，H-NOX蛋白對于NO或O2的親和性以及H-NOX蛋白區(qū)分NO和O2配體的能力可以通過引入一個或多個氨基酸突變而改變，使得H-NOX蛋白適合以期望的親和性結(jié)合NO或O2。例如，通過H-NOX蛋白結(jié)合NO或O2的解離常數(shù)或解離速率可以通過引入單個氨基酸突變而改變。另外的突變可以被引入，以進一步改變對NO和/或O2的親和性。H-NOX蛋白家族因此可以被操作，以顯示改善或最佳的NO輸送的動力學(xué)和熱力學(xué)特性。例如，突變H-NOX蛋白被制備，其具有改變的NO結(jié)合的解離常數(shù)和/或解離速率，其提高了H-NOX蛋白對于多種臨床和工業(yè)應(yīng)用的有效性。在一些實施方式中，具有低O2親和力的H-NOX蛋白(如在37℃至少大約1μM的O2解離常數(shù))被用于使結(jié)合H-NOX蛋白的O2的量減到最少，因而促進NO與H-NOX蛋白的結(jié)合，并且減少由于NO與結(jié)合到H-NOX蛋白的血紅素的O2反應(yīng)而被氧化的H-NOX蛋白的量。H-NOX蛋白的氧化的這種減少導(dǎo)致可以被受治療個體的器官、組織、以及細胞利用的NO和O2的破壞較少。調(diào)節(jié)H-NOX蛋白結(jié)合并輸送NO的能力是解決和克服當前血管擴張劑的主要缺點的治療途徑。因此，本發(fā)明提供用于NO輸送的蛋白質(zhì)、組合物、試劑盒以及方法。
0048使用用于NO輸送的H-NOX蛋白有許多優(yōu)點。有機硝酸鹽對于由于耐受引起的有限時長是有效的。因為H-NOX蛋白直接將NO輸送到個體而不要求硝酸鹽到NO的生物轉(zhuǎn)化，H-NOX蛋白作為NO載體的效應(yīng)不被這種生物轉(zhuǎn)化途徑的抑制所限制。血紅蛋白基的NO載體的主要局限性是它們對于O2的高親和力以及它們被NO鈍化的傾向。如上面提到的，即使低水平的NO被血紅蛋白基的載體破壞，可以對脈管系統(tǒng)和器官的緊張性靜止狀態(tài)(tonic resting state)具有嚴重的影響并且導(dǎo)致高血壓和胃腸的不良應(yīng)激。在被用作氧載體時，分子內(nèi)和分子間交聯(lián)已經(jīng)被用于使血紅蛋白基運載工具的毒性降到最低(“Blood Substitutes，”R.Winslow ed.Academic Press，2006)。雖然這些修飾克服了與血紅蛋白外滲有關(guān)的一些嚴重毒性問題，但仍保持高NO反應(yīng)性。相反地，H-NOX蛋白具有比血紅蛋白低得多的NO反應(yīng)性。由于較少的NO與結(jié)合到H-NOX蛋白的O2反應(yīng)，這種較低的反應(yīng)性導(dǎo)致NO、O2以及H-NOX蛋白的破壞較少。選擇具有期望的NO解離常數(shù)和解離速率的H-NOX蛋白的能力也可以通過防止太多的NO釋放(引起低血壓)使副作用降到最低，并且防止NO在不期望的部位(如，沒有血管收縮的部位)被釋放。工程改造H-NOX蛋白以在最小的NO反應(yīng)性下結(jié)合并輸送NO，提供了一種新的血液氣體NO載體，其中所述H-NOX蛋白輸送NO而不被NO鈍化。這些H-NOX蛋白、組合物、試劑盒以及方法在本文被進一步描述。
0049對于NO的輸送，工程H-NOX蛋白代表了重要的替代選擇，其克服了長期存在的當前硝基血管擴張劑耐受問題。H-NOX蛋白作為NO輸送媒介的應(yīng)用提供了治療慢性高血壓加重的疾病的新的治療途徑。
H-NOX蛋白 H-NOX蛋白家族綜述 0050除非另外指出，任何野生型或突變H-NOX蛋白可以在如本文所述的組合物、試劑盒以及方法中被使用。如本文所用的，“H-NOX蛋白”是指具有H-NOX結(jié)構(gòu)域(稱為血紅素-一氧化氮以及氧(Heme-Nitric oxide and OXygen)結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的蛋白質(zhì)。H-NOX蛋白可以包含或不包含一個或多個除了H-NOX結(jié)構(gòu)域之外的其它結(jié)構(gòu)域。H-NOX蛋白是高度保守的、充分表征的血紅素蛋白家族的成員(Iyer，L.M等人(2003年2月3日)，“Ancient Conserved Domains Shared byAnimal Soluble Guanylyl Cyclases And Bacterial Signaling Proteins，”BMC Genomics4(1)5；Karow，D.S等人(2004年8月10日)，“Spectroscopic Characterization of theSoluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae AndThermoanaerobacter Tengcongensis，”Biochemistry 43(31)10203-10211；Boon，E.M等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chem.Biol.153-59；Boon，E.M.等人(2005年10月)，“Ligand Discriminationin Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins，”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5)441-446；Boon，E.M.等人(2005)，“Ligand Specificity ofH-NOX DomainsFrom sGC to Bacterial NO Sensors，”J.Inorg.Biochem.99(4)892-902)。H-NOX蛋白也被稱為Pfam 07700蛋白或HNOB蛋白(Pfam-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域家族對比和隱蔽馬爾科夫模型(Hidden Markov Models)的數(shù)據(jù)庫，Copyright(C)1996-2006 The Pfam Consortium；GNU LGPL Free SoftwareFoundation，Inc.，59 Temple Place-Suite 330，Boston，MA 02111-1307，USA)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有，或被預(yù)測具有包括六個α-螺旋、隨后是兩個β折疊、接著是一個α-螺旋、之后是兩個β折疊的二級結(jié)構(gòu)。H-NOX蛋白可以是能夠結(jié)合血紅素的脫輔基蛋白質(zhì)或具有結(jié)合的血紅素的全蛋白質(zhì)。H-NOX蛋白能夠共價地或非共價地結(jié)合血紅素基團。一些H-NOX蛋白結(jié)合NO但不結(jié)合O2，而另外的H-NOX蛋白結(jié)合NO和O2。來自已經(jīng)被分離的兼性好氧菌的H-NOX結(jié)構(gòu)域結(jié)合NO但不結(jié)合O2。來自專性好氧原核生物、秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅的H-NOX蛋白結(jié)合NO和O2。哺乳動物具有兩種H-NOX蛋白β1和β2。小鼠、大鼠、母牛以及人H-NOX序列的對比顯示這些物種共有99％的同一性。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的H-NOX結(jié)構(gòu)域或整個H-NOX蛋白與天然存在的騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX蛋白或天然存在的sGC蛋白(如，天然存在的sGC β1蛋白)的相應(yīng)區(qū)域具有至少大約10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99.5％的同一性之一。如本文進一步討論的，與相應(yīng)的天然存在的H-NOX蛋白相比，H-NOX蛋白可以任選地包含一個或多個突變。在一些實施方式中，H-NOX蛋白包括除了H-NOX結(jié)構(gòu)域之外的一個或多個結(jié)構(gòu)域。在具體的實施方式中，H-NOX蛋白包括來自另一個蛋白質(zhì)的一個或多個結(jié)構(gòu)域或整個序列。例如，H-NOX蛋白可以是融合蛋白，該融合蛋白包括H-NOX結(jié)構(gòu)域和另一蛋白質(zhì)如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部。在一些實施方式中，只有H-NOX結(jié)構(gòu)域存在。
0051來自騰沖嗜熱厭氧菌的原核O2-結(jié)合H-NOX的晶體結(jié)構(gòu)(Nioche，P.等人(2004年11月26日)，“Femtomolar Sensitivity of a NO Sensor From ClostridiumBotulinum，”Science 306(5701)1550-1553；Pellicena，P.等人(2004年8月31日).“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble GuanylateCyclases，”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35)12854-12859)表明，酪氨酸側(cè)鏈羥基形成與FeII-O2部分的關(guān)鍵H鍵。這種遠側(cè)袋氫鍵合網(wǎng)絡(luò)——其主要涉及Y140——使FeII-O2復(fù)合物穩(wěn)定(圖6B)。該酪氨酸不存在于排斥O2并只結(jié)合NO的H-NOX蛋白中。例如，這種氫鍵合網(wǎng)絡(luò)被預(yù)測在來自sGC和好氧原核生物的H-NOX蛋白中不存在，表明這在由這些血紅素蛋白顯示出的針對O2的顯著配體選擇性中是關(guān)鍵的分子因素。圖7A-7G清楚地表明，在結(jié)合NO而不結(jié)合O2的野生型H-NOX蛋白的遠側(cè)袋中添加酪氨酸可以使突變H-NOX蛋白能夠結(jié)合O2。因而，在H-NOX血紅素折疊的遠側(cè)血紅素袋中的酪氨酸發(fā)揮開關(guān)一樣的作用，以開啟或關(guān)閉O2結(jié)合。
0052如在圖6A和6B中所示的，卟啉的結(jié)構(gòu)被高度扭曲。如在圖6A中圖示的，保守的Y-S-R基序使氫鍵合與血紅素基的丙酸側(cè)鏈相互作用。圖6B，保守的H102是血紅素的近側(cè)配體(圖6B)。
0053如本文所用的，“蛋白質(zhì)”包括無論分離自天然來源、由重組技術(shù)產(chǎn)生的、或化學(xué)合成的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段。蛋白質(zhì)可以具有一種或多種修飾，如翻譯后修飾(如，糖基化，等)或任何其它修飾(如，PEG化，等)。蛋白質(zhì)可以包含一個或多個非天然存在的氨基酸(例如，如具有側(cè)鏈修飾的氨基酸)。在不同的實施方式中，H-NOX蛋白具有至少大約50、100、150、181、200、250、300、350、400、或更多個氨基酸。在一些實施方式中，H-NOX蛋白可以包括大約50至大約600個氨基酸，如大約100至大約500個氨基酸、大約150至大約400個氨基酸、大約150至大約300個氨基酸、或大約175至大約200個氨基酸。
H-NOX蛋白的來源 0054來自任何屬或種的H-NOX蛋白可以被用在本文描述的組合物、試劑盒和方法中。在不同的實施方式中，H-NOX蛋白為來自哺乳動物(如靈長類(如人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、馬、豬、犬科或貓科)、昆蟲、酵母、或細菌的蛋白質(zhì)，或來源于這類蛋白質(zhì)。示例性的哺乳動物H-NOX蛋白包括野生型人和大鼠可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(如β1亞基)。H-NOX蛋白的例子包括野生型哺乳動物H-NOX蛋白，所述野生型哺乳動物如智人、小鼠、家犬、牛和褐鼠；以及野生型非哺乳動物的脊椎動物H-NOX蛋白，所述野生型非哺乳動物的脊椎動物如爪蟾、弓背青鳉、O.curivatus和紅鰭東方鲀。非哺乳動物野生型NO-結(jié)合H-NOX蛋白的例子包括黑腹果蠅、岡比亞按蚊以及煙草天蛾的野生型H-NOX蛋白；非哺乳動物野生型O2結(jié)合H-NOX蛋白的例子包括下列動物的野生型H-NOX蛋白秀麗隱桿線蟲gcy-31、gcy-32、gcy-33、gcy-34、gcy-35、gcy-36和gcy-37；黑腹果蠅CG14885、CG14886和CG4154；以及煙草天蛾β-3；原核野生型H-NOX蛋白的例子包括騰沖嗜熱厭氧菌、霍亂弧菌、費氏弧菌、點形念珠藻、脫硫脫硫弧菌、嗜肺軍團菌1、嗜肺軍團菌2、和丙酮丁醇梭菌的野生型H-NOX蛋白。
0055示例性H-NOX蛋白的NCBI登錄號包括下列智人(Homo sapiens)β1[gi2746083]、褐鼠(Rattus norvegicus)β1[gi27127318]、黑腹果蠅(Drosophilamelangaster)β1[gi861203]、黑腹果蠅(Drosophila melangaster)CG14885-PA[gi23171476]、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)GCY-35[gi52782806]、點形念珠藻(Nostoc punctiforme)[gi23129606]、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)[gi16127222]、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis[gi24373702]、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)(ORF 2)[CUCGC_272624]、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)[gi15896488]以及騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)[gi20807169]。
0056示例性H-NOX蛋白還包括下列H-NOX蛋白，其按照它們的基因名、接著是它們的種的縮寫和Genbank標識符加以列出(如從2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；或2007年5月21日起可獲得的下列蛋白序列，其各自以其全部通過引用由此被并入)Npun5905_Npu_23129606，alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476，CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169，Ddes2822_Dde_23475919，CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455，GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(giNP_650424.2、gi62484298)、gcy-32_Ce_13539160，gcy-36_Ce_17568391(gi32566352、gi86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi71985505)、GCY1a3_Hs_20535603、GCY1a2-Hs_899477、或GYCa-99B_Dm_729270(gi68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancient conserved domains shared byanimal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins，”BMG Genomics45-13)。在這些名稱中使用的種的縮寫包括Ana-魚腥藻(Anabaena Sp)；Ccr-新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)；Cac-丙酮丁醇梭桿菌(Clostridiumacetobutylicum)；Dde-脫硫脫硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp-趨磁細菌某種(Magnetococcus sp)；Mde-Microbulbifer degradans；Npu-點形念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp-渾球紅假單胞菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone-沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte-騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)；Vch-霍亂弧菌(Vibrio cholerae)；Ce-秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)；Dm-黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)；Hpul-馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)；Hs-智人(Homo sapiens)。
0057其它示范性的H-NOX蛋白包括下列H-NOX蛋白，其按照它們的生物體名稱和Pfam數(shù)據(jù)庫登錄號(如從2006年5月21日；2006年5月22日；2007年5月17日；或2007年5月21日起可獲得的下列蛋白序列，其各自以它們的全部通過引用被并入)列出線蟲種Q622M5_CAEBR、線蟲種Q61P44_CAEBR、線蟲種Q61R54_CAEBR、線蟲種Q61V90_CAEBR、線蟲種Q61A94_CAEBR、線蟲種Q60TP4_CAEBR、線蟲種Q60M10_CAEBR、秀麗隱桿線蟲GCY37_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY31_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY36_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY32_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY35_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY34_CAEEL、秀麗隱桿線蟲GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryziaslatipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodonnigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4S6K5_TETNG、紅鰭東方豚(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人(Homo sapiens)Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、紅猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、獼猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌長臂猿(Hylobateslar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE，、小鼠(Musmusculus)GCYB1_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q3UTI4_MOUSE、小鼠(Musmusculus)Q3UH83_MOUSE、小鼠(Mus musculus)Q6XE41_MOUSE、小鼠(Musmusculus)Q80YP4_MOUSE、褐鼠(Rattus norvegicus)Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野豬(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、雙斑蟋蟀(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、煙草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、煙草天蛾O76340_MANSE、蜜蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、蜜蜂Q5FAN0_APIME、蜜蜂Q6L5L6_APIME、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PESTQ7PYK9_ANOGA、岡比亞按蚊Anopheles gambiae str)PEST Q7Q9W6_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae str)PEST Q7QF31_ANOGA、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae str)PEST Q7PS01_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiaestr)PEST Q7PFY2_ANOGA、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)Q24086_DROME、黑腹果蠅GCYH_DROME、黑腹果蠅GCY8E_DROME、黑腹果蠅GCYDA_DROME、黑腹果蠅GCYDB_DROME、黑腹果蠅Q9VA09_DROME、擬暗果蠅(Drosophilapseudoobscura)Q29CE1_DROPS、擬暗果蠅Q296C7_DROPS、擬暗果蠅Q296C8_DROPS、擬暗果蠅Q29BU7_DROPS、加洲海兔(Aplysis californica)Q7YWK7_APLCA、馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)Q95NK5_HEMPU、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、魚腥藻某種(Anabaenasp)Q8YUQ7_ANASP、黃桿菌(Flavobacteria bacterium)BBFL7 Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白細菌(marinegamma proteobacterium)HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白細菌HTCC2207Q1YTK4_9GAMM、新月柄桿菌Q9A451_CAUCR、隱藏嗜酸菌(Acidiphiliumcryptum)JF-5 Q2DG60_ACICY、渾球紅假單胞菌(Rhodobacter sphaeroides)Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)PD1222、Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺軍團菌Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺軍團菌Q5X268_LEGPA、嗜肺軍團菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺軍團菌嗜肺亞種(Legionella pneumophila subsppneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺軍團菌嗜肺亞種Q5ZSQ8_LEGPH、Colwellia psychrerythraea(一種嗜冷細菌)Q47Y43_COLP3、大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6cQ3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)Q8EF49_SHEON、Saccharophagus_degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradansQ21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14 Q1ZWE5_9VIBR、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01Q1VCP6_VIBAL、弧菌某種(Vibrio sp)DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、費歇爾弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、創(chuàng)傷弧菌Q7MJS8_VIBVY、發(fā)光菌(Photobacterium sp)SKA34 Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺菌屬某種(Oceanospirillum sp)MED92Q2BKV0_9GAMM、海洋細菌某種(Oceanobacter sp)RED65Q1N035_9GAMM、脫硫脫硫弧菌Q310U7_DESDG、奧氏嗜熱鹽絲菌(Halothermothrix orenii)H 168Q2AIW5_9FIRM、騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacterter tengcongensis)Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicum)Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破傷風梭狀芽胞桿菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE、以及拜季林斯基氏梭菌NCIMB 8052Q2WVN0_CLOBE。應(yīng)用如本文所述的Pfam數(shù)據(jù)庫，基于屬于H-NOX蛋白家族的這些蛋白質(zhì)的標識，預(yù)測這些序列編碼H-NOX蛋白。
0058可以應(yīng)用標準方法確定另外的H-NOX蛋白和核酸，其可適合用于本文描述的藥物組合物和方法。例如，基于它們與已知H-NOX蛋白和核酸的一級和/或預(yù)測的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的相似性，標準序列對比和/或結(jié)構(gòu)預(yù)測程序可以被用于鑒定另外的H-NOX蛋白和核酸。例如，Pfam數(shù)據(jù)庫采用所定義的對比算法和隱蔽馬爾科夫模型(如Pfam 21.0)來將蛋白質(zhì)分類成家族，如H-NOX家族(Pfam-蛋白結(jié)構(gòu)域家族對比和隱蔽馬爾科夫模型的數(shù)據(jù)庫，Copyright(C)1996-2006 ThePfam Consortium；GNU LGPL Free Software Foundation，Inc.，59Temple Place-Suite330，Boston，MA 02111-1307，USA)。標準數(shù)據(jù)庫如swissprot-trembl數(shù)據(jù)庫(萬維網(wǎng)“expasy.org”，Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU-1 rueMichel Servet CH-1211 Geneva 4，Switzerland)也可以被用于鑒定H-NOX蛋白家族的成員。采用標準結(jié)構(gòu)預(yù)測程序如PredictProtein(630 West，168 Street，BB217，NewYork，N.Y.10032，USA)的默認設(shè)置，H-NOX蛋白的二級和/或三級結(jié)構(gòu)可以被預(yù)測。可選地，采用標準方法，H-NOX蛋白的真實二級和/或三級結(jié)構(gòu)可以被確定。
0059在一些實施方式中，H-NOX蛋白在相應(yīng)位置上具有與騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX中的下列遠側(cè)袋殘基的任何一個相同的氨基酸Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140、Leu144或前述的兩個或多個的任何組合。在一些實施方式中，基于它們的氨基酸序列的序列對比，H-NOX蛋白在對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Pro115或Arg135的位置分別具有脯氨酸或精氨酸。在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有對應(yīng)于褐鼠β1H-NOX的His105的組氨酸。在一些實施方式中，H-NOX具有或被預(yù)測具有包括6個α螺旋、之后為2個β折疊、接著為1個α螺旋、之后為2個β折疊的二級結(jié)構(gòu)。H-NOX蛋白的這種二級結(jié)構(gòu)已經(jīng)被報道。
0060如果需要，采用標準方法，新鑒定的H-NOX蛋白可以被測試，以確定其是否結(jié)合血紅素?？梢酝ㄟ^應(yīng)用標準方法——如本文描述那些方法——確定H-NOX蛋白是否結(jié)合NO，來測試H-NOX蛋白作為NO載體起作用的能力。如果需要，本文描述的一個或多個突變可以被引入到H-NOX蛋白中，以使其作為NO載體的特征得到優(yōu)化。例如，一個或多個突變可以被引入，以改變其NO解離常數(shù)、對NO的koff、對NO的k1、對NO的k2、O2解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、NO反應(yīng)性、血紅素自氧化速率、和前述的兩個或多個的任何組合。標準技術(shù)如本文描述的那些可以被用于測量這些參數(shù)。
0061如本文所討論的，突變H-NOX蛋白(如下面討論的I類和II類突變)可以從這些或其它天然野生型來源序列(如，在圖2-4D或8A-8DD列出的序列或本文所述的任何其它序列)通過誘變進行衍生。如本文所用的，“從......衍生(或衍生自)”涉及一個或多個突變被引入到其中的蛋白質(zhì)的來源。例如，“衍生自哺乳動物蛋白”的蛋白質(zhì)是指將一個或多個突變引入野生型(即，天然存在的序列)哺乳動物蛋白序列產(chǎn)生的目標蛋白質(zhì)。
突變H-NOX蛋白 0062如本文進一步討論的，H-NOX蛋白可以包括一個或多個突變，如與相應(yīng)野生型蛋白的那些相比，改變NO解離常數(shù)、對NO的koff、O2解離常數(shù)、對O2的koff、血紅素自氧化速率、NO反應(yīng)性、NO穩(wěn)定性、或前述兩個或多個的任何組合的突變。由于本文提供的教導(dǎo)，使用本文所述且普通技術(shù)人員已知的技術(shù)，可通過隨機誘變，接著經(jīng)驗篩選需要的或期望的解離常數(shù)、解離速率、NO反應(yīng)性、穩(wěn)定性、生理相容性或前述兩種或多種的任何組合，來產(chǎn)生工程H-NOX蛋白組?？蛇x地，誘變可以選擇性地靶向特定區(qū)域或殘基，例如H-NOX蛋白的實驗確定或預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)中明顯的遠側(cè)袋殘基(本文圖1A，并參見，例如，Boon，E.M.等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”NatureChemical Biology 153-59，其通過引用由此并入其全部內(nèi)容，特別是涉及野生型和突變H-NOX蛋白的序列)或從序列對比中鑒定的進化上保守的殘基(本文圖2-4D，并且參見例如，Boon E.M.等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in SolubleGuanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 153-59，其通過引用由此并入其全部內(nèi)容，特別是涉及野生型和突變H-NOX蛋白的序列)。
0063如本文所使用，“突變蛋白”意指與天然發(fā)生的蛋白質(zhì)相比，具有一個或多個突變的蛋白質(zhì)。在一種實施方式中，突變蛋白具有與所有天然發(fā)生的蛋白質(zhì)的序列不同的序列。在各種實施方式中，突變蛋白的氨基酸序列與天然發(fā)生的蛋白的相應(yīng)區(qū)域的序列具有至少約下列任一的同一性10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99.5％。在一些實施方式中，突變蛋白是含有來自全長蛋白的至少約下列任何個數(shù)的連續(xù)氨基酸的蛋白片段25、50、75、100、150、200、300或400個。例如，可以使用帶有其中指定的默認參數(shù)的序列分析軟件(例如Genetics Computer Group的序列分析軟件包(SequenceAnalysis Software Package)，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710University Avenue，Madison，WI 53705)測量序列同一性。該軟件程序通過對各種氨基酸置換、刪除和其它修飾賦予同源性程度來匹配相似序列。
0064如本文所使用，“突變”意指在天然發(fā)生的參考核酸或氨基酸序列中的改變。示例性的核酸突變包括插入、刪除、移碼突變、沉默突變、無義突變或錯義突變。在一些實施方式中，核酸突變不是沉默突變。示例性的蛋白突變包括一個或多個氨基酸的插入(如2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸的插入)、一個或多個氨基酸的刪除(如N-末端、C-末端和/或內(nèi)部殘基的刪除，例如至少約下列任何個數(shù)的氨基酸的刪除5、10、15、25、50、75、100、150、200、300或更多個，或者大約下列任何個數(shù)的氨基酸的刪除5、10、15、25、50、75、100、150、200、300或400個)、一個或多個氨基酸的置換(如2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸的置換)、或前述兩種或多種的組合。H-NOX蛋白的示例性功能截短包括β1序列的殘基1-385。在一些實施方式中，與天然發(fā)生的蛋白質(zhì)相比，突變蛋白具有至少一個氨基酸改變。在一些實施方式中，突變核酸序列編碼與天然發(fā)生的蛋白質(zhì)相比具有至少一個氨基酸改變的蛋白質(zhì)。在一些實施方式中，核酸不是天然發(fā)生的核酸的簡并版本，所述天然發(fā)生的核酸編碼與天然發(fā)生的蛋白質(zhì)具有相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在提到特定氨基酸突變中使用的命名法首先確定野生型氨基酸，接著是殘基編號，而最后是取代氨基酸。例如，Y140L表示在殘基編號140上的酪氨酸被亮氨酸置換。
0065“進化上保守的突變”是一種蛋白質(zhì)中的氨基酸被同一蛋白質(zhì)家族中另一種蛋白質(zhì)相應(yīng)位置上的氨基酸置換。示例性的進化上保守的突變(也表示為I類突變)列于表1A。在表1A中，突變根據(jù)人β1 H-NOX的序列進行編號/注釋，但對有所有H-NOX序列都是類似的。因此，任何其它H-NOX蛋白中的對應(yīng)位置可以被突變?yōu)橹赋龅臍埢?。例如，人? H-NOX的Phe4可以被突變?yōu)槔野彼?，由于其它H-NOX蛋白在該位置具有酪氨酸。對應(yīng)的苯丙氨酸殘基可以被突變?yōu)槠渌魏蜨-NOX蛋白中的酪氨酸。在具體實施方式
中，一個或多個突變被限定為進化上保守的殘基。在一些實施方式中，一個或多個突變可包括至少一個進化上保守的突變和至少一個非進化上保守的突變。如果希望，鑒于本文提供的教導(dǎo)，這些突變H-NOX蛋白經(jīng)受對NO/O2解離常數(shù)、NO反應(yīng)性、穩(wěn)定性和生理相容性的經(jīng)驗篩選。
表1A.示例性的靶向進化上保守的殘基的I類H-NOX突變 F4YQ30GI145Y F4LE33PI145H H7GN61GK151E A8EC78HI157F L9WA109F E183F 0066在一些實施方式中，所述突變?yōu)檫h側(cè)袋突變，例如α-螺旋A、D、E或G中殘基的突變(Pellicena，P.et al.(2004年8月31日).“Crystal Structure of AnOxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35)12854-12859)。示例性的遠側(cè)袋突變(也表示為II類突變)列于表1B。在表1B中，突變根據(jù)人β1 H-NOX的序列進行編號/注釋，但對于所有H-NOX序列都是類似的。因為若干取代在每個所描述的殘基處提供了可行的突變，在每個指出位置的殘基可以被改變?yōu)槿魏纹渌烊换蚍翘烊淮嬖诘陌被?表示為“X”)。這類突變可以產(chǎn)生具有各種期望親和力、穩(wěn)定性和反應(yīng)性特征的H-NOX蛋白。
表1B.示例性的靶向遠側(cè)袋殘疾的II類H-NOX突變 V8XM73XI145X L9XF77XI149X F70X C78X 0067在具體實施方式
中，所述突變?yōu)檠t素遠側(cè)袋突變。如本文所述，在H-NOX家族的NO-結(jié)合成員中阻止O2結(jié)合的關(guān)鍵分子決定因素是血紅素的遠側(cè)袋中氫鍵供體的缺乏。因此，在一些實施方式中，所述突變改變H-NOX結(jié)構(gòu)域和遠側(cè)袋內(nèi)配體之間的氫鍵結(jié)合。在一些實施方式中，所述突變破壞遠側(cè)袋的氫鍵供體和/或賦予相對于對應(yīng)的野生型H-NOX結(jié)構(gòu)域降低的O2配體結(jié)合。示例性的遠側(cè)袋殘基包括騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140和Leu144以及任何其它H-NOX蛋白中對應(yīng)的殘基。
0068不在遠側(cè)袋中的殘基也可影響血紅素基團的三維結(jié)構(gòu)；該結(jié)構(gòu)再影響O2和NO與血紅素基團中鐵的結(jié)合。因此，在一些實施方式中，H-NOX蛋白在遠側(cè)袋之外具有一個或多個突變?？梢员煌蛔兊辉谶h側(cè)袋中的殘基的實例包括騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Pro115和Arg135。在一些實施方式中，所述突變在近側(cè)袋(proximal pocket)中，所述近側(cè)袋包括His105，其作為連接到血紅素鐵的殘基。
0069在一些實施方式中，當存在兩個或多個突變時，至少一個突變在遠側(cè)袋之中，并且至少一個突變在遠側(cè)袋之外(例如，在近側(cè)袋中的突變)。在一些實施方式中，所有的突變都在遠側(cè)袋中。
0070在一些實施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列與由自然界中生物體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的序列不相同。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列與在2006年5月21日或2006年5月22日于任何數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的序列(例如預(yù)測為或已知為H-NOX核酸或氨基酸序列的所有已知序列)不相同。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列與在2007年5月21日或2007年5月22日于任何數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的序列(例如預(yù)測為或已知為H-NOX核酸或氨基酸序列的所有已知序列)不相同。
0071為了降低從人以外來源衍生的H-NOX蛋白的免疫原性，H-NOX蛋白中的氨基酸可以被突變?yōu)槿薍-NOX中的對應(yīng)氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白四級結(jié)構(gòu)表面上的一個或多個氨基酸可以被突變?yōu)槿薍-NOX蛋白中的相應(yīng)氨基酸。在一些變異中，一個或多個表面氨基酸的突變可與兩個或多個遠側(cè)袋殘基的突變、遠側(cè)袋外的一個或多個殘基的突變(如，近側(cè)袋中的突變)或前述兩種或多種的組合進行組合。
0072示例性的突變顯示于表2。此外，表2中所列殘基的任何一個可以被突變?yōu)槿魏纹渌被?。本發(fā)明也涉及本文所述突變的任何組合，例如雙突變、三突變或更高的多突變。例如，本文所述突變的任何一種的組合可以在同一H-NOX蛋白中進行。注意，在其它哺乳動物或非哺乳動物H-NOX蛋白的等價位置上的突變也被本發(fā)明包括。如果希望，除表2中提到的殘基以外的殘基也可以被突變。示例性的突變H-NOX蛋白包含一個或多個突變，其相對于對應(yīng)的野生型H-NOX結(jié)構(gòu)域賦予改變的NO或O2配體-結(jié)合，并可作為生理相容的哺乳動物NO血液氣體載體起作用。
0073在表2和所有隨后的表格中，突變的殘基編號表示在被描述的特定H-NOX蛋白的序列中的位置。例如，騰沖嗜熱厭氧菌I5A指的是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX第五個位置上的異亮氨酸被丙氨酸置換。相同的異亮氨酸到丙氨酸的突變可以在任何其它H-NOX蛋白的相應(yīng)殘基中進行(該殘基可以是或可以不是其它H-NOX蛋白序列中的第五個殘基)。由于哺乳動物β1 H-NOX結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列最多有兩個氨基酸不同，所以，當被引入野生型大鼠β1 H-NOX蛋白時產(chǎn)生期望突變H-NOX蛋白的突變也被預(yù)期，在被引入來自其它哺乳動物如人的野生型β1H-NOX蛋白中時產(chǎn)生期望的突變H-NOX蛋白。
0074在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115、Arg135或Tyr140，β1(1-385)的I145，或嗜肺軍團菌2的Phe142的殘基被任何其它氨基酸置換。在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有至少兩個突變，其中至少一個突變是對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115、Arg135或Tyr140，β1(1-385)的I145，或嗜肺軍團菌2的Phe142的殘基被任何其它氨基酸置換。在一些實施方式中，H-NOX蛋白中的突變對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌的I5A突變、I5L突變、W9F突變、Y140F突變、Y140L突變、Y140H突變、W9F Y140H雙突變、或F78Y Y140F雙突變，或β1的I145Y突變。在一些實施方式中，H-NOX蛋白中的突變對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌的W9Y突變、W9H突變、W9N突變、N74H突變、N74E突變、N74A突變、P115A突變、R135Q突變、I5L P115A雙突變、N74A Y140H雙突變或W9F N74A雙突變。在一些實施方式中，與相應(yīng)的野生型蛋白(如褐鼠或智人β1)相比，H-NOX蛋白中的至少一個C-末端氨基酸(如至少大約50個連續(xù)的C-末端氨基酸或在大約25至大約200個之間的連續(xù)C-末端氨基酸)已被除去。
表2.來自騰沖嗜熱厭氧菌(Tt)、嗜肺軍團菌(Lp)、脫硫脫硫弧菌(Dd)、霍亂弧菌(Vc)、點形念珠藻(Np)、肉毒梭菌(Cb)、丙酮丁醇梭桿菌(Ca)、大鼠、人、秀麗隱桿線蟲(Ce)的示例性H-NOX突變 Tt Lp Dd 其它細菌 大鼠 人 蠕蟲 Tt H-NOX L2 H-NOXDdH-NOXVc H-NOX β1(1-385) β1(1-385) Ce GCY-(728-899) 35(1-252) Tt H-NOX L2 F142YDd Y139L Np H-NOX β1(1-385) β1(1-385) His6 I145YI145Y L2 Cbβ1(1-385) β1(1-385) Tt I5AF9W-F142Y H-NOX(1-175) I145HI145H L1 H-NOX Cbβ1(1-385) β1(1-385) Tt I5L H-NOX(1-186) C78Y C78Y L1 F142Y Caβ1(1-194) β1(1-194) Tt I5L-P115A H-NOX(1-197) Tt W9F Caβ1 H105Fβ1 H105FH-NOX(1-183) Tt β1 H105Gβ1 H105G W9F-Y140L Tt β1(1-194) β1(1-194) W9F-Y140H I145YI145Y Tt β1(1-194) β1(1-194) W9F-N74A L9W-I145YL9W-I145Y Tt W9Yβ2(1-217)β2(1-217) Tt W9Nβ2(1-217)β2(1-217) I142YI142Y Tt W9H Tt N74E Tt N74A Tt N74H Tt N74A-Y140H Tt I75F His6 Tt F78Y-Y140L Tt F78Y-Y140F Tt P115A Tt R135Q His6 Tt Y140F Tt Y140L Tt Y140H Tt Y140A Tt L144F His6 H-NOX蛋白的修飾 0075野生型或突變H-NOX蛋白的任何一種都可以使用標準方法進行修飾和/或配制，以增強治療或工業(yè)應(yīng)用。例如并且尤其是應(yīng)用到異源工程H-NOX蛋白時，本領(lǐng)域內(nèi)已知各種方法用于將這樣的試劑與免疫監(jiān)視隔離，包括交聯(lián)、聚乙二醇化、糖修飾等(例如，Rohlfs，R.J.et al.(1998年5月15日)“Arterial BloodPressure Responses to Cell-Free Hemoglobin Solutions And The Reaction With NitricOxide，”J.Biol.Chem.273(20)12128-12134；Migita，R.et al.(1997年6月).“BloodVolume And Cardiac Index in Rats After Exchange Transfusion WithHemoglobin-Based Oxygen Carriers，”J.Appl.Physiol.82(6)1995-2002；Vandegriff，K.D.et al.(2004年8月15日)“Kinetics of NO and O2 Binding to a MaleimidePoly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin，”Biochem J.382(Pt 1)183-189，它們各自通過引用由此并入其全部內(nèi)容，尤其是關(guān)于蛋白質(zhì)的修飾)，以及普通技術(shù)人員已知的其它技術(shù)。將H-NOX蛋白與諸如人血清白蛋白的人蛋白融合可以提高血清半衰期、粘度和膠體滲透壓(colloidal oncotic pressure)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白在其合成過程之中或之后被修飾，以降低其免疫原性和/或提高其血漿保留時間。H-NOX蛋白也可以被包封(例如在脂質(zhì)體或納米顆粒中包封)。
野生型或突變H-NOX蛋白的特征 0076如本文所述，已經(jīng)制備了大量不同的提供NO解離常數(shù)范圍、O2解離常數(shù)范圍、NO koff范圍、O2 koff范圍、NO反應(yīng)性范圍和穩(wěn)定性范圍的H-NOX突變蛋白。在一些實施方式中，與目前使用的輸送NO的化合物——如任何生物轉(zhuǎn)化為NO的有機硝酸鹽——相比，H-NOX蛋白具有類似的或改善的NO解離常數(shù)、O2解離常數(shù)、NO koff、O2koff、NO反應(yīng)性、自氧化速率、血漿保留時間、或前述的兩者或多種的任何組合。
0077如上面所討論的，固有的低NO反應(yīng)性(和高的NO穩(wěn)定性)使野生型和突變H-NOX蛋白成為期望的NO載體，因為在O2存在下由NO鈍化H-NOX蛋白的可能性較低。在一些實施方式中，H-NOX蛋白具有低的O2親和力(如在37℃至少大約1μM的O2解離常數(shù))或沒有可檢測到的O2親和力。由于很少的——如果有的話——O2結(jié)合到H-NOX蛋白，結(jié)合到H-NOX蛋白的血紅素的O2的NO氧化為最少。因而最少的NO、O2和H-NOX蛋白被這種NO氧化所鈍化。因此，更多的NO可以被輸送到個體中期望的位點，而較少的能夠被個體中組織利用的O2被破壞。
0078如本文所使用，“血紅蛋白”表示來自被良好表征的血紅蛋白家族的蛋白或其突變體，它們是紅細胞中含鐵的O2輸送金屬蛋白。純化的、無基質(zhì)人血紅蛋白具有約200-500nM的對O2動力學(xué)KD。該值是亞基依賴性的。
0079“6-配位FeII-NO復(fù)合物”表示6-配位鐵-亞硝?；?，其在大約416-422nm處產(chǎn)生紫外-可見索雷(UV-Vis Soret)峰，如，例如由Boon，E.M.等人(2006年8月)，“Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube GuanylateCyclase β1 H0NOX Domain，”J.Biol.Chem.281(31)21892-21902所描述的，其通過引用由此以其全部內(nèi)容并入，尤其是關(guān)于含有6-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白樣品的百分數(shù)和含有5-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白樣品的百分數(shù)的確定。
0080“5-配位FeII-NO復(fù)合物”表示5-配位鐵-亞硝?；湓诖蠹s397-400nm處產(chǎn)生紫外-可見索雷峰，如，例如由Boon，E.M.等人(2006)，“NitricOxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOXDomain，”J.Biol.Chem.281(31)21892-21902所描述的，其通過引用由此以其全部內(nèi)容并入，尤其是關(guān)于含有6-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白樣品的百分數(shù)和含有5-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白樣品的百分數(shù)的確定。
0081如本文使用的，“koff”表示解離速率，如從蛋白質(zhì)中釋放NO或O2的速率。較低數(shù)值的低koff表示較慢的解離速率。對于具有6-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白，如Boon，E.M.等人(August 2006)，“Nitric Oxide Binding toProkaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain，”J.Biol.Chem.281(31)21892-21902和Boon，E.M等人(2005)，“Molecular Basis For NOSelectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 153-59所述的計算對NO的koff，其各自通過引用由此以其全部內(nèi)容并入，尤其是關(guān)于H-NOX蛋白的NO koff的計算。對于具有5-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白，對NO的koff由對NO的k1和對NO的k2來描述，如由Winger，J.A.等人(January 2007)“Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme-NitricOxide/Oxygen Binding Domain Constructs”J.Biol.Chem.282(2)897-907所描述的，其通過引用由此以其全部內(nèi)容并入，尤其是H-NOX蛋白的NO koff、NO k1和NOk2的計算。對于包含5-配位FeII-NO復(fù)合物和6-配位FeII-NO復(fù)合物的混合物的H-NOX蛋白，對NO的koff由對NO的k1和對NO的k2來描述，如由Winger，J.A等人(January 2007)，“Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase andHeme-Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs”J.Biol.Chem.282(2)897-907所描述的，其通過引用由此以其全部內(nèi)容并入，尤其是關(guān)于H-NOX蛋白的NO koff、NO k1和NO k2的計算。
0082在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃為大約1×10-4s-1至大約10s-1之間，如在37℃在大約1×10-4s-1至大約0.012s-1之間，在大約1×10-4s-1至大約0.007s-1，大約0.005s-1至大約0.011s-1，或大約1×10-4s-1至大約1×10-3s-1。在不同的實施方式中，H-NOX蛋白的對NO的koff在37℃為大約1至大約1,000s-1，如在37℃大約1至大約50s-1，大約50至大約100s-1，大約100至大約250s-1，大約250至大約500s-1，大約500至大約750s-1，或大約750至大約1,000s-1。
0083“kon”表示結(jié)合速率，如NO或O2結(jié)合到蛋白質(zhì)的速率。較低數(shù)值的低kon表示較慢的結(jié)合速率。在不同的實施方式中，H-NOX蛋白的對O2的kon在20℃為大約0.14至大約60μM-1s-1，如大約6至大約60μM-1s-1，大約6至大約12μM-1s-1，大約15至大約60μM-1s-1，大約5至大約18μM-1s-1，大約6至大約15μM-1s-1。
0084“解離常數(shù)”表示“動力學(xué)解離常數(shù)”或“計算的解離常數(shù)”。“動力學(xué)解離常數(shù)”或“KD”表示動力學(xué)解離速率(off-rate)(koff)與動力學(xué)結(jié)合速率(on-rate)(kon)的比率，如采用標準方法(如，標準光譜法、停流法、或閃光光解法)——包括技術(shù)人員已知的和/或本文描述的方法——被測定為絕對值的KD值?！坝嬎愕慕怆x常數(shù)”或“計算的KD”指基于測量的koff的動力學(xué)解離常數(shù)的近似值。對于計算的對NO的KD，H-NOX蛋白的對NO的kon的值被假定為710μM-1s-1，其是報道的β1(1-385)的kon，該kon在4℃被測量并且在37℃沒有顯著增加(Zhao，等人(1999)，“A Molecular Basis for Nitric Oxide Sensing by Soluble Guanylate Cyclase，”PNAS.9614753-14758，其通過引用由此以其全部內(nèi)容并入，尤其是關(guān)于H-NOX蛋白質(zhì)的NO kon的計算)。對于計算的對O2的KD，kon的值通過如本文所述的動力學(xué)KD和koff之間的相關(guān)性得到。
0085在不同的實施方式中，H-NOX蛋白結(jié)合NO的動力學(xué)或計算的KD在相同的條件下(如在20℃)在血紅蛋白的大約0.01至大約100倍之內(nèi)，如在相同的條件下(如在20℃)，在血紅蛋白的大約0.1至大約10倍之間或在大約0.5至大約2倍之間。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在37℃在大約0.1至大約20pM之間，如在37℃，為大約0.5至大約15，大約0.5至大約12，大約0.7至大約4，或大約0.7至大約3。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在37℃為至少大約0.1pM，如在37℃為至少大約0.5、1、3、5、10、12、50、100、400、500、1000、2000、3000或4000pM的任一個。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在37℃為5000pM以下，如在37℃為大約4000pM、3000pM、2000pM、1000pM、500pM、400pM、100pM、50pM、12pM、10pM、5pM、3pM或1pM的任一個以下。
0086在不同的實施方式中，H-NOX蛋白結(jié)合O2的動力學(xué)或計算的KD在相同的條件下(如在20℃)在血紅蛋白的大約0.01至大約100倍之內(nèi)，如在相同的條件下(如在20℃)，在血紅蛋白的大約0.1至大約10倍之間或在大約0.5至大約2倍之間。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，如在37℃為至少大約5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、或100μM的任一個。在一些實施方式中，在37℃沒有可檢測到的與O2的結(jié)合，如采用如本文所述的紫外-可見光譜法，沒有可檢測到的O2結(jié)合(如，在O2存在下，在～418nm沒有可觀察到的峰，例如，當如在O2不存在的情況下所觀察到的Soret峰保持在～431nm時或當由于蛋白質(zhì)氧化Soret峰移動到～410nm時)。
0087如本文使用的，“NO親和性”是定性的術(shù)語，其指NO結(jié)合到蛋白質(zhì)的強度(如結(jié)合到血紅素基或結(jié)合到氧，所述氧結(jié)合到與蛋白質(zhì)結(jié)合的血紅素基上)。這種親和性受對NO的koff和kon兩者的影響。數(shù)值較小的NO KD值意味著較高的親和性?！把跤H和性”是定性術(shù)語，其指氧結(jié)合到蛋白質(zhì)的血紅素部分的強度。這種親和性受對氧的koff和kon兩者的影響。數(shù)值較小的氧KD值意味著較高的親和性。
0088如本文所用的，“NO穩(wěn)定性”指在氧存在下蛋白質(zhì)對NO氧化的穩(wěn)定性或抵抗力。例如，蛋白質(zhì)在氧存在下結(jié)合到NO時不被氧化的能力可表示該蛋白質(zhì)的NO穩(wěn)定性。在一些實施方式中，在20℃溫育大約1、2、4、6、8、10、15或20小時的任一段時間之后，大約50、40、30、10或5％的任一個以下的H-NOX蛋白被氧化。
0089如本文所使用，“NO反應(yīng)性”指的是在2μM蛋白質(zhì)的濃度下，在氧存在的情況下，在血紅素結(jié)合蛋白的血紅素中的鐵被NO氧化的速率。單位為s-1的較低數(shù)值的NO反應(yīng)性表示較低的NO反應(yīng)性。在多種實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20℃小于約700s-1，例如，在20℃小于約600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1。在多種實施方式中，H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20℃在約0.1到約600s-1之間，例如，在20℃在約0.5到約400s-1、約0.5到約100s-1、約0.5到約50s-1、約0.5到約10s-1、約1到約5s-1或約0.5到約2.1s-1之間。在多種實施方式中，H-NOX蛋白的反應(yīng)性在相同條件下，如在20℃，比血紅蛋白的反應(yīng)性至少低約10、100、1,000或10,000倍。
0090如本文所使用，“自氧化速率”指的是在血紅素結(jié)合蛋白的血紅素中鐵被自氧化的速率。單位為s-1的較低數(shù)值的自氧化速率表示較低的自氧化速率。在多種實施方式中，H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃小于約1.0h-1，例如在37℃小于約下列值的任何一個0.9h-1、0.8h-1、0.7h-1、0.6h-1、0.5h-1、0.4h-1、0.3h-1、0.2h-1、0.1h-1或0.05h-1。在多種實施方式中，H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃，在約0.006到約5.0h-1之間，例如在37℃，約0.006到約1.0h-1、約0.006到約0.9h-1或約0.06到約0.5h-1。
0091在多種實施方式中，突變H-NOX蛋白具有(a)在血紅蛋白的2個數(shù)量級之內(nèi)的NO或O2解離常數(shù)、結(jié)合速率(對NO或O2的kon)或解離速率(對O2或NO的koff)，(b)分別具有比sGC β1弱(例如，至少弱約10倍、100倍或1000倍)的NO親和力，(c)比血紅蛋白低至少1000倍的與結(jié)合O2的NO反應(yīng)性，(d)比血紅蛋白高至少2、10、100或1000倍的體內(nèi)血漿保留時間，或(e)前述兩種或多種的任何組合。
0092示例性的適當NO載體提供了在血紅蛋白的兩個數(shù)量級之內(nèi)的解離常數(shù)，即在約0.01到100倍之間，例如在血紅蛋白的解離常數(shù)的約0.1到10倍之間，或約0.5到2倍之間。各種已建立的技術(shù)可被用于量化解離常數(shù)，例如本文所述的技術(shù)(Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in SolubleGuanylate Cyclase，”Nature Chem.Biol.153-59；Boon，E.M.et al.(2005年10月).“Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of HemeSensor Proteins，”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5)441-446；Boon，E.M.et al.(2005).“Ligand Specificity of H-NOX DomainsFrom sGC to Bacterial NO Sensors，”J.Inorg.Biochem.99(4)892-902)，Vandegriff，K.D.et al.(August 15，2004)“Kinetics of NOand O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated HumanHaemoglobin，”Biochem J.382(Pt 1)183-189，它們的每個都在此被完整引入作為參考，尤其是涉及解離常數(shù)的測量)，以及普通技術(shù)人員已知的那些技術(shù)。示例性的NO載體為帶有結(jié)合O2的H-NOX蛋白提供了低的或最小的NO反應(yīng)性，例如比血紅蛋白低的NO反應(yīng)性。在一些實施方式中，NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低得多，例如低至少約10、100、1,000或10,000倍。多種已建立的技術(shù)可被用于量化NO反應(yīng)性(Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in SolubleGuanylate Cyclase，”Nature Chem.Biol.153-59；Boon，E.M.et al.(2005年10月).“Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of HemeSensor Proteins，”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5)441-446；Boon，E.M.et al.(2005).“Ligand Specificity of H-NOX DomainsFrom sGC to Bacterial NO Sensors，”J.Inorg.Biochem.99(4)892-902)，Vandegriff，K.D.et al.(2004年8月15日)“Kinetics of NOand O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated HumanHaemoglobin，”Biochem J.382(Pt 1)183-189，它們的每個都在此被完整引入作為參考，尤其是涉及NO反應(yīng)性的測量)，以及普通技術(shù)人員已知的那些技術(shù)。因為野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX具有這樣的低NO反應(yīng)性，所以其它野生型H-NOX蛋白和突變H-NOX蛋白可具有相似的低NO反應(yīng)性。例如，騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXY140H具有與野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX相似的NO反應(yīng)性。
0093用于NO輸送的示范性突變體具有比sGC β1弱的的NO親和性，優(yōu)選地弱至少10倍、100倍、或1000倍。對于治療性NO輸送(如，在心臟病發(fā)作、心臟直視手術(shù)或中風期間/之后)，一系列具有不同親和性的工程H-NOX蛋白在特定的疾病狀況下被經(jīng)驗測試功效，在一些實施方式中NO親和性的范圍為0.1至1000nM。
0094此外，適當?shù)腘O載體提供了高的或最大的穩(wěn)定性，特別是體內(nèi)穩(wěn)定性。多種穩(wěn)定性量度可以被使用，例如氧化穩(wěn)定性(如，對自氧化或NO氧化的穩(wěn)定性)、溫度穩(wěn)定性和體內(nèi)穩(wěn)定性。多種已建立的技術(shù)可被用于量化穩(wěn)定性，例如本文所述的技術(shù)(Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivityin Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chem.Biol.153-59；Boon，E.M.et al.(2005年10月).“Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family ofHeme Sensor Proteins，”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5)441-446；Boon，E.M.et al.(2005).“Ligand Specificity of H-NOX DomainsFrom sGC to Bacterial NO Sensors，”J.Inorg.Biochem.99(4)892-902)，以及普通技術(shù)人員已知的那些技術(shù)。對于血漿、血液或組織中的體內(nèi)穩(wěn)定性，示例性的穩(wěn)定性量度包括保留時間、清除速率和半衰期。來自嗜熱生物體的H-NOX蛋白被預(yù)期在高溫下穩(wěn)定。在多種實施方式中，血漿保留時間比血紅蛋白的血漿保留時間高至少約2、10、100或1000倍(例如，Bobofchak，K.M.et al.(2003年8月).“A Recombinant Polymeric Hemoglobin WithConformational，F(xiàn)unctional，And Physiological characteristics of an in vivo O2transporter，”Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.285(2)H549-H561)。普通技術(shù)人員將認識到，血紅蛋白基載體受到來自血漿的無細胞血紅蛋白的快速清除的限制，該快速清除的原因在于存在將無細胞血紅蛋白從血漿中除去的血紅蛋白受體。由于血漿中沒有H-NOX蛋白的受體，野生型和突變H-NOX蛋白被預(yù)期具有比血紅蛋白更長的保留時間。如果希望，血漿保留時間可以通過聚乙二醇化或交聯(lián)H-NOX蛋白，或使用標準方法(如本文所述的那些和普通技術(shù)人員已知的那些)將H-NOX蛋白與另一蛋白融合而提高。
0095在不同的實施方式中，H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，而H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1至大約10s-1之間，并且H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μm。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃為大約1×10-4s-1至大約10s-1之間，并且H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μm。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃為大約1×10-4s-1至大約10s-1之間，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20℃為大約700s-1以下(如，在20℃為大約600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，而H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20℃為大約700s-1以下(如，在20℃為600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃為大約1×10-4s-1至大約10s-1之間，并且H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。在一些實施方式中，H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下，并且H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性在20℃為約700s-1以下(如，在20℃為約600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1以下)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白溶液的粘度在1和4厘泊(centipoise(cP))之間。在一些實施方式中，H-NOX蛋白溶液的膠體滲透壓在20和50mm Hg之間。
0096表3列出了野生型和突變H-NOX蛋白的示例性大小、氧親和性、自氧化穩(wěn)定性、NO反應(yīng)速率以及修飾。在表3中，載體大小是指修飾的(如PEG化的)或未修飾的H-NOX蛋白的分子量。
表3H-NOX蛋白的示例性實施方式 0097在表4-14中報道了具體突變體的示例性數(shù)據(jù)。在表4-14中，β1和β2指來自大鼠H-NOX蛋白的蛋白質(zhì)。由于哺乳動物β1 H-NOX結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列至多兩個氨基酸不同，所以對于其它哺乳動物H-NOX蛋白，如人β1中的相應(yīng)突變，相似的結(jié)果被預(yù)期。
0098表4表明，NO結(jié)合的解離常數(shù)可以通過使H-NOX蛋白中的一個或多個殘基突變而顯著地改變。另外，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑顯著地影響sGC的NO解離常數(shù)和解離速率的能力支持了這樣的突變能力，所述突變改變sGC或其它H-NOX蛋白的結(jié)構(gòu)以改變NO的解離常數(shù)和解離速率。如果需要，通過結(jié)合表4中列出的任何突變或通過將一個或多個另外的突變引入到H-NOX蛋白中，NO結(jié)合的解離常數(shù)可以被進一步改變，如本文所述。
表4.NO結(jié)合到H-NOX和其它血紅素蛋白的KD值


0099表5表明，通過突變H-NOX蛋白中的一個或多個殘基，NO結(jié)合的解離速率(koff)可以被顯著地突變。這些示例性突變H-NOX蛋白的koff在37℃在0.00013到0.011s-1的范圍內(nèi)。對于表5，應(yīng)用如在每一引用的文獻中指明的化學(xué)阱，得到血紅素蛋白的NO解離速率。為了比較，采用NO電極對來自有機硝酸鹽和NONOate的NO解離速率進行了測量并且使用氧基血紅素阱進行確認。必要時，利用大約每10℃速率加倍這一事實將數(shù)值調(diào)節(jié)到37℃。如果需要，通過將表5中列出的單或雙突變的任何組合或通過將一個或多個另外的突變引入到H-NOX蛋白中，NO結(jié)合的koff可以被進一步改變，如本文所述。
表5.血紅素蛋白和硝基血管擴張劑在37℃下的NO解離速率的比較。


0100如表6中所示，將一個或多個突變引入到野生型H-NOX蛋白中使自氧化速率和O2解離速率發(fā)生改變。如果需要，通過將表6中列出的單或雙突變的任何組合或通過將一個或多個另外的突變引入到H-NOX蛋白中，自氧化速率或O2解離速率可以被進一步改變，如本文所述。
表6.野生型和II類突變H-NOX蛋白對自氧化的穩(wěn)定性、O2結(jié)合特性(如O2解離的速率)以及遠側(cè)袋H-鍵合殘基被列出。


0101表7說明了通過引入一個或多個突變，H-NOX蛋白的O2結(jié)合速率(kon)、O2解離速率(koff)、O2解離常數(shù)(KD)以及自氧化速率(kox)的改變。在一些實施方式中，表7中列出的單或雙突變的任一個與另一個突變(如表7中的另一個突變或本文所述的任何其它突變)結(jié)合，以進一步改變O2結(jié)合速率(kon)、O2解離速率(koff)、O2解離常數(shù)、自氧化速率或前述兩個或多個的組合。
表7.組氨酰基連接的FeII血紅素蛋白的O2結(jié)合動力學(xué)常數(shù)

0102表8說明，H-NOX蛋白中的O2結(jié)合速率、O2解離速率、O2、自氧化速率、NO反應(yīng)性以及FeII-O2復(fù)合物的穩(wěn)定性可以通過引入一個或多個突變被改變。在一些實施方式中，表8中列出的任一單突變或雙突變與另一個突變(如表8中的另一個突變或本文所述的任何其它突變)結(jié)合，以進一步改變H-NOX蛋白中的O2結(jié)合速率、O2解離速率、O2、自氧化速率、NO反應(yīng)性或FeII-O2復(fù)合物的穩(wěn)定性。如技術(shù)人員將會理解的，一個或多個額外的突變的引入，如本文描述的那些突變，可以被用于進一步改變這些數(shù)值。
表8.H-NOX蛋白中的O2結(jié)合速率、O2解離速率、O2、自氧化速率、NO反應(yīng)性和FeII-O2復(fù)合物的穩(wěn)定性。


0103表9表明通過使H-NOX蛋白中的一個或多個殘基發(fā)生突變，O2結(jié)合的解離常數(shù)可以被顯著改變。這些示例性的H-NOX蛋白的動力學(xué)KD值在20℃在21.20nM至1000000.00nM的范圍內(nèi)。如果需要，通過將表9中列出的任一單或雙突變組合或通過將一個或多個額外的突變引入到H-NOX蛋白中，O2結(jié)合的解離常數(shù)可以被進一步改變，如本文所述。
表9.根據(jù)O2結(jié)合的解離常數(shù)的數(shù)值排列的野生型和突變的H-NOX蛋白以及參照蛋白。
0104表10表明，通過使H-NOX蛋白中的一個或多個殘基發(fā)生突變，O2結(jié)合的解離速率可以被顯著改變。這些示例性的H-NOX蛋白的解離速率在20℃在0.21s-1到23.4s-1的范圍內(nèi)。如果需要，通過將表10中列出的任一單或雙突變結(jié)合或通過將一個或多個額外的突變引入到H-NOX蛋白中，O2結(jié)合的解離速率以被進一步改變，如本文所述。
表10.根據(jù)O2結(jié)合的解離速率的數(shù)值排列的野生型和突變的H-NOX蛋白以及參照蛋白。
0105表11表明，通過使H-NOX蛋白中的一個或多個殘基發(fā)生突變，O2結(jié)合的結(jié)合速率可以被顯著改變。這些示例性的H-NOX蛋白的結(jié)合速率在20℃在60μM-1s-1至0.14μM-1s-1的范圍內(nèi)。如果需要，通過將表11中列出的任一單或雙突變結(jié)合或通過將一個或多個額外的突變引入到H-NOX蛋白中，O2結(jié)合的結(jié)合速率可以被進一步改變，如本文所述。
表11.根據(jù)O2結(jié)合的結(jié)合速率的數(shù)值排列的野生型和突變的H-NOX蛋白以及參照蛋白。


0106表12說明示了例性H-NOX突變對NO和O2結(jié)合的影響。表12中列出的Fe-未連接形式的每一個數(shù)字是用于單峰(其被列在β列和α列之間)。當NO或O2結(jié)合時，該單峰分成兩個峰，β和α(其被分別列于β列和α列下方)。如果需要，通過將表12中列出的任一單或雙突變結(jié)合或通過將一個或多個額外的突變引入到H-NOX蛋白中，NO或O2結(jié)合可以被進一步改變，如本文所述。
表12一些組氨酰基-連接的FeII血紅素蛋白復(fù)合物的紫外-可見光峰的位置a。

FeII-NO復(fù)合物
FeII-O2復(fù)合物

0107表13包含一些Fe(II)、Fe(III)、Fe(II)-NO和Fe(II)-O2復(fù)合物的UV-可見光峰的位置。當血紅蛋白或H-NOX蛋白厭氧時，其在～431nm處具有一個Soret(索雷)峰，并且其處于未連接態(tài)。如果H-NOX蛋白未結(jié)合O2，那么當O2被加入時，該Soret峰不改變。如果H-NOX蛋白結(jié)合NO并且形成6-配位的鐵-亞硝?；鶑?fù)合物，那么當NO被加入時，其Soret峰將移動到420nm和424nm之間。如果H-NOX蛋白結(jié)合NO并且形成5-配位的鐵-亞硝?；鶑?fù)合物，那么其Soret峰將移動到～399nm。如果H-NOX蛋白沒有結(jié)合O2，那么當O2被加入時，Soret峰將不會發(fā)生變化。如果H-NOX蛋白結(jié)合O2，那么當O2被加入時，其Soret峰將移動414nm和418nm之間，這與發(fā)生在血紅蛋白中的移動相同，表示O2結(jié)合到血紅素。氧化的H-NOX(Fe(III))的Soret峰可能與儲存或使用之后的H-NOX蛋白的狀態(tài)有關(guān)。如果需要，通過將表13中列出的任一單或雙突變結(jié)合或通過將一個或多個額外的突變引入到H-NOX蛋白中，NO或O2結(jié)合可以被進一步改變，如本文所述。
表13.一些Fe(II)、Fe(III)、Fe(II)-NO以及Fe(II)-O2復(fù)合物的紫外-可見峰光的位置。
a“N.A.”表示由于在較長的波長處的低信號，不可指定的α和β譜帶。
0108表14包含示例性騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX蛋白的自氧化速率。如果需要，通過組合表14中列出的任何突變或通過將一個或多個額外的突變引入到H-NOX蛋白中，自氧化速率可以被進一步改變，如本文所述。2nm和3nm的值在表14中是指UV-可見光Soret峰在觀察的時間段內(nèi)偏移2到3nm；這樣極小的改變可能是由于自氧化。
表14.騰沖嗜熱厭氧菌(Tt)H-NOX蛋白的自氧化速率 a“穩(wěn)定”表示在至少24小時之后血紅素沒有發(fā)生氧化。
“RT”表示室溫 H-NOX核酸 0109本發(fā)明也以編碼本文所述的任何突變H-NOX蛋白的核酸為特征。如本文所使用，“核酸”指的是單鏈或雙鏈形式的兩個或多個脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，并且除非另有限制，包含天然發(fā)生核苷酸的類似物，其以與天然發(fā)生的核苷酸相似的方式與核酸雜交。在一些實施方式中，所述核酸為重組核酸?！爸亟M核酸”表示一種目標核酸，其不含一個或多個在所述目標核酸從中衍生的生物體的天然發(fā)生的基因組中位于所述目標核酸側(cè)翼的核酸(如基因)。在一些實施方式中，H-NOX核酸被可操作地連接到另一核酸，所述另一核酸編碼另一蛋白的全部或部分，以便該重組核酸編碼融合蛋白，所述融合蛋白包括H-NOX蛋白(如，具有或不具有來自H-NOX蛋白另一結(jié)構(gòu)域的H-NOX結(jié)構(gòu)域)，以及諸如人血清白蛋白的另一蛋白的全部或部分。該術(shù)語因此包括，例如被參入載體、參入自主復(fù)制質(zhì)?；虿《?、或參入原核生物或真核生物基因組DNA的重組DNA，或者作為獨立于其它序列的單獨分子(如，cDNA、基因組DNA片段或通過PCR或限制性核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA片段)存在的重組DNA。
0110本發(fā)明也以含有一個或多個編碼本文所述的任何突變H-NOX蛋白的核酸的載體為特征。如本文所使用，“載體”表示能夠輸送，并任選地在宿主細胞中表達一個或多個目標核酸的構(gòu)建體(construct)。載體的實例包括，但不限于，質(zhì)粒、病毒載體、DNA或RNA表達載體、黏粒和噬菌體載體。在一些實施方式中，載體包含在表達調(diào)控序列調(diào)控下的核酸?！氨磉_調(diào)控序列”表示指導(dǎo)目標核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達調(diào)控序列可以是啟動子，例如組成型或誘導(dǎo)型啟動子，或者增強子。該表達控制序列被可操作地連接到待轉(zhuǎn)錄的核酸片段。
0111在具體實施方式
中，所述核酸包括圖2-4D或8A-8DD中所示的任何核酸的片段或完整核酸序列。在一些實施方式中，所述核酸包括至少約50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多個連續(xù)的來自H-NOX核酸的核苷酸，并且與其所衍生的H-NOX核酸相比包含一個或多個突變(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變)。在多種實施方式中，與其從中衍生的H-NOX核酸相比，突變H-NOX核酸包含少于約任何20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2個突變。本發(fā)明也以編碼突變H-NOX蛋白的任何核酸的簡并變體(degenerate variant)為特征。
0112本發(fā)明也包括含有至少一種編碼本文所述突變H-NOX蛋白的核酸的細胞或細胞群。示例性的細胞包括昆蟲、植物、酵母、細菌和哺乳動物細胞。這些細胞可用于使用標準方法——如本文所述的那些方法——生產(chǎn)突變H-NOX蛋白。
H-NOX蛋白的制劑 0113本文所述的任何野生型或突變H-NOX蛋白可被用于藥物組合物或非藥物組合物的配制。如下文進一步討論，這些制劑在多種治療應(yīng)用和工業(yè)應(yīng)用中有用。
0114在一些實施方式中，所述藥物組合物包括一種或多種野生型或突變H-NOX蛋白(例如本文所述的任何H-NOX野生型或突變蛋白)和藥學(xué)上可接受的載體。在多種實施方式中，H-NOX蛋白是分離的或純化的蛋白質(zhì)?！八帉W(xué)上可接受的載體”是表示任何這樣的物質(zhì)——當與活性成分結(jié)合時，基于普通技術(shù)人員的知識，其允許所述成分保持生物活性并且不引起不可接受的免疫反應(yīng)(如嚴重的過敏或過敏性休克)。實例包括，但不限于，任何標準藥物載體，例如磷酸緩沖鹽溶液、水、乳液如油/水乳液、和各種類型的潤濕劑。用于氣霧劑或腸胃外給藥的示例性的稀釋劑是磷酸緩沖鹽水或生理(0.9％)鹽水。包含這類載體的組合物通過已知的傳統(tǒng)方法(參見，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；和Remington，The Science andPractice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing，2000，它們在此被完整引入作為參考，尤其是涉及制劑的部分)進行配制。
0115盡管本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何合適載體可被用于本發(fā)明的藥物組合物，載體的類型將根據(jù)給藥方式而改變。組合物可以被配制，用于任何合適方式的給藥，包括，例如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、囊內(nèi)(intravesicular)、吸入、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、氣管內(nèi)、經(jīng)粘膜、眼內(nèi)、鞘內(nèi)或經(jīng)皮給藥。對于腸胃外給藥，例如皮下注射，載體可包括，例如水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。對于經(jīng)口給藥，可利用上述載體的任何一種，或者固體載體，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖或碳酸鎂。生物可降解微球(例如，聚乳酸、聚甘醇酸(polylactate polyglycolate))也可被用作載體。
0116在一些實施方式中，所述藥物組合物或非藥物組合物包括緩沖液(如中性緩沖鹽水、磷酸緩沖鹽水等)、糖(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精等)、抗氧化劑、螯合劑(如EDTA、谷胱甘肽等)、防腐劑、用于結(jié)合和/或運輸氧的另一種化合物、非活性成分(如穩(wěn)定劑、填料等)或前述兩種或多種的組合。在一些實施方式中，所述組合物被配制為凍干物。H-NOX蛋白也可能使用公知的技術(shù)包封入脂質(zhì)體或納米顆粒中?？梢员挥糜贖-NOX蛋白的其它示例性制劑由例如美國專利號6,974,795和6,432,918進行了描述，其在此被完整引入作為參考，尤其是關(guān)于蛋白質(zhì)制劑的部分。
0117本文所述的組合物可作為持續(xù)釋放制劑(例如，諸如膠囊或海綿的制劑，其在給藥后產(chǎn)生緩慢釋放的化合物)的一部分進行給藥。這樣的制劑通?？墒褂霉募夹g(shù)加以制備，并通過例如經(jīng)口、直腸、皮下植入進行給藥，或通過在期望的目標部位植入進行給藥。持續(xù)釋放制劑可含有分散于載體基質(zhì)中和/或包含于被速率控制膜包圍的儲庫(reservoir)中的H-NOX蛋白。這類制劑中使用的載體是生物相容的，并且也可以是生物可降解的。在一些實施方式中，所述制劑提供了相對恒定水平的H-NOX蛋白釋放。包含在持續(xù)釋放制劑中的H-NOX蛋白的量取決于植入部位、釋放速率和期望持續(xù)時間、以及待治療或預(yù)防的病癥的本質(zhì)。
0118在一些實施方式中，藥物組合物包含有效量的野生型或突變H-NOX蛋白。術(shù)語“有效量”意思是本文所述一種或多種蛋白的這樣的量——基于執(zhí)業(yè)專門醫(yī)師的知識，與其功效和毒性的參數(shù)結(jié)合，其在給定的治療形式中應(yīng)該有效。如本領(lǐng)域所知，有效量可以是一個或多個劑量。如臨床中所理解，與另一種藥物、化合物或藥物組合物一起，藥物組合物的有效劑量可能達到或可能不會達到。因此，有效量可以在給予一種或多種治療試劑的背景下加以考慮，并且如果與一種或多種其它試劑結(jié)合，期望或有益的結(jié)果可以或已經(jīng)達到，則單一藥劑可以被認為以有效量給藥。
0119血紅蛋白作為血液替代物的示例性劑量為每千克患者體重約10mg到約5克或更高的胞外血紅蛋白。H-NOX蛋白的相似劑量可被用于NO的輸送。因此，在一些實施方式中，給予人的有效量的H-NOX蛋白在數(shù)克到超過約350克之間。H-NOX蛋白的其它示例性劑量包括在適當?shù)妮斪⑺俾省缂s0.5ml/min(參見，例如Winslow，R.Chapter 12 In Blood Substitutes)下大約4.4、5、10或13G/DL(其中G/DL是H-NOX蛋白溶液在輸注進入循環(huán)系統(tǒng)之前的濃度)的任何一個。在一些實施方式中，10毫克以下劑量的H-NOX蛋白被用于臨時性血管舒張。可以理解，每種劑型的各個劑量中包含的活性成分的單位含量本身不需要構(gòu)成有效量，因為必要的有效量可通過多次給藥的組合效果達到。包含在藥物組合物中H-NOX蛋白量的選擇取決于使用的劑型、治療的病癥、以及根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的要達到的具體目的。
0120示例性的組合物包括遺傳工程改造的重組H-NOX蛋白，其可被分離或純化，所述重組H-NOX蛋白質(zhì)包含一個或多個突變，所述突變相對于對應(yīng)野生型H-NOX蛋白整體上賦予改變的NO或O2配體結(jié)合，并作為生理上相容的哺乳動物血液氣體NO載體起作用。例如，本文所述的突變H-NOX蛋白。
0121本發(fā)明也提供NO載體，其包含一種或多種野生型或突變H-NOX蛋白或主要由其組成。適合用于配制蛋白質(zhì)(如被輸送到血液或胃腸系統(tǒng)的蛋白質(zhì))的緩沖液和其它成分在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。
0122為了減輕或防止被給予藥物組合物的人類對象的免疫反應(yīng)，人H-NOX蛋白(野生型人蛋白質(zhì)或一個或多個突變已經(jīng)被引入其中的人蛋白質(zhì))或其它非抗原性H-NOX蛋白(如，哺乳動物H-NOX蛋白)可以被使用。為了降低或消除從人以外來源衍生的H-NOX蛋白的免疫原性，H-NOX蛋白中的氨基酸可以被突變?yōu)槿薍-NOX中的對應(yīng)氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白四級結(jié)構(gòu)表面上的一個或多個氨基酸可以被突變?yōu)槿薍-NOX蛋白中的相應(yīng)氨基酸。
H-NOX蛋白的治療應(yīng)用 0123本文描述的任何野生型或突變H-NOX蛋白(如分離的或純化的H-NOX蛋白)或藥物組合物可以在治療應(yīng)用中使用。對于所治療的具體適應(yīng)征，基于期望的NO解離常數(shù)、O2解離常數(shù)、NO koff、O2 koff、NO反應(yīng)性、NO穩(wěn)定性、自氧化速率、血漿停留時間、半衰期或前述兩種或多種的任何組合，可以選擇具體的H-NOX蛋白，用于這類應(yīng)用。H-NOX蛋白可以被用于治療任何輸送NO對其有益的病癥。典型的靶指征包括功能性NO缺乏的疾病，如其中需要血管擴張劑或NO載體的病癥，包括由慢性高血壓加劇的病癥，如心力衰竭、腎功能衰竭和中風。在不同的實施方式中，治療的病癥是心血管病癥(如，心肌梗塞或心臟手術(shù))、高血壓、血管收縮性病癥(如，中風)、勃起功能障礙、便秘、或腸梗阻。對于便秘或腸梗阻的治療，H-NOX蛋白可以被用于輸送NO，以治療括約肌控制缺陷，因而使平滑肌松弛。例如，當在消化系統(tǒng)中起作用的H-NOX蛋白通過消化系統(tǒng)時，所述H-NOX蛋白可以使回腸的平滑肌松弛。所述方法和組合物可應(yīng)用于急性的情況(向組織或特定部位快速提供NO，如急性心肌梗塞或中風)和慢性的情況(如，慢性高血壓或從心肌梗塞或中風的急性后恢復(fù)(post-acuterecovery from cardiac infarction or stroke))。
0125在多種實施方式中，本發(fā)明以向個體(例如，哺乳動物，如靈長類(如人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、馬、豬、犬科或貓科)輸送NO的方法為特征，該方法通過給予需要它的個體足以向該個體輸送NO的量的野生型或突變H-NOX蛋白進行。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了攜帶或向諸如哺乳動物的個體輸送血液氣體的方法，其包括向該個體(如，哺乳動物)的血液輸送一種或多種H-NOX組合物的步驟。用于向血液、消化系統(tǒng)或組織(如，哺乳動物血液或組織)輸送蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。在多種實施方式中，所述H-NOX蛋白是能夠結(jié)合血紅素的脫輔基蛋白或是具有血紅素結(jié)合的全蛋白質(zhì)。在向個體施用H-NOX蛋白之前，H-NOX蛋白可具有或可不具有結(jié)合的血紅素。在一些實施方式中，NO在其被輸送到個體之前結(jié)合到H-NOX蛋白。在其它實施方式中，在給予所述個體所述蛋白之前，NO未被結(jié)合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白將NO從該個體中的一個位置運輸?shù)皆搨€體中的另一個位置。例如，在具體的實施方式中，H-NOX蛋白結(jié)合血流中的NO并且只在NO濃度非常低的地方(如血管收縮部位)釋放NO。該NO的靶向輸送可以比傳統(tǒng)血管擴張劑產(chǎn)生更小的副作用，所述傳統(tǒng)血管擴張劑獨立于局部NO濃度而釋放NO并且因此全身性起作用，具有副作用如頭痛和周圍刺痛。
0126本發(fā)明的方法可以被用于治療任何個體。對于本文的應(yīng)用，除非另外清楚指出，如本文所使用，“個體”意思是哺乳動物，包括但不限于，靈長類(如，人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、馬、豬、犬科和貓科。因此，本發(fā)明可用于人類藥物和獸醫(yī)環(huán)境，包括在農(nóng)業(yè)牲畜和家養(yǎng)寵物中的用途。所述個體可已經(jīng)被診斷患有、被懷疑患有或處于發(fā)展某種指征的風險，例如心血管疾病(例如，心肌梗塞或心臟手術(shù))、高血壓、由高血壓加劇的病癥(如，心力衰竭、腎功能衰竭或中風)、血管收縮性病癥(如中風)、功能性NO缺乏、勃起功能障礙、便秘、或腸梗阻。該個體可以是遺傳上易于發(fā)展這類病癥或以其它方式易于發(fā)展這類病癥。
0127如本文所用的，“需要它的(in need thereof)”包括患有病癥或疾病(如，心血管病癥如心肌梗塞或心臟手術(shù)，高血壓，由高血壓加劇的病癥如心力衰竭、腎功能衰竭或中風，血管收縮性病癥如中風，功能性NO缺乏，勃起功能障礙，便秘或腸梗阻)或處于所述病癥或疾病的風險中的個體。如本文所使用的，“處于風險中”的個體是處于發(fā)展病癥如心血管病癥(如，心肌梗塞或心臟手術(shù))、高血壓、由高血壓加劇的病癥(如，心力衰竭、腎功能衰竭或中風)、血管收縮性病癥(如中風)、功能性NO缺乏、勃起功能障礙、便秘、或腸梗阻的風險中的個體?！疤幱陲L險中”的個體可以具有或可以不具有可檢測的疾病或病癥，并且在本文描述的治療方法之前可以顯示出或不顯示出可檢測的疾病?！疤幱陲L險中”表示個體具有一個或多個所謂的風險因素，其是與疾病和病癥的發(fā)展相關(guān)的可測量的參數(shù)并且在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。具有一種或多種這些風險因素的個體比沒有這些風險因素(一種或多種)的個體具有更高的可能性發(fā)展所述疾病或病癥。這些風險因素包括但不限于，年齡、性別、種族、飲食、以前的疾病史、前兆疾病的存在、基因(即，遺傳的)考慮因素以及環(huán)境暴露。
0128這些方法可以被用于治療或延遲NO輸送對其有益的任何病癥。“治療(treatment)”或“治療(treating)”表示用于獲得有益或期望結(jié)果——包括臨床結(jié)果——的方法。出于本發(fā)明的目的，有益或期望的結(jié)果包括，但不限于與病癥(如，但不限于，心血管病癥如心肌梗塞或心臟手術(shù)，高血壓，由高血壓加劇的病癥如心力衰竭、腎功能衰竭或中風，血管收縮性病癥如中風，功能性NO缺乏，勃起功能障礙，便秘或腸梗阻)相關(guān)的癥狀的緩解、與病癥相關(guān)的癥狀程度的減弱、或與病癥相關(guān)的癥狀惡化的預(yù)防。在一些實施方式中，比起與當前可用的療法相關(guān)的副作用，使用一種或多種本文公開的蛋白質(zhì)進行的治療未伴隨有副作用或伴隨有更少的副作用。
0129如本文所使用，“延遲”疾病或病癥的發(fā)展表示延遲、阻礙、減緩、阻止、穩(wěn)定和/或推遲諸如如心血管病癥(如心肌梗塞或心臟手術(shù))、高血壓、由高血壓加劇的病癥(如心力衰竭、腎功能衰竭或中風)、血管收縮病癥(如中風)、功能性NO缺乏、勃起功能障礙、便秘或腸梗阻的疾病或病癥的發(fā)展。延遲可以具有各種時間長度，取決于所述疾病的歷史和/或正治療的個體。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，實際上，足夠或明顯的延遲可以包括預(yù)防，因為個體不發(fā)展所述疾病或病癥。例如，當與不使用所述方法比較時，所述方法可降低在給定時幀中疾病發(fā)展的概率和/或減輕所述疾病在給定時幀中的程度。在一些實施方式中，這樣的比較基于使用統(tǒng)計上顯著個數(shù)的對象進行的臨床研究。疾病發(fā)展可以是使用標準臨床技術(shù)可檢測的。發(fā)展也可指初始不可檢測的疾病的發(fā)展，并包括發(fā)生、復(fù)發(fā)和發(fā)病。
0130在一些直接輸送帶有結(jié)合NO的H-NOX蛋白到身體中特定部位(如組織或器官)的實施方式中，對NO koff比KD值重要，因為NO已經(jīng)結(jié)合到所述蛋白質(zhì)(使得kon較不重要)并且NO需要在身體中特定部位處或附近處被釋放(以受koff影響的速率釋放)。在急性病癥治療的一些實施方式中，H-NOX蛋白具有相對高的對NO的koff、k1或k2(如至少大約0.05s-1、0.1s-1或1.0s-1的任一個)，以便血管舒張迅速發(fā)生。在一些全身給藥的實施方式中，H-NOX蛋白具有相對低的對NO的koff、k1或k2(如至少大約0.05s-1、0.01s-1或0.001s-1的任一個)，以使NO直到H-NOX蛋白到達低NO濃度的部位(如血管收縮的部位)才被釋放。
0131H-NOX蛋白也可以被用于成像(imaging)。具體而言，光成像(例如，光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography)；參見，例如Villard，J.W.(2002)“Use of a Blood Substitute to Determine Instantaneous Murine Right VentricularThickening with Optical Coherence Tomography，”Circulation 1051843-1849，其在此被完整引入作為參考，尤其是關(guān)于光學(xué)相干斷層掃描)被紅細胞變模糊。用H-NOX溶液灌注允許循環(huán)系統(tǒng)和血管壁的圖像更清晰，因為H-NOX蛋白比紅細胞小的多。
0132本發(fā)明的H-NOX蛋白和藥物組合物可以通過任何常規(guī)手段給予個體，例如通過經(jīng)口、局部、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、肺內(nèi)、氣管內(nèi)或氣溶膠給藥；通過經(jīng)皮或粘膜吸收；或通過注射(如，皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、囊泡內(nèi)或肌內(nèi)注射)。H-NOX蛋白也可以被包含在大體積腸胃外溶液中，用于施用到血液。在示例性的實施方式中，H-NOX蛋白被施用至個體的血液(例如，施用至血管，如靜脈、動脈或毛細血管)。
0133在一些實施方式中，所述組合物的持續(xù)連續(xù)釋放制劑被使用。H-NOX蛋白的給藥可以進行例如數(shù)秒到數(shù)小時的時間期間，這取決于給藥目的。對于急性病癥，示例性的給藥時程是盡可能迅速。其它示例性的時程包括大約10、20、30、40、60、90或120分鐘的任何一個。示例性輸注速率為從約30mL/小時到約13,260mL/小時，例如約100mL/小時到約3,000mL/小時。H-NOX蛋白的示例性總劑量為約900mg/kg，在20分鐘內(nèi)以13,260mL/小時加以施用。對于豬，H-NOX蛋白的示例性總劑量約為18.9克。
0134示例性的給藥頻率包括，但不限于，每周至少1、2、3、4、5、6或7次(即每天一次)。在一些實施方式中，H-NOX蛋白每天至少給藥2、3、4或6次。H-NOX蛋白可以在例如數(shù)天或數(shù)周的時間段內(nèi)給藥。在一些實施方式中，H-NOX蛋白被給藥更長的時間段，例如數(shù)月或數(shù)年?；诮o藥醫(yī)師的判斷，所述組合物的給藥頻率可以在療程內(nèi)加以調(diào)整。
0135如上文所述，H-NOX蛋白劑量的選擇取決于使用的劑型、給藥的頻率和次數(shù)、治療的病癥和根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的所要達到的具體目的。在一些實施方式中，給予人的H-NOX蛋白的有效量在數(shù)克到超過約350克之間。
0136在一些實施方式中，兩種或多種不同的H-NOX蛋白被同時、順序或共同給藥。在一些實施方式中，用于O2輸送的另一種化合物或療法與一種或多種H-NOX蛋白的給藥同時、順序、或共同給予。
H-NOX蛋白的工業(yè)應(yīng)用 0137本文所述的H-NOX蛋白和組合物也可以被用于多種體外或工業(yè)應(yīng)用(參見，例如美國專利號6,455,676，其在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于體外或工業(yè)應(yīng)用)。對于特定的應(yīng)用，基于期望的NO解離常數(shù)、O2解離常數(shù)、NOkoff、O2 koff、NO反應(yīng)性、NO穩(wěn)定性、自氧化速率、半衰期或前述兩種或多種的任何組合，可以選擇特定的H-NOX蛋白用于這類應(yīng)用。在工業(yè)應(yīng)用的多種實施方式中，H-NOX蛋白是能夠結(jié)合血紅素的脫輔基蛋白或帶有血紅素結(jié)合的全蛋白質(zhì)。
0138H-NOX蛋白可以被用于將NO加入到需要NO的溶液中。在使用需要厭氧發(fā)酵的生物反應(yīng)器的實施方式中，H-NOX蛋白被用于輸送NO到細胞。例如，向線粒體的NO輸送可限制氧化磷酸化并且增強通過乳酸鹽通路的代謝。丙酮丁醇梭桿菌中的H-NOX蛋白——其作為生物燃料發(fā)生器(biofuel generator)在厭氧發(fā)酵的條件下進行培養(yǎng)——可以天然地發(fā)揮此功能。而且，H-NOX蛋白可以被用于從需要除去NO的溶液中除去NO。例如，H-NOX蛋白可以被用于吸收或除去生物反應(yīng)器中的NO，在所述生物反應(yīng)器中NO是細胞增殖和/或線粒體功能的抑制劑。除去NO可以改善線粒體功能、限制凋亡、增加每細胞的生產(chǎn)率、或前述的兩種或多種的任何組合。
含有H-NOX蛋白的試劑盒 0139也提供了包含本文所述任何H-NOX蛋白及適當包裝的制品和試劑盒。在一些實施方式中，本發(fā)明包括試劑盒，其具有(i)H-NOX蛋白(例如，本文所述的野生型或突變H-NOX蛋白或本文所述的它們的制劑)和(ii)使用該試劑盒向個體輸送NO的說明。在多種實施方式中，本發(fā)明以試劑盒為特征，所述試劑盒具有(i)H-NOX蛋白(例如，本文所述的野生型或突變H-NOX蛋白或本文所述的它們的制劑)和(ii)將該試劑盒用于本文所述的任何工業(yè)應(yīng)用(如，將NO加入到溶液或從溶液除去NO)的說明。
0140用于本文所述組合物的適當包裝在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并且包括，例如，小瓶(如，密封的小瓶)、器皿、安瓿、瓶、罐、軟包裝(如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。這些制品可進一步被滅菌和/或密封。也提供了包含本文所述組合物的單位劑型。這些單位劑型能夠以單或多單位劑量被儲存在適當?shù)陌b中，并也可被進一步滅菌和密封。本發(fā)明的試劑盒中提供的說明通常是在標簽或包裝內(nèi)頁(例如，該試劑盒中包含的紙張)上的書面說明，但是機器可讀的說明書(例如，磁盤或光盤上攜帶的說明書)也是可接受的。涉及H-NOX蛋白應(yīng)用的說明通常包括關(guān)于目的治療或工業(yè)應(yīng)用的劑量、給藥方案和給藥途徑。試劑盒可進一步包括選擇適于治療的個體的描述。
0141容器可以是單位劑量、批量包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。例如，含有足夠劑量本文所公開的H-NOX蛋白的試劑盒也可被提供，以向個體提供延長時間段的有效治療，例如，約下列值的任何一個一周、2周、3周、4周、6周、8周、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月或更長時間。試劑盒也可包括多單位劑量的H-NOX蛋白和使用說明，并以足以用于藥房——例如醫(yī)院藥房和配藥藥房(compounding pharmacies)——存儲和使用的量進行包裝。在一些實施方式，試劑盒包括干燥(例如，凍干)組合物，其能夠被重構(gòu)、重懸浮或再水化，通常形成穩(wěn)定的H-NOX蛋白水混懸液。
H-NOX蛋白的示例性生產(chǎn)方法 0142本發(fā)明也提供了產(chǎn)生本文所述任何突變H-NOX蛋白的方法。在一些實施方式中，所述方法包括在適合突變H-NOX蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)具有編碼突變H-NOX蛋白的核酸的細胞。在多種實施方式中，突變H-NOX也被純化(例如，從細胞或培養(yǎng)基中純化H-NOX蛋白)。
0143如上文所述，數(shù)個野生型H-NOX蛋白和核酸的序列是已知的并且可以被用于產(chǎn)生本發(fā)明所述的突變H-NOX蛋白和核酸。用于重組H-NOX蛋白的突變、表達和純化的技術(shù)由例如Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NOSelectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 153-59和Karow，D.S.et al.(2004年8月10日)“Spectroscopic Characterization of The SolubleGuanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae AndThermoanaerobacter Tengcongensis，”Biochemistry 43(31)10203-10211中描述，其在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于重組H-NOX蛋白的突變、表達和純化。這些技術(shù)或其它標準技術(shù)可以被用于產(chǎn)生任何突變H-NOX蛋白。
0144具體而言，本文所述的突變H-NOX蛋白可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法產(chǎn)生。突變可以通過氨基酸的化學(xué)修飾發(fā)生在氨基酸水平，或通過編碼給定氨基酸的核苷酸序列的改變發(fā)生在密碼子水平。在蛋白質(zhì)的任何給定位置處的氨基酸取代可以通過改變編碼該氨基酸的密碼子而實現(xiàn)。這可以通過定點誘變，使用下列進行，例如(i)Amersham技術(shù)(Amersham mutagenesis kit，Amersham，Inc.，Cleveland，Ohio)，其基于Taylor，J.W.et al.(1985年12月20日)“The Use ofPhosphorothioate-Modified DNA in Restriction Enzyme Reactions to Prepare NickedDNA，”Nucleic Acids Res.13(24)8749-8764；Taylor，J.W.et al.(1985年12月20日)“The Rapid Generation of Oligonucleotide-Directed Mutations at High FrequencyUsing Phosphorothioate-Modified DNA，”Nucleic Acids Res.13(24)8765-8785；Nakamaye，K.L.et al.(1986年12月22日)“Inhibition of Restriction EndonucleaseNci I Cleavage by Phosphorothioate Groups and its Application toOligonucleotide-Directed Mutagenesis，”Nucleic Acids Res.14(24)9679-9698；和Dente et al.(1985).在DNA Cloning，Glover，Ed.，IRL Press，pages 791-802中的方法；(ii)Promega試劑盒(Promega Inc.，Madison，Wis.)；或(iii)Biorad試劑盒(BioradInc.，Richmond，Calif.)，其基于Kunkel，T.A.(1985年1月)“Rapid And EfficientSite-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(2)488-492；Kunkel，T.A.(1987).“Rapid And Efficient Site-Specific MutagenesisWithout Phenotypic Selection，”Methods Enzymol.154367-382；Kunkel，美國專利4,873,192，它們的每一個都在此被引入作為參考，特別是關(guān)于蛋白質(zhì)誘變。誘變也可以通過其它商業(yè)可得的或非商業(yè)手段進行，例如使用帶有突變核苷酸的定點誘變的那些手段。
0145定點誘變也可以使用基于PCR的誘變進行，例如在Zhengbin et al.(1992).PCR Methods and Applications，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork中205-207頁；Jones，D.H.et al.(1990年2月).“A Rapid Method ForSite-Specific Mutagenesis And Directional Subcloning by Using the Polymerase ChainReaction to Generate Recombinant Circles，”Biotechniques 8(2)178-183；Jones，D.H.et al.(1991年1月).“A Rapid Method For Recombination And Site-SpecificMutagenesis by Placing Homologous Ends on DNA Using Polymerase ChainReaction，”Biotechniques 10(1)62-66中描述的那些，它們中的每一個都在此被引入作為參考，特別是關(guān)于蛋白質(zhì)誘變。定點誘變也可以使用盒式誘變，利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)進行。
0146突變H-NOX核酸可以使用標準技術(shù)被參入載體，例如表達載體。例如，限制性酶可以被用于切割突變H-NOX核酸和載體。接著，被切割的突變H-NOX核酸和被切割的載體的匹配末端可以被連接。產(chǎn)生的載體可以使用標準技術(shù)(例如，電穿孔)被插入細胞(例如，昆蟲細胞、植物細胞、酵母細胞或細菌細胞)，用于編碼的H-NOX蛋白的表達。
0147具體而言，異源蛋白質(zhì)已經(jīng)被表達在許多生物表達系統(tǒng)中，例如昆蟲細胞、植物細胞、酵母細胞和細菌細胞。因此，合適的生物蛋白表達系統(tǒng)可以被用于產(chǎn)生大量重組H-NOX蛋白。在一些實施方式中，所述H-NOX蛋白(如，突變或野生型H-NOX蛋白)是分離的蛋白質(zhì)。如本文所使用，“分離的蛋白質(zhì)”表示從一種或多種組分分離的蛋白，所述蛋白質(zhì)與所述組分天然相關(guān)，所述組分包括，例如核酸、脂質(zhì)和其它蛋白質(zhì)。分離的蛋白質(zhì)也不存在于蛋白質(zhì)文庫中，例如具有2、5、10、20、50或更多種不同蛋白質(zhì)的文庫。分離的蛋白質(zhì)也可以通過，例如編碼該蛋白質(zhì)的核酸的表達或通過該蛋白質(zhì)的化學(xué)合成而獲得。
0148如果希望，H-NOX蛋白可以使用標準技術(shù)進行純化。如本文所使用，“純化的蛋白質(zhì)”表示，已經(jīng)從在產(chǎn)生蛋白質(zhì)時存在的一種或多種組分中分離的蛋白質(zhì)(例如，突變或野生型H-NOX蛋白)。在一些實施方式中，所述蛋白質(zhì)至少不含按重量計約60％的當產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)時存在的其它組分。在多種實施方式中，所述蛋白質(zhì)按重量計至少約75％、90％或99％純。純化的蛋白質(zhì)可以通過，例如從天然來源、重組表達系統(tǒng)或化學(xué)合成的反應(yīng)混合物進行純化(如，提取)而獲得。示例性的純化方法包括免疫沉淀、柱層析例如免疫親和層析、磁珠免疫親和純化、和使用板結(jié)合抗體淘選、以及普通技術(shù)人員已知的其它技術(shù)。純度可以通過任何適當?shù)姆椒ㄟM行測定，例如，通過柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析。在一些實施方式中，純化的蛋白質(zhì)被摻入本發(fā)明所述的藥物組合物或被用于本發(fā)明所述的方法。本發(fā)明所述的藥物組合物可具有添加劑、載體或除純化的蛋白質(zhì)以外的其它組分。
實施例 0149實施例——其旨在純粹是本發(fā)明的示例并因此不應(yīng)該被認為以任何方式限制本發(fā)明——還描述并詳述了上面討論的本發(fā)明的方面和實施方式。這些實施例并不旨在表示以下實驗是所進行的全部的或唯一的實驗。除非另外說明，溫度以攝氏度表示并且壓力等于或接近大氣壓。
實施例1野生型和突變H-NOX蛋白的產(chǎn)生 0150使用標準方法產(chǎn)生、表達和純化野生型和突變H-NOX蛋白，基本上如Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in SolubleGuanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 153-59和Karow，D.S.et al.(August 10，2004)“Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like HemeDomains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis，”Biochemistry 43(31)10203-10211中所描述，它們在此都被完整引入作為參考，特別是關(guān)于重組H-NOX蛋白的誘變、表達和純化。使用來自Strategene(La Jolla，CA)的QuickChange

方案進行誘變。蛋白質(zhì)在細胞培養(yǎng)中的表達及后續(xù)的蛋白質(zhì)純化根據(jù)Karow，D.S.et al.(2004年8月10日)“Spectroscopic Characterization of TheSoluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae AndThermoanaerobacter Tengcongensis，”Biochemistry 43(31)10203-10211所述進行。
實施例2突變H-NOX蛋白的表征 計算的對NO的KDkoff與kon的比率 0151為了確定計算的對NO的KD，H-NOX蛋白的對NO的kon的值被假定為710μM-1s-1，并且NO的解離速率(具有6-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白的koff或具有5-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白的k1或k2)如下所述進行測定。
koff、k1和k2(NO解離速率) 具有6-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白的koff值 0152對于具有6-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白，NO的koff被計算出，如由Boon，E.M.等人(August 2006)，“Nitric Oxide Binding to ProkaryoticHomologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain，”J.Biol.Chem.281(31)21892-21902和Boon，E.M.等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivityin Soluble Guanylate Cyclase，”Nature Chemical Biology 153-59所描述的，其各自以其全部內(nèi)容通過引用并入，尤其是關(guān)于H-NOX蛋白的NO koff的計算。簡而言之，稀釋在無氧的50mM三乙醇胺、50mM NaCl、pH 7.5的緩沖液中的H-NOX蛋白的FeII-NO復(fù)合物(5μM血紅素，終濃度)與飽和一氧化碳和相同緩沖液(無氧的)中的30mM(終濃度)連二亞硫酸鹽阱(trap)(Na2S2O4)迅速混合(Kharitonov，V.G.等人(1997)，Biochemistry 366814-6818和Moore，E.G.等人(1976)，J.Biol.Chem.2512788-2794，其各自全部內(nèi)容通過引用并入，尤其是關(guān)于NO解離速率的計算)。以前已經(jīng)確定，CO結(jié)合在這些實驗中并非速率限制性的(Kharitonov，V.G等人(1997)Biochemistry 366814-6818)；這在沒有CO下僅應(yīng)用30mM Na2S2O4作為阱的實驗中得到證實。采用具有100微升到1毫升大小和1厘米徑長的石英小池(quartz cuvette)(Cary 3E，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)，通過在Cary 3E分光光度計上定時地掃描而獲得數(shù)據(jù)，所述分光光度計裝備有被設(shè)定到不同溫度(0-70℃)的Neslab RTE-100恒溫浴。當FeII-CO復(fù)合物形成時，在423nm處監(jiān)測來自血紅素的NO的解離。通過從每一后續(xù)掃描減去第一次掃描來計算差示光譜(differencespectra)。通過423nm處的吸光度相對于時間的增加確定NO解離速率并且采用Kaleidagraph 3.X(Synergy Software，Reading，PA)將其以具有f(x)＝A x(1-e-kx)型的單指數(shù)進行擬合。具體而言，血紅素-CO濃度的單指數(shù)增加(由于來自NO阱的CO結(jié)合)可以由方程1描述 (方程1) 0153其中，ΔAt是在時間t下信號幅度的變化；ΔAT是信號幅度的總變化，并且k1是觀測反應(yīng)速率常數(shù)。每一次實驗最少進行六次，并且對獲得的速率取平均。所測量的解離速率獨立于CO和連二亞硫酸鹽濃度(3、30和300mM連二亞硫酸鹽被檢測)。
具有5-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白的k1和k2值 0154對于具有5-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白，對NO的koff通過對NO的k1和對NO的k2進行描述，如由Winger，J.A.等人(January 2007)，“Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme-NitricOxide/Oxygen Binding Domain Constructs”J.Biol.Chem.282(2)897-907所描述的，其由此通過引用以其全部并入，尤其是關(guān)于H-NOX蛋白的NO koff、NO k1以及NO k2的計算。簡而言之，采用以前描述的CO/連二亞硫酸鹽捕集法(Cary，S.P.L.等人(2005)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.10213064-13069和Kharitonov，V.G.等人(1997)，Biochemistry 366814-6818，其各自由此通過引用以其全部內(nèi)容并入，尤其是關(guān)于NO解離速率的計算)，在37℃和10℃測量NO與具有5-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白的血紅素的解離。如下制備捕集液使用無氧室(CoyLaboratory Products)，在特氟隆-密封的反應(yīng)小瓶(Teflon-sealed Reacti-Vial)(Pierce)中制備連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)在50mM HEPES，pH 7.4，50mM NaCl中的溶液。從無氧室移出該溶液并通過使氣體通過溶液起泡10分鐘用CO飽和該溶液。通過與過量DEA/NO(在10mM NaOH中)在25℃下在50mM HEPES，pH 7.4，50mMNaCl中溫育10分鐘，形成H-NOX蛋白-NO復(fù)合物。通過追蹤Soret最大值從431至399nm的偏移，確認向亞硝酰基類的全部轉(zhuǎn)化。H-NOX蛋白被放置在隔膜密封的無氧小池(具有100微升到1毫升的大小和1厘米徑長的石英小池)中，并且使用清除氧的氣體組(oxygen-scavenged gas train)進行脫氧。正好在脫氧之前加入小量的DEA/NO(～3當量)，以維持亞硝?；?任何殘留物隨后被捕集溶液中大量過量的Na2S2O4破壞)。無氧小池的頂部空間用CO替換，并且所述小池和捕集溶液在測定溫度下平衡1分鐘。通過用Hamilton氣密式注射器將CO/連二亞硫酸鹽溶液加入到無氧小池中并混合，起始反應(yīng)。反應(yīng)混合物中的Na2S2O4的終濃度為30mM。最終的蛋白質(zhì)濃度對于β1(1-194)、β1(1-385)和β2(1-217)為1.9至2.5μM，而對于sGC為0.88至2.5μM。在捕集液加入之后10秒鐘，開始數(shù)據(jù)收集。應(yīng)用裝備有Neslab RTE-100溫度控制器的Cary 3E分光光度計(Cary3E，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)，通過電子吸收光譜監(jiān)測反應(yīng)。在909納米/分鐘下，以1.5nm的數(shù)據(jù)點間隔，在380-450nm的范圍內(nèi)收集數(shù)據(jù)。每18秒鐘記錄光譜，進行5分鐘；每分鐘記錄，進行10分鐘；以及之后每2分鐘記錄，共記錄3小時或直到反應(yīng)完成。從每一光譜中減去緩沖液基線，并且通過標準化至410納米處的等吸光點，校正光譜的基線漂移。通過從所有后續(xù)光譜中減去時間0時的光譜，獲得差示光譜。從差示光譜中提取出在423納米處(ΔA423；β1(1-194))和β1(1-385))或424納米處(ΔA424；sGC和β2(1-217))的吸光度的變化值并且將其相對于時間作圖，以獲得每一實驗的解離時程。重復(fù)兩次或三次獲得解離時程，并且每一實驗在幾天內(nèi)重復(fù)2-5次。一般地，由于獲得大量的純化sGC相對困難，全長sGC的ΔA424值——其與實驗蛋白質(zhì)濃度成比例——比血紅素結(jié)構(gòu)域構(gòu)建物的ΔA424值小。
0155采用Kaleidagraph 3.X(Synergy Software Reading，PA)，進行曲線擬合、數(shù)據(jù)分析以及圖形產(chǎn)生。來自每一解離實驗的數(shù)據(jù)被擬合到如下面方程2示出的雙指數(shù)中，以獲得觀測速率常數(shù)。具體而言，方程2描述了血紅素-CO濃度的雙指數(shù)增加(由于來自NO阱的CO結(jié)合) (方程2) 其中，ΔAt是在時間t時信號幅度的變化；ΔA1和ΔA2是每一指數(shù)過程對于信號幅度總變化的貢獻，并且k1和k2是每一過程的觀測反應(yīng)速率常數(shù)。
0156觀測到的數(shù)據(jù)與其中解離發(fā)生于兩種5-配位血紅素-NO復(fù)合物的初始平衡混合物的模型一致，如方案1中顯示。因此，k1對應(yīng)于NO從血紅素-NO5C構(gòu)象的解離，而k2代表觀測的反應(yīng)速率，對應(yīng)于kO-kC，其受到較慢的從血紅素-NO NO*5C到血紅素-NO5C的轉(zhuǎn)化的限制。


方案1 具有5-配位和6-配位FeII-NO復(fù)合物混合物的H-NOX蛋白的k1和k2值 0157對于包含5-配位和6-配位FeII-NO復(fù)合物的混合物的H-NOX蛋白，對NO的koff由對NO的k1和對NO的k2來描述。如同上述對于具有5-配位FeII-NO復(fù)合物的H-NOX蛋白一樣，測量對NO的k1和k2，如由Winger，J.A.等人(January2007)，“Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme-NitricOxide/Oxygen Binding Domain Constructs”J.Biol.Chem.282(2)897-907所描述的，其由此通過引用以其全部并入，尤其是關(guān)于H-NOX蛋白的NO koff、NO k1以及NO k2的計算。
NO的計算的KD 0158對于NO的計算的KD，H-NOX蛋白的對NO的kon值被假定為710μM-1s-1，其是報道的β1(1-385)的kon——其在4℃下測量并且在37℃下沒有顯著增加(Zhao等人(1999)，“A Molecular Basis for Nitric Oxide Sensing by SolubleGuanylate Cyclase，”PNAS.9614753-14758，其尤其通過引用以其全部并入，尤其是關(guān)于H-NOX蛋白的NO kon計算)。因此，通過計算koff、k1或k2(如上述進行測量)與kon(被假定為710μM-1s-1)之比來確定NO的計算的KD。
O2的動力學(xué)KDkoff與kon之比 0159測定野生型和突變H-NOX蛋白的動力學(xué)KD值，基本上如Boon，E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase，”Nature ChemicalBiology 153-59所述進行，其在此被完整引入作為參考，特別是涉及O2結(jié)合速率、O2解離速率、O2結(jié)合的解離常數(shù)、自氧化速率和NO解離速率。
kon(O2結(jié)合速率) 0160使用閃光光解法在20℃下測量O2對血紅素的結(jié)合。由于非?？斓某蓪χ亟M動力學(xué)(geminate recombination kinetics)，不可能閃蒸出(flash off)FeII-O2復(fù)合體；因此，F(xiàn)eII-CO復(fù)合體用560nm的激光(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)進行閃光光解，產(chǎn)生5-配位的FeII中間體，在不同波長下追蹤分子O2與該FeII中間體的結(jié)合。通過用10mM連二亞硫酸鹽進行厭氧還原，接著在PD-10柱(Millipore，Inc.，Billerica，MA)上進行脫鹽而制備蛋白質(zhì)樣品。該樣品隨后在受控氣氛的石英小池(quartz cuvette)中在50mM TEA、50mM NaCl、pH 7.5的緩沖液中被稀釋到20μM的血紅素，石英小池的尺寸為100μL到1mL并且徑長為1cm。CO氣體在該小池的頂部空間流動10分鐘，以形成FeII-CO復(fù)合物，該復(fù)合物的形成通過UV-可見光譜(Soret最大值為423nm)加以確認。該樣品隨后被用于測量閃光光解后但仍在1大氣壓的CO氣體下的CO-再結(jié)合動力學(xué)，或在閃光光解之前，它被打開并在空氣中攪拌30分鐘，充分對緩沖液充氧，以觀察O2-再結(jié)合事件。在多個波長對時間下，觀察O2與血紅素的結(jié)合。這些跡線使用Igor Pro軟件(Wavemetrics，Inc.，Oswego，OR；最新2005版)以單指數(shù)擬合。該速率獨立于觀測波長，但依賴于O2濃度。UV-可見光光譜自始至終被使用，以確認所有的復(fù)合物和中間體(Cary3K，Varian，Inc.Palo Alto，CA)。瞬時吸收數(shù)據(jù)使用Dmochowski，I.J.et al.(2000年8月31日)“Enantiomeric Discrimination of Ru-Substrates by Cytochrome P450cam，”JInorg Biochem.81(3)221-228所述的儀器進行采集，其在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于儀器操作。該儀器具有20ns的反應(yīng)時間，并且數(shù)據(jù)以200兆樣每秒(megasample s-1)的速率被數(shù)字化。
koff(O2解離速率) 0161為了測量koff，蛋白質(zhì)(5μM血紅素)的FeII-O2復(fù)合物，在無氧的50mM TEA、50mM NaCl、pH 7.5的緩沖液中稀釋，與等體積含有各種濃度連二亞硫酸鹽和/或飽和CO氣體的相同緩沖液(無氧)迅速混合。在裝備有設(shè)置為20℃的Neslab RTE-100恒溫浴的HI-TECH Scientific SF-61停流分光光度計(TGKScientific LTD.，Bradford On Avon，United Kingdom)上獲取數(shù)據(jù)。O2從血紅素的解離被監(jiān)控為在437nm——FeII-FeII-O2差示光譜中的最大值——或425nm——FeII-FeII-CO差示光譜中的最大值——處吸光度的增加。最終的跡線使用軟件擬合成單指數(shù)，該軟件是所述儀器的一部分。每個實驗進行最少6次，并且對得到的速率進行平均。測量的解離速率獨立于連二亞硫酸鹽濃度(測試了100、50、25、10、5和2.5mM連二亞硫酸鹽)且獨立于作為被還原物質(zhì)的阱(trap)的飽和CO，兩者都在10mM連二亞硫酸鹽存在和不存在的情況下。
O2的動力學(xué)KD 0162通過使用上述koff與kon的測量結(jié)果計算koff與kon的比率，確定O2的動力學(xué)KD。
計算的KD 0163為測量計算的KD，對如上所述獲得的koff值和動力學(xué)KD值進行繪圖。koff與動力學(xué)KD之間的線性關(guān)系通過方程(y＝mx+b)加以定義。然后，koff值沿圖線插入，以使用ExcelMAC 2004(Microsoft，Redmond，WA)得到計算的KD。在沒有測量的kon的情況下，該插值提供了使koff與KD相關(guān)的方法。
自氧化速率 0164為測量自氧化速率，蛋白質(zhì)樣品被無氧還原，隨后在有氧的50mMTEA、50mM NaCl、pH 7.5的緩沖液中被稀釋到5μM血紅素。然后，這些樣品在裝備有設(shè)置到37℃的Neslab RTE-100恒溫浴的Cary 3E分光光度計中溫育，并定期掃描(Cary 3E，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)。通過在對時間繪制的并使用ExcelMAC 2004(Microsoft，Redmond，WA)以單指數(shù)擬合的FeIII-FeII差示光譜中的最大值與最小值之間的差確定自氧化速率。
與NO反應(yīng)的速率 0165使用在緩沖液A中以2μM濃度制備的純化蛋白(Tt WT HNOX、TtY140H HNOX和智人血紅蛋白(Hs Hb))和在緩沖液A中以200μM制備的NO測量NO反應(yīng)性(緩沖液A50mM Hepes，pH 7.5、50mM NaCl)。在裝備有設(shè)置為20℃的Neslab RTE-100恒溫浴的HI-TECH Scientific SF-61停流分光光度計(TGKScientific LTD.，Bradford On Avon，英國)上獲取數(shù)據(jù)。所述蛋白質(zhì)與NO以1∶1的比例迅速混合，混合時間0.00125秒。使用軟件將最大變化的波長擬合成單指數(shù)，該軟件是光度計的一部分，主要測量NO氧化的限速步驟。該反應(yīng)的終產(chǎn)物對于H-NOX蛋白是三價鐵-NO，而對于Hs Hb為三價鐵-水合物。
p50測量 0166如果希望，突變或野生型H-NOX蛋白的p50值可以如Guarnone，R.et al.(1995年9月/10月).“Performance Characteristics of Hemox-Analyzer ForAssessment of The Hemoglobin Dissociation Curve，”Haematologica 80(5)426-430所述加以測量，其在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于p50值的測量。使用血氧分析儀(HemOx-Analyzer)測定p50值。測量室起始于0％氧并緩慢上升，遞增至100％氧。該室中的氧探針測量氧飽和百分比。第二探針(UV-可見光)測量兩個吸收波長，調(diào)諧至血紅素蛋白(如，諸如與血紅素復(fù)合的H-NOX的蛋白質(zhì))的UV-可見光光譜的α和β峰。這些吸收峰隨著血紅素蛋白結(jié)合氧而線性升高。然后，繪制從未結(jié)合至100％結(jié)合的百分數(shù)變化對氧百分數(shù)值的圖，以產(chǎn)生曲線。p50是該曲線上的點，在該點50％血紅素蛋白結(jié)合氧。
0167具體而言，血氧-分析儀(Hemox-Analyzer)(TCS Scientific Corporation，New Hope，PA)通過將50μL血液或血紅素蛋白暴露于提高的氧氣分壓并用氮氣使其去氧，來確定氧血紅素蛋白(oxyhemoprotein)解離曲線(oxyhemoproteindissociation curve，ODC)。Clark氧電極檢測氧張力的變化，該變化被記錄在x-y坐標記錄儀的x軸上。所產(chǎn)生的氧血紅素蛋白分數(shù)的增長通過雙波長分光光度法在560nm和576nm同時監(jiān)測，并顯示在y軸上。從前中靜脈(antemedial vein)取血樣，用肝素抗凝，并在濕冰上保持在4℃，直到測定。50μL全血在5μL的Hemox溶液中稀釋，該溶液是制造商提供的緩沖液，其保持溶液的pH值在7.4±0.01。該樣品-緩沖液被吸入作為血氧-分析儀的一部分的小池，并且混合物的溫度被平衡并帶到37℃；該樣品隨后用空氣充氧到100％。調(diào)整pO2值之后，該樣品用氮氣去氧；在去氧的過程中，曲線被記錄在圖紙上。p50值使用作為血氧-分析儀一部分的軟件在x軸上外推為這樣的點，在該點上O2飽和度為50％。完成記錄所需的時間約為30分鐘。
0168任何H-NOX蛋白的p50值可以與血紅蛋白的p50值比較，作為H-NOX蛋白相比于血紅蛋白對O2的相對親和性的指示。表13列出了先前報告的血紅蛋白的p50值。
表13.血紅蛋白突變體及其報告的氧親和性 粘度測量 0169如果希望，H-NOX溶液的粘度可以使用帶有的CPE-40圓錐軸(conespindle)的錐板式流變計(型號DV-III，Brookfield；Middleboro，MA)以200/s的剪切速率進行測量。在血液稀釋氧輸送實驗中給予的粘度在1到4厘泊(cP)之間的溶液被報告為安全(Winslow，R.M.et al.(2004年10月).“Comparison ofPEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat，”J ApplPhysiol.97(4)1527-1534，美國專利號6,974,795和6,432,918，它們中的每一個都在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于粘度測量)。因此，在一些實施方式中，H-NOX蛋白溶液的粘度在1和4cP之間。
膠體滲透壓測量 0170如果希望，膠體滲透壓可以使用膠體滲透壓計(型號4420，Wescor；Logan，UT)，根據(jù)制造商的說明進行測量。測量膠體滲透壓的示例性方法在Vandegriff，K.D.et al.(1997年11月).“Colloid Osmotic Properties of ModifiedHemoglobinsChemically Cross-Linked Versus Polyethylene GlycolSurface-Conjugated，”Biophys.Chem.69(1)23-30，萬維網(wǎng)地址為“anaesthesiamcq.com/FluidBook/fl2_4.php”；美國專利號6,974,795和6,432,918中進行描述，它們中的每個都在此被完整引入作為參考，特別是關(guān)于測量膠體滲透壓。在血液稀釋氧輸送實驗中給予的、膠體滲透壓在20到50mmHg之間的溶液被報告為安全(Winslow，R.M.et al.(2004年10月).“Comparison of PEG-Modified AlbuminAnd Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat，”J.Appl.Physiol.97(4)1527-1534)。因此，在一些實施方式中，H-NOX蛋白溶液的膠體滲透壓在20和50mm Hg之間。
實施例3用于NO載體H-NOX突變體的心臟病模型 0171兩個動物模型可以被用于比較作為NO載體的H-NOX蛋白和標準硝酸鹽療法的功效。為了在慢性心血管疾病的大鼠模型中比較H-NOX蛋白的效應(yīng)與用二硝酸異山梨醇(ISDN)進行的真實NO輸送，可以使用雄性Wistar大鼠對已經(jīng)建立的方案(Shimamura，S.等人(2006)，J Vet Med Sci Vol.68(3)213-7，其由此通過引用以其全部并入，尤其是關(guān)于心血管疾病的模型)進行改進。為了模擬心血管肥大，通過腹側(cè)腹部剖腹手術(shù)和在插入的21號針上應(yīng)用收縮線——其隨后被除去以使血管狹窄一致，腹主動脈被收縮(腹主動脈狹窄或“AC”模型)。假手術(shù)組的大鼠經(jīng)歷相似的手術(shù)，但是不產(chǎn)生AC。手術(shù)之后，大鼠被隨機地分成每組14只動物的治療組(7只服藥而7只服安慰劑)，并且被允許恢復(fù)7天。每組的治療(對照組在每一測試情形下以安慰劑進行配對)是(1)AC大鼠被經(jīng)口施用sr-ISDN或安慰劑；(2)AC大鼠被IV施用本文描述的一種或多種野生型或突變H-NOX蛋白或安慰劑(如失活的H-NOX蛋白)；(3)和(4)假手術(shù)組大鼠，分別如(1)或(2)進行處理。一天一次治療，共12周，之后在動物被處死，心臟被切離，進行標準組織病理學(xué)分析，用于確定心肌細胞形態(tài)、纖維化、膠原沉積、心室直徑、主動脈形態(tài)、以及其它標準分析，從而評價疾病進程或預(yù)防。
0172為了比較H-NOX蛋白與ISDN在介導(dǎo)急性心肌梗塞之后的長期左心室重塑中的效力，采用標準方案(Bodh I.Jugdutt，MBChB，MSc；Mohammad I.Khan，MBBS(1994).Circulation 89(S))，制作了犬模型，其中ISDN通過長期施用已經(jīng)顯示出一些功效。對于每一實驗，40只健康的任一性別的雜種狗(體重，16至29千克)在全身麻醉(戊巴比妥鈉，30毫克/千克，IV)下進行左外側(cè)切口開胸手術(shù)。聚乙烯導(dǎo)管被插入到頸外靜脈、頸內(nèi)動脈、以及左心房中，所述聚乙烯導(dǎo)管中充滿肝素化鹽水，并且它們的末端在頸后外露。絲綢繃帶被放置在中左管狀動脈前降支的周圍，在第一和第二對角分支之間，并被系上。金屬珠被縫合在左中心室水平處的短軸平面中的心內(nèi)膜前表面、心內(nèi)膜側(cè)表面和心內(nèi)膜后表面，以使系列局部圖像的回波心臟描記的方向一致。心包和胸腔隨后被關(guān)閉。青霉素(1百萬單位)和鏈霉素(1克)被肌肉內(nèi)給藥，并且所述狗返回到它們的籠內(nèi)。
0173冠狀動脈結(jié)扎后兩天，70只健康的生還者被隨機進行硝酸鹽治療(n＝10)、H-NOX蛋白治療(如，一種或多種野生型或突變H-NOX蛋白，其已經(jīng)任選地使用本文描述的任一測定方法進行了體外表征并且任選地進行了毒性和/或藥物代謝動力學(xué)的優(yōu)化)(10只)、以及匹配的對照亞組(沒有治療，n＝20)亞組1(10只對照，10只硝酸鹽)和亞組2(10只對照，10只H-NOX蛋白)。所述狗被允許自由進食流體，并且沒有試圖通過流體限制或藥物治療來治療心力衰竭。在第六周，存活的狗被麻醉，并且用過劑量的靜脈內(nèi)氯化鉀將心臟固定在舒張期，切離心臟，在生理鹽水溶液中洗滌并稱重。取出血液樣品，用于監(jiān)測血液氣體、血像、和電解質(zhì)。應(yīng)用標準程序，進行康復(fù)期間的測量(如ECG’s、血液動力學(xué)，等)，并且驗尸分析包括上述對于慢性心力衰竭的那些測量(如，膠原堆積、肌細胞形態(tài)學(xué)，等等)。在心肌梗塞和/或慢性AC模型實驗中與ISDN(用于急性和慢性心力衰竭的基于硝酸鹽的治療的護理標準)一樣有效或更有效的H-NOX蛋白對于心力衰竭和/或慢性AC的治療特別有用。預(yù)期這樣的H-NOX蛋白對于治療NO輸送對其有益的其它指征也是有用的。
0174前述實施例和詳細描述通過闡述的方式而非通過限制的方式給出。本說明書中引用的所有出版物、專利申請和專利通過引用并入本文，如同每個單獨的出版物、專利申請或?qū)＠痪唧w地并各自地被指出通過引用而并入。盡管出于清楚理解的目的，前述發(fā)明已經(jīng)通過舉例說明和實施例的方式以一些細節(jié)進行了描述，但考慮根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言非常明顯的是，可以對本發(fā)明進行某些變化和修改而不背離所附權(quán)利要求書的精神或范圍。
0175除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義是本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的那些。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也將理解，與本文所描述的那些相似或等價的任何方法及材料也可以用于實施或測試本發(fā)明。
0176對于本文中的使用，除非另外明確指出，術(shù)語“一種/一個(a)”、“一種/一個(an)”及類似表達的使用指的是一個(種)或多個(種)。
0177提到“大約”，本文的值或參數(shù)包括(并描述了)涉及該值或參數(shù)本身的實施方式。例如，提到“大約X”的描述包括“X”的描述。
0178應(yīng)該理解，本文描述的本發(fā)明的方面和實施方式包括“包含(comprising)”、“由……組成(consisting)”和“主要由……組成(consisting essentiallyof)”的方面和實施方式。
權(quán)利要求
1.藥物組合物，其包含
(i)藥學(xué)上可接受量的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍，和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。
2.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的0.1至10倍之間。
3.權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的0.5至2倍之間。
4.權(quán)利要求1-3的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。
5.權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1000倍。
6.權(quán)利要求1-5的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
7.權(quán)利要求1-6的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1至大約10s-1之間。
8.權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1至大約0.012s-1之間。
9.權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1至大約1×10-3s-1之間。
10.權(quán)利要求1-9的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
11.權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約10μM。
12.權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約50μM。
13.權(quán)利要求1-12的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
14.權(quán)利要求1-13的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
15.權(quán)利要求1-14的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
16.權(quán)利要求1-15的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
17.權(quán)利要求1-16的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
18.權(quán)利要求1-17的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
19.權(quán)利要求1-18的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下，并且其中所述所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
20.權(quán)利要求1-19的任一個所述的藥物組合物，其中血紅素結(jié)合到所述H-NOX蛋白。
21.權(quán)利要求1-20的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白是突變蛋白質(zhì)。
22.權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個遠側(cè)袋突變。
23.權(quán)利要求20和21的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個不在所述遠側(cè)袋中的突變。
24.權(quán)利要求1-23的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變NO解離常數(shù)、對NO的koff、對NO的k1、對NO的k2、O2解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、血紅素自氧化速率、或前述兩種或多種的任何組合。
25.權(quán)利要求1-24的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變了NO反應(yīng)性。
26.權(quán)利要求1-25的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Tyr140的殘基被任何其它氨基酸置換。
27.權(quán)利要求1-26的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于嗜肺軍團菌8H-NOX的Phe148的殘基被任何其它氨基酸置換。
28.權(quán)利要求1-27的任一個所述的藥物組合物，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中至少一個C-末端氨基酸被除去。
29.權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中至少大約50個相鄰C-末端氨基酸被除去。
30.權(quán)利要求28和29的任一個所述的藥物組合物，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中的大約25個至大約200個連續(xù)C-末端氨基酸被除去。
31.權(quán)利要求1-30的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、嗜肺軍團菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1H-NOX、智人β1 I145Y、智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1 H-NOX H105G、智人β1 H-NOX H105F、智人β1H-NOX C78S、智人β1 H-NOX C78E、野生型褐鼠β1 H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1 H-NOXH105G、褐鼠β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1H-NOX C78S、褐鼠sGC β1H-NOXC78E、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35 H-NOX、秀麗隱桿線蟲H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蠅β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154；野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黃牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉H-NOX、野生型O.curivatusH-NOX、野生型紅鰭東方鲀H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX；野生型秀麗隱桿線蟲gcy-31、秀麗隱桿線蟲gcy-32、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-33、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-34、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-35、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-36、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-37；野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。
32.權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白選自野生型褐鼠sGC、野生型褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-194)、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX以及嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y。
33.權(quán)利要求1-32的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白或來源于哺乳動物蛋白。
34.權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白或來源于人蛋白。
35.權(quán)利要求34所述的藥物組合物，其中所述人蛋白為β1或來源于β1。
36.權(quán)利要求1-32的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為細菌蛋白或來源于細菌蛋白。
37.權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或來源于騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。
38.權(quán)利要求1-37的任一個所述的藥物組合物，其中NO結(jié)合到所述H-NOX蛋白。
39.權(quán)利要求1-38的任一個所述的藥物組合物，其包括一種或多種包含所述H-NOX蛋白的脂質(zhì)體或納米顆粒。
40.權(quán)利要求1-38的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到另一分子或部分。
41.權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到聚乙二醇。
42.權(quán)利要求1-41的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為權(quán)利要求245-314的任一項所述的突變H-NOX蛋白。
43.藥物組合物，其包含(i)藥學(xué)上可接受量的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。
44.權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約0.012s-1之間。
45.權(quán)利要求44所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約1×10-3s-1之間。
46.權(quán)利要求43-45的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約10μM。
47.權(quán)利要求46所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白O2解離常數(shù)在37℃為至少大約50μM。
48.權(quán)利要求43-47的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性是大約700s-1以下。
49.權(quán)利要求43-48的任一項所述的藥物組合物，其中H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
50.權(quán)利要求43-49的任一項所述的藥物組合物，其中H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
51.權(quán)利要求43-50的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
52.權(quán)利要求43-51的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
53.權(quán)利要求43-52的任一項所述的藥物組合物，其中H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
54.權(quán)利要求43-53的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
55.權(quán)利要求43-54的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
56.權(quán)利要求43-55的任一項所述的藥物組合物，其中血紅素結(jié)合到H-NOX蛋白。
57.權(quán)利要求43-56的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白是突變蛋白質(zhì)。
58.權(quán)利要求57所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個遠側(cè)袋突變。
59.權(quán)利要求57和58的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個不在所述遠側(cè)袋中的突變。
60.權(quán)利要求43-59的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變NO解離常數(shù)、對NO的koff、對NO的k1、對NO的k2、O2解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、血紅素自氧化速率、或前述兩種或多種的任何組合。
61.權(quán)利要求43-60的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變了NO反應(yīng)性。
62.權(quán)利要求43-61的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Tyr140的殘基被任何其它氨基酸置換。
63.權(quán)利要求43-62的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于嗜肺軍團菌8H-NOX的Phe148的殘基被任何其它氨基酸置換。
64.權(quán)利要求43-63的任一個所述的藥物組合物，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中的至少一個C-末端氨基酸被除去。
65.權(quán)利要求64所述的藥物組合物，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中至少大約50個相鄰的C-末端氨基酸被除去。
66.權(quán)利要求64和65的任一個所述的藥物組合物，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中大約25個至大約200個連續(xù)C-末端氨基酸被除去。
67.權(quán)利要求43-66的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、嗜肺軍團菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1 H-NOX、智人β1 I145Y、智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1H-NOX H105G、智人β1 H-NOX H105F、智人β1H-NOX C78S、智人β1 H-NOX C78E、野生型褐鼠β1 H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1 H-NOXH105G、褐鼠β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、褐鼠sGC β1 H-NOXC78E、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35 H-NOX、秀麗隱桿線蟲H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蠅β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154；野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黃牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉H-NOX、野生型O.curivatusH-NOX、野生型紅鰭東方鲀H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX；野生型秀麗隱桿線蟲gcy-31、秀麗隱桿線蟲gcy-32、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-33、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-34、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-35、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-36、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-37；野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。
68.權(quán)利要求67所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白選自野生型褐鼠sGC、野生型褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-194)、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX以及嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y。
69.權(quán)利要求43-68的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白或源自哺乳動物蛋白。
70.權(quán)利要求69所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白或源自人蛋白。
71.權(quán)利要求70所述的藥物組合物，其中所述人蛋白為β1或源自β1。
72.權(quán)利要求43-68的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為細菌蛋白或來源于細菌蛋白。
73.權(quán)利要求72所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或源自騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。
74.權(quán)利要求43-73的任一個所述的藥物組合物，其中NO結(jié)合到所述H-NOX蛋白。
75.權(quán)利要求43-74的任一個所述的藥物組合物，其包括一種或多種包含所述H-NOX蛋白的脂質(zhì)體或納米顆粒。
76.權(quán)利要求43-75的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到另一分子或部分。
77.權(quán)利要求76所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到聚乙二醇。
78.權(quán)利要求43-77的任一個所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白為權(quán)利要求245-314的任一項所述的突變H-NOX蛋白。
79.將NO輸送到個體的方法，其包括以足以輸送有效量的NO到所述個體的量將H-NOX蛋白施用到需要它的個體，其中所述H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍。
80.權(quán)利要求79所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的0.1至10倍之間。
81.權(quán)利要求80所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的0.5至2倍之間。
82.權(quán)利要求79-81的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。
83.權(quán)利要求82所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1000倍。
84.權(quán)利要求79-83的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性是大約700s-1以下。
85.權(quán)利要求79-84的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間。
86.權(quán)利要求85所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約0.012s-1之間。
87.權(quán)利要求86所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約1×10-3s-1之間。
88.權(quán)利要求79-87的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
89.權(quán)利要求88所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約10μM。
90.權(quán)利要求89所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約50μM。
91.權(quán)利要求79-90的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
92.權(quán)利要求79-91的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
93.權(quán)利要求79-92的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
94.權(quán)利要求79-93的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
95.權(quán)利要求79-94的任一項所述的方法，其中H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
96.權(quán)利要求79-95的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
97.權(quán)利要求79-96的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
98.權(quán)利要求79-97的任一項所述的方法，其中血紅素結(jié)合到H-NOX蛋白。
99.權(quán)利要求79-98的任一項所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白是突變蛋白。
100.權(quán)利要求99所述的藥物組合物，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個遠側(cè)袋突變。
101.權(quán)利要求99和100的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個不在所述遠側(cè)袋中的突變。
102.權(quán)利要求79-101的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變NO解離常數(shù)、對NO的koff、對NO的k1、對NO的k2、O2解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、血紅素自氧化速率、或前述兩種或多種的任何組合。
103.權(quán)利要求79-102的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變了NO反應(yīng)性。
104.權(quán)利要求79-103的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Tyr140的殘基被任何其它氨基酸置換。
105.權(quán)利要求79-104的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于嗜肺軍團菌10H-NOX的Phe148的殘基被任何其它的氨基酸置換。
106.權(quán)利要求79-105的任一個所述的方法，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中至少一個C-末端氨基酸被除去。
107.權(quán)利要求106所述的方法，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中至少大約50個相鄰的C-末端氨基酸被除去。
108.權(quán)利要求106和107的任一項所述的方法，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中大約25個至大約200個C-末端氨基酸被除去。
109.權(quán)利要求79-108的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W10F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W10F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W10F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W10F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W10Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W10N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W10H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F710Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F710Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、嗜肺軍團菌2F10W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(7210-101010)、脫硫脫硫弧菌H-NOX Y1310L、野生型智人β1H-NOX、智人β1 I140Y、智人β1 I145Y、智人β1(1-3105)、智人β1(1-3105)I145Y、智人β1(1-3105)I145H、智人β1(1-1104)、智人β1(1-1104)I145Y、智人β1(1-1104)L10W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1H-NOX H105G、智人β1 H-NOX H105F、智人β1 H-NOX C710S、智人β1 H-NOX C710E、野生型褐鼠β1 H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1 H-NOX H105G、褐鼠β1 H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1 H-NOX C710S、褐鼠sGC β1 H-NOX C710E、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-1106)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-1107)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-1103)、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35 H-NOX、秀麗隱桿線蟲H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蠅β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG1410105-PA、野生型黑腹果蠅CG1410106、野生型黑腹果蠅CG4154；野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黃牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉H-NOX、野生型O.curivatus H-NOX、野生型紅鰭東方鲀H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX；野生型秀麗隱桿線蟲gcy-31、秀麗隱桿線蟲gcy-32、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-33、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-34、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-35、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-36、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-37；野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。
110.權(quán)利要求109所述的方法，其中所述H-NOX蛋白選自野生型褐鼠sGC、野生型褐鼠β1(1-3105)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-1104)、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX以及嗜肺軍團菌2H-NOXF142Y。
111.權(quán)利要求79-110的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白或源自哺乳動物蛋白。
112.權(quán)利要求111所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白或源自人蛋白。
113.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述人蛋白為β1或源自β1。
114.權(quán)利要求79-110的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為細菌蛋白或來源于細菌蛋白。
115.權(quán)利要求114所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或源自騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。
116.權(quán)利要求79-115的任一項所述的方法，其包括一種或多種包含所述H-NOX蛋白的脂質(zhì)體或納米顆粒。
117.權(quán)利要求79-116的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到另一分子或部分。
118.權(quán)利要求117所述的方法，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到聚乙二醇。
119.權(quán)利要求79-118的任一項所述的方法，其中NO在所述H-NOX蛋白施用到所述個體之前結(jié)合到H-NOX蛋白。
120.權(quán)利要求79-118的任一項所述的方法，其中NO在H-NOX蛋白施用到所述個體之前未結(jié)合到所述H-NOX蛋白，并且其中所述H-NOX蛋白將NO從所述個體中的一個位置運輸?shù)剿鰝€體中的另一位置。
121.權(quán)利要求79-120的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白經(jīng)口施用、直腸施用或被施用到所述個體的血液中。
122.權(quán)利要求79-121的任一項所述的方法，其中所述個體是人。
123.權(quán)利要求79-122的任一項所述的方法，其中所述個體患有心血管病癥、高血壓、由高血壓加劇的病癥或功能性NO缺乏，或者處于心血管病癥、高血壓、由高血壓加劇的病癥或功能性NO缺乏的風險中。
124.權(quán)利要求123所述的方法，其中所述由高血壓加劇的病癥是心力衰竭、腎功能衰竭或中風。
125.權(quán)利要求79-124的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白被施用到所述個體至少兩次。
126.權(quán)利要求79-125的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白是權(quán)利要求245-314的任一項所述的突變H-NOX蛋白。
127.將NO輸送到個體的方法，其包括以足以輸送有效量的NO到所述個體的量將H-NOX蛋白施用到需要它的個體，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
128.權(quán)利要求127所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約0.012s-1之間。
129.權(quán)利要求128所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約1×10-3s-1之間。
130.權(quán)利要求127-129的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約10μM。
131.權(quán)利要求130所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約50μM。
132.權(quán)利要求127-131的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
133.權(quán)利要求127-132的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
134.權(quán)利要求127-133的任一項所述的方法，其中H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
135.權(quán)利要求127-134的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
136.權(quán)利要求127-135的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
137.權(quán)利要求127-136的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
138.權(quán)利要求127-137的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
139.權(quán)利要求127-138的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
140.權(quán)利要求127-139的任一項所述的方法，其中血紅素結(jié)合到H-NOX蛋白。
141.權(quán)利要求127-140的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白是突變蛋白。
142.權(quán)利要求141所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個遠側(cè)袋突變。
143.權(quán)利要求141和142的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個不在所述遠側(cè)袋中的突變。
144.權(quán)利要求127-143的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變NO解離常數(shù)、對NO的koff、對NO的k1、對NO的k2、O2解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、血紅素自氧化速率、或前述兩種或多種的任何組合。
145.權(quán)利要求127-144的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變了NO反應(yīng)性。
146.權(quán)利要求127-145的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Tyr140的殘基被任何其它的氨基酸置換。
147.權(quán)利要求127-146的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于嗜肺軍團菌10H-NOX的Phe1410的殘基被任何其它的氨基酸置換。
148.權(quán)利要求127-147的任一個所述的方法，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中至少一個C-末端氨基酸被除去。
149.權(quán)利要求148所述的方法，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中至少大約50個鄰近連續(xù)的C-末端氨基酸被除去。
150.權(quán)利要求148和149的任一項所述的方法，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中大約25個至大約200個連續(xù)C-末端氨基酸被除去。
151.權(quán)利要求127-150的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXI5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXW9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXN74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXF78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX R135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、嗜肺軍團菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1 H-NOX、智人β1I145Y、智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1 H-NOX H105G、智人β1 H-NOX H105F、智人β1 H-NOX C78S、智人β1 H-NOX C78E、野生型褐鼠β1 H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1 H-NOX H105G、褐鼠β1 H-NOX H105F、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-186)、褐鼠sGCβ1 H-NOX C78S、褐鼠sGC β1 H-NOX C78E、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35H-NOX、秀麗隱桿線蟲H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蠅β1H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154；野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黃牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉H-NOX、野生型O.curivatus H-NOX、野生型紅鰭東方鲀H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX；野生型秀麗隱桿線蟲gcy-31、秀麗隱桿線蟲gcy-32、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-33、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-34、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-35、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-36、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-37；野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。
152.權(quán)利要求151所述的方法，其中所述H-NOX蛋白選自野生型褐鼠sGC、野生型褐鼠β1(1-3105)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-1104)、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX以及嗜肺軍團菌2H-NOXF142Y。
153.權(quán)利要求127-152的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白或源自哺乳動物蛋白。
154.權(quán)利要求153所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白或源自人蛋白。
155.權(quán)利要求154所述的方法，其中所述人蛋白為β1或源自β1。
156.權(quán)利要求127-152的任一個所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為細菌蛋白或來源于細菌蛋白。
157.權(quán)利要求156所述的方法，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或源自騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。
158.權(quán)利要求127-157的任一項所述的方法，其中一種或多種脂質(zhì)體或納米顆粒包含所述H-NOX蛋白。
159.權(quán)利要求127-158的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到另一分子或部分。
160.權(quán)利要求159所述的方法，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到聚乙二醇。
161.權(quán)利要求127-160的任一項所述的方法，其中NO在所述H-NOX蛋白施用到所述個體之前結(jié)合到所述H-NOX蛋白。
162.權(quán)利要求127-160的任一項所述的方法，其中NO在H-NOX蛋白施用到所述個體之前未結(jié)合到所述H-NOX蛋白，并且其中所述H-NOX蛋白將NO從所述個體中的一個位置運輸?shù)剿鰝€體中的另一位置。
163.權(quán)利要求127-162的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白經(jīng)口施用、直腸施用或被施用到所述個體的血液中。
164.權(quán)利要求127-163的任一項所述的方法，其中所述個體是人。
165.權(quán)利要求127-164的任一項所述的方法，其中所述個體患有心血管病癥、高血壓、由高血壓加劇的病癥或功能性NO缺乏，或者處于心血管病癥、高血壓、由高血壓加劇的病癥或功能性NO缺乏的風險。
166.權(quán)利要求165所述的方法，其中所述由高血壓加劇的病癥是心力衰竭、腎功能衰竭或中風。
167.權(quán)利要求127-166的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白被施用到所述個體至少兩次。
168.權(quán)利要求127-167的任一項所述的方法，其中所述H-NOX蛋白是權(quán)利要求245-314的任一項所述的突變H-NOX蛋白。
169.試劑盒，其包括(i)藥學(xué)上可接受量的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍，和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。
170.權(quán)利要求169所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白NO解離常數(shù)的0.1至10倍之間。
171.權(quán)利要求170所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白NO解離常數(shù)的0.5至2倍之間。
172.權(quán)利要求169-171的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。
173.權(quán)利要求172所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1000倍。
174.權(quán)利要求169-173的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
175.權(quán)利要求169-174的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間。
176.權(quán)利要求175所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約0.012s-1之間。
177.權(quán)利要求176所述的試劑盒，，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約1×10-3s-1之間。
178.權(quán)利要求169-177的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
179.權(quán)利要求178所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約10μM。
180.權(quán)利要求179所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約50μM。
181.權(quán)利要求169-180的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
182.權(quán)利要求169-181的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
183.權(quán)利要求169-182的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
184.權(quán)利要求169-183的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
185.權(quán)利要求169-184的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
186.權(quán)利要求169-185的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
187.權(quán)利要求169-186的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
188.權(quán)利要求169-187的任一項所述的試劑盒，其中血紅素結(jié)合到所述H-NOX蛋白。
189.權(quán)利要求169-188的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白是突變蛋白。
190.權(quán)利要求189所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個遠側(cè)袋突變。
191.權(quán)利要求189和190的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個不在所述遠側(cè)袋中的突變。
192.權(quán)利要求169-191的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變NO解離常數(shù)、對NO的koff、對NO的k1、對NO的k2、O2解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、血紅素自氧化速率、或前述兩種或多種的任何組合。
193.權(quán)利要求169-192的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變了NO反應(yīng)性。
194.權(quán)利要求169-193的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Tyr140的殘基被任何其它的氨基酸置換。
195.權(quán)利要求169-194的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于嗜肺軍團菌9H-NOX的Phe149的殘基被任何其它的氨基酸置換。
196.權(quán)利要求169-195的任一項所述的試劑盒，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中至少一個C-末端氨基酸被除去。
197.權(quán)利要求196所述的試劑盒，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中至少大約50個連續(xù)的C-末端氨基酸或大約25個至大約200個之間的C-末端氨基酸被除去。
198.權(quán)利要求169-197的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、嗜肺軍團菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1 H-NOX、智人β1 I145Y、智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1 H-NOX H105G、智人β1H-NOX H105F、智人β1H-NOX C78S、智人β1 H-NOX C78E、野生型褐鼠β1 H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1H-NOXH105G、褐鼠β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、褐鼠sGC β1 H-NOXC78E、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35 H-NOX、秀麗隱桿線蟲H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蠅β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154；野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黃牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉H-NOX、野生型O.curivatusH-NOX、野生型紅鰭東方鲀H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX；野生型秀麗隱桿線蟲gcy-31、秀麗隱桿線蟲gcy-32、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-33、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-34、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-35、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-36、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-37；野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。
199.權(quán)利要求198所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白選自野生型褐鼠sGC、野生型褐鼠β1(1-395)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-194)、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX以及嗜肺軍團菌2H-NOXF142Y。
200.權(quán)利要求169-199的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白或源自哺乳動物蛋白。
201.權(quán)利要求200所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白，源自人蛋白，為人β1或者源自人β1。
202.權(quán)利要求169-199的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為細菌蛋白或來源于細菌蛋白。
203.權(quán)利要求202所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或源自騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。
204.權(quán)利要求169-203的任一項所述的試劑盒，其中NO結(jié)合到所述H-NOX蛋白。
205.權(quán)利要求169-204的任一項所述的試劑盒，其包括一種或多種包含所述H-NOX蛋白的脂質(zhì)體或納米顆粒。
206.權(quán)利要求169-205的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到另一分子或部分。
207.權(quán)利要求206所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到聚乙二醇。
208.權(quán)利要求169-207的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白是權(quán)利要求245-314的任一項所述所述的突變H-NOX蛋白。
209.試劑盒，其包括(i)H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，和(ii)使用所述試劑盒將NO輸送到所述個體的說明。
210.權(quán)利要求209所述的試劑盒，，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約0.012s-1之間。
211.權(quán)利要求210所述的試劑盒，，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約1×10-3s-1之間。
212.權(quán)利要求209-211的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約10μM。
213.權(quán)利要求212所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約50μM。
214.權(quán)利要求209-213的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
215.權(quán)利要求209-214的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
216.權(quán)利要求209-215的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
217.權(quán)利要求209-216的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
218.權(quán)利要求209-217的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
219.權(quán)利要求209-218的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
220.權(quán)利要求209-219的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
221.權(quán)利要求209-220的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
222.權(quán)利要求209-221的任一項所述的試劑盒，其中血紅素結(jié)合到所述H-NOX蛋白。
223.權(quán)利要求209-222的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白是突變蛋白。
224.權(quán)利要求223所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個遠側(cè)袋突變。
225.權(quán)利要求223和224的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個不在所述遠側(cè)袋中的突變。
226.權(quán)利要求209-225的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變NO解離常數(shù)、對NO的koff、對NO的k1、對NO的k2、O2解離常數(shù)、NO穩(wěn)定性、血紅素自氧化速率、或前述兩種或多種的任一組合。
227.權(quán)利要求209-226的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變改變了NO反應(yīng)性。
228.權(quán)利要求209-227的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Tyr140的殘基被任何其它的氨基酸置換。
229.權(quán)利要求209-228的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白包括至少一個突變，其中對應(yīng)于嗜肺軍團菌9H-NOX的Phe149的殘基被任何其它的氨基酸置換。
230.權(quán)利要求209-229的任一項所述的試劑盒，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中至少一個C-末端氨基酸被除去。
231.權(quán)利要求230所述的試劑盒，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中至少大約50個連續(xù)的C-末端氨基酸被除去。
232.權(quán)利要求230和231的任一項所述的試劑盒，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，所述突變H-NOX蛋白中大約25個至大約200個之間的連續(xù)C-末端氨基酸被除去。
233.權(quán)利要求209-232的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白選自野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX I5L-P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F-N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9Y、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9N、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74E、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX N74A-Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y-Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX P115A、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOXR135Q、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140A、騰沖嗜熱厭氧菌I75F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌I75F、騰沖嗜熱厭氧菌L144F-His6、騰沖嗜熱厭氧菌L144F、嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、嗜肺軍團菌2F9W-F142Y、野生型脫硫脫硫弧菌H-NOX、脫硫脫硫弧菌H-NOX(728-899)、脫硫脫硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1 H-NOX、智人β1 I145Y、智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1 H-NOX H105G、智人β1 H-NOX H105F、智人β1H-NOX C78S、智人β1 H-NOX C78E、野生型褐鼠β1 H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1H-NOXH105G、褐鼠β1 H-NOX H105F、褐鼠sGC β1H-NOX C78S、褐鼠sGC β1 H-NOXC78E、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35 H-NOX、秀麗隱桿線蟲H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蠅β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA、野生型黑腹果蠅CG14886、野生型黑腹果蠅CG4154；野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型黃牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型爪蟾H-NOX、野生型青鳉H-NOX、野生型O.curivatusH-NOX、野生型紅鰭東方鲀H-NOX、野生型岡比亞按蚊H-NOX、野生型煙草天蛾H-NOX；野生型秀麗隱桿線蟲gcy-31、秀麗隱桿線蟲gcy-32、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-33、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-34、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-35、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-36、野生型秀麗隱桿線蟲gcy-37；野生型霍亂弧菌H-NOX、野生型費氏弧菌H-NOX和野生型點形念珠藻H-NOX。
234.權(quán)利要求233所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白選自野生型褐鼠sGC、野生型褐鼠β1(1-395)、褐鼠β1(1-217)、褐鼠β1(1-194)、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140L、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺軍團菌1H-NOX、野生型嗜肺軍團菌2H-NOX以及嗜肺軍團菌2H-NOXF142Y。
235.權(quán)利要求209-234的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白或源自哺乳動物蛋白。
236.權(quán)利要求235所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為人蛋白或源自人蛋白。
237.權(quán)利要求236所述的試劑盒，其中所述人蛋白為β1或源自β1。
238.權(quán)利要求209-234的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為細菌蛋白或來源于細菌蛋白。
239.權(quán)利要求238所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白或源自騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。
240.權(quán)利要求209-239的任一項所述的試劑盒，其中NO結(jié)合到所述H-NOX蛋白。
241.權(quán)利要求209-240的任一項所述的試劑盒，其包括一種或多種包含所述H-NOX蛋白的脂質(zhì)體或納米顆粒。
242.權(quán)利要求209-241的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到另一分子或部分。
243.權(quán)利要求242所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到聚乙二醇。
244.權(quán)利要求209-243的任一項所述的試劑盒，其中所述H-NOX蛋白是權(quán)利要求245-314的任一項所述所述的突變H-NOX蛋白。
245.分離的H-NOX蛋白，其包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白相比，所述突變改變NO解離常數(shù)或NO反應(yīng)性，其中所述突變H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅素的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少10倍，并且其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、野生型褐鼠sGC、或嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y。
246.權(quán)利要求245所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L。
247.權(quán)利要求245和246的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、野生型智人β1H-NOX、褐鼠sGCβ1 H-NOX(1-385)、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA H-NOX、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35 H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型秀麗隱桿線蟲H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。
248.權(quán)利要求245-247的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGC β1H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、或褐鼠sGC β1 H-NOX C78E。
249.權(quán)利要求245-248的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H或智人β1 I140Y。
250.權(quán)利要求245-249的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)0.1至10倍之間。
251.權(quán)利要求250的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在血紅蛋白的NO解離常數(shù)0.5至2倍之間。
252.權(quán)利要求245-251的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少100倍。
253.權(quán)利要求252所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比血紅蛋白的NO反應(yīng)性低至少1000倍。
254.權(quán)利要求245-253的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
255.權(quán)利要求245-254的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間。
256.權(quán)利要求245-255的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約0.012s-1之間。
257.權(quán)利要求245-256的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約1×10-3s-1之間。
258.權(quán)利要求245-257的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
259.權(quán)利要求245-258的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約10μM。
260.權(quán)利要求259所述分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約50μM。
261.權(quán)利要求245-260的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
262.權(quán)利要求245-261的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
263.權(quán)利要求245-262的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
264.權(quán)利要求245-263的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
265.權(quán)利要求245-264的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
266.權(quán)利要求245-265的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
267.權(quán)利要求245-266的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
268.權(quán)利要求245-267的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其包括至少一個遠側(cè)袋突變。
269.權(quán)利要求245-268的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其包括至少一個不在所述遠側(cè)袋中的突變。
270.權(quán)利要求245-269的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其包括至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Tyr140的殘基被任何其它的氨基酸置換。
271.權(quán)利要求245-270的任一項所述分離的H-NOX蛋白，包括至少一個突變，其中對應(yīng)于嗜肺軍團菌2H-NOX的Phe142的殘基被任何其它的氨基酸置換。
272.權(quán)利要求245-271的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，至少一個C-末端氨基酸被除去。
273.權(quán)利要求272所述分離的H-NOX蛋白，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，至少大約50個連續(xù)的C-末端氨基酸被除去。
274.權(quán)利要求272和273的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，大約25個至大約200個之間的連續(xù)C-末端氨基酸被除去。
275.權(quán)利要求245-274的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白。
276.權(quán)利要求275所述分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為人蛋白。
277.權(quán)利要求276所述分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白是β1。
278.權(quán)利要求245-274的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為細菌蛋白。
279.權(quán)利要求278所述分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。
280.權(quán)利要求245-279的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白共價結(jié)合到另一分子或部分。
281.權(quán)利要求280所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白共價結(jié)合到聚乙二醇。
282.分離的H-NOX蛋白，其包括至少一個突變，與相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白相比，所述突變改變對NO的koff、k1或k2或改變O2解離常數(shù)，其中所述突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，其中所述突變H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y40L、野生型騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX、野生型褐鼠sGC、或嗜肺軍團菌2H-NOX F142Y。
283.權(quán)利要求282所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX F78Y/Y140L。
284.權(quán)利要求282和283的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是野生型嗜肺軍團菌2H-NOX、野生型智人β1 H-NOX、褐鼠sGCβ1 H-NOX(1-385)、野生型褐鼠β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅β1 H-NOX、野生型黑腹果蠅CG14885-PA H-NOX、野生型秀麗隱桿線蟲GCY-35 H-NOX、野生型點形念珠藻H-NOX、野生型新月柄桿菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。
285.權(quán)利要求282-284的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX W9F、騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140F、褐鼠sGC β1 H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX H105G、褐鼠sGC β1H-NOX H105F、褐鼠sGC β1 H-NOX I145Y、褐鼠sGC β1 H-NOX C78S、或褐鼠sGC β1 H-NOX C78E、或智人β1 H-NOX(1-385)I145Y。
286.權(quán)利要求282-285的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白不是騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX Y140H或智人β1 I140Y。
287.權(quán)利要求282-286的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約0.012s-1之間。
288.權(quán)利要求287的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約1×10-3s-1之間。
289.權(quán)利要求282-288的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約10μM。
290.權(quán)利要求289所述分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約50μM。
291.權(quán)利要求282-290的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
292.權(quán)利要求282-291的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述突變H-NOX蛋白的O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM。
293.權(quán)利要求282-292的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
294.權(quán)利要求282-293的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
295.權(quán)利要求282-294的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
296.權(quán)利要求282-295的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的對NO的koff、k1或k2在37℃在大約1×10-4s-1和大約10s-1之間，并且其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
297.權(quán)利要求282-296的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白O2解離常數(shù)在37℃為至少大約1μM，并且其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下。
298.權(quán)利要求282-297的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白的血紅素自氧化速率在37℃為大約1h-1以下，并且其中所述突變H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性為大約700s-1以下。
299.權(quán)利要求282-298的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其包括至少一個遠側(cè)袋突變。
300.權(quán)利要求282-299的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其包括至少一個不在所述遠側(cè)袋中的突變。
301.權(quán)利要求282-300的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其包括至少一個突變，其中對應(yīng)于騰沖嗜熱厭氧菌H-NOX的Tyr140的殘基被任何其它的氨基酸置換。
302.權(quán)利要求282-301的任一項所述分離的H-NOX蛋白，包括至少一個突變，其中對應(yīng)于嗜肺軍團菌2H-NOX的Phe142的殘基被任何其它的氨基酸置換。
303.權(quán)利要求282-302的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，至少一個C-末端氨基酸被除去。
304.權(quán)利要求303所述分離的H-NOX蛋白，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，至少大約50個相鄰的C-末端氨基酸被除去。
305.權(quán)利要求303和304的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中與相應(yīng)的野生型蛋白相比，大約25個至大約200個之間的相鄰C-末端氨基酸被除去。
306.權(quán)利要求282-305的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為哺乳動物蛋白。
307..權(quán)利要求306所述分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為人蛋白。
308.權(quán)利要求307所述分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白是β1。
309.權(quán)利要求282-305的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為細菌蛋白。
310.權(quán)利要求309所述分離的H-NOX蛋白，其中所述相應(yīng)的野生型H-NOX蛋白為騰沖嗜熱厭氧菌蛋白。
311.權(quán)利要求282-310的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變所述H-NOX蛋白共價結(jié)合到另一分子或部分。
312.權(quán)利要求311所述分離的H-NOX蛋白，其中所述突變H-NOX蛋白共價結(jié)合到聚乙二醇。
313.權(quán)利要求279-395的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的NO解離常數(shù)在智人血紅蛋白α的NO解離常數(shù)的2個數(shù)量級之內(nèi)。
314.權(quán)利要求279-396的任一項所述分離的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的NO反應(yīng)性比智人血紅蛋白α的NO反應(yīng)性低至少10倍。
315.重組核酸，其編碼權(quán)利要求245-314任一項所述的H-NOX蛋白。
316.載體，其包括權(quán)利要求315的核酸。
317.細胞，其包括權(quán)利要求315的核酸。
318.細胞，其含有權(quán)利要求316的載體。
319.產(chǎn)生H-NOX蛋白的方法，其包括在適合所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞包含編碼權(quán)利要求245-314的任一項所述的H-NOX蛋白的核酸。
320.權(quán)利要求319所述的方法，其進一步包括純化所述H-NOX蛋白的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于輸送一氧化氮的組合物和方法。H-NOX蛋白被突變?yōu)轱@示出改善的或優(yōu)化的血液氣體NO輸送的動力學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì)。工程H-NOX蛋白包含突變，所述突變相對于相應(yīng)的野生型H-NOX結(jié)構(gòu)域，賦予改變的NO或O2配體結(jié)合，并作為生理相容的哺乳動物血液NO氣體載體起作用。本發(fā)明也提供藥物組合物、試劑盒和方法，其使用野生型或突變H-NOX蛋白治療輸送NO對其有益的任何病癥。
文檔編號A61K38/41GK101495134SQ200780027797
公開日2009年7月29日 申請日期2007年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者S·P·L·卡瑞, E·M·博恩, J·A·溫格, M·A·馬萊塔 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會