專利名稱：刺激細(xì)胞生長、突觸重塑和鞏固長期記憶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及上調(diào)和下調(diào)蛋白激酶c的方法，該方法能用于刺激細(xì)胞生長、
突觸重塑和增強記憶力并能治療細(xì)胞增生性疾病。
背景技術(shù)：
存在各種影響認(rèn)知的病癥和疾病。認(rèn)知過程大致可以被描述成至少包括3個不同部分:注意、學(xué)習(xí)和記憶。每個部分和它們各自的水平均影響對象認(rèn)知能力的總體水平。例如，盡管阿耳茨海默病患者會遭受總體認(rèn)知的喪失，和由此帶來的這些特征的全部衰退，然而與該疾病最常相關(guān)的卻是喪失記憶。其它疾病的患者則遭受與不同認(rèn)知特征更顯著相關(guān)的認(rèn)知損傷。例如，注意缺陷型多動癥(ADHD)，關(guān)注個體保持注意力集中狀態(tài)的能力。其它疾病包括與其它神經(jīng)疾病、衰老和可以對心智能力帶來有害影響的疾病治療例如癌癥治療、中風(fēng)/缺血和智力低下有關(guān)的普通癡呆。
歷經(jīng)數(shù)十年對各種記憶病例進行研究終于證明了長期記憶需要蛋白質(zhì)的合成。Agranoff等(1967) Sc〖e"ce 158:1600-1601 ; Bergold等(1990)/Voc.A^/.v4cac/.5W 87:3788-3791 ; Cavallaro 等(2002)尸rac.Ato/JcfldSc/.99:13279-16284; Crow等(1990)A^/.」c。d 87:4490-4494; Crow等(1999) 乂 A^Mra/ /i!;w'o/. 82:495-500; Epstein等(2003) A^wro6Zo/.丄eam. iWem.79:127-131; Ezzeddine等(2003) / 23:9585-9594; Farley等(1991)尸rac.
tV?！? ^c"d 88:2016-2020;Flexner等(1996)尸rac Afe/. JcW. SW. 55:369-374;Hyden等(1970) Proc. A^/. ^cac/, Sd 65:898-904; Nelson等(1990) ZVoc. 7Va〃.Jew/. 87:269-273; Quattrone等(2001)尸麼.麵.」cac/. 98:11668-11673;Zhao等(1999) 5/。/. C/zem.274:34893-34902; Zhao等(2000)14:290-300。 Flexner首先揭示了藥物誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成抑制(如，用5-丙基尿嘧啶或茴香霉素)，當(dāng)該抑制發(fā)生于訓(xùn)練案例之后的臨界時間間隔時，能阻斷長期記憶。Flexner等(1996)尸rac. Ato/.」cad 55:369-374。如果在該臨界時 間窗前或該窗后的任何時間抑制蛋白質(zhì)的合成，則對長期記憶沒有影響。然而 鞏固記憶的必需蛋白質(zhì)、它們的調(diào)控機制和它們對鞏固長期記憶的作用仍然是 個謎。
已經(jīng)揭示許多物種的長期關(guān)聯(lián)記憶的形成依賴于蛋白激酶C(PKC)同工酶 易位到神經(jīng)元膜上并活化。首先，當(dāng)這些PKC同工酶被鈣和輔因子如二酰甘 油組合活化時，可以使外部神經(jīng)元膜的內(nèi)表面和內(nèi)部細(xì)胞器如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜之間 產(chǎn)生穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)。PKC活化發(fā)生在軟體動物海蛞蝓(/^，/^6"^)的一種已鑒定 的B類細(xì)胞中(McPhie等(簡) /臉卿由m. 60:646-651)，基于巴甫洛夫 (Pavlovian)條件反射的各種哺乳動物關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)方案中，包括家兔瞬膜條件反射 (Bank等(198S)尸rac.淑/,Sc/. 85:1988-1992; Olds等(1989) 245:866-869)、大鼠的空間迷宮學(xué)習(xí)(01ds等(1990)JiVewrasc/. 10:3707-3713)和大 鼠的嗅覺辨別學(xué)習(xí)。而且，在一種已鑒定的B類細(xì)胞中， 一種PKC的a同工 酶的高親和力底物克萊斯汀(calexcitin)(Nelson等(1990) Sc/e"ce 247:1479-1483) 的數(shù)量和磷酸化程度以巴夫洛夫條件反射依賴性方式增加(Kuzirian等(2001) J.7Vewrac,/. 30:993-1008)。
更多證據(jù)表明個體的PKC同工酶在生物過程中起著不同的，有些時候是 相反的作用，這為藥物開發(fā)提供了兩個方向。 一個是設(shè)計PKC的特異性(優(yōu)選 同工酶特異性)抑制劑。由于事實上催化域并不是主要負(fù)責(zé)PKC同種型特異性 的功能域，因此該方法較為復(fù)雜。另一種方法是開發(fā)具有同工酶選擇性的靶向 調(diào)控位點的PKC活化劑。這樣可以無需考慮具有相反的生物學(xué)作用的其它信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。或者，通過在劇烈活化后誘導(dǎo)PKC下調(diào)，可以使PKC活 化劑產(chǎn)生長期拮抗作用。
進行了關(guān)聯(lián)記憶方法之后，與特定腦區(qū)中膜部分關(guān)聯(lián)的PKC的增加會持 續(xù)許多天(01ds等(1989) 5Wence 245:866-869)。與這些發(fā)現(xiàn)一致，施用有效的 PKC活化劑苔蘚抑素，能增強大鼠的空間迷宮學(xué)習(xí)能力(Sun等(2005) Ez^乂尸A"rwaco/.512: 45-51)。而且，用PKC活化劑苔蘚抑素進行的臨床試驗表 明(Marshall等(2002) Owcw S/o/ogy cfe 7Tzerap;; l:409-416)通過間歇安排藥物遞 送可能可以增強PKC的活性作用。 一種PKC活化劑是苔蘚抑素，它是一種大環(huán)內(nèi)酯，能夠活化亞納摩爾濃度的 PKC(Talk等(1999)A^ra6/o/丄eamMem.72:95-117)。與佛波酯(phorbol esters)和內(nèi)源性活化劑DAG一樣，苔蘚抑素可以結(jié)合到PKC的C1域，使它易位到膜上，然后被下調(diào)。
為了以已知能使PKC最初活化然后下調(diào)延長的劑量(25-12(Hig/m^來治療癌癥，已經(jīng)在人體內(nèi)對非致瘤性PKC活化劑苔蘚抑素進行了廣泛的試驗(Prevostel等(2000) Jowma/ o/CW/Sc/e"ce 113:2575-2584; Lu等(1998) Mo/.所o/,Ce//. 8:839-845; Leontieva等(2004) J5/o/.Ozem.279:5788陽5801)。近來還顯示PKC活化劑苔蘚抑素能夠在人成纖維細(xì)內(nèi)活化切割淀粉樣前蛋白(APP)產(chǎn)生無毒可溶性前體蛋白片段(sAPP)的a分泌酶(Etcheberrigaray等(2004)尸rac. 7Va仏」cadSc/. 101:11141-11146)。苔蘚抑素還能增強大鼠對空間迷宮任務(wù)的學(xué)習(xí)和記憶能力(Sun等(2005)fw /尸/wrm"co/. 512:45-51)，家兔瞬膜案例中的學(xué)習(xí)能力(Schreurs和Alkon，未發(fā)表)和初步研究報告中的海蛞蝓(/f"m/Ment/a)條件反射(Scioletti等(2004)5Zo/. 5w〃. 207:159)。因此，PKC的最佳活化在正常和疾病狀態(tài)下對影響認(rèn)知的許多分子機制而言是重要的。
因為沒有下調(diào)難以獲得PKC的上調(diào)，反之亦然，于是需要能夠上調(diào)PKC而使下調(diào)最小化的方法來增強所觀察到的與PKC活化有關(guān)的認(rèn)知效果。本發(fā)明的方法和組合物可以滿足這些需要，它會大大改善對于阿耳茨海默病和其它神經(jīng)變性疾病的臨床治療效果，并預(yù)防性地提供了改善的認(rèn)知增強作用。還提供了通過調(diào)節(jié)a分泌酶來治療和/或提高認(rèn)知狀況的方法和組合物。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及使PKC活化劑接觸蛋白激酶C以至刺激蛋白質(zhì)的合成從而鞏固長期記憶的方法。
本發(fā)明涉及的方法包括使PKC活化劑接觸蛋白激酶C(PKC)以刺激細(xì)胞生長的步驟。
本發(fā)明涉及的方法包括使PKC活化劑接觸蛋白激酶C(PKC)以刺激神經(jīng)元生長的步驟。
本發(fā)明涉及的方法包括使PKC活化劑接觸蛋白激酶C(PKC)以刺激樹突生長的步驟。本發(fā)明涉及的方法包括使PKC活化劑接觸蛋白激酶C(PKC)以刺激樹突棘 形成的步驟。
本發(fā)明涉及的方法包括使PKC活化劑接觸蛋白激酶C(PKC)以刺激樹突棘 密度的步驟。
本發(fā)明涉及的方法包括使PKC活化劑接觸蛋白激酶C(PKC)以刺激ELAV 易位到近端樹突的步驟。
本發(fā)明提供了減緩或逆轉(zhuǎn)記憶力和學(xué)習(xí)力喪失的方法，包括使有效量PKC 活化劑接觸已鑒定為記憶力喪失的對象的蛋白激酶C(PKC)以減緩或逆轉(zhuǎn)記憶 力喪失的步驟。在一個實施方式中，所述使有效量PKC活化劑接觸PKC刺激 了細(xì)胞或神經(jīng)元生長。在另一個實施方式中，所述使有效量PKC活化劑接觸 PKC刺激了樹突生長。再在另一個實施方式中，所述使有效量PKC活化劑接 觸PKC刺激了樹突棘形成。再在另一個實施方式中，所述使有效量PKC活化 劑接觸PKC刺激了樹突棘密度。
本發(fā)明還提供了刺激細(xì)胞或神經(jīng)元生長的方法，包括使有效量PKC活化 劑接觸對象的蛋白激酶C(PKC)從而刺激細(xì)胞或神經(jīng)元生長的步驟。在一個實 施方式中，所述對象被鑒定為學(xué)習(xí)力或記憶力受損。在另一個實施方式中，所 述使有效量PKC活化劑接觸PKC刺激了樹突生長。再在另一個實施方式中， 所述使有效量PKC活化劑接觸PKC刺激了樹突棘形成。再在另一個實施方式 中，所述使有效量PKC活化劑接觸PKC刺激了樹突棘密度。
在一個實施方式中，所述PKC活化劑是大環(huán)內(nèi)酯。在一個實施方式中， 所述PKC活化劑是苯并內(nèi)酰胺。在一個實施方式中，所述PKC活化劑是吡咯 烷酮。在一個優(yōu)選實施方式中，所述大環(huán)內(nèi)酯是苔蘚抑素。在更加優(yōu)選的實施 方式中，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1、 -2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17或國18。在最優(yōu)選的實施方式中，所述苔蘚 抑素是苔蘚抑素-1。
在一個實施方式中，所述大環(huán)內(nèi)酯是納瑞他汀(neristatin)。在一個優(yōu)選實 施方式中，所述納瑞他汀是納瑞他汀-1。
在一個實施方式中，所述接觸活化PKC。在一個實施方式中，所述接觸使 PKC數(shù)量增加。在一個實施方式中，所述接觸使PKC合成增加。在一個實施方式中，所述接觸使克萊斯汀(calexcitin)的數(shù)量增加。在一個實施方式中，所述接觸不導(dǎo)致PKC隨后發(fā)生顯著失調(diào)(deregulation)。
在一個實施方式中，重復(fù)所述接觸。在另一個實施方式中，以規(guī)律間隔重復(fù)所述接觸。在另一個實施方式中，所述間隔為l周至l個月，1天至1周，或少于1小時至24小時。在另一個實施方式中，所述間隔為1周至1個月。在另一個實施方式中，所述間隔為1天至1周。在另一個實施方式中，所述間隔為少于1小時至24小時。
在一個實施方式中，在一固定期間內(nèi)保持所述接觸。在另一個實施方式中，所述固定期間為少于24小時。在另一個實施方式中，所述固定期間為少于12小時。在另一個實施方式中，所述固定期間為少于6小時。在另一個實施方式中，所述固定期間為少于6小時。在另一個實施方式中，所述固定期間為少于4小時。在另一個實施方式中，所述固定期間為少于2小時。在一個優(yōu)選實施方式中，所述固定期間約為1-12小時。在更加優(yōu)選的實施方式中，所述固定期間約為2-6小時。在最優(yōu)選的實施方式中，所述固定期間約為4小時。
在一個實施方式中，在多于l天的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另一個實施方式中，在l天至l個月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另一個實施方式中，在l天至I周的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另一個實施方式中，在1周至1個月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另一個實施方式中，在l-6個月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另一個實施方式中，在1個月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另一個實施方式中，在多于1個月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。
在一個實施方式中，給予所述PKC活化劑以至增強對大腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的送藥并最小化對外周組織的送藥。在另一個實施方式中，給予所述PKC活化劑以增強PKC活化劑穿過血腦屏障運送。在一個實施方式中，PKC活化劑被制成能增強對大腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的送藥并最小化對外周組織的送藥的藥物組合物。在另一個實施方式中，本發(fā)明的PKC活化劑利用美國專利公開號20040204354中所述的人造LDL顆粒給予，該專利公開通過引用全文納入本文。在另一個實施方式中，所述PKC活化劑被制成人造LDL顆粒。再在另一個實施方式中，所述PKC活化劑與膽固醇結(jié)合并被制成人造LDL顆粒。
本發(fā)明涉及使PKC活化劑接觸蛋白激酶C以至下調(diào)PKC的方法。在一個實施方式中，所述PKC活化劑是大環(huán)內(nèi)酯。在一個實施方式中，所述PKC活化劑是苯并內(nèi)酰胺。在一個實施方式中，所述PKC活化劑是吡咯垸酮。在一個優(yōu)選實施方式中，所述大環(huán)內(nèi)酯是苔蘚抑素。在更加優(yōu)選的實施
方式中，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1、 -2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、-11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17、或-18。在最優(yōu)選的實施方式中，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1。
在一個實施方式中，所述大環(huán)內(nèi)酯是納瑞他汀。在一個優(yōu)選實施方式中，所述納瑞他汀是納瑞他汀-1 。
在一個實施方式中，所述接觸不刺激PKC合成。在另一個實施方式中，所述接觸基本上不刺激PKC合成。在另一個實施方式中，所述接觸使PKC數(shù)量減少。在另一個實施方式中，所述接觸使PKC數(shù)量顯著減少。在另一個實施方式中，所述接觸不刺激克萊斯汀的合成。
在一個實施方式中，在一段持續(xù)期間內(nèi)進行所述接觸。在一個實施方式中，所述持續(xù)期間為少于1小時至24小時。在另一個實施方式中，所述持續(xù)期間為1天至1周。在另一個實施方式中，所述持續(xù)期間為l周至l個月。在另一個實施方式中，所述持續(xù)期間為少于1小時至12小時。在另一個實施方式中，所述持續(xù)期間為少于1小時至8小時。在另一個實施方式中，所述持續(xù)期間為少于1小時至4小時。在一個優(yōu)選實施方式中，所述持續(xù)期間約為4小時。
在一個實施方式中，所述接觸造成PKC持續(xù)下調(diào)。在一個實施方式中，所述持續(xù)期間為少于1小時至24小時。在另一個實施方式中，所述持續(xù)期間為1天至1周。在另一個實施方式中，所述持續(xù)期間為1周至1個月。在另一個實施方式中，所述持續(xù)期間為少于1小時至12小時。在另一個實施方式中，所述持續(xù)期間為少于1小時至8小時。在另一個實施方式中，所述持續(xù)期間為少于1小時至4小時。在一個優(yōu)選實施方式中，所述持續(xù)期間約為4小時。
本發(fā)明涉及使PKC活化劑接觸蛋白激酶C以至刺激蛋白質(zhì)的合成從而鞏固長期記憶的方法，還包括抑制PKC降解的步驟。
在一個實施方式中，所述降解通過泛素化作用進行。在另一個實施方式中，所述降解受乳胱素(lactacysteine)抑制。在另一個實施方式中，所述PKC來自人。
本發(fā)明涉及使PKC活化劑接觸蛋白激酶C以至刺激蛋白質(zhì)的合成從而鞏固長期記憶的方法，其中以含有PKC活化劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組 合物形式提供所述PKC活化劑。
在一個實施方式中，所述藥物組合物還含有PKC抑制劑。在另一個實施 方式中，所述PKC抑制劑是在外周組織內(nèi)抑制PKC的化合物。文中，本文所 用的"外周組織"是指除腦以外的組織。在另一實施方式中，所述PKC抑制 劑是優(yōu)選在外周組織中抑制PKC的化合物。在另一實施方式中，所述PKC抑 制劑是一種能夠緩解PKC活化劑給藥相關(guān)肌痛的化合物。在另一實施方式中， 所述PKC抑制劑是一種能夠在PKC活化劑受治個體中緩解肌痛的化合物。在 另一實施方式中，所述PKC抑制劑是一種能夠提高PKC活化劑耐受劑量的化 合物。具體而言，PKC抑制劑包括，例如，但不限于-
維生素E、維生素E類似物，以及它們的鹽；鈣感光蛋白C;噻唑垸二酮 類；羅伯斯妥林(ruboxistaurin)，及它們的組合。本文所用的"維生素E"是指 a-生育酚(5，7，8-三甲基生育酚)；(3-生育酚(5，8-二甲基生育酚；5-生育酚(8-甲基 生育酚)；和Y-生育酚(7，8-二甲基生育酚)，以及它們的鹽和類似物。
附圖簡述


圖1描述了苔蘚抑素對獲得長期記憶的影響，該圖顯示，經(jīng)亞優(yōu)訓(xùn)練的動 物在接受苔蘚抑素后均表現(xiàn)為獲得了長期記憶。
圖2描述了苔蘚抑素對獲得長期記憶的影響，該圖顯示，用或不用苔蘚抑 素，隨機進行光照和旋轉(zhuǎn)未產(chǎn)生條件反應(yīng)。
圖3描述了苔蘚抑素對獲得長期記憶的影響，該圖顯示，使動物連續(xù)兩天 接觸苔蘚抑素4小時，然后在第3天進行2次訓(xùn)練事件(TE)，動物表現(xiàn)出獲得 了至少6天的長期記憶。
圖4描述了苔蘚抑素對獲得長期記憶的影響，該圖顯示，使動物連續(xù)三天 接觸苔蘚抑素4小時，然后在第4天進行2次TE，動物表現(xiàn)出獲得了至少96 小時的長期記憶。
圖5描述了苔蘚抑素對獲得長期記憶的影響，該圖顯示，接觸苔蘚抑素 8-20小時，然后進行2次TE不足以獲得與接觸苔蘚抑素4小時所得相當(dāng)?shù)挠?憶。圖6描述了苔蘚抑素對獲得長期記憶的影響，該圖顯示，接觸濃度超過
1.0ng/ml的苔蘚抑素抑制長期記憶的獲得。
圖7描述了苔蘚抑素和茴香霉素對獲得長期記憶的影響，該圖顯示，單次 接觸苔蘚抑素4小時，加上2次TE能產(chǎn)生持續(xù)數(shù)小時的長期記憶，而在接觸 苔蘚抑素時存在茴香霉素則會完全消除這種記憶。
圖8描述了苔蘚抑素和乳胱素的影響，該圖顯示，乳胱素將單次接觸苔蘚 抑素(接著進行2次TE)所產(chǎn)生的短時記憶轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)許多天的長期記憶。
圖9描述了 PKC活化對克萊斯汀的影響。
圖10a描述了苔蘚抑素和訓(xùn)練事件對克萊斯汀免疫染色的影響。本圖顯 示，在B型細(xì)胞中，克萊斯汀隨著訓(xùn)練事件數(shù)的增加而增加。
圖10b通過免疫染色顯示單獨的苔蘚抑素對克萊斯汀的影響。
圖lla顯示了連續(xù)兩天接觸苔蘚抑素4小時并在24小時后進行2次訓(xùn)練 事件對克萊斯汀強度的影響。該圖顯示，連續(xù)兩天接觸苔蘚抑素4小時并在24 小時后進行2次訓(xùn)練事件才能將克萊斯汀水平提高到鞏固長期記憶所需的量。
圖lib描述了接觸苔蘚抑素后加入茴香霉素對克萊斯汀的影響。本圖顯示 了在2次TE加3天4小時接觸苔蘚抑素后加入茴香霉素未減少克萊斯汀的免 疫染色。
圖12顯示，據(jù)細(xì)胞溶膠組分中組蛋白磷酸化檢測，重復(fù)的4小時苔蘚抑 素接觸對PKC活性的影響。本圖顯示，連續(xù)兩天接觸苔蘚抑素使PKC活性顯 著高于對照或基線水平。
圖13顯示，據(jù)細(xì)胞膜組分中組蛋白磷酸化檢測，重復(fù)的4小時苔蘚抑素 接觸對PKC活性的影響。本圖顯示，連續(xù)兩天接觸苔蘚抑素使PKC活性顯著 高于對照或基線水平。
圖14描述了茴香霉素對PKC活性的影響。本圖顯示，連續(xù)三天接觸苔蘚 抑素的過程中每天存在茴香霉素能降低細(xì)胞溶膠和細(xì)胞膜組分中的PKC活性。
圖15描述了苔蘚抑素對海馬神經(jīng)元中的膜-結(jié)合PKC的影響。本圖顯示， 使培育的海馬神經(jīng)元接觸單劑活化劑量的苔蘚抑素(0.28nM) 30分鐘導(dǎo)致短期 的PKC從細(xì)胞溶膠易位到顆粒部分(約60%)，及此后長期的下調(diào)。第一次接觸 后再次接觸長達4小時使單次接觸苔蘚抑素4小時后發(fā)生的下調(diào)顯著減弱。圖16描述了重復(fù)接觸苔蘚抑素對PKC活性的影響。本圖顯示，延遲2-4 小時后進行第二次接觸消除了單次接觸苔蘚抑素30分鐘所產(chǎn)生的顯著下調(diào)， 如果第一次接觸后延遲4小時再進行第二次，則活性增加到基線之上，并顯著 高于2小時或更短時間之后進行第二次接觸所得水平。
圖17描述了苔蘚抑素對蛋白質(zhì)合成的作用。使大鼠IGF-IR細(xì)胞接觸 0.28nM苔蘚抑素30分鐘，培育1-79小時。然后將["S]甲硫氨酸(9.1pCi)加入 培養(yǎng)液，然后分析放射標(biāo)記物。據(jù)收集神經(jīng)元前最后半小時內(nèi)的"S-甲硫氨酸 摻入檢測，單次接觸0.28nM苔蘚抑素30分鐘，在接觸后24小時內(nèi)使總體蛋 白質(zhì)合成提高了 20%， 79小時內(nèi)提高了 60%，但當(dāng)同時存在PKC抑制劑 Ro-32-0432時，提高幅度顯著降低。
圖18描述了 PKOx易位到神經(jīng)元細(xì)BT質(zhì)膜的誘導(dǎo)。
圖19描述了 CA1神經(jīng)元中PKCa的劑量和時間依賴性。
圖20描述了苔蘚抑素-介導(dǎo)的ELAV核輸出到樹突軸(dendritic shaft)。
圖21描述了苔蘚抑素-介導(dǎo)的ELAV核輸出到樹突軸的劑量和時間依賴性。
圖22描述了通過標(biāo)記棘特異性蛋白一親棘蛋白一測得的苔蘚抑素-介導(dǎo)的 樹突棘密度提高。
圖23描述了使CA1和CA3神經(jīng)元接觸苔蘚抑素30分鐘后，苔蘚抑素-介導(dǎo)的近端樹突軸內(nèi)樹突棘密度的提高。
圖24描述了苔蘚抑素-介導(dǎo)的CA1神經(jīng)元內(nèi)棘數(shù)增加的劑量和時間依賴性。
圖25描述了體內(nèi)條件下CA1和CA3海馬神經(jīng)元內(nèi)苔蘚抑素-介導(dǎo)的棘數(shù) 增加。
圖26描述了苔蘚抑素對學(xué)習(xí)和記憶力保留的影響。星號表示明顯不同于 游泳對照(**， p<.01; **， p<.001)。在試探測試(probe test)中，迷宮+苔蘚抑素 (Bryo)明顯不同于迷宮和迷宮+苔蘚抑素+RO (p<.05)。
圖27描述了苔蘚抑素對經(jīng)過空間迷宮任務(wù)訓(xùn)練的大鼠樹突棘的影響。星 號表示明顯不同于天然對照(*， p<.05; **， p<.001)。
圖28描述了苔蘚抑素對蘑菇棘(mushroom spine)的影響。星號表示明顯不同于天然對照(*， p<.05; **， p<.001)。
圖29描述了苔蘚抑素對突觸前和突觸后結(jié)構(gòu)的不同作用。星號表示明顯
不同于天然對照(*， p<.05; **， p<.01; ***， p<.001)。
圖30描述了通過激活PKC提高棘密度的機制。黃色箭頭表示質(zhì)膜。白色 箭頭表示CA1神經(jīng)元。
圖31描述了通過激活PKC提高棘密度的機制。星號表示明顯不同于天然 對照(*， p〈.05; **， p〈.01; ***， p<.001)。
發(fā)明詳述
1.定義
本文所用的"上調(diào)"是指通過各種機制(包括但不限于增加轉(zhuǎn)錄、翻譯和
/或提高轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的穩(wěn)定性)而相比于基線狀態(tài)增加某種物質(zhì)如PKC
蛋白或轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量或提高其活性。
本文所用的"下調(diào)"是指通過各種機制(包括但不限于減少轉(zhuǎn)錄、翻譯和 /或降低轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的穩(wěn)定性)而相比于基線狀態(tài)減少某種物質(zhì)如PKC 蛋白或轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量或降低其活性。
本文采用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"是指活性成分可與之組合，且組 合后可用來將活性成分施用到個體的化學(xué)組合物、化合物或溶劑。本文所用的 "藥學(xué)上可接受的運載體"包括但不限于一種或多種以下物質(zhì)賦形劑；表面 活性劑；分散劑；惰性稀釋劑；?；瘎┖捅澜鈩?；粘合劑；潤滑劑；防腐劑； 可生理降解的組合物如明膠；水性載體和水性溶劑；油性載體和油性溶劑；懸 浮劑；分散劑或濕潤劑；乳化劑，緩和劑(demulcent);緩沖液；鹽類；增稠劑； 填充劑；抗氧化劑*，穩(wěn)定劑；和藥學(xué)上可接受的多聚或疏水材料和本領(lǐng)域已知 的和有記載的其它成分，例如全文納入本文做參考的Genaro編(1985)的國賓夕 法尼亞州伊斯頓市的馬克出版公司(MackPublishing Co.)出版的《雷明頓藥物科 學(xué)(i em/"gtow'f /Vzamwcewh'cfl/5We"ce^》中i己載的另卩些。
可以用藥物學(xué)領(lǐng)域各種己知的或今后的方法制備本文所述藥物組合物制 劑。通常，這種制備方法包括將活性成分與運載體或一種或多種其它助劑組合 的步驟，然后，如果必須或需要，將該產(chǎn)物成形或包裝成所需的單劑單位或多劑單位。
盡管本文所述的藥物組合物主要是指適于人用的藥物組合物，技術(shù)人員應(yīng) 該理解這種組合物一般說來適用于各種動物。如何使所述組合物適用于各種動 物而對適于人用的藥物組合物作出改變是本領(lǐng)域所熟知的，普通獸藥學(xué)家即使 需要也僅需要進行普通實驗就可以設(shè)計和完成這類改變。據(jù)信，可以施用本發(fā) 明藥物組合物的個體包括但不限于人及其它靈長類和其它哺乳動物。
2.阿耳茨海默病
阿耳茨海默病與腦中的特異性神經(jīng)元亞群大量損傷有關(guān)的，其普遍癥狀為 喪失記憶。(Katzman(1986) 7Vew五wg/aw" Jowma/ o/314:964)。阿耳茨 海默病的特點是神經(jīng)病理性改變。然而，己報道的外周組織異常支持了這樣一 種可能性，就是阿耳茨海默病是一種最顯著表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的全身性 疾病。(Connolly(1998)祭遂，r/尸S Co/. 19:171-77)。將阿耳茨海默病與遺傳起 源和染色體1、 14和21相聯(lián)系的論述參見St.George-Hyslop等(1987) Sc/e"ce 235:885; Tanzi等#"述，7Vewra6/o/ogy o/A'jewe 3:159-168; Hardy(1996)爿"a W譜"固^譜7^ 165:13-17。
對個體患上阿耳茨海默病的定義是進行性記憶損傷、失語以及視覺空間技 能和行為不足(McKhann等(1986) Wewra/ogy 34:939-944)?；加邪⒍暮Ｄ〉?個體的認(rèn)知受損是由位于大腦皮層、海馬、基底前腦和其它腦區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞 退化所造成的。對尸體解剖獲得的阿耳茨海默病患者大腦進行的組織學(xué)分析證 明了在退化神經(jīng)元的核周體和軸突中、胞外神經(jīng)炎性(老年性)斑和受影響腦區(qū) 的一些血管內(nèi)壁和周圍的淀粉樣斑中均存在神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)。神經(jīng)元纖 維纏結(jié)是含有以螺旋型配對的纖維(直徑約10nm)的異常纖維樣結(jié)構(gòu)，因此也稱 為成對螺旋纖維。神經(jīng)炎性斑位于退化的神經(jīng)末梢(包括軸突和樹突)，含有淀 粉樣蛋白纖維的核心化合物。總之，阿耳茨海默病的特點是具有某些神經(jīng)病理 特征，包括胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)，主要由細(xì)胞骨架蛋白和胞外薄壁組織和腦血 管淀粉樣蛋白組成。此外，本領(lǐng)域目前已經(jīng)有辦法區(qū)分阿耳茨海默病患者、正 常的老年人和其它神經(jīng)變性疾病如帕金森癥、亨廷頓氏舞蹈病、韋尼克-科爾 薩科夫綜合征(Wernieke-Korsakoff)或精神分裂癥的患者，在美國專利5,580,748 和美國專利6,080,582中有進一步的舉例描述。盡管引起神經(jīng)元損傷的細(xì)胞改變和疾病的根本病因仍在研究中，但已確證 了 APP代謝具有重要影響。在阿耳茨海默病患者的腦中被始終確定為對腦生 理學(xué)或病理生理學(xué)有作用的兩種蛋白質(zhì)是(3-淀粉樣蛋白和T蛋白。(參見
Selkoe(2001)/V^/o/og/c"/^v/ewy.81:2)。有關(guān)卩-淀粉樣蛋白代謝缺陷和異常鈣 禾急態(tài)禾口/或f丐活化激酶的論述。(Etcheberrigaray等j/z/ze/wer》i epw^第3、 5 和6巻第305-312頁；Webb等(2000) B〃力W Jowr"a/ o/P/2"wwco/ogy 130:1433-52)。
阿耳茨海默病(AD)是一種腦病，其特點為蛋白質(zhì)分解代謝發(fā)生變化。蛋白 質(zhì)磷酸化改變與阿耳茨海默病患者中發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi)形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)有關(guān)。淀 粉樣前體蛋白質(zhì)(APP)的加工處理產(chǎn)生的片段，之后聚集形成作為阿耳茨海默 病(AD)特征的淀粉樣沉淀片段，稱為老年斑或AD斑。阿耳茨海默病的主要病 理特征是斑塊內(nèi)有淀粉樣蛋白質(zhì)沉淀。因此，APP加工處理是AD的早期和關(guān) 鍵的病理生理學(xué)事件。
已確定存在3種APP加工處理途徑。前文術(shù)語"正常"加工處理包括在 A卩序列的Lysl6殘基位點(或在Lysl6和Leul7之間；APP770命名法)處切割 APP的酶的參與，得到非促淀粉樣變片段大的N-末端外功能區(qū)和小的9kDa 膜結(jié)合片段。尚待完全確定的所述酶稱為a-分泌酶。還有另外兩種分泌酶可以 參與APP的加工處理。 一種或選途徑包括在Ap功能域外的Met671和Asp672 位點之間切割A(yù)PP(用p-分泌酶)和內(nèi)體-溶酶體(endosomal-lysomal)系統(tǒng)的參 與。另一個切割位點發(fā)生在A(3段的羧基末端，質(zhì)膜內(nèi)A)3肽的第39位氨基酸 之后。該分泌酶(力的作用產(chǎn)生了含有A(3全序列和6kDa細(xì)胞關(guān)聯(lián)片段的胞外 氨基酸末端。因此，經(jīng)過P和Y分泌酶的加工處理，產(chǎn)生了因為含有AP全序 列而成為的潛能促淀粉樣變片段。多條證據(jù)鏈顯示所有或選途徑均可發(fā)生于同 一個給定系統(tǒng)，可溶性A(3可以是"正常產(chǎn)物"。然而，仍然有證據(jù)表明CSF 和血漿中的循環(huán)AP的數(shù)量在帶有"瑞典人(Swedish)"突變的患者中升高了。 而且，用該突變或APP717突變轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞分泌更多的A|3。最近，揭示 了其它APP突變和PS1和PS2突變的攜帶者可以分泌出更多的特定形式的長 (42-43氨基酸)片段AP。
因此，盡管在正常情況下所有或選途徑均可能發(fā)生，在家族性和可能的散發(fā)性AD中出現(xiàn)了促進促淀粉樣變加工的失衡。這些增強的促淀粉樣變途徑最
終導(dǎo)致AD患者腦中形成纖維和斑塊。因此，促進非促淀粉樣變、a-分泌酶途 徑的干預(yù)能夠有效地將APP加工平衡轉(zhuǎn)向據(jù)信為非致病性的、增加APP比之 可能有毒的AP肽的相對數(shù)量的加工。
所述PKC同工酶提供了一種關(guān)鍵的、特異的限速分子靶點，由此可以闡明 生物化學(xué)、生物物理學(xué)和行為效力之間的獨特關(guān)聯(lián)并應(yīng)用這種關(guān)聯(lián)來改善認(rèn)知 能力。
此夕卜，就正常和異常記憶而言，已經(jīng)證明K+和Ca^通道均對記憶儲存和記 憶復(fù)蘇起著關(guān)鍵的作用。例如，已發(fā)現(xiàn)在記憶儲存過程中鉀通道會變化。 (Etcheberrigaray等(1992)尸rac.A^/.」cw/.Sc/. 89:7184; Sanchez-Andres等(1991) ■/ow/W q/We腳6油gy 65:796; Collin等(1988) 5/。/ ty由Jo畫a/ 55:955; Alkon 等(1985) 5e/zav/ora"m/iVewra/歷o/ogy 44:278; Alkon(1984) S"e"ce 226:1037)。 該觀察結(jié)果，結(jié)合阿耳茨海默病患者中幾乎都會發(fā)生的失憶癥狀，使我們開始 對鉀通道功能可能是阿耳茨海默病的一個病理位點和PKC調(diào)控對認(rèn)知的影響 展開研究。
3.蛋白激酶C和阿耳茨海默病
己經(jīng)確定，PKC是最大的非受體絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶基因家族之一。 自從Nishizuka和同事們在八十年代早期有關(guān)PKC的發(fā)現(xiàn)(Kikkawa等(1982) JS/o/.C/zem. 257:13341)和將它確定為佛波酯的主要受體(Ashendel等(1983) Omc^:i "， 43:4333)以來，己經(jīng)有了許多關(guān)于該酶的生理學(xué)信號傳導(dǎo)機制的 描述。人們對PKC的如此強烈的興趣源于其可以被鈣和二酰甘油(和它的佛波 酯模擬物)體外活化這一獨特能力，二酰甘油是一種效應(yīng)物，它的形成與生長 因子和分化因子作用下的磷脂轉(zhuǎn)變相偶聯(lián)。
目前，所述PKC基因家族由ll種基因組成，將它們分成4個亞組l)經(jīng) 典的PKCou &、 j32((3,和f32是同一種基因的另路剪接形式)和Y， 2銜型PKCS、 s、 Ti和e， 3)非典型性PKCC、 X、 ti禾Bt以及4)PKQi。 PKCp類似于新型PKC 同工型，差別在于它具有推定的跨膜區(qū)(綜述參見Blohe等(1994) C""cw M"aWJ ev.l3:411; Hug等(1993) 5/oc&m 291 :329; Kikkawa等(1989) ^肌i ev.說oc/2e肌58:31)。 a、 (3!、 |32和y同工型是Ca2、磷脂和二酰甘油依賴型，代表了經(jīng)典的PKC同工型，而其它同工型均受磷脂和二酰甘油的活化卻不依
賴于CA^。所有同工型均包含5個可變(V1-V5)區(qū)，cu p、 y同工型含有4個 (Cl-C4)高度保守的結(jié)構(gòu)域。除PKCa、 P和y以外的所有同工型均缺乏C2區(qū)， x、 T!和同工型的C1內(nèi)還缺乏結(jié)合二酰甘油的兩個富含半胱氨酸的鋅指區(qū)中的 九個。Cl區(qū)還含有在所有同工型中均高度保守的偽底物序列，其通過阻斷底 物結(jié)合位點產(chǎn)生無活性的酶構(gòu)象而起著自身調(diào)節(jié)功能(House等，(1987) Sc/e"ce 238:1726)。
因為具有這些結(jié)構(gòu)特征，不同的PKC同工型在應(yīng)答生理學(xué)刺激的信號傳 導(dǎo)(Nishizuka (1989) Ca"cer 10:1892)，以及在腫瘤轉(zhuǎn)化和分化中(Glazer (1994) 《蛋白激酶C(尸rafeZw&waw C)》J.F.Kuo編，牛津大學(xué)出版社(1994)第171-198 頁)具有高度特異性的作用。關(guān)于已知的PKC調(diào)節(jié)劑的討論參見 PCT/US97/08141、美國專利號5,652,232; 6,043,270; 6,080,784; 5，891，906; 5，962，498; 5,955,501; 5,891,870和5，962，504。
鑒于PKC在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著主要作用，據(jù)證明PKC是調(diào)控APP加工的 興奮靶點。已經(jīng)確證PKC參與APP加工。已經(jīng)揭示，例如佛波酯能顯著增加 通過PKC活化分泌的非促淀粉樣變可溶性APP(sAPP)的相對量。然而，用佛 波酯活化PKC看起來無法使APP分子直接磷酸化。不考慮作用的精確位點， 佛波醇誘導(dǎo)的PKC活化能增強或促進a-分泌酶，非促淀粉樣變途徑。因此， PKC活化有望作為影響無害sAPP的產(chǎn)生，甚至產(chǎn)生有益sAPP且同時減少A(3 肽相對量的方法。然而，由于佛波酯具有腫瘤促進活性，因而不是最終迸行藥 物研發(fā)的合適化合物。(Ibarreta等(1999)7Vewrai e;wW第10巻，第5和6號， 第1034-40頁)。
本發(fā)明人還觀察到蛋白激酶C的活化促進阿耳茨海默病(AD)淀粉樣前體 蛋白(APP)的a-分泌酶加工，由此產(chǎn)生非促淀粉樣變可溶性APP(sAPP)。結(jié)果
減少促淀粉樣變AM。和Am2(3)的相対分泌量。這一點尤其重要，因為成纖維細(xì) 胞和其它表達APP和早老素AD突變的細(xì)胞的總A(3分泌量增加和/或 Am2(3)/Amo的比僮提高。有趣的是，在AD患者腦中(a和p同工型)和AD患 者的成纖維細(xì)胞中(a-同工型)均發(fā)現(xiàn)PKC缺陷。
研究表明對a、 p和y同工型選擇性增強的其它PKC活化劑(即苯并內(nèi)酰胺)能增強sAPP分泌使之超過基線水平。經(jīng)苯并內(nèi)酰胺處理的AD細(xì)胞的sAPP 分泌也略高于經(jīng)苯并內(nèi)酰胺處理的成纖維細(xì)胞對照，僅在用10pM BL處理后 才出現(xiàn)顯著的sAPP分泌增加。據(jù)進一步報道，十字孢堿(一種PKC抑制劑)能 夠消除苯并內(nèi)酰胺對對照和AD成纖維細(xì)胞的影響，而相關(guān)化合物還在PC12 細(xì)胞中引起 3倍的sAPP分泌。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用苔蘚抑素作為PKC活化 劑來促進非促淀粉樣變APP加工沒有腫瘤促進作用且已在II期臨床試驗階段， 因而極具治療價值。
阿耳茨海默病(AD)患者的成纖維細(xì)胞中的變化包括PKC的變化，以及鈣 調(diào)和鉀(K+)通道的變化。據(jù)檢測TEA-誘導(dǎo)的[Ca"]增加顯示，已經(jīng)表明PKC活 化能夠恢復(fù)正常的K+通道功能。進一步的膜片鉗數(shù)據(jù)證實了 PKC活化劑對 113psK+通道活性恢復(fù)的作用。因此，基于PKC活化劑來恢復(fù)K+通道已被確立 為研究AD病理生理學(xué)的方法之一，它為AD治療提供了有價值的模型。(參見， 審理中的美國申請序列號09/652,656，以其全文納入本文作為參考。)
特別有意義的是刺激PKC的大環(huán)內(nèi)酯類(即苔蘚抑素類和納瑞他汀類)。在 苔蘚抑素類化合物中，已經(jīng)顯示苔蘚抑素-1能活化PKC，而且被證明沒有促腫 瘤活性。苔蘚抑素-1，作為一種PKC活化劑，還由于其具有雙相的劑量反應(yīng)曲 線而特別有用。此外，還證實苔蘚抑素-l能夠差異調(diào)控PKC同工型，包括PKCou PKCS和PKCs。已經(jīng)在動物和人身上對苔蘚抑素-1進行了毒性和安全性的研 究，并且正作為抗癌藥被廣泛研究。用苔蘚抑素-l進行的研究確定，其對人的 主要副作用是肌痛，因此最大劑量限制在40mg/m2。本發(fā)明采用濃度為O.lnM 的苔蘚抑素-1大大增加了 sAPP的分泌。將苔蘚抑素-1與單獨載體和另一種 PKC活化劑苯并內(nèi)酰胺(BL)(高10,000倍的濃度)進行了比較。目前正在對苔蘚 抑素作為抗癌藥進行臨床試驗。已知苔蘚抑素會結(jié)合PKC的調(diào)控區(qū)并活化該 酶。苔蘚抑素是PKC的同工型選擇性活化劑之一。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)除了苔蘚抑素以 外還有其它化合物能調(diào)控PKC。(參見例如，W097/43268;以其全文納入本文 作參考)。
大環(huán)內(nèi)酯類，尤其是苔蘚抑素-1可參見美國專利4,560,774 (以其全文納入 本文作為參考)。大環(huán)內(nèi)酯類和它們的衍生物在本領(lǐng)域的其它地方有所描述， 例如美國專利6,187,568、美國專利6,043,270、美國專利5,393,897、美國專利5,072,004、美國專利5,196,447、美國專利4,833,257和美國專利4,6U,066(均以 其全文納入本文作參考)。上述專利描述了大環(huán)內(nèi)酯類的各種化合物和各種用 途，包括它們的消炎用途或作為抗腫瘤藥的用途。關(guān)于苔蘚抑素類化合物的其 它討論參見Szallasi等(1994)在NIH 3T3成纖維細(xì)胞中苔蘚抑素1和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸鹽對蛋白激酶C同工型的差異調(diào)控(Differential Regulation of Protein Kinase C Isozymes by Bryostatin 1 and Phorbol 12-Myristate 13-Acetate in NIH 3T3 Fibroblasts), Jowrwa/ o/5/o/og〖ca/ C7zem&^y 269(3):2118-24; Zhang 等(1996)蛋白激酶C的活化劑，天然產(chǎn)物抗癌藥苔蘚抑素1的臨床前藥理學(xué) (Preclinical Pharmacology of the Natural Product Anticancer Agent Bryostatin 1 ， an Activator of Protein Kinase C)， Cawcer 7 e鄉(xiāng)ra^ 56:802-808; Hennings等(1987) 蛋白激酶C的活化劑苔蘚抑素1抑制佛波酯對SENCAR小鼠皮膚腫瘤的促進 作用(Bryostatin 1 ， an Activator of Protein Kinase C ， inhibits tumor promotion by phorbol esters in SENCAR mouse skin)， Gar"'wogewei^ 8(9):1343-46; Varterasian 等(2000)苔蘚抑素1對復(fù)發(fā)的低級非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞性白血病 患者的II期試驗(Phase II Trial of Bryostatin 1 in Patients with Relapse Low-Grade Non-Hodgkin，s Lymphoma and Chronic Lymphocytic Leukemia), C7/m'ca/ Ca"cer i^earc/z 6:825-28;和Mutter等(2000)綜述文章苔蘚抑素的化學(xué)和臨床生物 對Review Article:Chemistry and Clinical Biology of the Bryostatins) ， 5z'oo;-g謹(jǐn)'c & MeAc/"a/ C/zew/^y 8:1841-1860 (均以其全文納入本文作參考)。
肌痛是限制PKC活化劑的耐受劑量的主要副作用。例如，在使用苔蘚抑 素-1的II期臨床試驗中，據(jù)報道，10-87%的患者發(fā)生肌痛。(Clamp等(2002) ^z"-CawerDn^ 13:673-683)。每周一次，每次2(Hig/m2，持續(xù)3周的劑量耐 受良好，未見肌痛或其它副作用。(Weitman等(l999) C//m'ca/Ca"c"i e"arc力 5:2344-2348)。另一項臨床研究中，每周一次施用25pg/m2的苔蘚抑素-1 ，持續(xù) 8周是最高的耐受劑量。(Jayson等(1995)5nY/^2J o/Q "cer 72(2):461-468)。另 一項研究報道，50^ig/mS(每兩周靜脈輸注1小時來給藥，持續(xù)6周)是最高的耐 受劑量。(Prendville等(1993)Bnfe/^. o/Omcer 68(2):418-424)。報道的肌痛隨 著苔蘚抑素-1的重復(fù)給藥而加劇，并開始于初次注射后的數(shù)天。肌痛對患者生 活質(zhì)量的不良影響是苔蘚抑素-1治療中斷的原因之一。苔蘚抑素誘發(fā)肌痛的病因尚未確定。
(美國)國立癌癥研究所建立了分級肌痛的通用毒性標(biāo)準(zhǔn)。具體地說，該標(biāo) 準(zhǔn)分成5類或5個等級。0級表示無肌痛。1級肌痛的特點是無需止痛藥的緩 和短暫疼痛。1級肌痛時，患者行動自如。2級肌痛的特點是中等疼痛，該疼
痛或所需的止痛藥會干擾一些功能但不會干擾日常生活的活動。3級肌痛是劇 烈疼痛，該疼痛或必需的止痛藥會嚴(yán)重干擾日常生活的活動。4級肌痛使人喪 失活動能力。
本發(fā)明組合物通過在外周組織中降低PKC活化提高了患者對PKC活化劑 的耐受劑量并且/或者減少或減輕了與PKC活化有關(guān)的副作用。具體地說，PKC 抑制劑能抑制外周組織中的PKC，或優(yōu)選抑制外周組織中的PKC。例如，實 驗顯示，維生素E能夠在糖尿病大鼠主動脈和接觸高葡萄糖水平的大鼠平滑肌 細(xì)胞培養(yǎng)物中使二酰甘油-蛋白激酶C活化恢復(fù)正常。(Kunisald等(1994) D/a&to 43(11): 1372-1377)。在中度阿耳茨海默病患者中進行的維生素 E(2000IU/天)雙盲試驗中發(fā)現(xiàn)，維生素E降低了死亡率和發(fā)病率，但無法增強 認(rèn)知能力。(Burke等(1999) PoW Grafifware 7We&c/"e 106(5):85-96)。
大環(huán)內(nèi)酯類，包括苔蘚抑素類，最初來源于多室草苔蟲(所gw/a朋n'""a丄)。
盡管已經(jīng)知道大環(huán)內(nèi)酯類，尤其是苔蘚抑素類，具有多重用途，但尚了解大環(huán)
內(nèi)酯類和認(rèn)知增強之間的聯(lián)系。
可用于本發(fā)明的化合物的例子包括大環(huán)內(nèi)酯類(即苔蘚抑素類和納瑞他汀
類化合物)。盡管實施例和具體描述中描述了這些化合物的具體實施方式
，但 應(yīng)該理解，參考文獻中公開的化合物及其衍生物也可用于本發(fā)明的組合物和方法。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，大環(huán)內(nèi)酯化合物及其衍生物，尤其是苔蘚 抑素類，可以通過組合合成技術(shù)進行制備，因此可以建立化合物文庫來優(yōu)化包 括但不限于組合物的效力和安全性在內(nèi)的藥理學(xué)參數(shù)。此外，還可以用這些文 庫試驗確定那些更適宜調(diào)控a-分泌酶和/或PKC的成員。
本發(fā)明還包括采用苔蘚抑素的合成類似物。具體地說，據(jù)與苔蘚抑素的 NMR光譜比較，這些類似物保留了Cl-、 C19-、 C26-氧識別區(qū)的取向以及不同 程度的PKC結(jié)合親和力。美國專利號6，624,189(以其全文納入本文作參考)所公開和描述的所述苔蘚抑素類似物也可用于本發(fā)明的方法中。具體地說，美國
專利號6,624,189的式I類化合物(第3欄，第35-66行)和美國專利號6,624,189 的式II-VII以及1998a和1998b化合物(第8欄，第28-60行)所表示的苔蘚抑 素類似物是適用于本發(fā)明方法的PKC活化劑。
仍然需要通過認(rèn)知能力的具體特征或者通過普遍認(rèn)知來發(fā)展能夠改善總 體認(rèn)知的治療方法。仍然需要發(fā)展能夠增強認(rèn)知的方法，而不論它是否與具體 疾病狀況或認(rèn)知紊亂有關(guān)。本發(fā)明的方法和組合物滿足了這些需要，能夠大大 改善臨床上對阿耳茨海默病和其它神經(jīng)變性疾病的治療效果，同時，能夠增強 認(rèn)知能力。還提供了通過調(diào)節(jié)a分泌酶來處理和/或增強認(rèn)知狀況的方法和組合 物。
4.蛋白激酶C的活化和突觸可塑性
活化蛋白激酶C能刺激突觸可塑性。突觸可塑性這一術(shù)語用來描述改變兩 個神經(jīng)元之間的連接或突觸的強度的能力。協(xié)作實現(xiàn)突觸可塑性的一些機制包 括釋放到突觸中的神經(jīng)遞質(zhì)量的改變以及細(xì)胞響應(yīng)那些神經(jīng)遞質(zhì)的效率的改 變(Gaiarsa等，2002)。由于記憶力是大腦內(nèi)相互連接的突觸網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生的，因此 突觸可塑性是學(xué)習(xí)力和記憶力的一種重要神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ)。
樹突棘密度的改變構(gòu)成突觸可塑性的基礎(chǔ)。樹突棘密度改變在包括學(xué)習(xí)力 和記憶力在內(nèi)的許多大腦功能中發(fā)揮作用。例如，長期記憶部分受到新樹突棘 生長調(diào)節(jié)從而強化特殊神經(jīng)通路。通過強化兩個神經(jīng)元之間的聯(lián)系，突觸前細(xì) 胞激活突觸后細(xì)胞的能力得以增強。
樹突棘是一種小的(亞微米)膜凸出部，它從樹突上伸出并形成一半突觸。 典型的棘具有球狀的頭(棘頭)，其通過細(xì)小棘頸與母樹突相連。在大腦中大多 數(shù)主要神經(jīng)元的樹突上發(fā)現(xiàn)了樹突棘。根據(jù)形狀可將棘分為，例如，蘑菇棘、 細(xì)棘和粗棘。電鏡顯示出這些類型之間的形狀連續(xù)性。 一些證據(jù)表明，不同形 狀的棘反映了不同的突觸發(fā)育階段和強度。激光掃描和共焦顯微術(shù)顯示出包括 棘大小和密度在內(nèi)的棘特性的變化。采用這些技術(shù)對活體大腦進行的慢速研究 已顯示，棘會產(chǎn)生和消失，較大的蘑菇棘最穩(wěn)定。
一些蛋白質(zhì)是樹突棘形成的標(biāo)記物。例如，親棘蛋白在樹突棘中高度富集 并已顯示能調(diào)節(jié)樹突棘的形成和功能。ELAV蛋白是神經(jīng)元分化的最早期標(biāo)記基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。
實施例
實施例l:行為藥理學(xué)
接^#^"#"^^素一開始實驗前，將海蛞蝓(/ferm&e^/a Cra^&om/力樣品置 于穿孔的50-ml錐形離心管中在15。的人造海7K(ASW)中養(yǎng)3天。將從海生苔 蘚動物多室草苔蟲中純化得到的苔蘚抑素溶解于EtOH，并在ASW中稀釋至 所需的終濃度。使該動物與苔蘚抑素一起在ASW中培養(yǎng)4小時，然后用標(biāo)準(zhǔn) ASW漂洗。針對所選實驗往ASW中加入乳胱素(IO ^M)或茴香霉素。
通過往每個動物所居住的8cm長，直徑為lcm的試管內(nèi)的培養(yǎng)浴液中加 入藥物使苔蘚抑素對海蛞蝓的行為及其生物化學(xué)屬性產(chǎn)生影響。
實施例2:免疫染色方法
實驗性處理和試驗之后，將動物快速去頭，取出中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)后在 含有4%多聚甲醛的20mM Tris-緩沖(pH8)的天然海水(NSW; 0.2pm微孔過濾) 中固定。然后將CNS包埋入聚酯蠟(20)中，切片(6pm)，用偶聯(lián)到結(jié)合親和素 的微過氧化物酶上的生物素化二抗免疫染色(ABC方法，載體公司(Vector))，用 氨基乙基咔唑(AEC)作為發(fā)色團。在家兔中由提取自烏賊眼葉的全長克萊斯汀 蛋白培養(yǎng)多克隆一抗(命名為25U2)。根據(jù)數(shù)碼顯微照片中劃定的B-感光器細(xì) 胞質(zhì)區(qū)域減去同一背景區(qū)(未染色神經(jīng)氈)來檢測灰度強度。
實施例3:蛋白激酶C試驗
在含有l(wèi)mM EGTA、 lmM PMSF和50mM NaF的100(il 10mM Tris-HCL pH7.4緩沖液中，用超聲處理(5秒，25W)使細(xì)胞勻漿化。將勻漿物轉(zhuǎn)移到異質(zhì) 同晶聚合物離心管中，4。和100，000xg離心10分鐘。分出上清液，立即置于干 冰上冷凍。將顆粒部分在lO(Hd上述緩沖液中通過超聲處理使其再次懸浮，-80° 保存。為了測定PKC，將10pl細(xì)胞溶膠或顆粒部分在含有10pM組蛋白、4.89 mMCaCl2、 1.2|ig/^il磷脂酰-L-絲氨酸、0.18嗎4dl.2-二辛?；?sn-甘油、10 mM MgCl2、 20mMHEPES(pH7.4)、 0-8mMEDTA、 4mMEGTA、 4%甘油、8嗎/ml 抑肽酶、8嗎/ml亮抑肽酶和2mM芐脒的條件下37°培育15分鐘。加入 0.5|iCi[Y32-P]ATP，如前所述(25)通過吸附到磷酸纖維素上來檢測"P-磷蛋白的形成。稍稍調(diào)整該試驗方法使其分別適用于海蛞蝓神經(jīng)系統(tǒng)勻漿物或培育的哺 乳動物神經(jīng)元勻漿物。
實施例4:細(xì)胞培養(yǎng)物
將大鼠的海馬細(xì)胞H19-7/IGF-IR(ATCC)置于涂有多聚-L-賴氨酸的平板 上，使它們在DMEM/10%FCS中于35。生長數(shù)天直到覆蓋度達到約50%。然后 用含有10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子的5ml N2培養(yǎng)液換下原培養(yǎng)液誘導(dǎo) 細(xì)胞分化成神經(jīng)元表型，在T-25燒瓶中于39'C進行培養(yǎng)(26)。然后往1(^1水 溶液中加入各種濃度的苔蘚抑素(O.Ol-l.O nM)。 一定間隔后，去除培養(yǎng)液，用 PBS洗滌細(xì)胞，輕刮取下細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞。
實施例5:行為的條件反射
對海蛞蝓進行巴甫洛夫條件反射訓(xùn)練包括重復(fù)成對的神經(jīng)刺激，即光，和 無條件刺激，即環(huán)形振蕩。(參見Lederhendler等(24)和Epstein等(6》。旋轉(zhuǎn)/ 振蕩刺激能使平衡囊毛細(xì)胞興奮，從而誘發(fā)無條件反應(yīng)稱為"足"的肌肉性 下表面迅速收縮，與此同時，附著或"粘著"到支撐足部的表面。條件反射訓(xùn) 練之前，光誘發(fā)弱陽性趨光性，與此同時，足部伸長。足夠次數(shù)的光-旋轉(zhuǎn)成 對刺激后，光不再誘發(fā)趨光性，轉(zhuǎn)而誘發(fā)新的反應(yīng)(24):先前只有通過無條件 刺激才能誘發(fā)的"粘著"和足縮短(圖1)。因此，無條件刺激即旋轉(zhuǎn)或環(huán)形振 蕩的意義轉(zhuǎn)移到條件剌激，表現(xiàn)為光誘發(fā)的足收縮一一種足長度的負(fù)改變。對 光的這種條件反應(yīng)可持續(xù)數(shù)周，它并不能由隨機的光和旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生，而是刺激特 異性的，具有哺乳動物巴夫洛夫條件反射的其它特征。
實施例6:苔蘚抑素誘使關(guān)聯(lián)記憶延長
對海蛞蝓的巴夫洛夫條件反射訓(xùn)練很好地定義了能使習(xí)得條件反應(yīng)保持 時間逐步延長的訓(xùn)練參數(shù)。例如，兩次(2TE)光和環(huán)形振蕩成對訓(xùn)練(參見"方 法")能誘導(dǎo)習(xí)得條件反應(yīng)(光誘發(fā)的足收縮或縮短)，不用藥時該反應(yīng)保留約7 分鐘的。4-6次訓(xùn)練(4-6TE)誘發(fā)了保留長達數(shù)小時的條件反應(yīng)，但在訓(xùn)練結(jié)束 約1天后消失。9次TE能產(chǎn)生持續(xù)許多天，通常高達2周的長時關(guān)聯(lián)記憶。
釆用4-和6-次成對CS/US訓(xùn)練(TE)的亞優(yōu)選方案訓(xùn)練動物，在訓(xùn)練前的 暗適應(yīng)期間(10分鐘)加入苔蘚抑素(0.25ng/ml)，持續(xù)4小時，或者不加苔蘚抑 素(NSW對照)；9-次成對的TE和NSW作為陽性對照。在第4小時和此后每隔24小時，所有動物接受單獨CS的測試。用苔蘚抑素處理過的經(jīng)亞優(yōu)方案訓(xùn)
練的動物全部表現(xiàn)為保有長期記憶(11=8-16動物/條件/實驗；ANOVA， pO.Ol)。 2次TE加苔蘚抑素能使記憶保持?jǐn)?shù)小時(相比之下，不用苔蘚抑素時只有 數(shù)分鐘)，4次TE加苔蘚抑素使保持時間延長到超過24小時(圖l)和6次TE 加苔蘚抑素能使保持時間達1周或更長。
在第4小時進行測試時，不用苔蘚抑素(NSW)，隨機和成對的CS/US訓(xùn) 練(TE)沒有產(chǎn)生LTM或誘發(fā)CR。進行6-TE條件反射訓(xùn)練前(IO分鐘的暗適應(yīng) 期間)施用苔蘚抑素(0.25ng/mlNSW)并在此后持續(xù)4小時產(chǎn)生正的CR(足收縮； 長度的負(fù)改變)，由此表明建立了 LTM。拮抗劑Ro-32在訓(xùn)練前(暗適應(yīng)期間) 施用時，會阻斷6TE加苔蘚抑素的作用，即動物會伸長(正的長度改變)并具有 正常的趨光性(11=4-8動物/條件/實驗；ANOVA差，p<0.01)。隨機給予光和旋 轉(zhuǎn)，不論用或不用苔蘚抑素，都不會產(chǎn)生條件反應(yīng)(圖2)，即，光誘發(fā)的足收 縮。因此，在亞優(yōu)選訓(xùn)練試驗中，在訓(xùn)練期間并緊隨其后使用苔蘚抑素可以延 長記憶的保留時間。
實施例7:訓(xùn)練前幾天預(yù)接觸苔蘚抑素能增強記憶獲得 之前的檢測(15、 17)表明學(xué)習(xí)可以誘導(dǎo)的PKC結(jié)合于神經(jīng)元膜(g卩，易位) 可以是持續(xù)性的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，家兔瞬膜條件反射、大鼠空間迷宮學(xué)習(xí)、迷宮學(xué) 習(xí)和大鼠嗅覺辨別學(xué)習(xí)均伴有訓(xùn)練后持續(xù)數(shù)天的PKC易位。海蛞蝓條件反射 伴有訓(xùn)練后持續(xù)至少1天的PKC易位，可在單一可鑒定的B型細(xì)胞中觀察到 這種現(xiàn)象(15)。
如上所述，訓(xùn)練期間和之后接觸苔蘚抑素4小時將2TE誘發(fā)的記憶保留 時間從6-8分鐘延長到數(shù)小時。然而，在訓(xùn)練前一天以及2TE當(dāng)日接觸苔蘚抑 素4小時可以使訓(xùn)練后的記憶保留時間延長到1天以上。僅采用CS進行試驗 時的CR(身體長度收縮)證明了 ，使動物連續(xù)2天接觸苔蘚抑素(0.25ng/m1)4小 時和進行2次成對CS/US訓(xùn)練能產(chǎn)生至少6天的長期記憶(11=16動物/條件； ANOVA， p〈0.01)(圖3)。
使動物連續(xù)3天接觸苔蘚抑素(0.25ng/ml)4小時，1天之后進行2-TE，表 現(xiàn)出可在訓(xùn)練后96小時以上測得的長期記憶(LTR)。未接觸苔蘚抑素的動物(同 圖3所示)未表現(xiàn)出任何行為改變(CS檢測無CR)。經(jīng)3天苔蘚抑素處理的動物訓(xùn)練后立即給予茴香霉素(ANI)(lpg/ml)，持續(xù)4小時，不能阻止長期記憶形成。 因此，3天的苔蘚抑素處理可以消除對產(chǎn)生LTR所必需的蛋白質(zhì)合成的依賴性， 所述蛋白質(zhì)合成通常受訓(xùn)練后加入的ANI所阻斷(11=16動物/條件；ANOVA， pO.01)。第三天的一次4小時苔蘚抑素處理引起了類似的巴甫洛夫條件反應(yīng)記 憶保留延長(圖4)。以上結(jié)果支持這樣的觀點，即連續(xù)2次間隔開的接觸苔蘚 抑素能活化PKC，還可能激活長期記憶關(guān)鍵蛋白質(zhì)的合成，同時盡可能避免了 同時發(fā)生和后續(xù)發(fā)生的PKC下調(diào)。2次TE之前延長苔蘚抑素接觸時間(即8-20 小時)(圖5)本身不足以產(chǎn)生與訓(xùn)練前連續(xù)2天接觸4小時所得結(jié)果相當(dāng)?shù)拈L期 記憶，這一觀察結(jié)果進一步支持了上述觀點。這些實驗中，觀察了在訓(xùn)練時接 觸苔蘚抑素(0.25ng/m1)20小時的作用。采用亞優(yōu)化的2-成對TE條件反射訓(xùn)練 方案時，48小時后記憶喪失。而采用預(yù)接觸苔蘚抑素20小時的4-成對TE條 件反射訓(xùn)練所得的長期記憶則得以保持(n-8只動物/條件；第48小時的 ANOVA， p<0.01)。已知，在其它細(xì)胞系統(tǒng)中，充分延長苔蘚抑素接觸時間(如， 8-12小時)能引起持續(xù)的PKC下調(diào)，從而抵消PKC活化和促進PKC合成。
類似地，充分提高的苔蘚抑素濃度最終會抑制記憶保持(圖6)，據(jù)推測可 能也是因為PKC的下調(diào)。亞優(yōu)化(4TE)訓(xùn)練條件下，苔蘚抑素濃度〈.50ng/ml 能增加記憶的獲得和保持。那些濃度對9-成對TE所得的記憶保持沒有明顯作 用。然而，在所有檢測的訓(xùn)練條件下，濃度》1.0ng/ml均抑制行為的習(xí)得和保 持(『16只動物/條件)，據(jù)推測可能是由于PKC下調(diào)。
實施例8:預(yù)接觸苔蘚抑素能消除對訓(xùn)練期間蛋白質(zhì)合成的依賴性 對動物進行2-成對訓(xùn)練(TE)， 4小時后檢測其記憶保持。在訓(xùn)練前的10 分鐘暗適應(yīng)期間和此后4小時將苔蘚抑素(0.25 ng/ml)加入NSW給予動物，結(jié) 果表現(xiàn)出行為條件反射保持(足收縮(CR)和體長縮短)。NSW對照動物和那些訓(xùn) 練前接受苔蘚抑素處理并在訓(xùn)練后立即接受茴香霉素(1.0^ig/ml)處理的動物均 未發(fā)生CR，其足部伸長并表現(xiàn)出正常的正趨光性(11=12動物/條件/實驗，雙向 ANOVA統(tǒng)計學(xué)方法，pO.Ol)。單次4小時接觸苔蘚抑素加上2次TE能產(chǎn)生 持續(xù)數(shù)小時的長期記憶，當(dāng)茴香霉素與苔蘚抑素同時存在時，這種記憶保持完 全喪失(圖7)。 6TE加苔蘚抑素實驗中也觀察到類似的茴香霉素阻斷作用。然 而，重復(fù)多次短暫接觸苔蘚抑素能提高PKC、克萊斯汀和其它記憶蛋白的凈合成，這樣，如果PKC下調(diào)被充分抑制，則不再需要巴夫洛夫條件反射訓(xùn)練期 間和之后的新增合成。對訓(xùn)練前3天每天接觸苔蘚抑素4小時的動物進行2次
TE后立即施用茴香霉素進行4小時的蛋白質(zhì)合成抑制。這種情況下，茴香霉 素誘發(fā)的蛋白質(zhì)合成抑制并未阻礙記憶的保持，記憶仍然持續(xù)了許多天(圖4)。 相反，同樣的茴香霉素處理4小時完全消除了 9次TE(—種通常會產(chǎn)生1-2周 記憶保持的訓(xùn)練方案(27))所產(chǎn)生的記憶保持。最后，如果連續(xù)3天接觸苔蘚抑 素4小時，每次均聯(lián)用茴香霉素，1天后進行2次TE，長期記憶消失。 實施例9:預(yù)先接受蛋白酶體抑制能增強苔蘚抑素對記憶的影響 增強和延長PKC和其它記憶相關(guān)蛋白質(zhì)從頭合成的另一種方法是阻斷蛋 白質(zhì)降解通路。其中之一的泛素-蛋白酶體通路(28-30)，被認(rèn)為是PKC的a-同 工酶降解的主要途徑。如前所述，20pM-5QpM的蛋白酶體抑制劑乳胱素可以 很大程度地阻止PKC-a降解。
將動物與苔蘚抑素(0.25ng/ml)和乳胱素(10^/M)同時培養(yǎng)4小時，然后，24 小時之后采用2-次CS/US成對訓(xùn)練(TE)誘導(dǎo)條件反射。接著在訓(xùn)練后第4小時， 然后每隔24小時單用CS測試動物。聯(lián)用苔蘚抑素/乳胱素進行處理的動物具
有持久保持的條件反射行為；單用苔蘚抑素處理的動物其行為保持在24小時 后消失。單用乳胱素處理的動物未表現(xiàn)出行為訓(xùn)練的習(xí)得或保持(數(shù)據(jù)未作圖)。
(n-28動物，聯(lián)用苔蘚抑素/乳胱素；n=20，單用苔蘚抑素；n=16，單用乳胱 素)。此例中，乳胱素將單獨接觸苔蘚抑素(然后進行2次TE)所產(chǎn)生的短時記 憶轉(zhuǎn)換成了持續(xù)數(shù)天的長期記憶(圖8)。
實施例10:基于PKC活性的克萊斯汀-免疫染色
最近我們揭示了在海蛞蝓條件反射的習(xí)得和保持期間， 一種已鑒定的B 類細(xì)胞中免疫染色標(biāo)記物克萊斯汀增加(20)。之前的許多發(fā)現(xiàn)提示，低分子量 鈣-結(jié)合和GTP-結(jié)合蛋白克萊斯汀，在海蛞蝓條件反射訓(xùn)練期間是PKC同工酶 的底物(19)。目前已經(jīng)測出了一些物種的克萊斯汀的全序列，它看起來與在其 它物種中的相似蛋白具有顯著的同源性(31)，在海蛞蝓巴甫洛夫條件反射訓(xùn)練 期間和之后經(jīng)歷了磷酸化的改變。它同時還是PKC的a同工酶的高親和力底 物以及p和Y同工酶的低親和力底物(19)。
顯微照片(A、 B)描繪了具代表性的經(jīng)克萊斯汀多抗25U2免疫染色的海蛞蝓眼組織切片。有或沒有預(yù)先施用苔蘚抑素的經(jīng)歷過成對CS/UCS關(guān)聯(lián)條件反
射訓(xùn)練的動物的B細(xì)胞感光器CB-Cdl)中發(fā)生陽性克萊斯汀染色(B)。隨機給 予這兩種刺激(訓(xùn)練，TE)未引起行為改變，也沒有使克萊斯汀高于正常的背景
水平(A);用脊椎動物多抗對基底膜和晶狀體進行人工染色。檢測染色強度的
差異，將其記錄為灰度強度(0-256; B-細(xì)胞胞質(zhì)減掉組織背景)。圖(C)顯示了 進行9次隨機TE(左欄)的海蛞蝓的測得強度和連續(xù)兩天接觸PKC激動劑苔蘚 抑素(0.25 ng/ml)然后進行2次成對TE進行關(guān)聯(lián)條件反射訓(xùn)練的動物的測得強 度。兩次接觸苔蘚抑素加上2次TE增強產(chǎn)生的PKC活化將克萊斯汀的水平顯 著提高，達到與9-次成對TE和鞏固(長時)記憶相關(guān)的水平(t^4-8只動物/條件/ 重復(fù)；f檢驗比較，p<0.01)。
克萊斯汀免疫染色的靈敏度足以分辨感光-前庭軸突區(qū)內(nèi)的突觸小結(jié)(D)。 箭頭代表中間神經(jīng)元(a)、對側(cè)神經(jīng)元軸突(b)和推定感光器的軸突末端突觸小結(jié) (c)間的枝狀區(qū)。刻度條=10(^11; CPG，腦側(cè)神經(jīng)節(jié)(圖9、 10)。
由于免疫染色抗體與蛋白質(zhì)的磷酸化和無磷酸化形式都反應(yīng)，因此，該條 件誘發(fā)的克萊斯汀標(biāo)記物增加反映實際蛋白質(zhì)數(shù)量增加。由于特異性PKC-阻 斷劑Ro-32阻止的學(xué)習(xí)和學(xué)習(xí)特異性的克萊斯汀在B類細(xì)胞中增加(如上所 述)，因此之前發(fā)現(xiàn)在所述各個B類細(xì)胞內(nèi)發(fā)生易位的PKC看起來引起了條件 誘發(fā)的克萊斯汀標(biāo)記物增加。無訓(xùn)練和/或隨機化的對照訓(xùn)練方法產(chǎn)生的克萊斯 汀(CE)免疫染色只相當(dāng)于訓(xùn)練誘發(fā)染色程度一個很小的分?jǐn)?shù)(圖9)。
沒有苔蘚抑素的隨機訓(xùn)練(4-TE)得到略高于背景的測得強度。施用苔蘚抑 素可以增加這兩種訓(xùn)練例的克萊斯汀水平。隨機訓(xùn)練情況下，當(dāng)偶爾發(fā)生CS 和US的重疊(配對)時，就如此處所述，CE有可能增加(增加2.0)。然而，成對 訓(xùn)練時，克萊斯汀水平的增加會超過4.3倍(平均數(shù)iSE， N=5只動物/處理。 4RTE-隨機對照，4次隨機光和旋轉(zhuǎn)試驗；6PTE-成對試驗，6次成對光和旋轉(zhuǎn) 試驗。6PTE-0Bry比6PTE-0.25Bry; p〈0.001; 4RTE-0.25Bry比6PTE-0.25Bry; pO.001(f檢驗)。當(dāng)采用亞優(yōu)化訓(xùn)練(4-6TE)時，CE免疫染色(圖IOA)有中度升 高。這些亞優(yōu)選方案不足以產(chǎn)生持續(xù)超過24小時的記憶保持。如上所述，6TE 訓(xùn)練期間施用苔蘚抑素能引發(fā)長期記憶保持(>1周)。而且，苔蘚抑素加6TE誘 導(dǎo)的CE免疫染色堪比9TE所得。低劑量(0.1-0.25ng/ml)苔蘚抑素顯著增強2、 4或6次訓(xùn)練試驗后的記憶。 施用苔蘚抑素時，6TE的巴甫洛夫條件反射訓(xùn)練能產(chǎn)生持續(xù)許多天的記憶，不 用苔蘚抑素則僅持續(xù)數(shù)小時。茴香霉素或PKC抑制劑Ro-32能夠阻斷上述記 憶增強。重要的是，9次TE之后24小時，CE免疫染色大大衰減，盡管記憶 仍能在此后持續(xù)超過1周。然而，最少訓(xùn)練(2TE)之前重復(fù)接觸苔蘚抑素數(shù)天 獲得了更持久的CE免疫染色。
1、 2和3天每天單獨施用苔蘚抑素(不同時進行條件反射)4小時，每次接 觸苔蘚抑素后24小時進行檢測，發(fā)現(xiàn)海蛞蝓的B感光器中的克萊斯汀水平逐 漸增強。接觸苔蘚抑素4小時1次后24小時，CE免疫染色沒有增強(圖IOB)。 兩次接觸苔蘚抑素(連續(xù)兩天，每天1次)后24小時，CE免疫染色殘留增多。 接觸苔蘚抑素3次，然后只進行2次成對訓(xùn)練(成對的光和環(huán)形振蕩)，克萊斯 汀水平進一步升高，同時，關(guān)聯(lián)條件反射誘發(fā)的行為改變保持天數(shù)顯著延長 (n=16只動物/條件ANOVA， pO.Ol)。 3次接觸后第一天進行2次TE， 24小 時后CE免疫染色的水平接近之前9次TE后立即觀察到的水平(圖IOB)。因此， 3天每天接觸苔蘚抑素4小時后進行最少訓(xùn)練(2 TE)后的CE免疫染色為比單獨 訓(xùn)練試驗所得的更持久。這種新合成克萊斯汀的持久性與表明苔蘚抑素誘導(dǎo)蛋 白合成增強的生物化學(xué)觀察結(jié)果相一致。
連續(xù)兩天每天接觸苔蘚抑素4小時，24小時后進行2次訓(xùn)練(2TE)才能將 克萊斯汀水平提高到與鞏固的長期記憶相關(guān)的水平。 一般而言，2-TE配合以2 次接觸苔蘚抑素能產(chǎn)生超過l周的記憶保持(n-16只動物/條件J檢驗，p0.01)。 先進行連續(xù)3天每天接觸苔蘚抑素4小時能使克萊斯汀水平達到獲得鞏固記憶 所需水平。2次訓(xùn)練后立即加入茴香霉素不會減少上述克萊斯汀水平，并且， 鞏固記憶可以持續(xù)許多天(N-8只動物/條件；Z檢驗，p>0.05，不顯著)。(圖IIA、 B)。
值得注意的是苔蘚抑素加訓(xùn)練后立即施用PKC抑制劑Ro-32沒能阻止長 期記憶的產(chǎn)生，而在訓(xùn)練加苔蘚抑素的過程中進行抑制確能阻止記憶的鞏固。 相反，有和沒有苔蘚抑素的訓(xùn)練期間加入茴香霉素未能阻止長期記憶，而有和 沒有苔蘚抑素的訓(xùn)練后加入茴香霉素則能完全抑制記憶形成。因此，訓(xùn)練期間 PKC活化之后是記憶所需蛋白質(zhì)的合成。因此， 一旦PKC活化被誘導(dǎo)到足夠的水平，就不可避免的會發(fā)生必需的蛋白質(zhì)合成。所以，訓(xùn)練前數(shù)天的苔蘚抑 素誘導(dǎo)PKC活化，配合以最少訓(xùn)練，足以產(chǎn)生長期記憶。而且，后一種情況 下的長期記憶無需訓(xùn)練(和訓(xùn)練前PKC活化)后的蛋白合成。再次重申，預(yù)先的
PKC活化足以導(dǎo)致后來形成長期記憶所需的蛋白質(zhì)合成。其合成受苔蘚抑素誘 導(dǎo)的PKC活化以及條件反射試驗所誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)之一是克萊斯汀 一 如免疫 染色標(biāo)記所證明的那樣。另一種是PKC本身。 實施例ll:苔蘚抑素對PKC活性的影響
已知苔蘚抑素通過增加PKC與細(xì)胞膜組分的結(jié)合而瞬時活化PKC。已有 許多關(guān)聯(lián)記憶范例被證明增強PKC與神經(jīng)元膜的結(jié)合。因此，我們對使海蛞 蝓重復(fù)接觸苔蘚抑素(g卩，精確按照訓(xùn)練方法接觸4小時)也會誘導(dǎo)持久的PKC 活化這一假設(shè)進行了檢驗。
連續(xù)數(shù)天將完整的海蛞蝓在所述條件下("行為藥理學(xué)")以4小時間隔接 觸苔蘚抑素(0.28nM)。然后檢測分離的食管外周神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞溶膠中的組蛋 白磷酸化(參見"方法")。2次接觸苔蘚抑素的第二次后10分鐘和24小時檢 測到的PKC活性顯著高于基線水平(每次檢測的N-6)(圖12、 13)。因此，兩中 組分中的PKC數(shù)量都明顯增加，但胞膜內(nèi)PKC與細(xì)胞溶膠中PKC之比沒有 增加。這些結(jié)果表明，與學(xué)習(xí)本身相比，預(yù)接觸苔蘚抑素對PKC產(chǎn)生了某些 不同的作用。最初活化后(通過易位)，苔蘚抑素的該作用極有可能是由PKC合 成增加產(chǎn)生的，這與苔蘚抑素引起克萊斯汀水平升高一致，但與重復(fù)接觸苔蘚 抑素不直接相關(guān)。
但如圖12、 13所述，每次接觸苔蘚抑素(0.25ng/ml)的同時加入茴香霉素 (1.0ng/ml)。注意，連續(xù)三天接觸苔蘚抑素后，茴香霉素顯著減少海蛞蝓食管周 圍神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞溶膠組分和胞膜組分的PKC活性(每次檢測的N=3， p〈01)(圖14)。
為了進一步檢測重復(fù)接觸苔蘚抑素的生物化學(xué)效應(yīng)，對經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn) 導(dǎo)溫度敏感型tsA5CSV40大T抗原而永生化的大鼠海馬祌經(jīng)元進行研究(25)。 這些神經(jīng)元在N2培養(yǎng)液中經(jīng)堿性成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)后分化出神經(jīng)元表 型(26)，并表達出包括PKC在內(nèi)的全部常規(guī)神經(jīng)元蛋白質(zhì)。
使培育的海馬神經(jīng)元接觸單劑激活劑量的苔蘚抑素(0.28nM)30分鐘引起了PKC從細(xì)胞溶膠向顆粒部分的迅速易位(約60y。)，此后是持續(xù)的下調(diào)(圖15)。 最初的PKC活化和后來的下調(diào)均己在先前描述過，并經(jīng)測定膜和細(xì)胞溶膠中 的PKC活性得以確定。使培育的海馬神經(jīng)元接觸苔蘚抑素30分鐘，然后間隔 30分鐘-8小時后再次接觸30分鐘，使膜結(jié)合的PKC更快地恢復(fù)(rebound)。因 此，延遲2-4小時后再次接觸消除了單次接觸苔蘚抑素導(dǎo)致的顯著下調(diào)(圖16)。 接觸苔蘚抑素后最初的4個小時內(nèi)在胞質(zhì)組分中未檢測到PKC活性的顯著變 化。相反，如果使細(xì)胞在2小時內(nèi)兩次接觸苔蘚抑素，第二次接觸后的PKC 活性顯著降低。然而，如果第二次接觸比首次接觸晚4小時，則活性提高到基 線之上，顯著高于2小時或更短時間后進行第二次接觸所誘導(dǎo)的水平(圖16)。
這些結(jié)果符合以下解釋苔蘚抑素先活化PKC后PKC又下調(diào)(28-30)導(dǎo)致 PKC同工酶(以及上述克萊斯汀)合成增加(通過蛋白質(zhì)從頭合成)。實際上，我 們通過收集神經(jīng)元前最后半小時內(nèi)的"S-甲硫氨酸摻入檢測發(fā)現(xiàn)，單次接觸 0.28nM苔蘚抑素30分鐘能在接觸苔蘚抑素后24小時內(nèi)使得總蛋白質(zhì)合成增 加了20%， 79小時內(nèi)增加60%(圖17)。當(dāng)同時存在PKC抑制劑Ro-32時，苔 蘚抑素所引起的這種持久而復(fù)雜的蛋白質(zhì)合成增加被部分抑制(圖17)。
許多觀察結(jié)果表明，足以引起PKC活化的苔蘚抑素不可避免地也會使 PKC逐漸失活，然后下調(diào)。實際上，足夠劑量的苔蘚抑素(超過1.0ng/ml)抑制 巴甫洛夫條件反射。這極有可能是由PKC下調(diào)所引起的，而PKC下調(diào)正是高 濃度苔蘚抑素所致行為結(jié)果的特征之一。已經(jīng)知道，有兩條不同途徑可以下調(diào) 苔蘚抑素誘發(fā)的PKC活化。 一條途徑也受佛波酯誘導(dǎo)，包括泛素化，接著經(jīng) 由蛋白酶體路徑蛋白水解。第二種下調(diào)機制不由佛波酯誘導(dǎo)，包括通過胞膜窖 區(qū)室(caveolar compartment)移動以及磷酸酶PP1和PP2A介導(dǎo)的降解。PKC活 化劑的濃度足夠高和/或持續(xù)時間足夠久，PKC降解途徑使PKC不足從而刺激 PKC的從頭合成，PKC的合成不能補償其失活和下調(diào)，由此造成可用PKC減 少95%或更多。
實施例12:苔蘚抑素對學(xué)習(xí)和記憶保持的影響
利用大鼠空間迷宮模型研究苔蘚抑素對學(xué)習(xí)和記憶的影響。在第l、 3、 5 天，進行水迷宮訓(xùn)練前20分鐘，腹膜內(nèi)注射苔蘚抑素(NCI， 10ue/ks體重)。 在注射苔蘚抑素前10分鐘，經(jīng)尾靜脈注射RO-31-8220(西格瑪公司(Sigma)，500 ug/kg體重)。結(jié)果見圖26。星號表示與游泳對照有顯著差異(**， p<.01; **， P<.0(m。在試探測試(probetest沖，迷宮+苔蘚抑素明顯不同于迷宮和迷宮 十苔蘚抑素+RO (p〈.05)。
在圖26A中，與對照相比，苔蘚抑素治療動物組中大鼠到達平臺的潛伏 時間大大縮短(即促進學(xué)習(xí))；但在PKC-a抑制劑RO-31-8220存在下未出現(xiàn)這 種縮短。在圖B中，在所有訓(xùn)練后24小時的保持第l天，與對照相比苔蘚抑 素治療動物到達目標(biāo)象限的時間縮短(即增強了記憶保持)；但在RO-31-8220 存在下未出現(xiàn)這種縮短。在圖C中，在所有訓(xùn)練后1天的保持第1天，苔蘚抑 素治療動物的目標(biāo)穿越次數(shù)類似地增加(即增強了記憶保持)。
實施例13:苔蘚抑素對經(jīng)過空間迷宮任務(wù)訓(xùn)練的大鼠樹突棘的影響 圖27顯示了苔蘚抑素對經(jīng)過水迷宮訓(xùn)練的大鼠樹突棘形成的影響。在保 持第2天，采用共聚焦顯微術(shù)和DiI染色來研究絲狀偽足和樹突棘蘑菇棘、 細(xì)棘和粗棘(圖A)。水迷宮訓(xùn)練增加了蘑薛棘的數(shù)目；苔蘚抑素能增強這一效 果(圖B)。單獨苔蘚抑素沃訓(xùn)練)增加了粗棘的數(shù)目(pH)(圖C)。在所有情況 下，未觀察到絲狀偽足或細(xì)棘有變化(未顯示)。僅用苔蘚抑素處理的大鼠以及 僅接受訓(xùn)練的大鼠中絲狀偽足和(所有形狀)棘的總數(shù)有類似的增加(圖D)。但 水迷宮訓(xùn)練大鼠的同時用苔蘚抑素處理時這種增加得到增強(p〈05)。星號表明 與天然對照有顯著差異(*， p<.05; **， p<.001)。
實施例14:苔蘚抑素對蘑菇棘的影響 圖28為電子顯微照片，顯示了蘑菇棘(M)和突觸后密度(PSD;黃色箭頭) 的變化；紅色箭頭=突觸前膜；0=苔蘚抑素處理和訓(xùn)練后的樹突(圖A)。迷宮+ 苔蘚抑素(bryo)圖顯示穿孔PSD(中央有空洞的大PSD)，而其他圖是斑點類型 (沒有空洞的小PSD)。無論有或沒有苔蘚抑素，水迷宮均能提高PSD的平均大 小(圖B)，這是由于有穿孔PSD的大蘑菇棘的數(shù)目增加(圖C)。星號表明與天 然對照有顯著差異(*， p<，05; **， p<.001)。
實施例15:苔蘚抑素對突觸前和突觸后結(jié)構(gòu)的不同影響 通過定量共聚焦免疫組織化學(xué)測定出，水迷宮訓(xùn)練增加了樹突棘標(biāo)記物親 棘蛋白(圖29;圖B)、突觸后膜標(biāo)記物神經(jīng)粒蛋白(圖29;圖A和D)以及突觸 前標(biāo)記物GAP-43 (圖A和E)的數(shù)量，但未增加軸突突觸小結(jié)標(biāo)記物突觸小泡蛋白(圖29;圖A和B)。這些結(jié)果顯示，新棘與之前存在的軸突突觸小結(jié)形成 突觸，該軸突突觸小結(jié)已經(jīng)與之前存在的棘形成突觸。僅接受苔蘚抑素的大鼠 也顯示突觸前標(biāo)記物的數(shù)目增加。無論有或沒有苔蘚抑素處理，水迷宮訓(xùn)練增 加了突觸前和突觸后膜的尺寸，證實水迷宮訓(xùn)練能選擇性增加具有大PSD的 蘑菇棘。星號表明與天然對照有顯著差異(*， p<.05; **， p<.01; ***， p<.001)。
實施例16:通過激活PKC提高棘密度的機制 圖30顯示了通過激活PKC提高棘密度的機制。快速海馬切片用O.l nM 苔蘚抑素連續(xù)培育，處理后進行共聚焦免疫組織化學(xué)檢測。苔蘚抑素刺激PKCoc 向質(zhì)膜易位(黃色箭頭)并將其激活，并刺激PKC-依賴性ELAV， mRNA-穩(wěn)定蛋 白，核輸出到CA1神經(jīng)元的細(xì)胞體和近端樹突的胞質(zhì)中(白色箭頭)。通過測定 棘標(biāo)記物親棘蛋白發(fā)現(xiàn)，苔蘚抑素還增加樹突棘數(shù)目。
實施例17:通過激活PKC提高棘密度的機制 圖31顯示了通過激活PKC提高棘密度的機制。在海馬切片中，苔蘚抑素 選擇性激活PKCa，但不激活PKC5和PKCs(圖A)。用苔蘚抑素培育120分鐘 時，ELAV明顯轉(zhuǎn)移到樹突(圖B)，樹突棘數(shù)目增加(圖C)。 PKC阻斷劑 RO-31-8220或白屈菜季銨堿能抑制這種作用(圖D)。蛋白質(zhì)合成阻斷劑也抑制 棘密度提高(未顯示)?？偠灾?，這說明苔蘚抑素刺激了 PKCa-激活的ELAV 蛋白，從而導(dǎo)致抑制mRNA降解和增強對于棘形成很重要的蛋白質(zhì)的合成。 在試探測試后第2天和水迷宮訓(xùn)練的6天中，樹突中的ELAV仍舊升高(圖E)， 說明水迷宮通過PKC/ELAV/蛋白質(zhì)合成級聯(lián)增加蘑菇棘密度。然而，無論有或 沒有苔蘚抑素，空間學(xué)習(xí)后樹突中的ELAV都持續(xù)增加，說明PKC/ELAV/蛋 白質(zhì)合成不是蘑菇棘形成的唯一途徑。星號表明與天然對照有顯著差異(*， p<.05; **， p<.01; ***， p<.001)。
權(quán)利要求
1.一種方法，該方法包括使PKC活化劑接觸蛋白激酶C(PKC)以刺激細(xì)胞或神經(jīng)元生長的步驟。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，使PKC活化劑接觸蛋白激酶 C(PKC)刺激了樹突生長。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，使PKC活化劑接觸蛋白激酶 C (PKC)刺激了樹突棘形成。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，使PKC活化劑接觸蛋白激酶 C(PKC)刺激了樹突棘密度。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，使PKC活化劑接觸蛋白激酶 C (PKC)刺激了 ELAV易位到近端樹突。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是大環(huán)內(nèi)酯。
7. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是苯并內(nèi)酰胺。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是吡咯烷酮。
9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述大環(huán)內(nèi)酯是苔蘚抑素。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1、 -2、陽3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17、 或-18。
11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1。
12. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述大環(huán)內(nèi)酯是納瑞他汀。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述納瑞他汀是納瑞他汀-1。
14. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述接觸活化PKC。
15. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述接觸使PKC數(shù)量增加。
16. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述接觸使PKC合成增加。
17. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述PKC是PKCa。
18. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述PKC是PKC(x。
19. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述PKC是PKC(x。
20. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述接觸使克萊斯汀的數(shù)量 增加。
21. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述接觸不導(dǎo)致PKC隨后明顯下調(diào)。
22. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，重復(fù)使PKC活化劑接觸PKC 的步驟。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，以規(guī)律間隔重復(fù)使PKC活 化劑接觸PKC的步驟。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述間隔為1周至1個月， 1天至1周，或少于1小時至24小時。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述間隔為l周至l個月。
26. 如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述間隔為l天至l周。
27. 如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述間隔為少于1小時至 24小時。
28. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在一固定期間內(nèi)保持PKC 活化劑與PKC的接觸。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期間為少于24小時。
30. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期間為少于12小時。
31. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期間為少于6小時。
32. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期間為少于4小時。
33. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期間為少于2小時。
34. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期間約為2-6小時。
35. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期間約為4小時。
36. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述接觸時間約為l-12小時。
37. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，在多于1天的期間內(nèi)重復(fù) 所述接觸。
38. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，在1天至1個月的期間內(nèi) 重復(fù)所述接觸。
39. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，在1天至1周的期間內(nèi)重 復(fù)所述接觸。
40. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，在1周至1個月的期間內(nèi) 重復(fù)所述接觸。
41. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，在l-6個月的期間內(nèi)重復(fù)所 述接觸。
42. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，在1個月的期間內(nèi)重復(fù)所 述接觸
43. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，在多于1個月的期間內(nèi)重 復(fù)所述接觸。
44. 一種方法，包括使PKC活化劑接觸蛋白激酶C(PKC)以刺激蛋白質(zhì)的 合成從而鞏固長期記憶的步驟。
45. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是大環(huán)內(nèi)酯。
46. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是苯并內(nèi)酰胺。
47. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是吡咯垸酮。
48. 如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述大環(huán)內(nèi)酯是苔蘚抑素。
49. 如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1、 -2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17、 或-18。
50. 如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1 。
51. 如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述大環(huán)內(nèi)酯是納瑞他汀。
52. 如權(quán)利要求51所述的組合物，其特征在于，所述納瑞他汀是納瑞他汀-1。
53. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述接觸活化PKC。
54. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述接觸使PKC數(shù)量增加。
55. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述接觸使PKC合成增加。
56. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述接觸使克萊斯汀的數(shù) 量增加。
57. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述接觸不導(dǎo)致PKC隨后 明顯下調(diào)。
58. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，重復(fù)使PKC活化劑接觸PKC 的步驟。
59. 如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，以規(guī)律間隔重復(fù)使PKC活 化劑接觸PKC的步驟。
60. 如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述間隔為l周至l個月， 1天至1周，或少于1小時至24小時。
61. 如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述間隔為1周至1個月。
62. 如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述間隔為1天至1周。
63. 如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述間隔為少于1小時至 24小時。
64. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，在一固定期間內(nèi)保持PKC 活化劑與PKC的接觸。
65. 如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期間為少于24小時。
66. 如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期間為少于12小時。
67. 如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期間為少于6小時。
68. 如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期間為少于4小時。
69. 如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期間為少于2小時。
70. 如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期間約為2-6小時。
71. 如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期間約為4小時。
72. 如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述接觸時間約為l-12小時。
73. 如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，在多于1天的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。
74. 如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，在1天至1個月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。
75. 如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，在1天至1周的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。
76. 如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，在1周至1個月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。
77. 如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，在l-6個月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。
78. 如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，在l個月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。
79. 如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，在多于1個月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。
80. —種方法，包括使PKC活化劑接觸蛋白激酶C(PKC)以下調(diào)PKC的步驟。
81. 如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是大環(huán)內(nèi)酯。
82. 如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是苯并內(nèi)酰胺。
83. 如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是吡咯烷酮。
84. 如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述大環(huán)內(nèi)酯是苔蘚抑素。
85. 如權(quán)利要求84所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1、-2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17、或-18。
86. 如權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1。
87. 如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述大環(huán)內(nèi)酯是納瑞他汀。
88. 如權(quán)利要求81所述的組合物，其特征在于，所述納瑞他汀是納瑞他汀-1。
89. 如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述接觸下調(diào)PKC。
90.如權(quán)利要求89所述的方法，其特征在于，所述接觸顯著下調(diào)PKC。
91. 如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述接觸不刺激PKC合成。
92. 如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述接觸基本上不刺激PKC合成。
93. 如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述接觸使PKC數(shù)量減少。
94. 如權(quán)利要求93所述的方法，其特征在于，所述接觸使PKC數(shù)量顯著減少。
95. 如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述接觸不刺激克萊斯汀的合成。
96. 如權(quán)利要求93所述的方法，其特征在于，所述接觸不刺激克萊斯汀(calexitin)的合成。
97. 如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，在一持續(xù)期間使PKC活化劑接觸PKC。
98. 如權(quán)利要求97所述的方法，其特征在于，所述持續(xù)期間為少于1小時至24小時。
99. 如權(quán)利要求97所述的方法，其特征在于，所述持續(xù)期間為1天至1周。
100. 如權(quán)利要求97所述的方法，其特征在于，所述持續(xù)期間為l周至l個月。
101. 如權(quán)利要求97所述的方法，其特征在于，所述持續(xù)期間為少于l小時至12小時。
102. 如權(quán)利要求97所述的方法，其特征在于，所述持續(xù)期間為少于l小時至8小時。
103. 如權(quán)利要求97所述的方法，其特征在于，所述持續(xù)期間為少于l小時至4小時。
104. 如權(quán)利要求97所述的方法，其特征在于，所述持續(xù)期間約為4小時。
105. 如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述接觸導(dǎo)致PKC持續(xù)下調(diào)。
106. 如權(quán)利要求44所述的方法，還包括抑制蛋白激酶C(PKC)降解的步驟。
107. 如權(quán)利要求106所述的方法，其特征在于，所述降解通過泛素化作用進行。
108. 如權(quán)利要求107所述的方法，其特征在于，所述降解受乳胱素的抑制。
109. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述PKC來自人。
110. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，以含有PKC活化劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物形式提供所述PKC活化劑。
111. 如權(quán)利要求110所述的方法，其特征在于，所述藥物組合物還含有PKC抑制劑。
112. 如權(quán)利要求lll所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制劑能在外周組織中抑制PKC。
113. 如權(quán)利要求lll所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制劑選擇性地抑制外周組織中的PKC。
114. 如權(quán)利要求lll所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制劑是一種能夠緩解給予個體PKC活化劑相關(guān)肌痛的化合物。
115. 如權(quán)利要求lll所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制劑是一種能夠提高PKC活化劑耐受劑量的化合物。
116. 如權(quán)利要求lll所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制劑為維生素E、維生素E類似物、維生素E鹽、鈣感光蛋白C、噻唑烷二酮、羅伯斯妥林或其組合。
117. —種減緩或逆轉(zhuǎn)記憶力和學(xué)習(xí)力喪失的方法，包括使有效量PKC活化劑接觸已鑒定為記憶力喪失的對象的蛋白激酶C(PKC)以減緩或逆轉(zhuǎn)記憶力喪失的步驟。
118. 如權(quán)利要求U7所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化劑接觸PKC刺激了細(xì)胞或神經(jīng)元生長。
119. 如權(quán)利要求117所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化劑接觸PKC刺激了樹突生長。
120. 如權(quán)利要求117所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化劑接觸PKC刺激了樹突棘形成。
121. 如權(quán)利要求117所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化劑接觸PKC刺激了樹突棘密度。
122. —種刺激細(xì)胞或神經(jīng)元生長的方法，包括使有效量PKC活化劑接觸對象的蛋白激酶C(PKC)，從而剌激細(xì)胞或神經(jīng)元生長的步驟。
123. 如權(quán)利要求122所述的方法，其特征在于，所述對象被鑒定為學(xué)習(xí)力或記憶力受損。
124. 如權(quán)利要求122所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化劑接觸PKC刺激了樹突生長。
125. 如權(quán)利要求122所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化劑接觸PKC刺激了樹突棘形成。
126. 如權(quán)利要求122所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化劑接觸PKC刺激了樹突棘密度。
全文摘要
本發(fā)明提供了減緩或逆轉(zhuǎn)記憶力和學(xué)習(xí)力喪失的方法，包括使有效量PKC活化劑接觸已鑒定為記憶力喪失的對象的蛋白激酶C(PKC)以減緩或逆轉(zhuǎn)記憶力喪失的步驟。本發(fā)明提供了刺激細(xì)胞生長、神經(jīng)元生長、樹突生長、樹突棘形成、樹突棘密度，以及將ELAV易位到近端樹突，和重塑突觸的方法。本發(fā)明還提供了使蛋白激酶C(PKC)活化劑接觸PKC以刺激蛋白質(zhì)的合成從而鞏固長期記憶的方法。本發(fā)明還提供了使蛋白激酶C(PKC)活化劑接觸PKC來下調(diào)PKC的方法。
文檔編號A61K31/365GK101541322SQ200780028657
公開日2009年9月23日 申請日期2007年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月28日
發(fā)明者D·L·阿爾康, J·洪帕桑 申請人:布朗歇特洛克菲勒神經(jīng)科學(xué)研究所