專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)脫礦質(zhì)的組合物和方法
用于檢測(cè)脫礦質(zhì)的組合物和方法本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)牙齒脫礦質(zhì)的組合物。更具體地，本發(fā)明涉及一種組合 物，所述組合物包含能夠?qū)τ坞x離子的存在產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)特征的復(fù)合物，這種組合物的藥 物用途，以及用于使用這種組合物檢測(cè)在牙齒表面的活性脫礦質(zhì)的方法和試劑盒。牙齒釉質(zhì)含有大量磷灰石晶體，其形成緊固的組合結(jié)構(gòu)；然而，用水和有機(jī)材料裝 滿(mǎn)的極小的晶粒間的空間或孔隙分開(kāi)所述晶體。在齒中發(fā)現(xiàn)的磷灰石形式是羥基磷灰石， 其最小的重復(fù)單元是Caltl (PO4) 6 ·2 (OH)。所述晶體的組分可被取代。已知的取代物包括關(guān) 于鈣的鍶，鋇，鉛，鈉，鉀和鎂；關(guān)于氫氧化物和碳酸鹽的鹵素(F，Cl，I，Br)；以及關(guān)于磷酸 鹽的磷酸氫鹽。這些取代中，據(jù)報(bào)道氟化物和碳酸鹽是最重要的，并且氟化物防止/修復(fù)齲 齒且碳酸鹽增加對(duì)齲齒的易感性。也報(bào)道在表面釉質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了許多其它離子，諸如鋅，錫和 鐵。在完全成形的釉質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的有機(jī)材料(1重量％，2體積％ )主要由釉蛋白(enamelins) (質(zhì)量50-70kDa)組成，但是也含有低分子量類(lèi)脂物，以及一些糖類(lèi)和有機(jī)酸諸如檸檬酸鹽 和乳酸鹽?？赏ㄟ^(guò)免疫印記分析來(lái)檢測(cè)釉蛋白。許多牙齒問(wèn)題由脫礦質(zhì)導(dǎo)致。脫礦質(zhì)是一個(gè)涉及齲齒，牙齒磨蝕以及牙質(zhì)過(guò)敏發(fā) 展的潛在過(guò)程。一個(gè)或多個(gè)牙齒硬組織的脫礦質(zhì)引起牙齒完整性的損失。礦物質(zhì)一般存在 于礦化狀態(tài)的牙齒硬組織中，并且脫礦質(zhì)涉及游離離子的釋放。齲齒損害損傷齒的結(jié)構(gòu)。齲齒疾病可導(dǎo)致疼痛，感染，難聞的氣味，難聞的味道以 及牙齒損失。在嚴(yán)重的情況下，感染可蔓延到周?chē)能浗M織，其可導(dǎo)致死亡。誘導(dǎo)齲齒的因 素包括在齒周?chē)苑Q(chēng)為蝕斑的粘稠性物質(zhì)方式集中的細(xì)菌，以及攝取的食物和飲料。與早 期脫礦質(zhì)有關(guān)的細(xì)菌是變異鏈球菌，而乳桿菌看來(lái)像是與損害發(fā)展有關(guān)。這些細(xì)菌在食物/ 飲料中通過(guò)發(fā)酵將糖轉(zhuǎn)化為酸，諸如乳酸，并且如果保持與齒接觸，這些酸導(dǎo)致脫礦質(zhì)。從 齒的晶體表面除去礦物質(zhì)使結(jié)構(gòu)更多孔且對(duì)侵蝕更敏感。隨著孔隙尺寸增加，酸可以更深 地穿透到組織中并溶解表面下的礦物質(zhì)。最終在脫礦質(zhì)以后的是有機(jī)材料的崩解。如果讓 其發(fā)展，礦物質(zhì)的含量損失到這樣的程度，即留下的柔軟的有機(jī)材料分裂形成空腔或破壞 牙齒的表面完整性。如果齲齒要發(fā)展，則在表面的蝕斑生物膜的存在是必需的。存在確定齲齒損害的位置和程度(深度和/或礦物質(zhì)損失體積)的技術(shù)。目前臨 床醫(yī)生使用識(shí)別脫礦質(zhì)的區(qū)域來(lái)檢測(cè)齲齒及其它牙齒問(wèn)題。這可以包括通過(guò)臨床醫(yī)生的視 覺(jué)檢查，放射照相術(shù)或諸如DIAGNOdent (專(zhuān)利號(hào)US 4290433)的現(xiàn)有技術(shù)。采用視覺(jué)檢查 以檢出齲齒依靠鑒定者的技術(shù)，且更重要的是脫礦質(zhì)/磨蝕的程度。經(jīng)常地，以這樣的方式 檢測(cè)到齲齒時(shí)，將已經(jīng)存在顯著的損傷。X-射線(xiàn)分析可顯示眼看不見(jiàn)的齲齒的存在，然而需 要繼續(xù)評(píng)估以確定齲齒活性?？蓭椭x齒診斷的本領(lǐng)域技術(shù)包括用光或激光的光纖照射。 DIAGNOdent (US 4290433)和定量光-誘導(dǎo)熒光(QLF) (US4290433)涉及分別用紅色激光 (633nm)或高強(qiáng)度藍(lán)色光照射牙表面，然后分析發(fā)射的熒光。發(fā)射的熒光的特性與牙中的脫 礦質(zhì)的程度有關(guān)。其它方法例如為超聲齲齒檢測(cè)器(UCD)采用超聲波(US 2007238996) 產(chǎn)生牙的圖像，其中反射度的水平與組織的密度成正比例；或拉曼光譜(US2005283058)， 其對(duì)礦物質(zhì)和晶體取向敏感，從而表征釉質(zhì)表面。牙齒磨蝕是逐漸從牙表面開(kāi)始的硬組織厚度的漸進(jìn)性損失，且經(jīng)常由酸性飲料/食物(其可能或可能不是含糖的)所引起，其導(dǎo)致脫礦質(zhì)且可引起牙質(zhì)的暴露。通過(guò)酸-軟 化釉質(zhì)(或牙質(zhì))的牙-清潔還可以加速磨蝕，從而導(dǎo)致釉質(zhì)的完全除去和隨之發(fā)生的牙 質(zhì)暴露。具體地說(shuō)，磨蝕是指引起硬的牙齒組織漸進(jìn)性損失的非-細(xì)菌過(guò)程。當(dāng)你的牙齒 上的釉質(zhì)被酸磨損時(shí)，就發(fā)生牙磨蝕。通常，包含在唾液中的鈣將在你消費(fèi)少量酸后幫助再 礦化(或增強(qiáng))你的牙齒，但是在你口中的許多的酸的存在不允許再礦化。酸可來(lái)自許多 來(lái)源，包括碳酸飲料。所有的“嘶嘶發(fā)泡的(fizzy)”飲料都含有酸且可很快溶解釉質(zhì)。增 加的消費(fèi)數(shù)量導(dǎo)致隨著增加的損傷，如保持飲料在口中較長(zhǎng)時(shí)間。純果汁含有酸，且因此以 與碳酸飲料類(lèi)似的方式作用。貪食癥和酸反流會(huì)由于牙齒暴露于胃酸而促進(jìn)牙磨蝕。有許多牙磨蝕跡象，從它的初始階段(敏感性，變色，圓齒)到后面的更多嚴(yán)重的 階段(裂紋，嚴(yán)重敏感性，杯狀陷凹)。保護(hù)性釉質(zhì)的磨損導(dǎo)致增加牙髓中的神經(jīng)末梢的暴 露，從而導(dǎo)致當(dāng)你消費(fèi)熱的，冷的，或甜的食物和飲料時(shí)疼痛。患者可能因此經(jīng)常出現(xiàn)敏感 性。嚴(yán)重的敏感性可能發(fā)展為更多釉質(zhì)被磨損且牙齒愈加變得敏感?；颊呖赡芤渤霈F(xiàn)變色 的牙齒，因?yàn)楫?dāng)牙質(zhì)外露時(shí)他們會(huì)變得微黃。磨蝕的結(jié)果為牙齒可能成圓形或“砂磨”外觀(guān)。 前牙在咬合邊緣附近可能看起來(lái)稍微透明。后期的變色可導(dǎo)致-牙齒可能變得更黃，因?yàn)?由于牙釉質(zhì)損失而使更多牙質(zhì)外露。小的裂紋和粗糙可能出現(xiàn)在牙齒的邊緣，且因?yàn)樵谘?齒的咀嚼表面可能出現(xiàn)小的凹穴，所以可能出現(xiàn)杯狀陷凹。如果鑒定為早期的牙磨蝕，則可 適用治療而保護(hù)牙齒。例如，可密封問(wèn)題區(qū)域以防止進(jìn)一步的脫礦質(zhì)。因此早期檢測(cè)和診 斷極為重要。牙質(zhì)過(guò)敏是由暴露的牙質(zhì)引起的疼痛，典型響應(yīng)于外部刺激(且其不能通過(guò)任何 其它的牙齒疾病形式解釋)。暴露的張開(kāi)的牙本質(zhì)小管直接通向在其內(nèi)部包括神經(jīng)的髓組 織。當(dāng)在牙齦后退以后不再存在覆蓋根牙質(zhì)的牙骨質(zhì)(由于磨蝕或磨損)時(shí)，小管暴露且可 出現(xiàn)敏感性和疼痛。在過(guò)敏的情況下，相比不出現(xiàn)疼痛時(shí)，牙質(zhì)在牙質(zhì)表面有多達(dá)8倍以上 的小管張開(kāi)且小管直徑加寬。這為諸如通過(guò)酸性飲料的脫礦質(zhì)提供了較大的可用表面積， 且也導(dǎo)致應(yīng)用這種產(chǎn)品后釋放更多的鈣。如上所述，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)牙齒硬組織的脫礦質(zhì)的牙完整性的損失，引起齲齒，磨 蝕或過(guò)敏的發(fā)展。羥基磷灰石，即釉質(zhì)的主要組分，在暴露于酸性環(huán)境時(shí)變得可溶。牙齒處 于來(lái)自它們的外界環(huán)境的不斷侵蝕之下。牙表面的蝕斑細(xì)菌產(chǎn)生酸且在含糖的飲食或零食 以后，蝕斑的酸度可以顯著增強(qiáng)。在暴露于任何酸性環(huán)境過(guò)程中，在牙齒表面的無(wú)機(jī)物質(zhì)內(nèi) 容物的部分溶解，且可保持溶解超過(guò)2小時(shí)。酸可滲透通過(guò)此表面脫礦質(zhì)產(chǎn)生的微孔，且因 為隨著蝕斑酸度回到較低水平，表面層部分再礦化，可產(chǎn)生牙內(nèi)的表面下脫礦質(zhì)層。因此， 在蝕斑存在下，牙齒表面的脫礦質(zhì)和再礦化的振蕩周期是“正?！碧卣?。相比釉質(zhì)，牙質(zhì)和牙骨質(zhì)對(duì)酸脫礦質(zhì)更敏感，因?yàn)樗麄冇懈偷牡V物質(zhì)含量。齲齒 過(guò)程是一個(gè)在牙表面開(kāi)始的動(dòng)態(tài)過(guò)程，但是由于與牙和蝕斑內(nèi)的流體中的礦物質(zhì)濃度梯度 有關(guān)系的復(fù)雜的脫礦質(zhì)-再礦化過(guò)程，表面比表面下區(qū)域變得更高度礦化。取代容易發(fā)生 在釉質(zhì)的無(wú)機(jī)結(jié)構(gòu)中，且因此脫礦質(zhì)也導(dǎo)致許多不同離子的釋放。該因素對(duì)于早期檢測(cè)尤 其重要，因?yàn)橛再|(zhì)表面是初始攝取的位置，且也恰好是酸侵蝕的優(yōu)先點(diǎn)。通常的取代物包括鈉，鎂，氟化物和碳酸鹽。鎂和碳酸鹽可穿透到釉質(zhì)中，且已知 改變磷灰石的晶體結(jié)構(gòu)以致它變得更加可溶；因此，當(dāng)酸侵蝕時(shí)從表面下部?jī)?yōu)選損失這些 離子。與較深的層相比，表面釉質(zhì)中還發(fā)現(xiàn)較高濃度的鋅，鉛，錫和鐵。對(duì)釉質(zhì)中的齲蝕損害分析通常顯示高水平的氟化物以及可感知水平的鎂，其被認(rèn)為是由于新暴露的磷灰石層 對(duì)這些離子的迅速攝取。盡管存在一些用于確定齲齒損害的位置和程度(深度和/或礦物質(zhì)損失體積)的 技術(shù)，但這些方法的主要缺點(diǎn)在于他們不確定齲齒過(guò)程的特性，即在任何一個(gè)具體的時(shí)間 點(diǎn)，它們是活性的還是非活性的。非活性齲齒損害可能不需要治療，然而活性齲齒損害將 (通過(guò)定義)指示正在進(jìn)行的脫礦質(zhì)。它也將有益于盡可能早地得到關(guān)于脫礦質(zhì)的信息?；?性齲齒經(jīng)常到其過(guò)程的晚期才能發(fā)現(xiàn)，且對(duì)于牙的完整性已產(chǎn)生顯著損傷。有時(shí)只有患者 開(kāi)始感到疼痛時(shí)才使用X-射線(xiàn)證實(shí)齲齒的存在。目前，僅可通過(guò)典型地，在放射照相(X-射 線(xiàn))情況下，在多于一年的時(shí)期內(nèi)評(píng)價(jià)齲齒損害隨時(shí)間的進(jìn)程，確定齲齒的活性特征。如果 齲齒，牙磨蝕或過(guò)敏性牙齒及早鑒定，則可施用治療而保護(hù)牙齒。例如，可密封問(wèn)題區(qū)域以 防止進(jìn)一步的脫礦質(zhì)。因此及早檢測(cè)和診斷是極為重要的。此外，在檢查中最好捕獲關(guān)于 活性的信息。初始的齲齒診斷涉及所有可見(jiàn)的牙表面的檢驗(yàn)，經(jīng)常使用牙探測(cè)器，或金屬鎬和 反射鏡，通過(guò)明亮的光源照射。在一些情況下，齲蝕損害或釉質(zhì)脫礦質(zhì)的跡象是在牙的表面 上出現(xiàn)白堊色白色斑點(diǎn)。然而，這種斑點(diǎn)不總是可見(jiàn)的。用于診斷早期齲齒的通常技術(shù)是跨越可疑表面吹空氣。所導(dǎo)致的從表面的濕氣損 失改變脫礦質(zhì)的釉質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)，從而使得指示早期齲齒的白色斑點(diǎn)損害可見(jiàn)。隨著持續(xù) 脫礦質(zhì)，齲齒可轉(zhuǎn)為黑色且最終發(fā)展為空腔。大的齲齒損害經(jīng)常是肉眼可見(jiàn)的。然而，較小 的損害可能很難識(shí)別。一旦空腔形成，損失的牙結(jié)構(gòu)就不能再生。在該點(diǎn)以前的過(guò)程是潛 在可逆的，因此必需盡快識(shí)別齲齒。可幫助齲齒診斷的現(xiàn)有技術(shù)包括用光或激光的光纖照射。Diagnodent是專(zhuān)利 US6, 769，911涉及的技術(shù)，其中，含探針元件和集成的紅色光源的工具在牙的被細(xì)菌感染的 齲蝕區(qū)域中誘導(dǎo)熒光，所述熒光在通過(guò)適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器后被裝置測(cè)量。然而，該方法沒(méi)有提供 關(guān)于齲齒是活性還是非活性的指示。作為檢出牙腐蝕的方法，包括熒光染料的染料也已經(jīng)用于識(shí)別牙齒上細(xì)菌的位 置和酸的存在。然而，這些染料趨向于是有毒性的且因此不適于口內(nèi)分析。此外，釉質(zhì)是 自-熒光的(auto-fluorescent)，因此背景熒光可超限制地高。就齲齒檢測(cè)而論，磨蝕是通過(guò)視覺(jué)檢查檢測(cè)的。指示磨蝕的跡象和癥狀包括，門(mén)齒 增加的透明度，上升超過(guò)周?chē)例X的填充物，和在非-咀嚼表面上的磨損。所有這些從容發(fā) 展至可見(jiàn)程度，且損傷將已經(jīng)完成。由于許多原因，期望獲得用于測(cè)試由于磨蝕而脫礦質(zhì)的 方法。例如，可施用某些食物或飲料到牙齒，接著是所公開(kāi)的組合物。如果由于食物或飲料 與牙接觸而發(fā)出離子，所述公開(kāi)組合物將發(fā)射出可檢測(cè)信號(hào)?；蛘邽榱藴y(cè)量標(biāo)準(zhǔn)食物或飲 料產(chǎn)品，或者在牙-友好產(chǎn)品(低的導(dǎo)致磨蝕可能性)或磨蝕預(yù)防產(chǎn)品如牙膏和密封劑的 開(kāi)發(fā)中，為了確定可食用的產(chǎn)品可能對(duì)于牙齒造成的潛在破壞性如何的制造商可以使用該 測(cè)試。牙科臨床醫(yī)生也可使用所述公開(kāi)的組合物確定患者對(duì)磨蝕的易感性，并且通過(guò)牙組 成和唾液確定。牙質(zhì)過(guò)敏將由患者報(bào)告且由牙科醫(yī)師研究。有用的診斷工具是空氣/水注射器， 牙齒探測(cè)器，叩診測(cè)試，咬合應(yīng)力測(cè)試，以及其它熱測(cè)試諸如冰塊以及阻塞評(píng)估。然而，這些 方法，基于患者的報(bào)告，是主觀(guān)的并且缺乏準(zhǔn)確度。
本發(fā)明的目的是以減輕諸如上面描述的那些問(wèn)題。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含能對(duì)游離離 子的存在產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)特征的復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種用于檢測(cè)活性齲齒和/或由于磨蝕導(dǎo)致的活性 牙脫礦質(zhì)的組合物，所述組合物包含能對(duì)游離離子的存在產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)特征的復(fù)合物。用于檢測(cè)的復(fù)合物可以是染料，合成離子螯合劑如EDTA-報(bào)道分子復(fù)合物或大環(huán) 如冠醚報(bào)道分子復(fù)合物，蛋白或蛋白-報(bào)道分子復(fù)合物，分子印跡聚合物-報(bào)道分子復(fù)合物 或分子探針如霍利迪連接體。例如如果要檢測(cè)不同的離子，則可使用這些復(fù)合物的一種或 組合。要檢測(cè)的離子可以包含鈣離子，鎂離子，磷酸根離子，碳酸根離子，鉀離子，鍶離 子，氟離子，銅離子，氯離子，鋅離子，鉛離子，錫離子，鐵離子或有機(jī)材料如釉蛋白。不同離 子的檢測(cè)可能有助于確定脫礦質(zhì)的位置及其進(jìn)入到牙齒硬組織中的深度，因?yàn)椋邕@里所 描述的，不同的離子可能存在于不同的牙齒硬組織中。所述組合物還可以包含藥用添加劑，并且所述添加劑優(yōu)選為殺菌或抑菌試劑。所述組合物可以包含藥用賦形劑，并且所述賦形劑優(yōu)選為調(diào)味或著色添加劑。優(yōu)選的是，所述組合物處于藥用劑型，并且所述組合物優(yōu)選為液體，粉末或凝膠。 所述組合物可以包含lng/ml至10mg/ml的復(fù)合物，或提供顯著高的信噪比的任何濃度。所述組合物可以包含蛋白或蛋白復(fù)合物。這種復(fù)合物在結(jié)合游離離子時(shí)可能經(jīng)歷 構(gòu)象的變化，這導(dǎo)致產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)。優(yōu)選的是，所述蛋白或蛋白復(fù)合物包括水母發(fā)光蛋白，螅蛋白，鈣調(diào)發(fā)光蛋白 (clytin), mitrocomin, halistaurin,瓶梗蛋白(phialidin), mnemiopsin, symplectin, gr-bolinopsin,酪蛋白，集鈣蛋白，calexcitin，鈣結(jié)合半胱氨酸蛋白酶，鈣調(diào)蛋白以及其 它的EF手型蛋白瓜水母光蛋白(EF handproteinsor berovin)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉功 能類(lèi)似并且可以無(wú)需過(guò)度努力地選擇的其它蛋白或蛋白復(fù)合物。優(yōu)選地是，所述蛋白或蛋白復(fù)合物包含熒光蛋白和離子結(jié)合蛋白如鈣調(diào)蛋白，鈣 調(diào)蛋白_結(jié)合肽(M13)，以及增強(qiáng)的綠色_或黃色_發(fā)射熒光蛋白的銜接融合物。備選地，所述復(fù)合物可在指示離子存在的特征波長(zhǎng)發(fā)熒光。所述組合物可以包含在結(jié)合游離離子時(shí)產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)的蛋白或蛋白復(fù)合物，以及 在指示離子存在的特征波長(zhǎng)發(fā)熒光的蛋白或蛋白復(fù)合物。這些可以被修飾，例如通過(guò)改變基因的DNA序列，通過(guò)乙?；已趸驶?，熒 光胺-修飾或熒光素標(biāo)記或通過(guò)形成嵌合蛋白如GFP-水母發(fā)光蛋白(US2003175807)，從而 增強(qiáng)信號(hào)，延長(zhǎng)信號(hào)持續(xù)時(shí)間或改變它的發(fā)射光譜。也可使用具有類(lèi)似功能的蛋白和蛋白 復(fù)合物，諸如結(jié)合離子時(shí)經(jīng)歷導(dǎo)致光學(xué)信號(hào)的構(gòu)象變化的那些。蛋白或蛋白復(fù)合物優(yōu)選包含重組蛋白(以高純度表達(dá))?？蓪⒌鞍谆虻鞍?蛋白 復(fù)合物在無(wú)特定離子的溶液中施用，以減少背景信號(hào)。這可使用離子螯合劑實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，所述組合物將是光學(xué)透明的。這將容許組合物傳送當(dāng)離子_敏感性報(bào)道 分子與游離離子接觸時(shí)發(fā)射的光。也可加入添加劑以改變信號(hào)，例如，用于延長(zhǎng)可檢測(cè)信號(hào) 保持可檢測(cè)出的時(shí)間長(zhǎng)度的凝膠，為優(yōu)化反應(yīng)或被修飾物質(zhì)以防止立即閃光的緩沖液，但 是所述閃光可隨后被觸發(fā)，諸如用于腔腸動(dòng)物的熒光素酶的Enduren體系。
組合物在暴露于游離離子時(shí)產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)可通過(guò)以下檢測(cè)分光光度計(jì)，電荷 耦合裝置(CCD)，互補(bǔ)金屬-氧化物半導(dǎo)體CMOS，數(shù)字照相機(jī)，增強(qiáng)照相機(jī)，口內(nèi)照相機(jī)，視 頻示波器，照相軟片，光纖裝置，光度檢測(cè)器，光電倍增器，微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)或在視覺(jué)上 通過(guò)眼。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供如上所述藥物組合物用于制備用于檢測(cè)齲齒的制劑 的用途。根據(jù)脫礦質(zhì)的存在，可從活性齲齒區(qū)分非活性齲齒，因此所述組合物可用于制備用 于區(qū)分活性和非活性齲齒的制劑。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供如上所述藥物組合物用于制備制劑的用途，所述制 劑用于檢測(cè)由于磨蝕導(dǎo)致的活性牙脫礦質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供如上所述藥物組合物用于制備制劑的用途，所述制 劑用于檢測(cè)與牙質(zhì)過(guò)敏有關(guān)的牙質(zhì)脫礦質(zhì)的部位。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供用于檢測(cè)活性牙脫礦質(zhì)的方法，所述方法包含以下 步驟將牙暴露于如在上文描述的組合物；和檢測(cè)產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)。所述方法還可以包括另外的標(biāo)記牙或牙模型區(qū)域的步驟，以容許對(duì)牙或牙模型的 特別區(qū)域的識(shí)別?？赡茈y以保證牙或牙模型的相同區(qū)域可以被監(jiān)控，并且可以幫助將來(lái)的 分析，諸如當(dāng)比較來(lái)自不同技術(shù)的數(shù)據(jù)或用于監(jiān)控疾病或治療隨時(shí)間的發(fā)展時(shí)。這種標(biāo)記 可用染料、鉛筆形成，或通過(guò)將例如具有指甲油的由銅絲制成的格柵附著到牙齒上形成。所述方法還可以包括在暴露組合物之前，將牙暴露于敏化溶液的步驟。敏化溶液 可為酸性或含糖(其中出現(xiàn)蝕斑)的溶液。這可以容許確定牙對(duì)磨蝕的易感性。為了估計(jì) 對(duì)于牙磨蝕的個(gè)體的易感性，可使用該方法。該方法還可以用于估計(jì)食物或飲料產(chǎn)品對(duì)牙 齒侵蝕性質(zhì)。所述方法還可以包含在施用敏化溶液和施用檢測(cè)組合物之間允許過(guò)去一段時(shí)期 的步驟。這是為了容許口中的唾液增強(qiáng)，并且容許使用者估計(jì)唾液的保護(hù)效果。這段時(shí)期可 以是，例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25， 26，27，28，29，或30秒鐘，但是可以是任何其它認(rèn)為必需的時(shí)間，以便容許唾液返回到它在 口中的正常體積和組成，例如，可能需要一分鐘，兩分鐘或直到五分鐘。需要的時(shí)間長(zhǎng)度將 取決于個(gè)體患者中唾液體積和流動(dòng)，且可容易地通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員確定?？梢酝ㄟ^(guò)分光光度計(jì)，電荷耦合裝置(CXD)，互補(bǔ)金屬-氧化物半導(dǎo)體CMOS，數(shù)字 照相機(jī)，增強(qiáng)照相機(jī)，口內(nèi)照相機(jī)，視頻示波器，照相軟片，光纖裝置，光度檢測(cè)器，光電倍增 器，雪崩光電二極管，光敏陣列，微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)或通過(guò)眼在視覺(jué)上檢測(cè)光學(xué)信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明的第七實(shí)施方案，提供了一種用于檢測(cè)脫礦質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒 包括含有離子-敏感性復(fù)合物的組合物，用于施用所述組合物的工具以及檢測(cè)器單元。所 述試劑盒還可以包括酸性或含糖的敏化溶液。所述試劑盒還可包括標(biāo)記物，諸如用于在牙 或牙模型上標(biāo)記所關(guān)心區(qū)域的格柵。由于許多原因可以購(gòu)買(mǎi)試劑盒。牙科醫(yī)師可能希望得 到方便的市場(chǎng)上可買(mǎi)到的測(cè)試試劑盒，以用于評(píng)價(jià)患者對(duì)磨蝕的易感性。消費(fèi)者可以使用 磨蝕易感性的家-用測(cè)試，其然后可以決定采取什么預(yù)防性措施。食品或飲料產(chǎn)品的制造 商如果關(guān)心他們產(chǎn)品的牙-侵蝕性能，則可以購(gòu)買(mǎi)測(cè)試。因而，本發(fā)明設(shè)法提供一種用于在牙齒應(yīng)用中檢測(cè)游離離子的組合物以及一種使 用這種組合物的方法。
本發(fā)明還將僅經(jīng)由實(shí)施例描述并且參考附圖來(lái)描述，在所述附圖中

圖1是在嘉美露(cameleon)指示劑中的FRET的示意性表示；圖2顯示具有標(biāo)記在其表面上的掩蔽‘窗口’的提取的前磨牙；圖3顯示施用酸性凝膠和公開(kāi)的凝膠后的提取的牙齒的圖像；圖4和5表明了圖像分析程序ImageJ的使用，其用于確定用酸性凝膠和公開(kāi)的凝 膠處理的區(qū)域的亮度；圖6表明螅蛋白作為公開(kāi)組合物的使用；圖7a至7b顯示在具有齲齒的牙的根上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖8a和8b顯示在牙的牙質(zhì)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖9a至9b顯示進(jìn)行的與空腔識(shí)別有關(guān)的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖IOa至IOb顯示進(jìn)行的與空腔識(shí)別有關(guān)的進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖Ila至lib顯示進(jìn)行的與齲齒識(shí)別有關(guān)的進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖12顯示具有成穴損害(A)的脫落磨牙的圖像。圖12a和c顯示光中的牙齒的 圖像，而圖12b和12d顯示在施用公開(kāi)的凝膠以后的單色圖像；圖13A顯示具有大的齲齒損害的門(mén)齒(脫落的)(已知為奶瓶綜合征)，所述牙的 圖像在光中取得；圖13B在施用公開(kāi)的凝膠以后的門(mén)齒(脫落的)單色圖像，所述門(mén)齒具有大的齲 齒損害(已知為奶瓶綜合征)；圖14A是顯示磨牙(脫落的)的平滑表面的圖像，光中的牙齒的圖像；圖14B是顯示在施用公開(kāi)的凝膠以后的磨牙(脫落的)的平滑表面的單色圖像；圖15A和15B顯示磨牙(永久的)的咬合表面。圖15A顯示牙在光中的圖像，圖 15B顯示在施用公開(kāi)的凝膠以后的單色圖像；圖16A是在光中取得的磨牙(脫落的)的圖像；圖16B顯示在施用公開(kāi)的凝膠以后的單色圖像；圖16C是穿過(guò)損害產(chǎn)生的光的圖解表述；圖17A顯示永久磨牙的X-射線(xiàn)；圖17B顯示永久磨牙，其中央表面也用X-射線(xiàn)然后用公開(kāi)的凝膠研究；圖18A顯示已經(jīng)在去離子水中漂洗并且在評(píng)價(jià)以前移去的牙齒的圖像；圖18B顯示已經(jīng)在唾液中漂洗并評(píng)價(jià)的牙齒；圖18C顯示已經(jīng)在唾液中漂洗但是 在評(píng)價(jià)以前移去的牙齒；圖18D顯示已經(jīng)在唾液中溫育、移去、在評(píng)價(jià)以前在去離子水中漂洗的牙齒；圖19A顯示添加公開(kāi)的溶液以后成像的上-牙齦結(jié)石；圖19B顯示添加公開(kāi)的溶液以后成像的下_牙齦結(jié)石；圖20A顯示施用公開(kāi)凝膠后牙在光中的圖像；方框表示結(jié)石區(qū)域；圖20B顯示施用公開(kāi)凝膠后的單色圖像；方框表示結(jié)石區(qū)域；圖21A顯示施用公開(kāi)凝膠前，磨牙(永久的)在光中的咬合表面的圖像；圖21B施用公開(kāi)凝膠后，磨牙(永久的)的咬合表面的單色圖像；圖22a至22c顯示進(jìn)行的與牙齒磨蝕和過(guò)敏有關(guān)的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖23a至23c顯示進(jìn)行的與牙齒磨蝕和過(guò)敏有關(guān)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；
圖24a至24c顯示進(jìn)行的與牙齒磨蝕和過(guò)敏有關(guān)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖25a至25c顯示用酸侵蝕的牙齒進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖26a至26d顯示用酸侵蝕的牙齒進(jìn)行的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖27A和27B是顯示與去離子水對(duì)比，唾液對(duì)酸處理的釉質(zhì)的保護(hù)效果的圖；圖28是顯示如通過(guò)亮度變化測(cè)量的，不同pH溶液對(duì)不同脫礦質(zhì)水平的影響的圖， 并且較低PH的溶液產(chǎn)生更多脫礦質(zhì)(更多亮度)；和圖29是指示食品對(duì)牙齒脫礦質(zhì)的影響的圖，所述影響可用本發(fā)明的公開(kāi)的組合 物和測(cè)定方法確定。在本發(fā)明的上下文中，“離子-敏感性復(fù)合物”指的是，能對(duì)由于脫礦質(zhì)釋放的游 離離子的存在產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)特征的復(fù)合物。所述復(fù)合物可以是染料，合成離子螯合劑如 EDTA-報(bào)道分子復(fù)合物或大環(huán)如冠醚報(bào)道分子復(fù)合物，蛋白或蛋白_報(bào)道分子復(fù)合物，分子 印跡聚合物-報(bào)道分子復(fù)合物或霍利迪連接體。可以將其修飾以增強(qiáng)對(duì)于離子的敏感性， 以改善信號(hào)強(qiáng)度，以延長(zhǎng)信號(hào)，以改善信噪比，以改善光譜響應(yīng)。也可使用重組或修飾的蛋 白。本發(fā)明涉及下列復(fù)合物中的一種或組合作為在牙齒脫礦質(zhì)檢測(cè)中的報(bào)道分子的 新的藥物用途，所述復(fù)合物為離子_敏感性染料，合成離子螯合劑如EDTA-報(bào)道分子復(fù)合物 或大環(huán)如冠醚報(bào)道分子復(fù)合物，蛋白或蛋白-報(bào)道分子復(fù)合物，分子印跡聚合物-報(bào)道分子 復(fù)合物或分子探針如霍利迪連接體。如上所述，在牙表面的游離離子的存在指示脫礦質(zhì)的 存在。這些報(bào)道分子可用于檢出牙齒上游離離子的存在，因而幫助檢出特定的牙齒問(wèn)題。在游離離子的存在下，從離子_敏感性報(bào)道分子發(fā)射光學(xué)信號(hào)。信號(hào)的光譜，強(qiáng)度 或持續(xù)時(shí)間與游離離子的量成正比例。不同組織具有可獲得的不同量和不同類(lèi)型的離子， 并且因此對(duì)離子_敏感性報(bào)道分子的響應(yīng)將在組織之間改變。牙齒磨蝕過(guò)程中，最終可能 將牙質(zhì)暴露。在牙質(zhì)過(guò)敏過(guò)程中，牙骨質(zhì)被除去且暴露根牙質(zhì)。與釉質(zhì)相比，牙質(zhì)和牙骨質(zhì) 較少被礦化，并且因而直接響應(yīng)于離子-敏感性報(bào)道分子?？梢杂删哂懈鼜?qiáng)的光學(xué)信號(hào)的 區(qū)域鑒定牙齒的這些脫礦質(zhì)特征。在活性齲齒的存在下，隨著牙被酸性環(huán)境和細(xì)菌脫礦質(zhì)，游離離子將被連續(xù)釋放。 所述信號(hào)的位置和強(qiáng)度容許確定活性齲齒的定位。所述組合物可能含有一種或多種下列物質(zhì)染料，合成離子螯合劑如EDTA-報(bào)道 分子復(fù)合物或大環(huán)如冠醚報(bào)道分子復(fù)合物，蛋白或蛋白-報(bào)道分子復(fù)合物，分子印跡聚合 物_報(bào)道分子復(fù)合物或分子探針如霍利迪連接體。所述蛋白或蛋白復(fù)合物可以包括離子敏 感性光蛋白(photoproteins)，離子敏感性熒光蛋白，或可通過(guò)熒光，生物發(fā)光，化學(xué)發(fā)光或 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET，CRET或FRET))檢測(cè)的蛋白復(fù)合物，識(shí)別有機(jī)材料如釉蛋白的標(biāo) 記抗體。所述合成離子螯合劑或蛋白復(fù)合物可結(jié)合在離子結(jié)合時(shí)猝滅的熒光部分，或結(jié)合 有熒光部分和猝滅劑的蛋白復(fù)合物，所述猝滅劑在引起光釋放的離子結(jié)合時(shí)被除去。用不同復(fù)合物可以檢測(cè)不同離子。鎂通過(guò)熒光染料如Mag-Fura-2和Mag_Fura_5 檢測(cè)。它們可以用于原位測(cè)量鎂(激發(fā)340-380nm，發(fā)射500-510nm)。優(yōu)選地，染料沒(méi)有毒 性。許多染料是鈣敏感性的，但是可能對(duì)于口中使用毒性太大。Fura-2，鈣 綠-1 (Calcium Green-1)，F(xiàn)luo-3, Indo-I和cSNARF-1全部是結(jié)合游離的細(xì)胞內(nèi)鈣的熒光染料。Indo-I和cSNARF-1是雙重發(fā)射染料。作為對(duì)發(fā)光光蛋白的備選，用于檢測(cè)和測(cè)量 游離鈣的熒光的鈣結(jié)合染料可能有用。此外，如果與Halistaurin聯(lián)合使用，這些的染料可 用于同時(shí)測(cè)量唾液中的鈣和鍶的新方法。Fura-2，鈣綠_1，Indo-I和它們的acteto甲基酯 (actetomethylester)衍生物已經(jīng)用于小鼠(體內(nèi))以監(jiān)控神經(jīng)元的活性。Rhod_2也是鈣 敏感性染料，雖然它比Fluo-3較少敏感。Rhod-2的較長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)( 556/576nm) 使得所述報(bào)道分子可用于具有高水平的自熒光的細(xì)胞和組織中的實(shí)驗(yàn)，以及用于其中同時(shí) 使用另一種較短波長(zhǎng)的熒光染料的實(shí)驗(yàn)。因?yàn)橛再|(zhì)已知發(fā)熒光，因此這種長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)將成 為顯著的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)熒光染料可實(shí)現(xiàn)氟化物的檢測(cè)。高水平的氟化物一般存在于齲齒損害中，被 認(rèn)為歸因于在脫礦質(zhì)部位的離子高度攝取。對(duì)于工業(yè)和醫(yī)療應(yīng)用，已經(jīng)存在且繼續(xù)著大量 對(duì)氟化物敏感性熒光體系的研究。一種這樣的復(fù)合物是&(IV)-EDTA-喔星，其顯示與氟 化物結(jié)合時(shí)熒光降低。顯示在氟化物存在下熒光增加的氟化物傳感器也已報(bào)道；這些包 括硼酸化合物和硫脲基萘衍生物。硼酸化合物目前相對(duì)不靈敏(檢測(cè)水平50-70mM)，然 而，相信通過(guò)適當(dāng)?shù)男揎?，氟化物選擇性可以良好地調(diào)節(jié)至期望的濃度范圍。新的硫脲基 萘衍生物顯示氟化物存在時(shí)熒光增加40倍，且對(duì)氟化物具有超過(guò)其他商素的很高的選擇 性。備選地，(Tae-Hyun Kim 和 Timothy Μ. Swager (2003，德國(guó)應(yīng)用化學(xué)國(guó)際版(Chem. Int. Ed. Angewandte) 42,4803-4806)描述了一種其中通過(guò)氟化物所致的Si-O鍵的開(kāi)裂導(dǎo)致高 熒光香豆素分子形成的體系。鉀的檢測(cè)可用熒光染料如SBFI，其是鉀和鈉都敏感的(激發(fā)340-380nm，發(fā)射 5IOnm)。鉀與牙齒過(guò)敏有關(guān)系且可能與齲齒有關(guān)。備選地，由鳶烏賊(Symplectoteuthis oualaniensis)獲得的光蛋白對(duì)鉀敏感且可以使用(US2004191884)。在所述組合物包括蛋白或蛋白復(fù)合物的情況下，它可以在結(jié)合游離離子時(shí)產(chǎn) 生光學(xué)信號(hào)?？蓪⑦@種蛋白或蛋白復(fù)合物修飾，例如通過(guò)改變基因的DNA序列，通過(guò)乙 酰化，乙氧基羰基化，熒光胺_修飾或熒光素標(biāo)記或通過(guò)形成諸如GFP-水母發(fā)光蛋白 (US2003175807)的嵌合蛋白，從而增強(qiáng)信號(hào)，延長(zhǎng)信號(hào)持續(xù)時(shí)間或改變它的發(fā)射光譜。也可 使用具有類(lèi)似功能的蛋白和蛋白復(fù)合物，諸如結(jié)合離子或有機(jī)材料時(shí)經(jīng)歷導(dǎo)致光學(xué)信號(hào)的 構(gòu)象變化的那些。這種蛋白或蛋白復(fù)合物的實(shí)例是光蛋白。光蛋白是由一個(gè)或多個(gè)多肽鏈和氧-預(yù) 活化底物組成的穩(wěn)定的酶_底物復(fù)合物，所述氧_預(yù)活化底物例如為2-氫過(guò)氧化腔腸 素(hydroperoxycoelenterazine)，其與蛋白緊密但是非共價(jià)結(jié)合。生物發(fā)光可通過(guò)例如 Ca2+和與蛋白結(jié)合的底物的脫羧的產(chǎn)物觸發(fā)。根據(jù)本發(fā)明，另一種可能有用的光蛋白是 halistaurin. Halistaurin可用于檢測(cè)鍶，鍶被認(rèn)為在礦化過(guò)程中取代羥基磷灰石晶體中 的一小部分鈣。鍶的缺陷與齲齒有關(guān)系(“鍶和齲齒(Strontium and dental caries)”. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)綜述(Nutr Rev) 1983 ;41 :342-344)。鍶的檢測(cè)可使用光蛋白如halistaurin。在 US的不同區(qū)域中已經(jīng)報(bào)道了牙齒中的寬范圍的鍶的值(例如，66-564ppm)。光蛋白的另一個(gè)實(shí)例是水母發(fā)光蛋白，其天然地產(chǎn)生于生物發(fā)光水母維多利亞多 管水母(Aequorea Victoria)中，或可以重組表達(dá)。水母發(fā)光蛋白是能儲(chǔ)藏大量在鈣存在 下釋放的能量的蛋白。脫輔基水母發(fā)光蛋白(Apoaequorin)與它的底物腔腸素互相作用， 以形成相對(duì)穩(wěn)定的通過(guò)鈣活化的復(fù)合物。兩個(gè)鈣離子對(duì)水母發(fā)光蛋白的結(jié)合引起所述蛋白的構(gòu)象改變，導(dǎo)致蛋白開(kāi)放和腔腸素過(guò)氧化物分解為腔腸酰胺(coelenteramide)和CO2, 伴有光學(xué)信號(hào)或光的發(fā)射。進(jìn)一步的關(guān)于水母發(fā)光蛋白的描述可以在下列文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn) Shimomura 等(1978)美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc. Natl Acad. Sci. U. S. Α.) 75, 2611-2615 ；Head 等(2000)自然(Nature) 405，372-376 ；和 Shimomura (2005)顯微鏡學(xué)雜志(Journal of Microscopy)217,3-15。光蛋白的其它實(shí)例包括螅蛋白，鈣調(diào)發(fā)光蛋白(clytin)，mitrocomin, halistaurin,瓶梗蛋白(phialidin), mnemiopsin, symplectin, gr-bolinopsin 禾口 瓜水母光蛋白。這些光蛋白顯示高的序列同源性，且包含三個(gè)“EF-手型”鈣結(jié)合部 位。這些光蛋白的進(jìn)一步描述可在以下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)Prasher等，生物化學(xué)與生物物 理學(xué)研究通訊(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 126(1985) ； Inouye 等，美國(guó)科學(xué)院 院刊(Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A.) 82 (1985)，3154-3158 頁(yè)；Prasher 等，生物化學(xué) (Biochemistry) 26 (1987)，1326-1332 頁(yè)；Inouye 等，F(xiàn)EBS 通訊(FEBS Lett.) 315 (1993), 343-346 頁(yè)；T. F. Fagan 等，F(xiàn)EBS 通訊(FEBS Lett.) 333 (1993)，301-305 頁(yè)；Illarionov 等， Dokl. Akad. Nauk 326 (1992)，911-913 頁(yè)；Illarionov 等，基因(Gene) 153 (1995)，273-274 頁(yè)；Shimomura 等(1985)，生物化學(xué)雜志(Biochem J.)6 月 15 日；228 (3) 745-9 ；Ward 等(1974)生物化學(xué)(Biochemistry). 3月26日；13 (7) :1500_10。這些蛋白的作用模式 的進(jìn)一步描述可在以下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)=Markova等，生物化學(xué)學(xué)(Biochemistry) 41 (2002)， 2227-2236 頁(yè)；Charbonneau 等，生物化學(xué)(Biochemistry) 24 (1985)，6762-6771 頁(yè)；Tsuji 等，光化學(xué)光生物學(xué)(Photochem. Photobiol.) 62 (1995)，657-661 頁(yè)。所述組合物可以包含合成離子螯合劑如EDTA-報(bào)道分子復(fù)合物或大環(huán)如冠醚報(bào) 道分子復(fù)合物。有許多關(guān)于這些的實(shí)例，其與離子結(jié)合且具有報(bào)道分子的復(fù)合物已經(jīng)制成。 例如，對(duì)于鈣，使用BAPTA，用光誘導(dǎo)的電子傳遞連接熒光團(tuán)和選擇性受體，所述BAPTA如在 John F. Callan, A. Prasanna de SiIvaa禾口 Nathan D. McClenaghanv (2004)化學(xué)通訊(Chem. Commun.) 2048-2049中所描述。美國(guó)專(zhuān)利5409835也描述了用于確定樣品中鈣離子濃度的 熒光鈣_結(jié)合雜環(huán)探針化合物。所述組合物可以包含在指示離子存在的特征波長(zhǎng)發(fā)熒光的復(fù)合物。通過(guò)改變光的 強(qiáng)度或顏色，這種發(fā)熒光復(fù)合物響應(yīng)于離子。這些復(fù)合物可以是蛋白或蛋白復(fù)合物。熒光蛋白的優(yōu)選實(shí)例包括嘉美露蛋白或指示劑。嘉美露是一類(lèi)新的用于活細(xì)胞 中鈣離子濃度的指示劑，其在鈣離子的存在下，通過(guò)導(dǎo)致“Foster共振能量轉(zhuǎn)移(Fdrster Resonance Energy Transfer) ”(FRET或“熒光共振能量轉(zhuǎn)移”)的構(gòu)象變化起作用。圖1顯 示了嘉美露指示劑中FRET的示意性表示。更具體地，F(xiàn)RET涉及經(jīng)由分子間遠(yuǎn)程(10-100 A )偶極-偶極相互作用，來(lái)自激發(fā)的給體熒光團(tuán)的激發(fā)能至處于基態(tài)的受體熒光團(tuán)的非輻 射轉(zhuǎn)移。嘉美露指示劑包含由綠色熒光蛋白(GFP)修飾的人工蛋白。嘉美露分子結(jié)構(gòu)被 模擬為兩個(gè)熒光蛋白(具有不同激發(fā)和發(fā)射特征)，鈣調(diào)蛋白(CaM)，和肌球蛋白輕鏈激酶 (M13)的鈣調(diào)蛋白-結(jié)合域之間的融合產(chǎn)物。鈣調(diào)蛋白能夠與游離鈣離子結(jié)合，并且M13鏈 可以在其已經(jīng)與鈣離子結(jié)合之后與鈣調(diào)蛋白結(jié)合。將這四個(gè)蛋白的基因線(xiàn)性結(jié)合，且將融 合基因在不同細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)鈣調(diào)蛋白結(jié)合游離鈣時(shí)，它結(jié)構(gòu)改變，從而將兩個(gè)熒光蛋白靠 得更近并導(dǎo)致FRET。這樣，代替發(fā)射藍(lán)光的青色熒光蛋白的是，此光被轉(zhuǎn)移到黃色熒光蛋 白，從而導(dǎo)致光色熒光。關(guān)于嘉美露指示劑的進(jìn)一步的描述可在以下文獻(xiàn)中找到=Miyawaki等(1997)自然(Nature) 388 (6645) :882 ;Miyawaki 等，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proceedings of the National Academy ofSciences(USA)) 96 :2135_2140 (1999)。熒光蛋白的另一個(gè)實(shí)例是Pericam，其是GFP的修飾形式。CaM和pericam的結(jié)合 肽M13之間的Ca2+-誘導(dǎo)的相互作用導(dǎo)致循環(huán)改變(cp) YFP的熒光特征的改變，如Nagai等， PNAS 98(6) 3197(2001)描述的。熒光方法的另一個(gè)實(shí)例是Camgar00探針，其中鈣的結(jié)合與鈣調(diào)蛋白互相作用，所 述鈣調(diào)蛋白引起蛋白構(gòu)象的變化以及來(lái)自黃色熒光蛋白的熒光增加，并且誘導(dǎo)熒光增加 (如在 RUdiger Rudolf,Marco Mongillo,Rosario Rizzuto 和 Tullio Pozzan 的自然綜述 分子細(xì)胞生物學(xué)(NatureReviews Molecular Cell Biology) 4，579-586 中評(píng)論的)。熒光方法的另一個(gè)實(shí)例是嵌合熒光_光蛋白，例如GFP-水母發(fā)光蛋白(諸如 US2003175807)，其中熒光分子與光蛋白共價(jià)連接，并且存在通過(guò)化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移 (CRET)的能量轉(zhuǎn)移。這些實(shí)例用于說(shuō)明蛋白-報(bào)道分子復(fù)合物在離子檢測(cè)中的用途。涉及的蛋白可以 是在結(jié)合特定離子時(shí)結(jié)合或改變構(gòu)象的任意數(shù)量。對(duì)于鈣，這些可以是酪蛋白，集鈣蛋白， calexcitin,鈣結(jié)合半胱氨酸蛋白酶，鈣調(diào)蛋白和其它EF手型蛋白。報(bào)道分子可以是染料 或熒光蛋白或發(fā)光蛋白。所述組合物可以包含結(jié)合分子探針的復(fù)合物，所述分子探針諸如Scorpion探針， Taqman探針，霍利迪連接體或線(xiàn)性探針。離子結(jié)合探針時(shí)可出現(xiàn)熒光或發(fā)光。分子探針的 優(yōu)選實(shí)例是霍利迪連接體。這些是在四股DNA之間形成的活動(dòng)連接體。通常用它們來(lái)檢測(cè) 特定的DNA序列，然而，已知金屬離子通過(guò)結(jié)合到特定部位而在確定連接體的構(gòu)象中起重 要的作用(Thorpe J. H.，Gale B. C.，Teixeria S. C.和 Cardin C. J. (2003)分子生物學(xué)雜 志(.丁 Mol Biol.) 20033月14日；327(1) :97_109)。因此這些連接體可以用于檢測(cè)離子如 鈉，鈣和鍶的存在。許多方法可以一起使用。例如，可用螯合劑來(lái)隔絕一種離子，留下另一種以結(jié)合光 蛋白。因而光蛋白halistaurin結(jié)合鈣和鍶兩者。鍶可能是疾病的好的量度，并且可以在將 光蛋白加入到牙中以前，將會(huì)另外掩蔽存在的鍶的量的鈣隔絕，從而使光蛋白僅響應(yīng)于鍶。 鈣隔絕試劑可以是基于蛋白(鈣調(diào)蛋白，鈣周期蛋白)的或基于化學(xué)品(BAPTA，EGTA)的。 BAPTA(1，2-雙(鄰-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸)是鈣-特定的螯合劑， 且BAPTA基化合物對(duì)于測(cè)量游離的細(xì)胞內(nèi)Ca2+是最通用的。用生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)可以一起使用光蛋白和熒光蛋白，其中從光蛋 白產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)傳遞至緊密接近的熒光蛋白，然后測(cè)量來(lái)自熒光蛋白的熒光。用這樣 的方式，可改變信號(hào)的顏色或增加信號(hào)的持續(xù)時(shí)間以改善成像。與牙齒上的成像熒光染料 有關(guān)的問(wèn)題之一在于經(jīng)常存在下列情況，其中使用高強(qiáng)度光源不實(shí)際，原因在于內(nèi)在的牙 齒的高的自-熒光。使用BRET的一個(gè)可能的好處在于，它可以用于在鈣存在的特定區(qū)域 共-定位(co-localised)的熒光探針的激發(fā)。所述組合物可以用于口中分析，例如以檢測(cè)活性齲齒的存在；和口外分析，諸如在 實(shí)驗(yàn)室中用于人工誘導(dǎo)的齲齒的研究，新式牙-友好食物和制劑的開(kāi)發(fā)以及食品腐蝕性的 研究。使用所述組合物的口外分析也可用牙模型如羥基磷灰石模型或釉質(zhì)切片進(jìn)行。例如通過(guò)牙科醫(yī)師和牙齒衛(wèi)生學(xué)家，所述組合物可以用于活性脫礦質(zhì)的早期檢測(cè)，最佳治療的確定，用于隨著時(shí)間的過(guò)去監(jiān)控問(wèn)題或治療，以及識(shí)別可能對(duì)某種牙齒問(wèn)題 敏感(例如磨蝕或過(guò)敏)的個(gè)體；由實(shí)驗(yàn)室研究者用于新產(chǎn)品(例如牙膏，飲料)的開(kāi)發(fā)； 或?yàn)榱思彝プo(hù)理市場(chǎng)而用于活性牙齒疾病的檢測(cè)和評(píng)估(例如以嗽口水或公開(kāi)片劑的形 式)O當(dāng)前沒(méi)有用于活性齲齒檢測(cè)的單一步驟方法?；钚札x齒趨向于產(chǎn)生游離離子，原 因在于持續(xù)的脫礦質(zhì)；無(wú)活性齲齒將產(chǎn)生很少的，若有的話(huà)，游離離子，原因在于沒(méi)有脫礦 質(zhì)。通過(guò)在施用離子-敏感性報(bào)道分子以后測(cè)量光學(xué)信號(hào)輸出可檢測(cè)脫礦質(zhì)，這可以與其 中存在很少或沒(méi)有脫礦質(zhì)的非-活性齲齒對(duì)比。因此，離子-敏感性報(bào)道分子可以提供對(duì)齲齒的活性特性的一次測(cè)量，并消除對(duì) 到牙科醫(yī)師多次就診的需要。離子-敏感性報(bào)道分子也可用于確定個(gè)體對(duì)牙齒疾病如牙齒 磨蝕的敏感性。在該情況下，可將溫和侵蝕溶液如弱酸加入到牙齒，并且牙齒的響應(yīng)將指示 脫礦質(zhì)的程度和將來(lái)遇到與磨蝕有關(guān)的問(wèn)題的可能性，所述響應(yīng)通過(guò)由檢測(cè)組合物發(fā)射的
信號(hào)測(cè)量。用于檢測(cè)活性牙脫礦質(zhì)的方法可任選地包括以下步驟，從牙表面去除唾液，并且 其中適當(dāng)?shù)娜コg斑(如果存在)，然后將待研究的牙表面暴露于如上所述的組合物并檢 測(cè)得到的光學(xué)信號(hào)。所述方法還可以包含下列步驟在用蛋白組合物暴露之前，將牙暴露于敏化溶液， 諸如含糖的或酸性溶液。敏化溶液模仿脫礦質(zhì)的作用，以便檢測(cè)過(guò)敏和磨蝕，并可用來(lái)估計(jì) 具體問(wèn)題的程度。例如，酸性溶液可用來(lái)識(shí)別牙質(zhì)(例如來(lái)自牙磨蝕)或根暴露(例如來(lái)自 后退的牙齦)的區(qū)域。這是因?yàn)檠赖奶貏e部分對(duì)酸性溶液比對(duì)其它部分將響應(yīng)更強(qiáng)烈，且 因此可被識(shí)別。例如，原因在于質(zhì)和牙骨質(zhì)內(nèi)較低的礦化程度，因此和釉質(zhì)對(duì)比，敏化溶液 的添加將導(dǎo)致從牙質(zhì)和牙骨質(zhì)比從釉質(zhì)釋放更多的鈣。在施用離子_敏感性報(bào)道分子時(shí)， 牙質(zhì)區(qū)域(相當(dāng)于牙質(zhì)磨蝕或過(guò)敏的區(qū)域)將比釉質(zhì)區(qū)域更明亮，即具有更強(qiáng)的光學(xué)信號(hào)， 如此指示問(wèn)題的程度。這可以改善結(jié)果的準(zhǔn)確度。敏化溶液也可以用于估計(jì)個(gè)體對(duì)于特別狀態(tài)的敏感性。那些對(duì)牙磨蝕更敏感的個(gè) 體將顯示更多脫礦質(zhì)且因此顯示更大的響應(yīng)。在評(píng)價(jià)對(duì)牙齒磨蝕敏感性中，釉質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu) 成相比于唾液不重要。在確定個(gè)體的磨蝕敏感性中，唾液組合物，體積，組成和流動(dòng)給予重 要的作用。本發(fā)明的技術(shù)可能能夠確定牙釉質(zhì)對(duì)酸挑戰(zhàn)的耐受性，包括通過(guò)個(gè)體唾液(特 別是唾液表膜)提供的保護(hù)。這種定量測(cè)試可能有益于牙科醫(yī)師和牙齒衛(wèi)生學(xué)家確定患者 敏感性并且監(jiān)控治療，且有益于牙膏開(kāi)發(fā)商和食品科學(xué)家，他們要了解對(duì)于制劑在脫礦質(zhì) 水平上有什么效果改變。另外，所述測(cè)試將在促進(jìn)新的磨蝕預(yù)防涂層中有用。因此，用于歸 因于磨蝕的脫礦質(zhì)測(cè)試的備選方案可包括等待一段時(shí)間以后，例如暴露于侵蝕溶液小于1， 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29 或30秒鐘后，以致唾液在口中增強(qiáng)，然后用檢測(cè)組成測(cè)試脫礦質(zhì)的程度。為了唾液再次增 強(qiáng)，可將所述的時(shí)期根據(jù)需要延長(zhǎng)高達(dá)1，2或5分鐘。可用分光光度計(jì)，電荷耦合裝置(CXD)，互補(bǔ)金屬-氧化物半導(dǎo)體(CMOS)，數(shù)字照 相機(jī)，增強(qiáng)照相機(jī)，照相軟片，光纖裝置，光度檢測(cè)器，光電倍增器，微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)或在 視覺(jué)上通過(guò)眼檢測(cè)得到的光學(xué)信號(hào)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室測(cè)試，例如在牙-友好飲料的開(kāi)發(fā)過(guò)程中， 為了樣品的自動(dòng)化和高檢測(cè)量，所述方法可以使用照相機(jī)，發(fā)光計(jì)或熒光計(jì)。
可使用軟件來(lái)分析光的強(qiáng)度，光的位置和產(chǎn)生的光的持續(xù)時(shí)間。它可用于增強(qiáng)信 號(hào)并在牙齒圖像上提供“疊加的”覆蓋(overlay)，以使牙科醫(yī)師能夠精確地定位部位，并且 幫助監(jiān)控實(shí)時(shí)的或在治療后的改變。因而，本發(fā)明通過(guò)確定游離鈣的量，還容許評(píng)價(jià)進(jìn)一步磨蝕的可能性，以及牙質(zhì)過(guò) 敏(通過(guò)脫礦質(zhì)引起暴露的牙本質(zhì)小管進(jìn)一步的張開(kāi))。因而，所述方法容許對(duì)牙磨蝕更敏 感的患者以及過(guò)敏性牙的鑒定。這將容許易于磨蝕的那些個(gè)體采取預(yù)防性措施，并且也可 以容許實(shí)驗(yàn)室_基試驗(yàn)研究新的用于過(guò)敏的牙膏，或分析關(guān)于其牙_腐蝕性質(zhì)的食品或飲 料廣品。使用基于圖像的發(fā)光技術(shù)和離子-敏感性蛋白即水母發(fā)光蛋白進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。使 用提取的人齒進(jìn)行全部工作。在口中，可以使用多種應(yīng)用的方法。例如，可以存在用于所述 公開(kāi)的組合物的載體裝置。這可以是口模如牙盤(pán)。使用載體裝置的優(yōu)點(diǎn)是，它保持唾液遠(yuǎn) 離牙和所述公開(kāi)組合物。所述盤(pán)可以是非-定制的，即僅具有與人口近似的形狀和尺寸，或 定制的，即使用人齒作為模板來(lái)制造所述盤(pán)。所述盤(pán)將作為所述公開(kāi)組合物和所述檢測(cè)器 之間的界面。優(yōu)選地，所述載體裝置是光學(xué)清晰的?？梢詫⑺龉_(kāi)組合物在放入患者口 中以前加入到載體裝置，或當(dāng)載體裝置在口中時(shí)將所述公開(kāi)組合物注入載體裝置中。備選 地，可以使用所述公開(kāi)組合物的條(strip)。這將與現(xiàn)有技術(shù)中已知的牙漂白條類(lèi)似，可將 其用于所關(guān)心的區(qū)域。常規(guī)漂白條包含涂有中等粘度的牙齒漂白凝膠的柔性塑料條，且在 面對(duì)使用者牙齒的所述條的一側(cè)具有相對(duì)低的粘合性。備選地，可以將所述組合物噴在牙 齒上或施用在嗽口水中。水母發(fā)光蛋白溶液制備如下。用原始來(lái)自維多利亞多管水母(AequoreaVictoria) 的基因序列在大腸桿菌中表達(dá)重組水母發(fā)光蛋白，與底物腔腸素復(fù)合，并且凍干。所述干備 料包含在甘露糖醇(Prolume(RTM))中約1重量％的水母發(fā)光蛋白。為了制造用于施用到 牙齒的工作水母發(fā)光蛋白溶液，將干原料水母發(fā)光蛋白制劑在無(wú)鈣凈化水中以lmg/ml w/v 的濃度溶解。備選地，在具有ImM EDTA的Akucell 3625凝膠中制備lmg/ml w/v的水 母發(fā)光蛋白。當(dāng)將鈣離子加入到此水母發(fā)光蛋白溶液或凝膠中，發(fā)射藍(lán)光的閃光(flash)。將樣品放置在高度-可調(diào)臺(tái)上的暗箱中，且使用低光電荷耦合裝置或CXD (裝有 Tamron (RTM)超近攝鏡頭的Starlight Xpress HX-9 (RTM)熱電冷卻CCD照相機(jī))記錄圖 像。大多數(shù)情況下，2x2的硬件像素融合(binning)用于增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏性且減少暴露時(shí) 間。將圖像保存為T(mén)IF文件。當(dāng)暗箱門(mén)打開(kāi)從而允許環(huán)境的光照射樣品時(shí)，捕獲日光圖像， 且用10/10(^秒曝光并2x2貯存。隨著所述暗箱的門(mén)關(guān)閉，取得黑色圖像，并用1或2分鐘 曝光時(shí)間，用2x2像素融合。在Image J中將灰度(256水平)圖像打開(kāi)，并且(如果必要)在將所述圖像插入 至Microsoft Word(RTM)文件以前，調(diào)整對(duì)比度以增強(qiáng)圖像的清晰度。對(duì)于相同實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生 的圖像，對(duì)每個(gè)圖像進(jìn)行相同的調(diào)整。得到的圖像可用于繪制相應(yīng)于樣品上的鈣的存在的 發(fā)光。所述最黑的區(qū)域(黑的)指示最低的光的區(qū)域而較亮的區(qū)域(白的)指示增加了光 的區(qū)域。實(shí)驗(yàn)A 使用酸性凝膠的牙齒脫礦質(zhì)將工業(yè)中為了模仿實(shí)驗(yàn)室中的活性齲齒的產(chǎn)生而使用的標(biāo)準(zhǔn)方法用于使用酸性 溶液或凝膠產(chǎn)生脫礦質(zhì)的區(qū)域(例如參考文獻(xiàn)Amaechi等口腔生物學(xué)文集(Arch OralBiol) 1998 ；43 :619_628)。本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)，以確定本發(fā)明人公開(kāi)的材料 是否可用于識(shí)別脫礦質(zhì)的區(qū)域。在pH 4.7或pH 6. 4 (用0. IM乳酸，用5M氫氧化鉀中和)制備羧甲基纖維素(3% w/v Akucell 1985)凝膠。因?yàn)橛再|(zhì)在大約5. 4的臨界pH溶解，因而選擇所述pH范圍。使 用指甲油在提取的前磨牙的平滑表面上產(chǎn)生大約4x 4mm的‘窗口’，圖2。窗口具有類(lèi)似的 大小(因?yàn)橐阎叽缬绊懙V物質(zhì)的損失程度)。將凝膠(PH4. 7或6. 4)施用于窗口且將所 述牙在水合環(huán)境且37°C中溫育5，10，14或21天。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和pH，使用5顆復(fù)制牙齒。 另外，在pH4. 7的任一凝膠中將15顆牙齒溫育14天，評(píng)價(jià)，然后在再評(píng)價(jià)之前，用pH4. 7或 PH6. 4的凝膠再溫育5天。這容許確定是否可以通過(guò)中和凝膠停止脫礦質(zhì)。溫育后，將所述凝膠從具有組織的所述牙表面輕輕地擦去，且用去離子水將表面 清洗。用Sony HX 9照相機(jī)用2x2融合將所述牙成像，且在光中圖像捕獲時(shí)間為10ms。使 用自動(dòng)移液器，將0. 2cm3用ImM EDTA制備的在Akucell 3625凝膠(公開(kāi)凝膠)中的 lmg/cm3水母發(fā)光蛋白轉(zhuǎn)移至牙齒。在黑暗中立即取2x2融合的1分鐘圖像。圖3中顯示了實(shí)例圖像。將圖像的對(duì)比度改變以改善外觀(guān)，且對(duì)所有圖像施用完 全相同的調(diào)整。將Image J用于確定所述窗口內(nèi)區(qū)域的亮度，圖4和5。所述結(jié)果清楚地顯示，相比于用pH 6. 4的凝膠溫育的那些，用pH4. 7的凝膠溫育 的那些牙齒顯示較高水平的光，即游離鈣的釋放和脫礦質(zhì)。此外，與從酸性凝膠轉(zhuǎn)移至酸性 凝膠的牙齒相比，當(dāng)牙齒首先在酸性凝膠中溫育然后轉(zhuǎn)移至中性凝膠時(shí)，光輸出減少。這些結(jié)果提供了穩(wěn)固的證據(jù)，即鈣敏感性光蛋白如水母發(fā)光蛋白可以檢測(cè)脫礦質(zhì) 的區(qū)域。顯著地，僅5天后就可以檢測(cè)脫礦質(zhì)。這早于發(fā)表的文獻(xiàn)中所描述的其它技術(shù)，從 而提供該方法將提供非常早的脫礦質(zhì)的數(shù)據(jù)的證據(jù)。實(shí)驗(yàn)B 備選公開(kāi)材料的使用存在許多可用于通過(guò)確定離子釋放來(lái)識(shí)別脫礦質(zhì)區(qū)域的材料。實(shí)施例A使用光蛋 白水母發(fā)光蛋白。其它材料也可使用。圖6顯示也可以使用螅蛋白(鈣敏感性光蛋白)。將提取的牙在檸檬酸中溫 育2分鐘。已知酸導(dǎo)致釉質(zhì)的脫礦質(zhì)。將牙移去，在去離子水中清洗然后測(cè)定。用Sony HX 9照相機(jī)用2x2融合將所述牙成像，且在光中圖像捕獲時(shí)間為10ms。使用自動(dòng)移液器，將 0. 2cm3用ImM EDTA制備的在Akucell 3625凝膠(公開(kāi)凝膠)中的lmg/cm3的水母發(fā) 光蛋白或50ug/ml的螅蛋白轉(zhuǎn)移至牙齒。在黑暗中立即取2x2融合的1分鐘圖像。為了改 善外觀(guān)，用ImageJ調(diào)整圖像對(duì)比度；對(duì)兩個(gè)圖像都進(jìn)行相同的調(diào)整。圖6A顯示從水母發(fā)光 蛋白凝膠產(chǎn)生的光，且6B顯示從螅蛋白凝膠產(chǎn)生的光。結(jié)果顯示許多不同的報(bào)道分子可也 用于指示游離離子的存在和脫礦質(zhì)。實(shí)驗(yàn)C.根的暴露將提取的牙浸于水母發(fā)光蛋白中，以測(cè)試是否所述牙的所有區(qū)域以同樣方式對(duì)水 母發(fā)光蛋白溶液響應(yīng)。用無(wú)鈣凈化水將所述牙輕輕地刷拭，且將牙放在暗箱中的3cm直徑 的皮氏培養(yǎng)皿中。用所述的C⑶照相機(jī)獲得日光圖像。將5ml的lmg/ml水母發(fā)光蛋白溶液直接吸移到所述牙表面上。直接獲得圖像，用 2分鐘曝光，用2x2融合。然后用液體乳液(CopyDex(RTM))將所述相同牙的根‘掩蔽’，然 后再添加水母發(fā)光蛋白溶液，并且像以前一樣取得圖像。結(jié)果顯示于圖7a和7b中。
圖7a和7b分別是暴露于水母發(fā)光蛋白后的牙的圖像，以及在暴露于水母發(fā)光蛋 白以前用Copydex(RTM)掩蔽的牙的根的圖像。圖7中，較亮區(qū)域(最大的發(fā)光)對(duì)應(yīng)于根， 且在圖7B中，沒(méi)有來(lái)自已經(jīng)被掩蔽的根區(qū)域的光。光輸出稍有不同，原因在于掩蔽后的牙 的再-定向(re-orientation)。箭頭顯示所述牙冠中齲齒的存在，如明顯的為白色斑點(diǎn)，且 通過(guò)牙科臨床醫(yī)生證實(shí)。結(jié)果顯示，所述牙的根與冠相比對(duì)所述水母發(fā)光蛋白反應(yīng)更強(qiáng)烈，指示所述根中 游離鈣的量更高。認(rèn)為這是由于所述根組織(牙質(zhì)和牙骨質(zhì))比所述冠的釉質(zhì)的更低的礦 化。諸如這里所描述的方法，使用水母發(fā)光蛋白的鈣_敏感性測(cè)定可用來(lái)識(shí)別暴露的根組 織，例如作為過(guò)敏性機(jī)構(gòu)研究的一部分。備選地，在添加所述水母發(fā)光蛋白以前，可將根例 如用Copydex(RTM)掩蔽，從而允許在沒(méi)有來(lái)自根干擾的情況下的對(duì)冠的研究。實(shí)驗(yàn)D 牙質(zhì)的暴露也可將公開(kāi)的凝膠或溶液用于檢測(cè)和估計(jì)脫礦質(zhì)的程度和定位，所述的公開(kāi)的凝 膠或溶液識(shí)別由于離子釋放的脫礦質(zhì)，所述脫礦質(zhì)由磨蝕(并且間接地，過(guò)敏)產(chǎn)生。當(dāng)牙的冠變得碎裂-即失去一些釉質(zhì)時(shí)，牙的牙質(zhì)會(huì)暴露。類(lèi)似地，當(dāng)牙齒例如通 過(guò)酸腐蝕時(shí)，可能暴露牙質(zhì)。在此實(shí)驗(yàn)中，將碎裂的牙用于研究用離子-敏感性報(bào)道分子測(cè) 定是否可鑒定暴露的牙質(zhì)。用無(wú)鈣凈化水輕輕地刷拭提取的牙。在所述過(guò)程中一部分釉質(zhì) 碎裂掉，從而暴露出下面的牙質(zhì)。用液體乳液(CopyDex(RTM))將所述牙的根‘掩蔽’。將所 述牙放置在暗箱中的3cm的皮氏培養(yǎng)皿中。獲得日光圖像。將4ml的lmg/ml水母發(fā)光蛋 白溶液直接吸移到所述牙的表面上。在完全黑暗中立即獲得圖像，用2分鐘曝光，用2x2像 素融合。圖8a和8b中顯示了結(jié)果。圖8a是牙的日光圖像，并且圖8b是牙在暴露于水母發(fā)光蛋白后的圖像。圓形區(qū) 域顯示碎片區(qū)域。箭頭指示未完全被CopyDex (RTM)覆蓋的根的區(qū)域。結(jié)果顯示許多光產(chǎn)生于與所述牙剛剛碎裂的區(qū)域接觸的水母發(fā)光蛋白。這顯示暴 露的牙質(zhì)與水母發(fā)光蛋白反應(yīng)以產(chǎn)生光。因此可以將離子-敏感性報(bào)道分子測(cè)定，例如使 用水母發(fā)光蛋白的離子-敏感性報(bào)道分子測(cè)定，用于例如在牙磨蝕以后識(shí)別暴露牙質(zhì)的區(qū) 域。實(shí)驗(yàn)E 空腔識(shí)別由訓(xùn)練的牙科臨床醫(yī)生將提取的牙識(shí)別為具有空腔。用CopyDex(RTM)將所述牙 的根掩蔽。用無(wú)鈣凈化水將所述牙輕輕地刷拭，且將牙放在暗箱中的3cm的皮氏培養(yǎng)皿中。 用C⑶照相機(jī)獲得日光圖像。將5ml的lmg/ml水母發(fā)光蛋白溶液直接吸移到所述牙的表面上。在完全黑暗中 立即獲得圖像，用2分鐘暴露，用2x2像素融合。圖9a至9b和IOa至IOb中顯示了結(jié)果。圖9a至9b是(a)在光中的脫落的(或‘乳’)牙的圖像，且(b)是單色圖像。隨 后處理以黑色顯示的較低光的圖像區(qū)域，用灰色和白色指示增加光的區(qū)域。箭頭顯示由牙 科臨床醫(yī)生識(shí)別的空腔。圖IOa至IOb分別是在光中的恒牙的圖像以及單色圖像。隨后處理以黑色顯示的 較低光的圖像區(qū)域，用灰色和白色指示增強(qiáng)的光的區(qū)域。箭頭顯示由牙科臨床醫(yī)生識(shí)別的空腔。根據(jù)本發(fā)明的組合物通過(guò)發(fā)射光對(duì)游離離子響應(yīng)，并且所述光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度是存在的游離離子的數(shù)量的量度。所述發(fā)射光的持續(xù)時(shí)間顯示所述釋放離子的特性，例如較長(zhǎng)的 發(fā)光可顯示離子的連續(xù)釋放或來(lái)自更深組織的離子釋放。所述牙的不同部分對(duì)由于存在的 游離離子的化學(xué)性質(zhì)的離子-敏感性蛋白的響應(yīng)不同，例如歸因于礦化的量，牙質(zhì)響應(yīng)多 于釉質(zhì)。這可用于識(shí)別牙活性齲齒，活性的磨蝕，牙齦退回以后暴露的牙質(zhì)，等等。所述光學(xué)信號(hào)的位置將顯示所述問(wèn)題如所述活性齲齒的位置。光的表面積的尺寸 顯示問(wèn)題的程度，所述問(wèn)題例如為活性齲齒的表面積。所述發(fā)光的持續(xù)時(shí)間可以顯示所述 問(wèn)題的程度，所述問(wèn)題例如為酸_挑戰(zhàn)的影響程度(即牙/患者對(duì)齲齒或磨蝕的個(gè)體敏感 性)或受影響組織的類(lèi)型。通過(guò)產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)的強(qiáng)度，持續(xù)時(shí)間或顏色，可將活性齲齒與 無(wú)活性齲齒區(qū)別。在活性齲齒中，脫礦質(zhì)是連續(xù)的，因此存在更多鈣且產(chǎn)生更多信號(hào)。完全 的無(wú)活性損害將僅產(chǎn)生‘背景’信號(hào)水平。部分活性損害將顯示活性和無(wú)活性的區(qū)域，即具 有信號(hào)的區(qū)域和無(wú)信號(hào)的區(qū)域。因而，用離子_敏感性復(fù)合物，可在臨床可見(jiàn)齲齒損害形成之前檢測(cè)脫礦質(zhì)的區(qū) 域，從而可以應(yīng)用治療如氟化物施用，以防止衰減過(guò)程的進(jìn)一步發(fā)展。實(shí)驗(yàn)F 齲齒識(shí)別I使用酸性溶液，可將實(shí)驗(yàn)室研究用于產(chǎn)生人造齲齒。優(yōu)選地，將自口提取且具有齲 齒的牙齒用來(lái)測(cè)試所述方法。這些將具有自然產(chǎn)生的齲齒，且提供較好的口中牙齒模仿。在明亮的光下識(shí)別‘白色’區(qū)域后，由經(jīng)訓(xùn)練的牙齒臨床醫(yī)生識(shí)別提取的牙具有齲 齒。這指示了脫礦質(zhì)的區(qū)域并且是識(shí)別齲齒的傳統(tǒng)方法。用CopyDex(RTM)將所述牙的根掩蔽。用無(wú)鈣凈化水將所述牙輕輕地刷拭，且將牙 放在暗箱中的3cm的皮氏培養(yǎng)皿中。用CXD照相機(jī)獲得日光圖像。將5ml的lmg/ml水母發(fā)光蛋白溶液直接吸移到所述牙的表面上。在完全黑暗中 立即獲得圖像，用2分鐘暴露，用2x2像素融合。圖Ila至lib分別是牙在光中的日光圖像以及灰度圖像。隨后處理圖像，以黑色 顯示的較低光的區(qū)域，用灰色和白色指示增強(qiáng)的光的區(qū)域。箭頭顯示由牙科臨床醫(yī)生用傳 統(tǒng)方法識(shí)別的齲齒。如圖像顯示，由經(jīng)訓(xùn)練的牙科臨床醫(yī)生識(shí)別為是齲齒損害的‘白色’區(qū)域(當(dāng)提取 所述牙時(shí)，是活性的)被識(shí)別為是水母發(fā)光蛋白測(cè)定中的明亮區(qū)域。這顯示所述水母發(fā)光 蛋白測(cè)定可以取代傳統(tǒng)的‘憑視覺(jué)’的方法。實(shí)驗(yàn)G 剛剛提取的牙齒的齲齒識(shí)別，評(píng)估將出于正牙學(xué)或其它的原因提取的牙齒在提取后立即獲得。沒(méi)有獲得患者信息， 雖然牙科醫(yī)師預(yù)測(cè)一些牙齒由于年齡(用于未成年人的臨床)和牙齒病癥而具有活性齲 齒。提取后立即用去離子水清洗牙齒以除去一些粘附的血液和生物物質(zhì)。用公開(kāi)的凝膠立 即測(cè)定所述牙齒。通過(guò)比較來(lái)自刷拭和不刷拭的具有成穴損害的牙齒的光輸出，確定在去離子中刷 拭提取的牙齒的影響；圖12。觀(guān)察到有限的影響并且因此刷拭牙齒的其余部分，因?yàn)楸景l(fā) 明人認(rèn)為該方法最好地模仿了當(dāng)訪(fǎng)問(wèn)牙科醫(yī)師時(shí)患者的行動(dòng)。牙科醫(yī)師評(píng)價(jià)牙齒的齲齒損害且用鉛筆標(biāo)記看來(lái)像在牙的哪一側(cè)。將該側(cè)在皮氏 培養(yǎng)皿中放置在最上，并用Sony HX 9照相機(jī)用2x2融合成像，且在光中圖像捕獲時(shí)間為 10ms。使用自動(dòng)移液器，將0. 2cm3用ImMEDTA制備的在1 % Akucell 3625凝膠(公開(kāi)凝膠)中的lmg/cm3的水母發(fā)光蛋白轉(zhuǎn)移至牙齒。在黑暗中立即取2x2融合的1分鐘圖像。盡管在沒(méi)有圖像修飾情況下的差異也是容易可見(jiàn)的，也將Image J用于改變圖像 的對(duì)比度，其處理是為了較好地呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。較低的光區(qū)域呈現(xiàn)黑色，用灰色和白色指示增強(qiáng) 的光的區(qū)域。圖13-16中顯示了結(jié)果。然后對(duì)牙齒施加X(jué)-射線(xiàn)，以確定是否在所述光蛋白測(cè)定中識(shí)別的活性脫礦質(zhì)區(qū) 域通過(guò)傳統(tǒng)方法是可見(jiàn)的。盡管χ-射線(xiàn)用于監(jiān)控?fù)p害發(fā)展，但用所述公開(kāi)凝膠檢測(cè)的齲齒 通過(guò)X-射線(xiàn)不可見(jiàn)，圖17。這顯示了該方法用于齲齒損害的早期識(shí)別的有效性。實(shí)驗(yàn)H 干擾的評(píng)估研究其它產(chǎn)品如牙膏的潛在干擾，原因在于如果響應(yīng)于這些而產(chǎn)生光，則該測(cè)定 對(duì)于口中使用可能有問(wèn)題。唾液將提取的牙齒在去離子水或唾液(匯聚自8個(gè)個(gè)體)中清洗。在添加公開(kāi) 的溶液以前，用Sony HX 9照相機(jī)用2x2融合且在光中捕獲時(shí)間為IOms將所述牙齒成像。 然后添加5cm3的lmg/ml去離子水中的水母發(fā)光蛋白(公開(kāi)溶液)且在黑暗中成像2分鐘， 2x2融合。將牙齒或者在唾液中、或者從唾液中移去或在去離子水中移去并且清洗的情況下 成像，圖18。結(jié)果顯示唾液含有顯著量的鈣。然而，只要牙不在大量的唾液中，不會(huì)干擾分 析。即使在口中，大量的唾液將最少，因此不預(yù)期唾液對(duì)于分析是個(gè)問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)H2-結(jié)石在牙齒治療的過(guò)程中，通過(guò)從牙齒上敲擊獲得結(jié)石，且作為懸浮在水中的薄片提 供結(jié)石。將齦下的和齦上的兩者都評(píng)價(jià)。在使用以前，將樣品在真空下用Millipore膜過(guò) 濾器和固定器將樣品過(guò)濾，并且用去離子水洗滌。添加5cm3的去離子水中的lmg/ml水母 發(fā)光蛋白，且將樣品成像1分鐘，2x2融合。圖19a和19b。用ImageJ調(diào)整對(duì)比度以改善外 觀(guān)，將相同的調(diào)整應(yīng)用于兩個(gè)樣品。也研究原位結(jié)石的影響。添加5cm3的去離子水中的lmg/ml水母發(fā)光蛋白，且將 樣品成像2分鐘，2x2融合，圖20。實(shí)驗(yàn)H3-樹(shù)脂填充物評(píng)價(jià)具有樹(shù)脂填充物的牙。用Sony HX 9照相機(jī)用2x2融合將所述牙成像，且在 光中圖像捕獲時(shí)間為10ms。將0. 2cm3用ImM EDTA制備的在Akucell 3625凝膠(公 開(kāi)凝膠)中的lmg/cm3的水母發(fā)光蛋白轉(zhuǎn)移至牙齒。在黑暗中立即取2x2融合的1分鐘圖 像，圖21。結(jié)果顯示獲得少量的光，但是可能過(guò)低而干擾所述測(cè)定。實(shí)際上，牙上光較低的區(qū) 域可以提供結(jié)石存在的指示。實(shí)驗(yàn)H4-牙膏。在對(duì)牙齒用2cm3的去離子水中的lmg/cm3水母發(fā)光蛋白評(píng)價(jià)以前，用去離子水，或 牙膏和去離子水刷拭牙齒。與對(duì)照相比，沒(méi)有來(lái)自牙膏_處理的表面的額外的光可見(jiàn)，從而 指示牙膏不應(yīng)當(dāng)干擾所述測(cè)定(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)驗(yàn)I 牙齒磨蝕和過(guò)敏碳酸軟飲料含有高水平的酸且已知是牙磨蝕的原因并可以加重牙質(zhì)過(guò)敏。將許多 提取的牙齒在這些飲料中溫育，且將水母發(fā)光蛋白用于估計(jì)它們的影響。進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)的目 的在于，開(kāi)發(fā)用于牙齒磨蝕(且間接地，過(guò)敏)的測(cè)定或識(shí)別可感者個(gè)體的方法。
用無(wú)鈣凈化水和牙刷輕輕地刷拭提取的牙齒，并將提取的牙齒放置在暗箱中的 3cm的皮氏培養(yǎng)皿中。用C⑶照相機(jī)獲得日光圖像。將5ml的lmg/ml水母發(fā)光蛋白溶液直 接吸移到所述牙的表面上。在黑暗中立即獲得圖像，用2分鐘曝光，用2x2像素融合。然后將所述牙齒用無(wú)鈣凈化水清洗，之后浸于可樂(lè)，Irn Bru (RTM)或1 %檸檬酸中 10分鐘。然后用無(wú)鈣凈化水漂洗牙齒，之后添加5ml水母發(fā)光蛋白溶液，且將所述牙齒如前 成像。也評(píng)價(jià)所述溶液的PH(用Hydrus 300pH計(jì)(RTM))。全部是酸性的=Cola :ρΗ2· 38 ； Irn Bru (RTM) ρΗ2. 82 ；檸檬酸 ρΗ2. 17。圖 22a 至 22c，23a 至 23c 和 24a 至 24c 顯示了結(jié)果。圖22a至22c示例了浸沒(méi)在可樂(lè)中10分鐘的影響。圖22a是沒(méi)有添加水母發(fā)光 蛋白的牙的日光圖像；圖22b是添加水母發(fā)光蛋白后在黑暗中的牙的圖像，沒(méi)有任何其它 處理；而圖22c是添加水母發(fā)光蛋白后且接著在可樂(lè)中溫育10分鐘后，在黑暗中的牙的圖 像。圖23a至23c示例了在Irn Bru (RTM)中浸沒(méi)10分鐘的影響。圖23a是沒(méi)有添加 水母發(fā)光蛋白的牙的日光圖像；圖23b是添加水母發(fā)光蛋白后在黑暗中的牙的圖像，沒(méi)有 任何其它處理；且圖23c是添加水母發(fā)光蛋白后且接著在Irn Bru(RTM)中溫育10分鐘后， 在黑暗中的牙的圖像。圖24a至24c示例了在檸檬酸中浸沒(méi)10分鐘的影響。圖24a是沒(méi)有添加水母 發(fā)光蛋白的日光圖像；圖24b是添加水母發(fā)光蛋白后在黑暗中的牙的圖像，沒(méi)有任何其它 處理；且圖24c是添加水母發(fā)光蛋白后接著在檸檬酸中溫育10分鐘后，在黑暗中的牙 的圖像。已知飲用碳酸飲料導(dǎo)致牙磨蝕。本文中的結(jié)果顯示，在用含糖的碳酸飲料或酸性 溶液溫育后，從牙齒釋放可用水母發(fā)光蛋白檢測(cè)的游離鈣。這些在根上是最顯著的。因此， 可將離子-敏感性蛋白如水母發(fā)光蛋白用于指示鈣釋放的區(qū)域，并且因此顯示脫礦質(zhì)的區(qū) 域以及隨后的牙損傷如磨蝕或增加的過(guò)敏可能性。在過(guò)敏性牙齒中，牙質(zhì)有更多小管在牙質(zhì)表面打開(kāi)(高達(dá)8倍)且所述小管直徑 更寬。這為如通過(guò)酸性飲料的脫礦質(zhì)提供了較大的可獲得的表面積，且也將引起在施用這 種產(chǎn)品以后更多鈣的釋放。這將被觀(guān)察為較亮區(qū)域，如圖22至24所看到的。實(shí)驗(yàn)J 酸侵蝕的牙齒將牙齒蝕刻凝膠用于將牙表面變粗糙，從而例如可將裂隙密封劑穩(wěn)固地附著。所 述蝕刻凝膠是酸性制劑，所述酸性制劑在局部區(qū)域中蝕刻至有限深度。用無(wú)鈣凈化水和牙刷輕輕地刷拭提取的牙齒。將小的(4x4mm)標(biāo)簽應(yīng)用于牙，并 且通過(guò)在標(biāo)簽的整個(gè)區(qū)域上并且包裹牙表面涂布指甲油，將其固定在適當(dāng)位置。容許其干 燥，然后將所述標(biāo)記剝離，得到由指甲油包圍的4x4mm的暴露區(qū)域。這限制了施用牙齒蝕刻 凝膠(Ultradent Products Inc)的區(qū)域。蝕刻凝膠被保留5分鐘，然后用棉拭子擦去，并 且用潮濕的脫脂棉拭子清洗掉。將5ml的lmg/ml水母發(fā)光蛋白溶液直接吸移到所述牙的表面上。在完全黑暗中 立即獲得圖像，用2分鐘曝光，用2x2像素融合。然后立即獲得第二個(gè)圖像，用2分鐘曝光。 圖25a至25c中顯示了結(jié)果。圖25a至25c是日光圖像，沒(méi)有添加水母發(fā)光蛋白；添加水母發(fā)光蛋白后的單色 圖像，用2分鐘曝光；和添加水母發(fā)光蛋白后的單色圖像，用連續(xù)的2分鐘曝光。左側(cè)箭頭指示了指甲油，星號(hào)指示了施用所述蝕刻凝膠的區(qū)域。當(dāng)將水母發(fā)光蛋白加入到已經(jīng)被牙齒蝕刻凝膠侵蝕的牙時(shí)，存在通過(guò)眼可見(jiàn)的光 的明亮閃光。相比第一次曝光，第二次曝光導(dǎo)致較少光發(fā)射。這顯示凝膠僅從限部區(qū)域釋 放鈣，這對(duì)于對(duì)水母發(fā)光蛋白的反應(yīng)直接有效，因此所述閃光具有很少的用于將光輸出延 長(zhǎng)的‘表面下的’鈣釋放。這不像用檸檬酸觀(guān)察到的影響，其中光輸出持續(xù)一些時(shí)間。如圖26a至26d中所 示，用第二次圖像，5min曝光，并且在添加所述水母發(fā)光蛋白后15分鐘獲得，進(jìn)行如實(shí)驗(yàn)E 中描寫(xiě)的方法。看來(lái)檸檬酸引起更廣泛的脫礦質(zhì)。圖26a至26d示例了在檸檬酸中浸沒(méi)10分鐘的影響。圖26a是日光圖像，沒(méi) 有添加水母發(fā)光蛋白；圖26b是添加水母發(fā)光蛋白后在黑暗中的牙的圖像，沒(méi)有任何附加 處理；圖26c是添加水母發(fā)光蛋白后且在檸檬酸中溫育10分鐘之后，在黑暗中牙的圖 像，添加水母發(fā)光蛋白后2分鐘曝光直接取得；圖26d是添加水母發(fā)光蛋白后且在檸檬 酸中溫育10分鐘之后，在黑暗中的牙的圖像，添加水母發(fā)光蛋白15分鐘后5分鐘曝光直接 取得。實(shí)驗(yàn)K 患者對(duì)磨飩敏感件的評(píng)估不同人對(duì)磨蝕和過(guò)敏具有不同的敏感性。已知這部分地在于諸如氟中毒的治療和 牙齒的定位，盡管一般地認(rèn)為影響牙齒磨蝕預(yù)防的最重要因素是唾液(流速，組成，緩沖和 再礦化能力)。所述公開(kāi)的組合物可用來(lái)識(shí)別脫礦質(zhì)的水平，所述脫礦質(zhì)是由患者通過(guò)在酸性溶 液中首先漂洗牙齒的酸磨蝕所引起的。這將提供關(guān)于牙本身對(duì)于磨蝕的敏感性信息。進(jìn)一 步地，通過(guò)對(duì)所述牙齒添加唾液后再估價(jià)光輸出，可以確定個(gè)體患者的唾液的作用?？稍谔?取的牙齒上或在所述口中進(jìn)行所述的測(cè)定。為了評(píng)價(jià)脫礦質(zhì)，用SonyHX9照相機(jī)用2x2融合，且在光中圖像捕獲時(shí)間10ms，將 所述牙成像。使用自動(dòng)移液器，將0. 2cm3用ImM EDTA制備的在1 % Akucell 3625凝膠(公 開(kāi)凝膠)中的lmg/cm3的水母發(fā)光蛋白轉(zhuǎn)移至牙齒。用2x2融合，在黑暗中立即取1分鐘圖 像。將ImageJ用于確定冠和根區(qū)域的亮度。包括Glowell (藍(lán)色G2，96孔格式)，以保證 光測(cè)量裝備的一致性。重要的是，所述水母發(fā)光蛋白對(duì)PH不敏感，且跨越大的pH范圍的光 輸出類(lèi)似。將提取牙齒如上評(píng)價(jià)(三重測(cè)定)。將牙齒在檸檬酸中溫育2分鐘，移去， 在去離子水中清洗，評(píng)價(jià)，然后在去離子水或者唾液中溫育30s然后再評(píng)價(jià)。圖27a和27b顯示所述唾液對(duì)酸-處理的釉質(zhì)如何比去離子水有更大的保護(hù)作 用，從而導(dǎo)致光輸出更大的減少。在根表面上觀(guān)察到較少差異。與提供用于所述測(cè)定定量特 性的證據(jù)的實(shí)驗(yàn)L 一起，此實(shí)驗(yàn)提示的是，類(lèi)似的測(cè)定將提供確定患者對(duì)磨蝕敏感性的方 法，其中所述類(lèi)似的測(cè)定用酸性溶液將患者的牙齒清洗，用脫礦質(zhì)公開(kāi)溶液對(duì)光輸出評(píng)價(jià)， 且通過(guò)接觸唾液后再估價(jià)來(lái)確定唾液的保護(hù)影響。這將在臨床診斷，決定適當(dāng)?shù)闹委?，以?在為生活方式如何影響患者的牙齒提供證據(jù)中有用。實(shí)驗(yàn)L 食品腐蝕性的評(píng)估已知不同的食品導(dǎo)致不同的磨蝕水平(例如Hemingway等，英國(guó)牙齒雜志 (British Dental Journal) (2006) ；201，439)。這部分在于由于食品的pH并且部分在于鈣 濃度。例如，碳酸軟飲料含有高水平的酸，且已知是牙磨蝕的原因且可以加重牙質(zhì)過(guò)敏。
可將所述公開(kāi)的溶液和測(cè)定法用來(lái)開(kāi)發(fā)對(duì)于牙齒磨蝕的測(cè)定(且間接，過(guò)敏)。這 可用來(lái)識(shí)別由食品所引起的脫礦質(zhì)程度，如此證明食物的危險(xiǎn)因素。也可將其用于確定消 費(fèi)者和諸如牙膏，嗽口水，密封劑，漂白試劑的臨床產(chǎn)品的有效性。也可將其用于食品的開(kāi) 發(fā)和鑒定，所述食品導(dǎo)致較少脫礦質(zhì)且因此對(duì)牙齒較好。在過(guò)敏性牙齒中，牙質(zhì)有更多小管在牙質(zhì)表面打開(kāi)(高達(dá)8倍)且所述小管直徑 更寬。這為例如通過(guò)酸性飲料的脫礦質(zhì)提供了更大的可獲得的表面積，且也將引起繼施用 這種產(chǎn)品后更多鈣的釋放。這將作為較明亮的區(qū)域被觀(guān)察?？缭教崛〉拿撀溲例X，將管道用指甲油畫(huà)好以限定冠和根表面。將提取的牙齒在 不同PH的溶液中溫育。這些要么是檸檬酸，碳酸氫鈉，磷酸鹽緩沖鹽水的不同稀釋物，要么 是去離子水。也評(píng)價(jià)所述溶液的PH(用Hydrus 300pH計(jì)(RTM))。溫育2分鐘，溫育后將所 述牙齒移出在去離子水中清洗，然后測(cè)定。在光中，用SonyHX9照相機(jī)用2x2融合且圖像捕 獲時(shí)間10ms，將所述牙成像。使用自動(dòng)移液器，將0. 2cm3用ImM EDTA制備的在1 % Akucell 3625凝膠(公開(kāi)凝膠)中的lmg/cm3的水母發(fā)光蛋白轉(zhuǎn)移至牙齒。在黑暗中立即取2x2融 合的1分鐘圖像。將ImageJ用于確定所述冠和根區(qū)域的亮度。包括Glowell (藍(lán)色G2， 96孔形式)，以保證光測(cè)量裝備的一致性。將實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三重測(cè)定；顯示平均值。圖28示例如通過(guò)亮度測(cè)量，不同pH溶液如何引起不同水平的脫礦質(zhì)，并且較低 PH的溶液產(chǎn)生更多的脫礦質(zhì)(更大亮度)。如所示的，根比冠更敏感，在pH4具有更多脫礦 質(zhì)，其與可獲得的文獻(xiàn)相當(dāng)符合，其顯示釉質(zhì)在臨界PH5. 5脫礦質(zhì)，然而不被釉質(zhì)保護(hù)的根 組織在臨界PH6. 2脫礦質(zhì)。該實(shí)驗(yàn)顯示所述測(cè)定是定量的且可用于評(píng)價(jià)由磨蝕導(dǎo)致的脫礦 質(zhì)。識(shí)別由于離子釋放的脫礦質(zhì)的公開(kāi)的凝膠或溶液，可用于指示牙損傷，諸如磨蝕或增加 的過(guò)敏可能性。圖29示例如何用該公開(kāi)組合物和測(cè)定法確定食品對(duì)牙齒脫礦質(zhì)的影響。測(cè)定法 如所描述的。結(jié)果顯示所述食品的PH對(duì)牙齒有大的影響。此外所述根表面看來(lái)好象對(duì)pH 更敏感。所述結(jié)果不僅依賴(lài)于食物的PH并且看起來(lái)涉及其它因素。因此，飲料可口可樂(lè) (RTM)和ribena really Iight(RTM)少于可能從它們的pH預(yù)期產(chǎn)生的光。公開(kāi)的識(shí)別由于離子釋放的脫礦質(zhì)的凝膠或溶液，當(dāng)將其用于如此的測(cè)定時(shí)，可 將其用于確定不同食品對(duì)牙齒的危險(xiǎn)因素，或作為新式食品以及消費(fèi)者和臨床產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中 的工具，所述消費(fèi)者和臨床產(chǎn)品諸如牙膏，嗽口水，密封劑，漂白劑。其它步驟的加入，諸如 如實(shí)驗(yàn)G所示將唾液洗滌結(jié)合，對(duì)模仿口內(nèi)條件也是有用的。
權(quán)利要求
一種藥物組合物，所述藥物組合物包含能夠?qū)τ坞x離子的存在產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)特征的復(fù)合物。
2.一種用于檢測(cè)由于磨蝕導(dǎo)致的活性齲齒和/或活性牙脫礦質(zhì)的組合物，所述組合物 包含能夠?qū)τ坞x離子存在產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)特征的復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的組合物，其中所述復(fù)合物是染料，合成離子螯合劑如 EDTA-報(bào)道分子復(fù)合物或大環(huán)如冠醚報(bào)道分子復(fù)合物，蛋白或蛋白_報(bào)道分子復(fù)合物，分子 印跡聚合物_報(bào)道分子復(fù)合物或分子探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中至少一種待檢測(cè)的離子選自下列組鈣離子，鎂 離子，磷酸根離子，碳酸根離子，鉀離子，鍶離子，氟離子，銅離子，氯離子，鋅離子，鉛離子， 錫離子，鐵離子或有機(jī)材料如釉蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的組合物，所述組合物還包含藥用添加劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述添加劑是治療活性劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中所述活性劑是殺菌或抑菌試劑。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物還包含藥用賦形劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中所述賦形劑是調(diào)味或著色添加劑。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物是藥用劑型。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其中所述組合物是液體，粉末，可模塑物質(zhì)或凝膠。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含約lng/ml至約IOmg/ ml的復(fù)合物，或提供足夠高的信噪比的濃度。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述復(fù)合物是蛋白或蛋白復(fù)合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述蛋白或蛋白復(fù)合物在結(jié)合游離離子時(shí)經(jīng)歷構(gòu) 象改變，從而導(dǎo)致產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述蛋白或蛋白復(fù)合物包括水母發(fā)光蛋白，螅 蛋白， 丐調(diào)發(fā)光蛋白，mitrocomin, halistaurin,瓶梗蛋白，mnemiopsin, symplectin, gr-bolinopsin,酪蛋白，集鈣蛋白，calexcitin，鈣結(jié)合半胱氨酸蛋白酶，鈣調(diào)蛋白以及其 它的EF手型蛋白瓜水母光蛋白，或它們的混合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述蛋白或蛋白復(fù)合物包括熒光蛋白、鈣調(diào)蛋白 以及鈣調(diào)蛋白_結(jié)合肽(M13)的銜接融合物。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述復(fù)合物在指示離子存在的特征波 長(zhǎng)發(fā)熒光。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含在結(jié)合游離離子時(shí)產(chǎn) 生光學(xué)信號(hào)的復(fù)合物，以及在指示游離離子存在的特征波長(zhǎng)發(fā)熒光的復(fù)合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中將所述蛋白或蛋白復(fù)合物修飾以增強(qiáng)所述信號(hào)或 改變它的發(fā)射光譜。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中通過(guò)改變基因的DNA序列，通過(guò)乙?；?，乙氧基羰 基化，熒光胺-修飾或熒光素標(biāo)記或通過(guò)形成嵌合蛋白而實(shí)現(xiàn)所述蛋白或蛋白復(fù)合物的修 飾。
21.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述蛋白或蛋白復(fù)合物包含重組蛋白。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物是光學(xué)透明的。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中通過(guò)分光光度計(jì)，電荷耦合裝置 (CCD)，互補(bǔ)金屬-氧化物半導(dǎo)體CMOS，數(shù)碼照相機(jī)，增強(qiáng)的照相機(jī)，口內(nèi)照相機(jī)，視頻示波 器，照相軟片，光纖裝置，光度檢測(cè)器，光電倍增器，微-電-機(jī)械性系統(tǒng)(MEMS)或在視覺(jué)上 通過(guò)眼檢測(cè)所述光學(xué)信號(hào)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)的組合物用于制備制劑的用途，所述制劑用于檢測(cè) 齒禹齒。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的組合物在制備用于制備制劑的用途，所述制劑用于區(qū)別活性和 無(wú)活性的齲齒。 根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)的組合物用于制備制劑的用途，所述制劑用于檢測(cè) 由于磨蝕引起的牙脫礦質(zhì)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)的組合物用于制備制劑的用途，所述制劑用于檢測(cè) 與牙質(zhì)過(guò)敏有關(guān)的牙質(zhì)脫礦質(zhì)的部位。
27.一種用于檢測(cè)牙脫礦質(zhì)的方法，所述方法包括將牙暴露于根據(jù)權(quán)利要求1至23中 任一項(xiàng)的組合物，并且檢測(cè)得到的信號(hào)的步驟。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，所述方法還包括標(biāo)記所述牙或牙模型區(qū)域以允許識(shí)別特 定區(qū)域的步驟。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，所述方法還包括在暴露于所述組合物之前，將所述牙暴 露于敏化溶液的步驟。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述敏化溶液包括酸性溶液。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述敏化溶液包括含糖溶液。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中在施用所述敏化溶液和施用權(quán)利要求1-23的所述檢 測(cè)組合物之間，容許過(guò)去一段時(shí)期。
33.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述時(shí)期是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14， 15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29 或 30 秒。
34.根據(jù)權(quán)利要求24至33中任一項(xiàng)的方法，其中借助于分光光度計(jì)，電荷耦合裝置 (CCD)，互補(bǔ)金屬-氧化物半導(dǎo)體CMOS，數(shù)字照相機(jī)，增強(qiáng)照相機(jī)，口內(nèi)照相機(jī)，視頻示波 器，照相軟片，光纖裝置，光度檢測(cè)器，光電倍增器，雪崩光電二極管，光敏陣列，微機(jī)電系統(tǒng) (MEMS)或通過(guò)眼在視覺(jué)上，進(jìn)行檢測(cè)。
35.一種用于檢測(cè)脫礦質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒包括；a)組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的離子-敏感性復(fù)合物；b)用于施用所述組合物的工具，和c)檢測(cè)器。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的試劑盒，所述試劑盒還包括酸性或含糖的敏化溶液。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的試劑盒，所述試劑盒還包括用于在牙或牙模型上標(biāo)記所關(guān)心的 區(qū)域的標(biāo)記物如格柵。全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)牙脫礦質(zhì)的組合物。更具體地，本發(fā)明涉及一種組合物，所述組合物包含能夠?qū)τ坞x離子的存在產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)特征的復(fù)合物，這種組合物的藥物應(yīng)用，以及用于使用這種組合物檢測(cè)在牙表面的活性脫礦質(zhì)的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)A61K49/00GK101951961SQ200780051625
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2007年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日
發(fā)明者克里斯·朗博頓, ?，敗ょ曩M(fèi)克特 申請(qǐng)人:勒克斯創(chuàng)新有限公司;敦提大學(xué)校董事會(huì)