專利名稱：：尿囊素在肉蓯蓉屬植物品種鑒定中的應(yīng)用及其降血脂新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中草藥化學(xué)成分的提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)；并涉及天然尿囊素或尿囊素提取物在護(hù)膚、降血脂等方面的醫(yī)學(xué)用途；本發(fā)明還可應(yīng)用于肉蓯蓉中管花肉蓯蓉粉末與其它肉灰蓉粉末定性區(qū)別。
背景技術(shù)：
：近一、二十年來，國內(nèi)外有關(guān)肉蓯蓉的化學(xué)成分的報(bào)道已有上百篇之多，僅從荒漠肉灰蓉中分得的化合物數(shù)量就達(dá)69個(gè)(劉國鈞主編.肉蓯蓉及其人工種植.中國勞動(dòng)社會(huì)保障出版社，2003.120)，在其它品種的肉蓯蓉中也分離得到40多個(gè)化合物。其中大部分成份與荒漠肉蓯蓉一致，相關(guān)的報(bào)道可見KobayashiH，etal.ChemPharmBull.1984,32(5);1984,32(8);1985,33(9);1987，35(8)等文獻(xiàn)。通過文獻(xiàn)査新，在肉蓯蓉屬植物已報(bào)道的化合物中，未見尿囊素的報(bào)道，所以從肉歡蓉中分離得到的尿囊素是肉灰蓉屬中首次發(fā)現(xiàn)的化合物。尿囊素(Allantoin)，也稱脲基海因(Ureidehydantoin)。它有滋潤皮膚的作用，可增加皮膚角質(zhì)細(xì)胞粘合質(zhì)的吸濕能力，由于能吸收較多的水分，使角質(zhì)蛋白分散、鱗屑松懈、脫落，從而皮膚變得光滑柔軟。此外還具有局麻作用，對不良刺激起到緩和作用，并有促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合作用。臨床上用于皮膚干燥皸裂、皮膚潰瘍、手部皮炎等，也可口服用于胃及十二指腸潰瘍。個(gè)別文獻(xiàn)報(bào)道它還具有緩解癌性腹水的作用。未見尿囊素有降血脂作用的報(bào)道。目前臨床上用的尿囊素均為人工合成品，以純天然提取得到的尿囊素或含有尿囊素的提取物尚未在化妝品或皮膚病治療劑中應(yīng)用。從人工栽培的鹽生肉蓯蓉中尿囊素的含量測定值大約為0.50.8%左右。
發(fā)明內(nèi)容本
發(fā)明內(nèi)容包括用大孔樹脂和活性炭吸附分離天然尿囊素或含尿囊素提取物的方法；所得尿囊素的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)確認(rèn)；含有天然尿囊素提取物高級護(hù)膚霜的制備；尿囊素的降血脂作用；尿囊素在肉灰蓉屬植物化學(xué)分類學(xué)上的應(yīng)用。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不以此限制本發(fā)明。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:以肉灰蓉為原料制備尿囊素提取物或尿囊素鹽生肉蓯蓉G'Wa"c力esaAa(C.A.Mey)G.Beck160g，分別以10倍、8倍量水加熱80'C條件下提取2次，合并提取液，減壓濃縮至稠膏狀(50'C密度約為1.lg/ml)，加乙醇至含醇量60%，靜置過夜，醇液濃縮，加水溶解。水液通過大孔吸附樹脂SP825柱(體積約500ml)，以3倍柱床體積水洗脫，收集其中含尿囊素的流份，再通過顆?；钚蕴?約300g)，先以3倍柱床體積的水洗脫，再用3倍柱床體積30%乙醇洗脫，收集含尿囊素的流份，減壓濃縮至稠膏，再經(jīng)冷凍干燥得尿囊素提取物，用乙醇重結(jié)晶可得無色結(jié)晶狀尿囊素。實(shí)施例2:尿囊素的結(jié)構(gòu)確認(rèn)由實(shí)施例l所得的結(jié)晶，mp243245'C，易溶于水及稀醇，生物堿反應(yīng)呈陽性。IR(KBr)cm—1:3437，3344(NH2);3207，3062(NH);1779，1568(C=0);1602，1528，1430，1183(C-N);MS:158(M+)提示分子結(jié)構(gòu)有偶數(shù)N;!H-,(DMS0-d6)Sppm:5.25(1H，d，J=8.lHz，H_4),5.76(2H，s，H_8),6.86(1H,d,J=8.lHz,H-6)，8.03(1H's,H-3),10.51(1H,s,H-l);13ONMR(DMSO-d6)Sppm:62.6(C-4),156.9(C-2)，157.5(C_7)，173.7(C-5)。與合成的尿囊素同時(shí)進(jìn)樣于HPLC儀中，其保留時(shí)間一致。結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>實(shí)施例3:—種天然尿囊素護(hù)膚霜的配制配方硬脂酸AcidiStearici100克鯨蠟醇CetyliiAlcoholis45克羊毛脂AdepsLarme10克丙二醇GlycolisPropyienici150毫升十二烷基硫酸鈉NatriiLauryiisSulfatis5克三乙醇胺Triaethanol柳ini7克維生素EVitE0.5克天然尿囊素Allantoin10克或尿囊素提取物orAllantoinextract相當(dāng)于10克尿囊素的提取物水溶性香精Esssenlce適量去離子水加至Aquae加至1000克制法1.取硬脂酸、鯨蠟醇、羊毛脂、維生素E置于適當(dāng)?shù)娜萜髦屑訜?08(TC;2.取丙二醇、十二垸基硫酸鈉、三乙醇胺、水溶性香精及水另一適當(dāng)容器中加熱708(TC。二液等溫后，將油液以緩緩細(xì)流加入水液中，隨加隨攪至凝固即得；用途護(hù)膚防裂，緩解皮膚老化。實(shí)施例4:尿囊素在肉蓯蓉屬植物化學(xué)分類學(xué)上的應(yīng)用肉蓯蓉屬植物主要包括管花肉蓯蓉、鹽生肉蓯蓉和荒漠肉蓯蓉。其中管花肉蓯蓉占藥材市場的一半以上，日本厚生省已明文規(guī)定管花肉蓯蓉列入日本的植物健康食品范圍之內(nèi)。應(yīng)用下面方法可區(qū)別管花肉蓯蓉與其它肉蓯蓉。方法分別取管花肉蓯蓉、鹽生肉蓯蓉(或荒漠肉蓯蓉)粉末各0.2克，置25ml量瓶中，加20%甲醇適量超聲提取30分鐘，加20%甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45um)濾過，作為供試品溶液。另取尿囊素對照品lmg，置10ml量瓶中，加20%甲醇溶解并添加至刻度，作為對照品溶液。照高效液相色譜(《中國藥典》2005年版一部，附錄(VID)試驗(yàn)，用十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑(本實(shí)驗(yàn)使用SymmetryShieldRp8色譜柱4.6mmX150ram，5lini)，乙腈-水(1:99)為流動(dòng)相，檢測波長224nm，流速0.5ml/min，柱溫25'C，分別精密吸取供試溶液與對照溶液各5ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。鹽生肉蓯蓉(或荒漠肉蓯蓉)的HPLC色譜圖中，在與對照品尿囊素色譜相應(yīng)的位置上，顯示保留時(shí)間相同的色譜峰，而管花肉蓯蓉供試品的HPLC色譜圖中，無尿囊素對照品峰，提示不含尿囊素的肉蓯蓉可能為管花肉蓯蓉。實(shí)施例5尿囊素的降血脂作用發(fā)明是通過如下方法實(shí)現(xiàn)的酵母雙雜交方法(yeasttwo-hybrid)是近年發(fā)展起來的在細(xì)胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，我們選用Clontech公司得以GAL4為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)m為實(shí)驗(yàn)體系，用占大鼠HDL65W的apoAI及HDL受體SR-BI的全長cDNA構(gòu)建成相應(yīng)的酵母表達(dá)載體，以報(bào)告基因所表達(dá)的P-半乳糖苷酶酶活定量檢測了叩oAI和SR-BI間存在相互作用的強(qiáng)弱，如果某一化合物促進(jìn)了這對蛋白的相互作用，就必定會(huì)提高報(bào)告基因的活性，即檢測到報(bào)告基因活力上升就說明該化合物可能促進(jìn)這對蛋白的相互作用，具有一定的降血脂作用。本發(fā)明報(bào)告以從肉蓯蓉藥材中提取分離得到的天然尿囊素為研究對象，從分子生物學(xué)研究角度出發(fā)，揭示它能增強(qiáng)apoAI與SR-BI之間的相互作用，從而提示尿囊素的降血脂功效。實(shí)驗(yàn)方法1.接種共轉(zhuǎn)化了apo-AI和SR-BI的AH109菌株或交配的二倍體菌株；2.培養(yǎng)基中分別加入待測藥品，在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)；3.測定OD6M判斷藥品的毒性，以不加藥物組分的共轉(zhuǎn)化菌株為空白對照(只有對酵母菌株生長影響不大時(shí)才能用此系統(tǒng)進(jìn)行檢測)。4.P-半乳糖甘酶的活力檢測方法以硝基苯吡喃半乳糖(ONPG)為底物的液體分析法檢測8-半乳糖苷酶的活力可測得含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI質(zhì)粒的酵母菌表達(dá)的P-半乳糖苷酶的活力在20-80U左右。具體方法如下1)在30/-1^11/-丁。/-招3/-八(16液體培養(yǎng)基中加入含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI質(zhì)粒菌斑，在30°C搖動(dòng)(250rpm)24-30h活化菌種。2)取出菌液20-50uI于5mlYPDA培養(yǎng)基混合后3(TC搖動(dòng)(250rpm)16-18h，此時(shí)，OD60o=0.4-1.2。3)取0.5-1.5ml菌液于1.5ml離心管中，離心后，用Z-buffer清洗一次，再離心，棄上清。4)再用O.lmlZ-buffer重懸細(xì)胞。5)在液氮中裂解5次以上。6)加入0.7mlZ-buffer疏基乙醇、0.16mlONPG(4mg/ml)混勻后3(TC保溫記時(shí)至溶液變黃。7)在加入0.4ml1MNa2C03混勻后14000rpm離心10min。s)用上清比色測定OD420值，計(jì)算e-半乳糖苷酶的活力。計(jì)算公式如下e-半乳糖苷酶活力值[1=1000乂OD42C/(tXVXOD,)t-反應(yīng)開始到溶液變黃的時(shí)間V-0.1mlX濃縮因子OD6M=600nm吸光值OD42()=420nm吸光值[l]Miller,J.H.Inashortcourseinbacterialgenetics.Coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor;p74檢測樣品對報(bào)告基因P-半乳糖苷酶的影響，從而判斷它對載脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受體(SR-BI)間存在相互作用的影響。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果—_表le-半乳糖苷酶活力值(x)_<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注空白為不加樣品，加與樣品相同量溶劑。經(jīng)t檢驗(yàn)，尿囊素組在0.052、0.104mg/ml兩個(gè)濃度下，銀杏葉片組在0.396、0.792mg/ml兩個(gè)濃度下，分別與空白組相比，t值均大于4.587，顯示尿囊素組、銀杏葉片組與空白組的P-半乳糖苷酶活力值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，pO.001(U咖,1()=4.587)。測試過程中采用攜帶有大鼠載脂蛋白apo-AI及清道夫受體SR-BI基因質(zhì)粒的酵母菌株AH109-030613為測試菌株，在空白對照中加入了與測試樣溶液等量溶劑以扣除溶劑對大鼠載脂蛋白apo-AI與清道夫受體SR-BI之間相互作用的影響。從表1中的0-半乳糖苷酶活力值可看出，尿囊素在濃度為0.052mg/ml、0.104mg/ml時(shí)，有增強(qiáng)apo-AI與SR-BI之間相互作用的效果，提示有一定的降脂作用。權(quán)利要求1.一種以尿囊素為鑒別試劑，區(qū)別肉蓯蓉屬中管花肉蓯蓉與其它品種的用途。2.—種尿囊素作為活性成分單獨(dú)應(yīng)用或與其它降脂成分聯(lián)合應(yīng)用于降血脂的醫(yī)療或保健制劑中的用途。全文摘要“尿囊素在肉蓯蓉屬植物品種鑒定中的應(yīng)用及其降血脂新用途”運(yùn)用大孔吸附樹脂和顆粒活性炭吸附分離技術(shù)，從肉蓯蓉中提取分離得尿囊素和含有尿囊素的組份，經(jīng)理化數(shù)據(jù)和光譜數(shù)據(jù)分析，確定了它的化學(xué)結(jié)構(gòu)。這是肉蓯蓉屬植物中首次發(fā)現(xiàn)的成分，由于管花肉蓯蓉中不含此成分，所以可用作管花肉蓯蓉與其它肉蓯蓉的特征鑒別；同時(shí)運(yùn)用分子生物學(xué)的酵母雙雜交系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，確定了尿囊素具用降血脂的新醫(yī)療用途。文檔編號(hào)A61K31/416GK101271089SQ20081000914公開日2008年9月24日申請日期2005年5月12日優(yōu)先權(quán)日2005年5月12日發(fā)明者堵年生,楊建華,熱娜·卡斯木申請人:新疆醫(yī)科大學(xué)