專利名稱：：一種防治肝臟損傷的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種防治肝臟損傷的藥物。
背景技術(shù)：
：淫羊藿(EpimediiHerba)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，系小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(Epimediiim)植物，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕的功效。淫羊藿中黃酮醇類化合物具有治療心腦血管疾病、防治骨質(zhì)疏松等藥理活性(裴利寬等，中國(guó)中藥雜志，2007,32(6):466-471)。淫羊藿素(icaritin)是淫羊藿中主要有效成分淫羊藿苷的苷元，屬黃酮醇類化合物，它既是淫羊藿苷經(jīng)化學(xué)處理轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物，同時(shí)也是淫羊藿苷在機(jī)體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物(LiuJetal,JPharmBiomedAnal,2004，36(2):365-370)。淫羊藿素作為一個(gè)化學(xué)分子單體，有關(guān)其藥理作用的報(bào)道目前主要有1、通過(guò)擬雌激素樣作用促進(jìn)細(xì)胞增殖，保護(hù)腦細(xì)胞的毒性損傷(WangZetal，Neuroscience,2007,145(3):911-922);2、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化；3、通過(guò)擬雌激素作用抑制雄性激素依賴的前列腺癌細(xì)胞的增殖分化，從而具有治療前列腺癌的應(yīng)用前景(HuangXetal,EurJPharmacol,2007,564(1-3):26-36)。目前有關(guān)淫羊藿素的前體物質(zhì)淫羊藿總黃酮和淫羊藿苷保護(hù)器官急、慢性損傷及缺血再灌注損傷的文獻(xiàn)較為多見(jiàn)，靶器官主要集中在腦、心臟、腎臟等，但研究均不夠深入。在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M急、慢性損傷及缺血再灌注損傷條件下，淫羊藿總黃酮和淫羊藿苷對(duì)上述器官細(xì)胞具有保護(hù)作用；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，無(wú)論是經(jīng)缺血干預(yù)前的胃詞還是靜脈注射，對(duì)上述損傷器官也都表現(xiàn)出保護(hù)作用。其可能的機(jī)理主要包括下列四個(gè)方面1、擴(kuò)張器官血管，降低血流阻力，增加器官血流量(LiuWJetal,AsianJAndrol,2005，7(4):381-388);2、能調(diào)控多種內(nèi)臟器官的鈣通道，維持細(xì)胞內(nèi)Ca^離子濃度穩(wěn)定和細(xì)胞正常生理功能，在缺氧條件下可阻止缺血再灌注細(xì)胞內(nèi)C^+離子濃度升高(ULetal,ChinMedJ，2005,118(19):1637-1643);3、可提高組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性，增加對(duì)活性氧簇(ROS)的清除，降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度，減少血清脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用(LiuZQ，JPhysChemA,2006，110(19):6372-6378);4、淫羊藿總黃酮對(duì)腎上腺素能受體具有阻斷作用(PanYetal，BiolPharmBull,2006,29(12):2399-2403)。但直至目前，還未見(jiàn)有關(guān)淫羊藿素作為防治肝臟損傷的藥物的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種以淫羊藿素作為有效成分的防治肝臟損傷的藥物。防治肝臟損傷的藥物中也可含有治療有效量的淫羊藿素及可藥用載體和/或賦形劑。所述肝臟損傷包括急、慢性肝損傷，缺氧肝損傷和缺血再灌注肝損傷。本發(fā)明在體外細(xì)胞和小鼠或大鼠體內(nèi)藥理試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)淫羊藿素降低急、慢性肝損傷，缺氧肝損傷及缺血再灌注肝損傷的防治藥效機(jī)制進(jìn)行了論證，提出淫羊藿素可作為防治肝臟損傷藥物的有效成分，提出淫羊藿素可在制備防治急、慢性肝損傷，缺氧肝損傷及缺血再灌注肝損傷藥物中的應(yīng)用。淫羊藿素的制備參考文獻(xiàn)報(bào)道(葉海涌等，浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005,34(2):131-136)。簡(jiǎn)述如下將箭葉淫羊藿磨成粉末，用溶劑萃取，萃取物通過(guò)硅膠柱層析，用溶劑洗脫，可制得淫羊藿素前體淫羊藿苷。再按照下列示意的反應(yīng)路線，將淫羊藿苷通過(guò)水解反應(yīng)制得淫羊藿素。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>淫羊藿苷淫羊藿素淫羊藿素的藥理試驗(yàn)1.體外肝細(xì)胞損傷模型試驗(yàn)a)淫羊藿素對(duì)11202損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用為了證實(shí)淫羊藿素對(duì)&02損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用，用不同濃度的淫羊藿素處理H202損傷的大鼠原代肝細(xì)胞6小時(shí)，用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力(OD值表示)。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，淫羊藿素處理后，各組較對(duì)照組的細(xì)胞活力有明顯提高，淫羊藿素8umol/L組顯示最佳的保護(hù)作用。b)淫羊藿素對(duì)四氯化碳(ccu)損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用為了證實(shí)淫羊藿素對(duì)CCl4損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用，用不同濃度的淫羊藿素處理CCl4損傷的大鼠原代肝細(xì)胞6小時(shí)，然后用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定培養(yǎng)上清液中肝臟損傷的特異性酶學(xué)指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活力。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，隨著淫羊藿素濃度升高，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT和AST活力逐漸降低，在淫羊藿素8"mol/L時(shí)二酶活力最低，約為對(duì)照組的1/3。C)淫羊藿素能抑制缺氧后復(fù)氧肝細(xì)胞內(nèi)活性氧簇生成，具有確定的抗氧化活性為了證實(shí)淫羊藿素對(duì)缺氧損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用，用淫羊藿素處理后，檢測(cè)缺氧后復(fù)氧2小時(shí)大鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)活性氧簇，檢測(cè)圖像結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖像可以看出，淫羊藿素可抑制缺氧后復(fù)氧肝細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的產(chǎn)生，淫羊藿素8umol/L組的效果較為明顯。該試驗(yàn)證實(shí)淫羊藿素是細(xì)胞活性氧的清除劑，通過(guò)抗氧化活性起到保護(hù)細(xì)胞免受缺氧復(fù)氧所致的活性氧損傷。d)淫羊藿素能增強(qiáng)11202損傷肝細(xì)胞的抗凋亡作用用濃度為8umol/L的淫羊藿素處理大鼠原代肝細(xì)胞24小時(shí)，收集后用AnnexinV/FITC熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率，試驗(yàn)結(jié)果圖像見(jiàn)圖4。應(yīng)用淫羊藿素處理后，肝細(xì)胞凋亡細(xì)胞的比率由74%下降到5%，證明淫羊藿素具有增強(qiáng)損傷肝細(xì)胞抗凋亡的活性。e)淫羊藿素能提高損傷肝細(xì)胞的抗炎能力培養(yǎng)的肝細(xì)胞經(jīng)10ng/mlTNF-ct作用16小時(shí)后用不同濃度淫羊藿素處理，采用ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清液中的炎性細(xì)胞因子含量，結(jié)果顯示，TNF-a可誘導(dǎo)大鼠原代肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間粘附分子-l(ICAM-l)和E-選擇素(E-selection)，而淫羊藿素能降低其表達(dá)，表明淫羊藿素具有增強(qiáng)損傷肝細(xì)胞抗炎的活性。2.淫羊藿素能降低小鼠缺血再灌注肝損傷用昆明種小鼠做試驗(yàn)，手術(shù)后缺血90分鐘再灌注6小時(shí)作為抽取血樣的時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定ALT活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著淫羊藿素劑量增加，治療組肝細(xì)胞釋放ALT減少，而ALT越低說(shuō)明肝細(xì)胞損傷越輕。圖5顯示最大保護(hù)濃度為10mg/kg體重，血清ALT活性為1820U/L，與缺血再灌注損傷組相比有明顯降低。此外還進(jìn)行了下列試驗(yàn)淫羊藿素在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)口飼給藥的淫羊藿素在4個(gè)昆明種小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明淫羊藿素能在體內(nèi)保持一定的藥物濃度，有利于防治肝臟損傷的效果。給藥后淫羊藿素對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)受試小鼠處死后進(jìn)行病理分析，結(jié)果顯示，以單次劑量1000mg/kg體重和多次劑量200mg/kg體重(Q2天X15)給予淫羊藿素，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長(zhǎng)良好，無(wú)一死亡。由以上藥理試驗(yàn)的效果證明，來(lái)源于天然物質(zhì)中草藥箭葉淫羊藿的淫羊藿素對(duì)受損傷的肝細(xì)胞具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的活性及保護(hù)作用，淫羊藿素對(duì)急、慢性肝損傷，缺氧肝損傷及肝臟缺血再灌注損傷所產(chǎn)生的活性氧簇、細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞因子釋放具有明顯的抑制作用。淫羊藿素是一個(gè)有效的抗氧化劑，能通過(guò)抑制活性氧簇生成降低對(duì)肝細(xì)胞的損傷；淫羊藿素通過(guò)擬雌激素樣作用降低肝細(xì)胞的凋亡；應(yīng)用淫羊藿素處理肝臟缺血再灌注損傷的昆明小鼠，試驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組血清ALT水平較對(duì)照組明顯降低。此外，淫羊藿素對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果也未顯示毒性，所有受試小鼠生長(zhǎng)良好，無(wú)一死亡。因此淫羊藿素是一種有效的具有很大開發(fā)前景的防治急、慢性肝損傷，缺氧肝損傷及缺血再灌注肝損傷的新藥，在臨床應(yīng)用淫羊藿素保護(hù)肝臟損傷的范疇主要包括甲、乙、丙型肝炎病毒對(duì)肝臟的炎癥損傷，抗腫瘤化療藥物對(duì)肝臟的毒性損傷，藥物過(guò)量及誤服毒性物質(zhì)所引起的肝臟急性損傷，肝葉切除術(shù)中肝血流阻斷對(duì)殘肝的缺血再灌注損傷，以及在肝移植供體保存所致冷缺血損傷及熱缺血灌注損傷。防治藥物中也可含有有效量的淫羊藿素及通常已知常規(guī)的可藥用載體和/或賦形劑，例如Captisol，玉米油，羧甲基纖維素鈉。口服的有效劑量推薦為每天250-50mg/體表面積M2，持續(xù)兩周為一療程。具體病例可由醫(yī)師根據(jù)病情調(diào)整。圖1是淫羊藿素作用于&02損傷大鼠原代肝細(xì)胞后肝細(xì)胞活力的變化示圖。圖2是淫羊藿素作用于CCl4損傷大鼠原代肝細(xì)胞后培養(yǎng)上清的肝酶變化示圖。圖3是淫羊藿素對(duì)缺氧后復(fù)氧2小時(shí)大鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)活性氧簇生成影響的檢測(cè)圖像，圖中A:空白對(duì)照組B:損傷組C:淫羊藿素4umol/L處理組D:淫羊藿素8wmol/L處理組。圖4是淫羊藿素降低H202所致大鼠原代肝細(xì)胞凋亡的AnnexinV/FITC熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)圖像，圖中A:空白對(duì)照組B:&02損傷組C:淫羊藿素8umol/L處理組D:淫羊藿素8umol/L+ICI182780(0.1Pmol/L)處理組圖5是淫羊藿素對(duì)缺血再灌注肝損傷小鼠血清ALT影響的示圖。圖6是淫羊藿素對(duì)CCU所致急性肝損傷小鼠血清肝酶影響的示圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1淫羊藿素的制備(參見(jiàn)葉海涌等，浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2005，34(2):131-136)取在中國(guó)南部山區(qū)采集獲得的箭葉淫羊藿2kg磨成粉末，然后用950/。乙醇(10L)萃取。獲得250g濃縮原料，然后用2.5L氯仿、乙酸乙酯和n-丁醇進(jìn)一步萃取。將8g乙酸乙酯萃取物和10gn-丁醇萃取物裝入硅膠層析柱，用CHClrMeOH-HCOOH(15:l:0.5)和CHClrMeOH(8:2)分別洗脫。通過(guò)這一過(guò)程，可制得300mg淫羊藿素和去甲淫羊藿素前體淫羊藿苷。然后按照以下簡(jiǎn)要描述的方法將前體水解，即可制得淫羊藿素。溶液A:將80mg前體超聲溶解于18ml甲醇溶液中；溶液B:500U(0.433g)纖維素酶溶于180ml(0.1mol/L)，pH5.0乙酸緩沖液中。一邊攪拌一邊將溶液A緩慢加入溶液B中，然后將所得混合物在37'C的振蕩水浴中孵育過(guò)夜，以充分水解連接在前體上的葡萄糖和鼠李糖。第二天用三份等體積(約200ml)的乙酸乙酯萃取，并將有機(jī)物層在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空干燥得淫羊藿素(150mg)。實(shí)施例2淫羊藿素減輕大鼠原代肝細(xì)胞11202損傷模型試驗(yàn)1.大鼠原代肝細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)參考Seglen的兩步膠原酶灌注法并作改進(jìn)(徐哲等，醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2003,16(5):342-344)。取SD大鼠(購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)麻醉后，尾靜脈注射肝素1000U，無(wú)菌條件打開腹腔，分離并結(jié)扎門靜脈和下腔靜脈的遠(yuǎn)心端及上腔靜脈，從門靜脈近心端插管，剪開下腔靜脈近心端，用4°CD-Hanks液(含0.5mol/LEDTA)以流速為40ml/分鐘恒流泵開放灌注，待肝臟變?yōu)橥咙S色后，把肝臟置于消毒的平皿中，改用37"、0.03%膠原酶300ml，以20ml/分鐘速度進(jìn)行循環(huán)灌注，約10分鐘后可見(jiàn)包膜下的肝組織呈龜背狀裂開，繼續(xù)灌注5分鐘后停止灌注。去除肝包膜及血管等纖維結(jié)締組織，收集肝細(xì)胞懸液，洗滌液清洗肝細(xì)胞3次去除膠原酶及非肝臟實(shí)質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力大于90%，將肝細(xì)胞懸液的密度調(diào)整為IX106/ml，按2Xl()S/cm2接種于鋪有O.lmg/ml鼠尾膠的培養(yǎng)板中，37°C、5%(302條件下培養(yǎng)。12小時(shí)后換用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，20mg/L促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，0.5mg/L胰島素，1.0X10—3mol/L地塞米松)，以后每24小時(shí)換培養(yǎng)液一次。2、貼壁大鼠原代肝細(xì)胞隨機(jī)分為11202損傷組、溶劑DMSO組、淫羊藿苷陽(yáng)性對(duì)照組、淫羊藿素2umol/L處理組、淫羊藿素4ymol/L處理組、淫羊藿素8umol/L處理組、淫羊藿素16"mol/L處理組。大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，各組加入不同濃度藥物的培養(yǎng)液，24小時(shí)后置換含11202的培養(yǎng)液(濃度為800timol/L)，作用6小時(shí)后用MTT法測(cè)定各孔的細(xì)胞活力。淫羊藿苷己被證實(shí)具有明確的保肝效果，其保肝作用是常用保肝藥物水飛薊素的20倍(Mi-kyeongLee，PlantaMed.1995，61(6):523-526)。MTT測(cè)定的OD值大小代表細(xì)胞存活數(shù)目的多少，OD值越大，存活細(xì)胞越多，細(xì)胞活力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的淫羊藿素處理組細(xì)胞活力較&02損傷組有明顯提高，淫羊藿素8umol/L處理組顯示最佳的保護(hù)作用，OD值是H202損傷組的25倍，并且優(yōu)于淫羊藿苷陽(yáng)性對(duì)照組。不同濃度淫羊藿素作用于H202損傷大鼠原代肝細(xì)胞后肝細(xì)胞活力的變化情況見(jiàn)圖1。實(shí)施例3淫羊藿素減輕大鼠原代肝細(xì)胞ccu損傷模型試驗(yàn)1、大鼠原代肝細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)見(jiàn)實(shí)施例2。2、大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板，隨機(jī)分為CCU損傷組、溶劑DMSO組、淫羊藿苷及還原型谷胱甘肽對(duì)照組、淫羊藿素2ixmol/L處理組、淫羊藿素4umol/L處理組、淫羊藿素8umol/L處理組、淫羊藿素16iimol/L處理組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。還原型谷胱甘肽是臨床常用的保肝藥品，在本試驗(yàn)中與淫羊藿苷共同設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照組。大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)兩天后，各組分別加入不同濃度藥物的培養(yǎng)液，24小時(shí)后置換含CC14的培養(yǎng)液(濃度為8mmol/L)，作用6小時(shí)后，離心細(xì)胞培養(yǎng)上清，用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定ALT及AST水平。在正常條件下，ALT和AST存在于肝細(xì)胞的胞漿與線粒體內(nèi)，肝細(xì)胞受到損傷時(shí)可釋放到細(xì)胞外。其數(shù)值的高低可以判斷肝細(xì)胞損傷的程度。試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著淫羊藿濃度升高，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT和AST逐漸降低，在淫羊藿素8ymol/L時(shí)數(shù)值最低，減少至CC14損傷組的約1/3，效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物淫羊藿苷及還原型谷胱甘肽，充分說(shuō)明淫羊藿素可以保肝降酶。詳細(xì)情況見(jiàn)圖2。實(shí)施例4淫羊藿素減輕大鼠原代肝細(xì)胞缺氧損傷模型試驗(yàn)1、大鼠原代肝細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)見(jiàn)實(shí)施例2。2、本試驗(yàn)將6孔板培養(yǎng)的大鼠原代肝細(xì)胞分為空白對(duì)照組、損傷組、淫羊藿素4umol/L處理組、淫羊藿素8umol/L處理組。淫羊藿素處理組的大鼠原代肝細(xì)胞經(jīng)淫羊藿素處理24小時(shí)后與損傷組肝細(xì)胞共同放入缺氧培養(yǎng)箱(SANYO)，調(diào)整培養(yǎng)箱條件為021%，C024%，N295%，共培養(yǎng)4小時(shí)，改換正常條件培養(yǎng)2小時(shí)后用熒光法(試劑盒購(gòu)自GENMED公司)檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖像可以看出,淫羊藿素可減少缺氧復(fù)氧后肝細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的產(chǎn)生，淫羊藿素8umol/L組的效果較為明顯。該試驗(yàn)證實(shí)淫羊藿素是細(xì)胞活性氧的清除劑，有明確的抗氧化活性，能起到保護(hù)細(xì)胞免受缺氧復(fù)氧所致的活性氧損傷。實(shí)施例5淫羊藿素降低11202所致大鼠原代肝細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)1、大鼠原代肝細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)見(jiàn)實(shí)施例2。2、大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，培養(yǎng)兩天充分貼壁后分為空白對(duì)照組(A)、H202損傷組(B)、淫羊藿素8umol/L處理組(C)、淫羊藿素8umol/L+ICI182780(0.1umol/L)處理組(D)。ICI182780是非選擇性雌激素受體(ER)拮抗劑。各相應(yīng)藥物處理組作用24小時(shí)后置換含&02濃度800umol/L的培養(yǎng)液。作用24小時(shí)后收集細(xì)胞，用AnnexinV/FITC熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。試驗(yàn)結(jié)果圖像見(jiàn)圖4，(A)凋亡率為0%，(B)凋亡率為47%，(C)凋亡率為5%，(D)凋亡率為20%?？梢?jiàn)，應(yīng)用淫羊藿素處理后，肝細(xì)胞凋亡細(xì)胞率由47%下降至5%，證明淫羊藿素有降低肝細(xì)胞損傷后凋亡的作用。如果用ICI182780阻斷肝細(xì)胞激素受體，淫羊藿素減輕凋亡的作用則減弱至20%。因此，淫羊藿素減輕肝細(xì)胞凋亡的機(jī)理與擬雌激素作用有關(guān)。實(shí)施例6淫羊藿素影響損傷肝細(xì)胞抗炎的試驗(yàn)1、大鼠原代肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)Wistar雄性大鼠購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，按Bmet方法并加以改進(jìn)分離肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。以膠原酶A(購(gòu)自BoehringerMannheim公司)原位灌注和Percoll分離液(25%和50%)梯度離心法獲取肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。相差顯微鏡下觀察肝竇內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，確定其純度大于90%，臺(tái)盼藍(lán)染色可見(jiàn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞活力大于95%。在膠原包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3天，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板后用于實(shí)驗(yàn)。2、培養(yǎng)的肝細(xì)胞經(jīng)10ng/mlTNF-a作用16小時(shí)后用不同濃度淫羊藿素處理(淫羊藿素Oumol/L組、淫羊藿素2ixmol/L組、淫羊藿素4umol/L組、淫羊藿素8umol/L組、淫羊藿素16timol/L組)，采用ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清液中的炎性細(xì)胞因子ICAM-1和E-selectinde的含量。ICAM-1和E-selectin是肝臟損傷重要的炎癥介質(zhì)，可以介導(dǎo)巨嗜細(xì)胞、中性粒細(xì)胞向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及受損肝細(xì)胞移動(dòng)，進(jìn)而通過(guò)分泌各種炎癥因子、釋放活性氧簇?fù)p傷靶細(xì)胞，造成肝臟功能損害。檢測(cè)結(jié)果顯示，TNF-a可誘導(dǎo)大鼠原代肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間粘附分子-l(ICAM-l)和E-選擇素(E-selection)，而淫羊藿素能降低其表達(dá)，表明淫羊藿素具有增強(qiáng)損傷肝細(xì)胞抗炎的活性。實(shí)施例7淫羊藿素減輕小鼠缺血再灌注肝損傷的試驗(yàn)昆明種小鼠隨機(jī)分為5組(每組8只)假手術(shù)組、缺血再灌注損傷組、淫羊藿素5mg/kg治療組、淫羊藿素10mg/kg治療組和淫羊藿15mg/kg治療組。小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(60mg/kg,腹腔注射)麻醉后，沿腹部中線切開，小心游離肝臟左葉，剪除韌帶或系膜，用小血管夾鉗夾肝左葉底部，造成左葉肝臟缺血，鉗夾90分鐘后松開血管夾，使血液復(fù)流進(jìn)行再灌注，松開血管夾后觀察1分鐘，觀察肝臟顏色是否發(fā)生變化，若復(fù)流不暢則終止實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組按同樣步驟操作，只是不阻斷肝葉。治療組從術(shù)前三天開始按設(shè)計(jì)劑量經(jīng)尾靜脈注射。手術(shù)后每只鼠腹腔內(nèi)補(bǔ)充生理鹽水0.8ml，用4-0絲線分兩層縫合腹部切口。缺血90分鐘再灌注6小時(shí)作為抽取血樣肝臟損傷指標(biāo)的時(shí)間點(diǎn)。正常條件下丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶存在于肝細(xì)胞的胞漿，在肝細(xì)胞受到損傷時(shí)可釋放到細(xì)胞外，是肝臟損傷的特異性酶學(xué)指標(biāo)。根據(jù)其數(shù)值的高低可以判斷肝細(xì)胞損傷的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨淫羊藿素劑量增加，肝細(xì)胞釋放ALT減少，ALT越低說(shuō)明損傷越輕。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5，最大保護(hù)濃度為10mg/kg體重治療組，血清中ALT活力為1820U/L，相對(duì)于缺血再灌注損傷組有明顯降低。實(shí)施例8淫羊藿素減輕小鼠ccu急性肝損傷的試驗(yàn)昆明種小鼠40只，體重20土2g，雌雄兼用，隨機(jī)分為對(duì)照組、損傷組、淫羊藿素5mg/kg治療組、淫羊藿素10mg/kg治療組和淫羊藿15mg/kg治療組。治療組經(jīng)尾靜脈注射給予不同劑量的淫羊藿素，對(duì)照組和損傷組均注射等體積生理鹽水，各組每天給藥一次，連續(xù)7天。各組小鼠處死前禁食，自由飲水。除對(duì)照組和損傷組外，其余各組分別于第7天給藥后2小時(shí)，腹腔注射0.1。/。CCU食用油溶液10ml/kg—次。16小時(shí)后斷頭取血，以16000r/min離心5分鐘，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定ALT和AST活性。取出肝臟組織用生理鹽水制成10%肝勻漿，分別測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，淫羊藿素可減少CCU所致急性肝損傷的肝酶釋放，有較明確的保肝作用。由圖6看出，淫羊藿素10mg/kg治療組呈現(xiàn)最大的保肝效應(yīng)，ALT及AST由損傷組的210U/L、250U/L下降為141U/L、170U/L，其機(jī)理與淫羊藿素減輕氧自由基的釋放有關(guān)。SOD活性和MDA含量是組織自由基損傷的重要指標(biāo)，其中MDA標(biāo)志組織脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，而SOD是清除活性氧自由基重要生物酶。MDA越多說(shuō)明組織損害越重，而SOD越高說(shuō)明保護(hù)作用越強(qiáng)。由表l可以看出，SOD活性和MDA含量與淫羊藿素呈劑量依賴性，淫羊藿素可以減少M(fèi)DA含量，升高SOD活性。表1淫羊藿素對(duì)CC14急性肝損傷小鼠血清MDA、SOD的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注*與對(duì)照組比較(代0.05);林與模型組比較(P<0.05)實(shí)施例9淫羊藿素減輕大鼠ccu慢性肝損傷的試驗(yàn)大鼠慢性肝損傷模型采用皮下注射10。/。CCl4橄欖油的方法。雄性SD大鼠50只，體重150-170g，隨機(jī)分為對(duì)照組、損傷組、淫羊藿素5mg/kg治療組、淫羊藿素10mg/kg治療組和淫羊藿15mg/kg治療組。治療組經(jīng)尾靜脈注射和腹腔注射方法交替給與不同劑量的淫羊藿素共10次，對(duì)照組和損傷組按治療組給藥時(shí)間和次數(shù)注射等體積生理鹽水。每周2次注射10MCCU橄欖油，持續(xù)3個(gè)月后處死大鼠，下腔靜脈取血，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定ALT和AST及白蛋白/球蛋白比值(A/G)。取肝臟組織用生理鹽水制成10%肝勻漿，測(cè)定羥脯氨酸含量。取相同肝左葉相同部位肝組織，常規(guī)固定、脫水、包埋并行HE染色。肝組織纖維化程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為正常肝組織為0級(jí)；增生的纖維組織細(xì)窄而短為1級(jí)；較粗而長(zhǎng)、延伸入肝小葉內(nèi)形成不全分隔為2級(jí)；正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，形成假小葉為3級(jí)；纖維組織過(guò)度沉積、有瘢痕形成為4級(jí)。以上各級(jí)分別計(jì)0、1、2、3、4分，累加所有分?jǐn)?shù)，并計(jì)算出每組每只動(dòng)物肝纖維化的平均分，分值越高提示肝纖維化程度越嚴(yán)重。由表2看出，淫羊藿素能明顯降低CCU致慢性肝損傷大鼠的血清ALT、AST值及升高血清A/G(白/球)比值，表明淫羊藿素對(duì)受損及處于受損的肝細(xì)胞有保護(hù)和修復(fù)作用；羥脯氨酸為膠原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝臟中的含量可反映膠原代謝的變化情況，與肝纖維化程度相平行。表3說(shuō)明淫羊藿素能降低肝組織羥脯氨酸含量，表明淫羊藿素有抗肝纖維化的作用；病理檢驗(yàn)結(jié)果表明，淫羊藿素可改善大鼠肝纖維化評(píng)分，能在不同程度上減輕CCU造成的慢性肝組織纖維化。以上證實(shí)淫羊藿素對(duì)CCU所致的慢性肝損傷具有明顯的保肝降酶作用和抗肝纖維化的作用。表2淫羊藿素對(duì)CCl4慢性肝損傷大鼠血清ALT、AST、A/G比值的影響組別大鼠數(shù)(只)劑量(rag/kg)ALT(U/L)AST圃白/球?qū)φ战M10—26.83±7,5949.08±14.620.81±0.18損傷組10—158.01±59.92'144.55±24,7840.66±0.11*淫羊藿素105122.58±40.36121.47±29.190.74±0.145mg/kg治療組淫羊藿素101088.90±47.04"91.41±27.36"0.96±0.16"10mg/kg治療組淫羊藿素1015109.33±36.7"114.13±30.02A0.85±0.13A15mg/kg治療組注*與對(duì)照組比較(代0.05);A與損傷組比較(代O.05)，△A與損傷組比較(代O.01)。表3淫羊藿素治療后各組大鼠肝組織羥脯氨酸及肝纖維化評(píng)分比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注*與對(duì)照組比較(代0.05);A與損傷組比較(代0.05)，AA與損傷組比較(代O.Ol)，△△A與損傷組比較(代O.001)。實(shí)施例IO淫羊藿素在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)口飼給藥的淫羊藿素在4個(gè)小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明淫羊藿素能在體內(nèi)保持一定的藥物濃度，有利于防治肝臟損傷的效果。表4淫羊藿素在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例11給藥后淫羊藿素對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)取兩組8周齡的BALB/c小鼠，每組10只(5只雄性和5只雌性)，分別以單次劑量1000mg/kg和多次劑量200mg/kg(Q2DX15)給予淫羊藿素(用玉米油或載體配制)，然后分別觀察1周和4周。每?jī)商旆Q體重。試驗(yàn)結(jié)束后，將受試小鼠處死，進(jìn)行病理分析。結(jié)果顯示，以單次劑量1000mg/kg和多次劑量200mg/kg(Q2DX15)給予淫羊藿素，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長(zhǎng)良好，無(wú)一死亡。權(quán)利要求1.一種防治肝臟損傷的藥物，其特征在于該藥物是以淫羊藿素作為有效成分。2.如權(quán)利要求1所述的防治肝臟損傷的藥物，其特征在于該藥物中含有防治肝臟損傷的有效量的淫羊藿素及可藥用載體和/或賦形劑。3.如權(quán)利要求1或2所述防治肝臟損傷的藥物，其特征在于所述肝臟損傷是急、慢性肝損傷，缺氧肝損傷和缺血再灌注肝損傷。4.淫羊藿素在制備防治急、慢性肝損藥和缺氧損傷藥物中的應(yīng)用。5.淫羊藿素在制備防治缺血再灌注肝損傷藥物中的應(yīng)用。全文摘要一種以淫羊藿素作為有效成分的防治肝臟損傷的藥物。藥理試驗(yàn)效果證明淫羊藿素對(duì)肝臟損傷具有抗凋亡、抗氧化、抗炎活性及保護(hù)作用，淫羊藿素對(duì)急、慢性肝損傷、缺氧肝損傷及缺血再灌注肝損傷所致活性氧簇、細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞因子的釋放具有明顯的抑制作用。且淫羊藿素對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)顯示無(wú)毒性。因此淫羊藿素是一種具有很大開發(fā)前景的防治急、慢性肝損傷、缺氧肝損傷及缺血再灌注肝損傷的新藥。文檔編號(hào)A61K31/352GK101284002SQ200810034109公開日2008年10月15日申請(qǐng)日期2008年2月29日優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日發(fā)明者鵬劉,康曉燕,殷正豐,陸懷秀申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)