專利名稱：：Xage-1基因及其表達(dá)產(chǎn)物在腫瘤治療和診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因治療和診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種新的腫瘤抗原——XAGE-1及其表達(dá)產(chǎn)物在腫瘤治療和診斷中的應(yīng)用。技術(shù)背景腫瘤-睪丸抗原(CT抗原)是一類主要表達(dá)于正常的種系生殖組織(特別是免疫赦免的睪丸組織)與癌變組織，在其他正常組織中完全不表達(dá)或僅有少量表達(dá)的腫瘤抗原，一些著名的腫瘤抗原，如MAGE，BAGE，GAGE等均屬于CT抗原。CT抗原這種精確的限制性分布使其成為了當(dāng)前腫瘤免疫治療研究中的熱點(diǎn)。XAGE/CT12是利用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的一類新基因，包括XAGE-1，XAGE-2和XAGE-3。其中，XAGE-2與XAGE-3的腫瘤表達(dá)譜很窄，研究也很少，XAGE-1除了在正常的睪丸組織中表達(dá)外，在前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、涎腺腺樣囊性癌等多種腫瘤組織中均有較高的檢出率。XAGE-l有4種表達(dá)亞型XAGE-la,XAGE-lb，XAGE-lc和XAGE-ld,主要表達(dá)亞型是XAGE-lb。目前XAGE-l的功能尚未見報(bào)道，本文以XAGE-lb為例首次闡述了XAGE-1的功能及其應(yīng)用價(jià)值。涎腺腺樣囊性癌(ACC)是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，較易發(fā)生遠(yuǎn)地尤其是肺轉(zhuǎn)移。ACC-2是涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系，ACC-M是經(jīng)裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代培養(yǎng)，從低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)CC-2中分離出的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系。涎腺腺樣囊性癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系基因表達(dá)譜差異性研究發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中XAGE-lb呈高表達(dá)狀態(tài)。利用基因工程方法，應(yīng)用真核表達(dá)質(zhì)粒與腺病毒表達(dá)系統(tǒng)介導(dǎo)基因過表達(dá)及RNA干擾是研究基因功能的有效方法。將XAGE-lbcDNA序列構(gòu)建到真核表達(dá)載體上，同時(shí)構(gòu)建該基因的腺病毒表達(dá)載體，利用載體介導(dǎo)該基因在ACC細(xì)胞或其他細(xì)胞中的過表達(dá)，通過細(xì)胞增殖、克隆形成、體外穿膜、軟瓊脂集落形成、裸鼠皮下成瘤及尾靜脈注射肺部成瘤實(shí)驗(yàn)就可以研究該基因在腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中的作用；以真核質(zhì)粒或腺病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)靶向XAGE-lb表達(dá)的RNA干擾，利用細(xì)胞及裸鼠模型實(shí)驗(yàn)同樣可以研究該基因的功能及其在腫瘤治療上的應(yīng)用。針對(duì)肝癌，臨床上迫切需要解決的問題是尋找既敏感又特異的診斷指標(biāo)。目前首選指標(biāo)是甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)，但其特異性及敏感性均有許多不足。采用Taq-Man熒光定量PCR方法，分析一定數(shù)量肝細(xì)胞癌患者及部分健康志愿者血液樣本中XAGE-lb的表達(dá)水平及其與AFP的相關(guān)性，從而可以探討XAGE-1作為腫瘤分子診斷標(biāo)識(shí)的可行性。另外，擴(kuò)增XAGE-la，lb兩種轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游序列，分別構(gòu)建入報(bào)告基因載體，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)可以研究比較各片段的轉(zhuǎn)錄活性，可以推測(cè)XAGE-1基因核心啟動(dòng)子和其它一些調(diào)控元件所在區(qū)域，從而可以探討XAGE—1基因調(diào)控序列在腫瘤治療等方面的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新型的腫瘤治療藥物靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物，該靶點(diǎn)或標(biāo)志物是腫瘤抗原基因XAGE-1(包括XAGE-la，XAGE-lb，XAGE-lc和XAGE-ld)及其表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明還提供基于XAGE-1及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1.XAGE-1對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖能力的影響分別將表達(dá)及干擾XAGE-lb的穩(wěn)定細(xì)胞株ACC2-Xb-19與ACCM-pG-Sh-a接種于96孔板，1X104細(xì)胞/孔，分別在之后的24h、48h、72h、96h，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACC2-Xb-19與ACC2-Xb-M組細(xì)胞增殖能力顯著強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞，ACCM-pG-Sh-a細(xì)胞增殖能力顯著弱于對(duì)照組細(xì)胞；分別將ACC-2與ACC-M細(xì)胞接種于96孔板，3乂103細(xì)胞/匕10h后感染Adv-lb，在此之后每隔12h利用MTT法檢測(cè)一次細(xì)胞數(shù)量，共6次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染Adv-lb后的細(xì)胞增殖能力顯著強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞;分別將ACC2-Xb-19與ACCM-pG-Sh-a細(xì)胞接種于6孔板，500細(xì)胞/孔，14d后結(jié)晶紫染色觀察記錄:ACC2-Xb-19組形成的集落數(shù)量顯著多于對(duì)照組，ACCM-pG-Sh-a組形成的集落數(shù)量顯著少于對(duì)照組；分別將感染病毒后的ACC-2與ACC-M細(xì)胞接種于6孔板，500細(xì)胞/L，10d后結(jié)晶紫染色觀察記錄Adv-lb感染后的細(xì)胞形成的細(xì)胞單克隆集落要顯著大于對(duì)照組。上述結(jié)果說(shuō)明XAGE-l可以顯著地促進(jìn)ACC-2及ACC-M細(xì)胞的體外增殖能力。2.XAGE-1對(duì)腫瘤細(xì)胞體外浸潤(rùn)能力的影響使用QCMTM24-WellCellInvasionAssay,在上室孔中準(zhǔn)確接種ACC2-Xb-19細(xì)胞，2Xl()S細(xì)胞/孔，48h后在下室中加入裂解及染色試劑，測(cè)量熒光強(qiáng)度并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示穿膜的ACC2-Xb-19與ACC2-Xb-M組細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組；在每個(gè)Boyden小室中準(zhǔn)確接入2X105^ACCM-pU-Sh-c細(xì)胞，24h后固定、染色、計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)穿膜的ACCM-pU-sh-c組細(xì)胞數(shù)量顯著少于對(duì)照組；在6孔板中的0.6%的下層瓊脂之上，分別將腺病毒感染后的ACC-M細(xì)胞準(zhǔn)確接種于0.3%的上層瓊脂中，500細(xì)胞/L，18d后計(jì)數(shù)上層平板內(nèi)所有肉眼可見的細(xì)胞克隆，統(tǒng)計(jì)顯示Adv-lb感染后的ACC-M細(xì)胞的集落形成率顯著大于對(duì)照組。上述結(jié)果說(shuō)明XAGE-1可以顯著地促進(jìn)ACC-M細(xì)胞的體外浸潤(rùn)能力。3.XAGE-1對(duì)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖能力的影響選擇4-6周的雌性裸鼠，皮下注射細(xì)胞，2X105細(xì)胞/只，待成瘤體積至0.2-0.5cm3時(shí)，每隔3-4d測(cè)量一次腫瘤體積。接種4j吉r后處死小鼠，剝離腫瘤稱重，結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示接種ACC2-Xb-19與ACC2-Xb-M細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組小鼠成瘤體積與重量均顯著大于對(duì)照組，接種ACCM-pG-Sh-a細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組小鼠成瘤體積與重量均顯著小于ACCM組。由結(jié)果可知XAGE-1可以顯著地促進(jìn)ACC細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力。4.XAGE-1對(duì)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響將上述裸鼠分組，尾靜脈注射細(xì)胞，7-8周后處死細(xì)胞。提取肺組織基因組，建立定量PCR方法，檢測(cè)組織中人與小鼠e2-微球蛋白分子拷貝數(shù)之比，以此計(jì)為腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示接種ACC2-Xb-19細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組小鼠轉(zhuǎn)移率顯著大于對(duì)照組，接種ACCM-pU-Sh-c細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組小鼠轉(zhuǎn)移率顯著低于對(duì)照組。由此可知XAGE-1可以顯著地促進(jìn)ACC細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。5.收集一定數(shù)量的肝細(xì)胞癌患者及正常人血液樣本，抽提RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)熒光定量PCR方法分析XAGE-lb的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)XAGE-lb單獨(dú)可以提高14.0%的診斷靈敏度，與AFP雙檢測(cè)指標(biāo)可以提高33.3X。并可以輔助良性肝病的診斷，降低誤診率。6.采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，擴(kuò)增XAGE-la，lb兩種轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游序列，分別構(gòu)建入報(bào)告基因載體，與對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24h后檢測(cè)報(bào)告熒光強(qiáng)弱，用兩種熒光素酶的熒光強(qiáng)度比值表征DNA序列的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示(-654..+213)序列(以XAGE-la基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為原點(diǎn))具有較高的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。因此，XAGE-1具有促進(jìn)體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的作用，XAGE-1可以成為腫瘤治療，尤其是抗轉(zhuǎn)移治療中的藥物靶點(diǎn)；我們所構(gòu)建的真核RNA干擾質(zhì)粒系統(tǒng)，如pG-Sh-a，pG-Sh-b，pU-Sh-c;腺病毒載體系統(tǒng)，如Adv-Sh-a與Adv-Sh-b;相關(guān)穩(wěn)定細(xì)胞株系統(tǒng)ACCM-pG-Sh-a，ACCM-pU-Sh-c,可以在以XAGE-1為靶點(diǎn)的腫瘤治療中發(fā)揮有效作用。另外，XAGE-l可以成為一個(gè)具有較高靈敏度與準(zhǔn)確度的腫瘤標(biāo)識(shí)物，有效提髙肝癌及其它腫瘤的診斷水平。可以開發(fā)基因診斷用熒光定量PCR試劑盒(主要成分是基于該基因序列的特異性探針與引物等)，依次類推可以開發(fā)其他類型的診斷試劑與手段用于腫瘤、基因檢測(cè)或細(xì)胞學(xué)研究，如分子生物學(xué)試劑RT-PCR、生物芯片等；基于XAGE-1的單克隆或多克隆抗體的試劑與手段ELISA、免疫磁珠、流式細(xì)胞技術(shù)、Western-Blot等；采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)XAGE-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制分析表明(-654..+213)序列(以XAGE-la基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為原點(diǎn))具有較高的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，可以用于腫瘤生物治療。說(shuō)明附1為XAGE-lb表達(dá)的RNA干擾分析，其中(a)為真核質(zhì)粒介導(dǎo)對(duì)ACCM細(xì)胞內(nèi)源XAGE-lb表達(dá)的RNA干擾分析，Lipo為lipofectamine2000對(duì)照組，Blank為空白對(duì)照'組，N為干擾對(duì)照質(zhì)粒組，Sh-b為轉(zhuǎn)染pG-Sh-b的細(xì)胞，Sh-a為轉(zhuǎn)染pG-Sh-a的細(xì)胞；(b)為質(zhì)粒pU-Sh-c對(duì)XAGE-lb的干擾效果，Sh-c為轉(zhuǎn)染pU-Sh-c的細(xì)胞組，N為干擾對(duì)照質(zhì)粒組，ACCM為空白對(duì)照組。圖2為真核質(zhì)粒介導(dǎo)XAGE-lb過表達(dá)對(duì)ACC2細(xì)胞增殖能力的影響，ACC2-pE-Negative為轉(zhuǎn)染pEGFP-Nl質(zhì)粒的穩(wěn)定細(xì)胞株，ACC2-Xb-19為轉(zhuǎn)染pE-Xb的單克隆細(xì)胞株，ACC2-Xb-M為轉(zhuǎn)染pE-Xb的多克隆細(xì)胞株，從第二天起ACC2-Xb-19組細(xì)胞數(shù)量顯著大于ACC2-pE-Negative組(PO.Ol)，第四天起ACC2-Xb-M組細(xì)胞數(shù)量顯著大于ACC2-pE-Negative組(PO.Ol)，所示數(shù)據(jù)為3次重復(fù)間平均值，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。圖3為腺病毒載體介導(dǎo)XAGE-lb過表達(dá)對(duì)ACC細(xì)胞增殖能力的影響，其中(a)為ACC2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；(b)為ACCM細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)所示數(shù)據(jù)為6個(gè)重復(fù)間平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著，P<0.01。圖4為干擾XAGE-lb表達(dá)對(duì)ACCM細(xì)胞增殖能力的影響，ACCM-pG-Negative為轉(zhuǎn)染干擾對(duì)照質(zhì)粒的穩(wěn)定細(xì)胞株，ACCM-pG-Sh-a為轉(zhuǎn)染pG-Sh-a的穩(wěn)定細(xì)胞株，與對(duì)照相比ACCM-pG-Sh-a組細(xì)胞增殖能力顯著降低(PO.Ol)，所示數(shù)據(jù)為3次重復(fù)間平均值，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。圖5為改變XAGE-lb表達(dá)水平對(duì)ACC細(xì)胞穿膜的影響，其中(a)為過表達(dá)XAGE-lb對(duì)ACC2細(xì)胞穿膜的影響；(b)為干擾XAGE-lb表達(dá)對(duì)ACCM細(xì)胞穿膜的影響，ACCM-pU-Negative為轉(zhuǎn)染干擾對(duì)照質(zhì)粒的穩(wěn)定細(xì)胞株，ACCM-pU-Sh-c為轉(zhuǎn)染pU-Sh-c的穩(wěn)定細(xì)胞株，ACC2-Xb-M與ACC2-Xb-19組細(xì)胞數(shù)目顯著多于對(duì)照，ACCM-pU-Sh-c組細(xì)胞數(shù)目顯著少于對(duì)照，P<0.01(n=3)。圖6為XAGE-lb過表達(dá)對(duì)ACC腫瘤生長(zhǎng)的影響，其中(a)為腫瘤生長(zhǎng)曲線；(b)為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組腫瘤的體積差異；(c)為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組腫瘤的重量差異，Xb-M組與Xb-19組均和對(duì)照組差異顯著(PO.Ol)。圖7為干擾XAGE-lb表達(dá)對(duì)ACC腫瘤生長(zhǎng)的影響，其中(a)為腫瘤生長(zhǎng)曲線，(b)為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組腫瘤的體積差異，(c)為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組腫瘤的重量差異，ACCM-pG-Sh-a組與ACCM組差異顯著P<0.01。具體實(shí)施方式1.表達(dá)該基因的真核質(zhì)粒及腺病毒載體的構(gòu)建利用RT-PCR方法從ACC-McDNA中擴(kuò)增得到XAGE-lbcDNA序列，插入pEGFP-Nl質(zhì)粒(Clontech，MountainView,USA)得到XAGE-lb的真核表達(dá)載體pE-Xb。并且轉(zhuǎn)染ACC-2細(xì)胞(上海市第九人民醫(yī)院口外腫瘤實(shí)驗(yàn)室)，利用G418抗性篩選該載體的穩(wěn)定細(xì)胞株ACC2-Xb-19〖単克隆"抹)，ACC2-Xb-M(多克隆株)。PCR擴(kuò)增XAGE-lbcDNA序列并插入pAdTrack-CMV(Stragene，USA)質(zhì)粒，穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pAdEasy-l(Stragene，USA)在BJ5183菌株(Stragene,USA)同源重組后得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(ATCC，USA)后包裝得到成熟病毒粒子:Adv-lb。RT-PCR與Wetem-Blot均證明ACC-2-Xb-19及Adv-lb感染后的ACC-2細(xì)胞具有較高的XAGE-lb表達(dá)水平。2.表達(dá)siRNA(smallinterferingRNA)的真核質(zhì)粒及腺病毒載體的構(gòu)建選擇XAGE-lb開放閱讀框(ORF)的20-38與125-143序列為作用位點(diǎn)，分別將含有siRNA編碼序列的正反向shRNA編碼序列黏合后插入載體pGCsi-U6/Neo/RFP(Jikai，Shanghai)，得到兩種表達(dá)靶向XAGE-lb的siRNA的真核表達(dá)載體pG-Sh-a與pG-Sh-b;選擇XAGE-lb開放閱讀框(ORF)210-230序列為作用位點(diǎn)，將含有siRNA編碼序列的正反向shRNA編碼序列黏合后插入pcDNA3.1(U6)構(gòu)建干擾質(zhì)粒pU-sh-c。利用PCR將U6啟動(dòng)子及shRNA序列由載體pG-Sh-a與pG-Sh-b上擴(kuò)增下來(lái)，插入穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV。以同樣方法構(gòu)建兩種表達(dá)靶向XAGE-lb的siRNA的腺病毒載體Adv-Sh-a與Adv-Sh-b。利用熒光報(bào)告基因及RT-PCR均證實(shí)pG-Sh-b與Adv-Sh-b的干擾效果較弱，pG-Sh-a，pU-sh-c與Adv-Sh-a的千擾效果較強(qiáng)，(圖1)。同時(shí)將質(zhì)粒pG-Sh-a與pU-sh-c轉(zhuǎn)染ACC-M細(xì)胞(來(lái)自上海市第九人民醫(yī)院口外腫瘤實(shí)驗(yàn)室)，利用G418抗性篩選得到該載體的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株ACCM-pG-Sh-a與ACCM-pU-sh-c。3應(yīng)用舉例(l).XAGE-l對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖能力的影響1-1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分別將表達(dá)及干擾XAGE-lb的穩(wěn)定細(xì)胞株ACC-2-Xb-19與ACCM-pG-Sh-a及對(duì)照組細(xì)胞接種于96孔板，lX10"細(xì)胞/孔。分別在之后的24h、48h、72h、96h，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量。SPSS15.0軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量差異發(fā)現(xiàn)過表達(dá)XAGE-lb后的細(xì)胞增殖能力顯著強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞，干擾XAGE-lb表達(dá)后的細(xì)胞增殖能力顯著弱于對(duì)照組細(xì)胞，(圖2，4)。分別將ACC-2與ACC-M細(xì)胞接種于%孔板，3X103細(xì)胞/孔。10h后感染Adv-lb，在此之后每隔12h利用MTT法檢測(cè)一次細(xì)胞數(shù)量，共6次。SPSS15.0軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量差異發(fā)現(xiàn)感染Adv-lb后的細(xì)胞增殖能力顯著強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞，(圖3)。1-2克隆形成實(shí)驗(yàn)分別將表達(dá)及干擾XAGE-lb的穩(wěn)定細(xì)胞株ACC-2-Xb-19與ACCM-pG-Sh-a及對(duì)照組細(xì)胞接種于6孔板，500細(xì)胞/孔。Md后結(jié)晶紫染色觀察ie:錄ACC-2-Xb-19組形成的集落數(shù)量顯著多于對(duì)照組，ACCM-pG-Sh-a組形成的集落數(shù)量顯著少于對(duì)照組。1-3集落形成實(shí)驗(yàn)分別將感染病毒后的ACC-2與ACC-M細(xì)胞接種于6孔板，500細(xì)胞/L。10d后結(jié)晶紫染色觀察記錄Adv-lb感染后細(xì)胞形成的單克隆集落顯著大于對(duì)照組。由以上可知XAGE-1可以顯著地促進(jìn)ACC細(xì)胞的體外增殖能力。(2).XAGE-1對(duì)腫瘤細(xì)胞體外浸潤(rùn)能力的影響2-1細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)使用QCMTM24-WellCellInvasionAssay,在上室孔中準(zhǔn)確接種ACC-2-Xb-19及對(duì)照細(xì)胞，2><105細(xì)胞/孔。48h后在下室中加入裂解及染色試劑，測(cè)量熒光強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示ACC-2-Xb-19與ACC-2-Xb-M組細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組；在每個(gè)Boyden小室中準(zhǔn)確接入2X105個(gè)ACCM-pU-Sh-c及對(duì)照組細(xì)胞，24h后固定、染色、計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)穿膜的ACCM-pU-Sh-c組細(xì)胞數(shù)量顯著少于對(duì)照組，(圖5)。2-2軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)在6孔板中的0.6n/。的下層瓊脂(含lX完全培養(yǎng)基)之上，分別將腺病毒感染后的ACC-M細(xì)胞準(zhǔn)確接種于0，/。的上層瓊脂(含1X完全培養(yǎng)基)中，500細(xì)胞/孔。18d后計(jì)數(shù)上層平板內(nèi)所有肉眼可見的細(xì)胞克隆。統(tǒng)計(jì)顯示Adv-lb感染后的ACC-M細(xì)胞的集落形成率顯著大于對(duì)照組，(表l)。由以上可知XAGE-1可以顯著地促進(jìn)ACC-M細(xì)胞的體外浸潤(rùn)能力。表1ACCM細(xì)胞軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞集落數(shù)/個(gè)集落形成率/%Adv-zero組140±728.0空白對(duì)照組136±1427.2Ack-lb組217±1543.4**p<0.01(3).XAGE-對(duì)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖能力的影響選擇4-6周的雌性裸鼠(BALb/cnu/nu〉(由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，皮下注射細(xì)胞，2Xl()S細(xì)胞/只。待成瘤體積至0.2-0.5cm3時(shí)，每隔3-4d測(cè)量一次腫瘤體積(V=l/2ab2，a:長(zhǎng)徑，b:短徑)。接種4周后處死小鼠，剝離腫瘤稱重。結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示接種ACC-2-Xb-19與ACC-2-Xb-M細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組小鼠成瘤體積與重量均顯著大于對(duì)照組，接種ACCM-pG-Sh-a細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組小鼠成瘤體積與重量均顯著小于ACCM組。由此可知XAGE-1可以顯著地.促進(jìn)ACC-M細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力，(圖6，7)。(4).XAGE-1對(duì)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響將上述裸鼠分組，尾靜脈注射細(xì)胞，7-8周后處死細(xì)胞。提取肺組織基因組，建立定量PCR方法，檢測(cè)組織中人與小鼠P2-微球蛋白分子拷貝數(shù)之比，以此計(jì)為腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示接種ACC-2-Xb-19細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組小鼠轉(zhuǎn)移率顯著大于對(duì)照組，接種ACCM-pU-Sh-c細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組小鼠轉(zhuǎn)移率顯著低于對(duì)照組。由此可知XAGE-1可以顯著地促進(jìn)ACC細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力，(表2，3)。表2過表達(dá)XAGE-lb對(duì)ACC腫瘤肺轉(zhuǎn)移的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)驗(yàn)期間每組小鼠存活數(shù)；*p<0.01表3過表達(dá)XAGE-lb對(duì)ACC腫瘤肺轉(zhuǎn)移的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>a實(shí)驗(yàn)期間每組小鼠存活數(shù)；'p<0.01(5).抽提收集的腫瘤血液樣本RNA并反轉(zhuǎn)錄為c隨A，利用Taq-Man定量PCR方法分析XAGE-lb的表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參照，XAGE-lb正常值界定為正常人表達(dá)范圍(P2.275-P97725)的上限，AFP正常值界定為20pg/L。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者的XAGE-1。陽(yáng)性率68.4。/。(n=57)，顯著高于良性肝病患者的26.5%(n=34)與正常人的4%(n=50)(f5<0.01，卡方檢驗(yàn))，但與其他類型腫瘤患者的46.2%(n=13)無(wú)顯著差異；XAGE-lb單獨(dú)可以提高14.0%的診斷靈敏度，與AFP雙檢測(cè)指標(biāo)可以提高33.3%，并可以輔助良性肝病的診斷，降低誤診率；21例雙檢測(cè)指標(biāo)陽(yáng)性的肝病患者中，肝細(xì)胞癌患者占95.2%，顯著多于良性肝病患者，(表4，5)。由此可見XAGE-1可以成為肝癌尤其是肝細(xì)胞癌一較好的標(biāo)識(shí)物，提高肝癌的診斷水平。(6)采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體pGL3-Basic與，海腎焚光素酶報(bào)告載體pRL-SV40,Promega公司)，分別擴(kuò)增XAGE-la,lb兩種轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游序列，(表6),構(gòu)建入報(bào)告基因載體，與對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24h后檢測(cè)報(bào)告熒光強(qiáng)弱，用兩種熒光素酶的熒光強(qiáng)度比值表征DNA序列的轉(zhuǎn)錄活性。分析表明-A1,A2,A3的轉(zhuǎn)錄活性都很低，和陰性對(duì)照組接近；B1,B2,B3轉(zhuǎn)錄活性較高，B3>B2>B1,轉(zhuǎn)錄活性隨著片段增長(zhǎng)而增加。Bl、B2、B3片段分別相對(duì)應(yīng)的A1、A2、A3在結(jié)構(gòu)上的差異，僅僅是其3'端多出(+31..+213)長(zhǎng)為181bp的一段，大致覆蓋了基因組上XAGE-la和XAGE-lb的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)之間的區(qū)域。這一段區(qū)域是造成A、B兩組片段轉(zhuǎn)錄活性巨大差異的主要原因，B1、B2、B3的轉(zhuǎn)錄活性均呈現(xiàn)近似線性的遞增趨勢(shì)，提示整個(gè)(-654..+213)范圍內(nèi)均為啟動(dòng)子區(qū)域，且在(-654..+31)區(qū)域存在正調(diào)控元件。表4XAGE-lbmRNA與AFP在肝細(xì)胞癌患者血液中的檢測(cè)結(jié)果AFPXAGE陽(yáng)lbmRNA+一合計(jì)+20(35.1)11(19.3)31(54.4)一19(33.3)7(12.3)26(45.6)合計(jì)39(68.4)18(31.6)57括號(hào)內(nèi)為占樣本總數(shù)的百分比表5XAGE-lbmRNA與AFP在良性肝病患者血液中的檢測(cè)結(jié)果AFP-XAGE-lbmRNA+—合計(jì)+1(2.9)11(32.4)12(35.3)—8(23.6)14(41.1)22(64.7)合計(jì)9(26.5)25(73.5)34括號(hào)內(nèi)為占樣本總數(shù)的百分比4.具體應(yīng)用免疫學(xué)手段是一種很有潛力的診治惡性腫瘤的方法，也是近年來(lái)抗腫瘤研究熱點(diǎn)之一，其首要目標(biāo)在于確認(rèn)腫瘤抗原，以有針對(duì)性地實(shí)施治療。其中最為著名的是腫瘤-睪丸抗原(CT抗原)，其嚴(yán)格的限制性分布為精確的癌癥免疫療法提供了新的可能。以老鼠為模型的實(shí)驗(yàn)提示類似人CT抗原的鼠P815AB抗原在鼠睪丸、胎盤上的分布并不影響P815AB在其他部位的免疫原性；同時(shí)，誘導(dǎo)對(duì)P815AB的細(xì)胞毒反應(yīng)后，小鼠生殖未受干擾。1999年進(jìn)行的一項(xiàng)MAGE-A3疫苗人體研究中，25名完成疫苗治療的III，IV期黑色素瘤病人中有7名出現(xiàn)顯著改善，且所有病例均未出現(xiàn)明顯的副作用?？梢?，CT抗原具有有效的免疫原性和潛在的臨床表6擴(kuò)增得到的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表7熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Ml/M2比值，表征插入片段的轉(zhuǎn)錄活性，M1和M2分別為螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的熒光強(qiáng)度，單位是相對(duì)熒光強(qiáng)度單位(RLU)。相對(duì)值為除以PGL-3組后得到的相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性。上述研究并未涉及XAGE-1，而該說(shuō)明書闡述的正是該基因及其表達(dá)產(chǎn)物在腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移方面的重要功能及其與腫瘤的相關(guān)性，顯示了XAGE-1在腫瘤治療與診斷應(yīng)用方面重要的價(jià)值。首先，鑒于該基因在腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中的重要作用，該基—因及其編^產(chǎn)^I以"作為A及其他哺乳動(dòng)物的抗腫瘤治療，尤其是抗轉(zhuǎn)移治療的藥物靶點(diǎn)，減少腫瘤轉(zhuǎn)移率，提高腫瘤的治療水平。其次，利用基因工程手段所構(gòu)建的真核質(zhì)粒基因功能干擾系統(tǒng)，如:pG-Sh-a，pG-Sh-b，pU-sh-c;腺病毒載體基因功能干擾系統(tǒng)，如Adv-Sh-a與Adv-Sh-b，及相關(guān)穩(wěn)定細(xì)胞株系統(tǒng)，如ACCM-pG-Sh-a,ACCM-pU-Sh-c可以在以XAGE-1為靶點(diǎn)的腫瘤治療中發(fā)揮有效作用，并且XAGE-1特異性啟動(dòng)子也可用于腫瘤治療。最后，XAGE-1可以成為一個(gè)具有較高靈敏度與準(zhǔn)確度的肝癌尤其是肝細(xì)胞癌的分子標(biāo)識(shí)物，有效地提高肝癌，尤其是早期肝癌的診斷水平，從而該基因可以用來(lái)開發(fā)各種試劑或手段用于腫瘤或基因診斷。雖然本說(shuō)明書中的功能研究是以涎腺腺樣囊性癌及其細(xì)胞株為例的，診斷標(biāo)志研究是以肝癌為例的，但如上所述，XAGE-1的腫瘤表達(dá)譜是比較廣泛的，從而XAGE-l可以用于各種具有該基因較高表達(dá)水平的腫瘤治療及診斷。權(quán)利要求1、一種腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1及其表達(dá)產(chǎn)物作為人或其他哺乳動(dòng)物的抗腫瘤治療藥物靶點(diǎn)的應(yīng)用。2.利用基因工程手段構(gòu)建的干擾腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1的質(zhì)粒系統(tǒng)pG-Sh-a，pG-Sh-b，pU-Sh-c;腺病毒載體系統(tǒng)Adv-Sh-a，Adv-Sh-b;細(xì)胞株系統(tǒng)ACCM-pG-Sh-a，ACCM匿p(J-Sh-Co3.—種腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1的特異性啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子為以XAGE-la基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為原點(diǎn)的-654..+213序列。4、一種腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1及其表達(dá)產(chǎn)物在制備腫瘤基因診斷試劑盒中的應(yīng)用，該試劑盒主要成份包括腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1的特異性探針與引物。5、一種腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1及其表達(dá)產(chǎn)物在制備腫瘤生物學(xué)試劑RT-PCR或生物芯片中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于基因治療和診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種腫瘤抗原——XAGE-1基因及其表達(dá)產(chǎn)物在腫瘤治療和診斷中的應(yīng)用。該發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)XAGE-1基因在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，并且是腫瘤的重要標(biāo)志物。研究結(jié)果證明XAGE-1可以促進(jìn)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞及其它各種腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)能力。所以該基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以作為藥物靶點(diǎn)，開發(fā)各種腫瘤治療藥物尤其是抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的藥物；XAGE-1及其表達(dá)產(chǎn)物可作為腫瘤的標(biāo)志物用于腫瘤診斷和病情分析，用來(lái)開發(fā)各種診斷試劑盒及方法，大大提高腫瘤，尤其是早期腫瘤的診斷水平；根據(jù)XAGE-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，其特異性調(diào)控序列可以應(yīng)用于腫瘤治療等方面。文檔編號(hào)A61K48/00GK101270360SQ20081003745公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2008年5月15日優(yōu)先權(quán)日2008年5月15日發(fā)明者洋劉,宋玉亮,朱乃碩申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)