專利名稱：兩種魚(yú)類抗菌肽基因的串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物及其表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海洋生物的基因工程技術(shù)，尤其是涉及一種對(duì)具有抗菌活性的大 黃魚(yú)抗菌肽h印cidin(簡(jiǎn)寫為PC-h印C)和黑鯛抗菌肽h印cidin(簡(jiǎn)寫為AS-h印C2)基因 進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，并進(jìn)行體外表達(dá)產(chǎn)物的活性鑒定。
背景技術(shù)：
抗菌肽是由動(dòng)植物細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，其生成和 釋放是機(jī)體炎癥反應(yīng)的組成部分，是宿主防御細(xì)菌、真菌等病原微生物入侵的重要屏障。 Hepcidin (肝殺菌肽)是一個(gè)具β片層結(jié)構(gòu)的在C端保守位點(diǎn)上富含半胱氨酸殘基的抗菌 肽家族，參與宿主非特異性免疫。2000年，Krause等從人血漿中首先發(fā)現(xiàn)了 LEAP-I (肝臟 表達(dá)的抗菌肽，后稱為h印cidin)，并用化學(xué)合成該多肽檢測(cè)了 h印cidin的抗菌活性，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，hepcidin能夠劑量依賴性地抑制革蘭氏陽(yáng)性菌藤黃微球菌、肉葡萄球菌、巨大芽孢桿 菌、枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌灰色奈瑟球菌的生長(zhǎng)，但是對(duì)大腸桿菌和螢光假單胞菌 沒(méi)有活性。Park等從人尿液中分離的Ifep20和H印c25天然產(chǎn)物，體外抗菌試驗(yàn)中在30 μ M 濃度下對(duì)大腸桿菌(E. coliML35P G-)具較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)金色葡萄球菌和表皮葡萄球菌 等革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)抑制作用較弱。相關(guān)報(bào)道表明，人h印cidin是一種具有廣譜殺菌抑 菌作用的抗菌肽，與機(jī)體內(nèi)其他富含半胱氨酸的抗菌肽一樣參與宿主的天然防御。本申請(qǐng)人通過(guò)化學(xué)合成大黃魚(yú)h印cidin成熟肽和原核表達(dá)AS-h印c2后進(jìn)行體 外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了魚(yú)類h印cidin有抑菌和殺菌特性。有報(bào)道H印cidin變體的氨基酸序列 在種間高度相似，而與陸生哺乳動(dòng)物具有的進(jìn)化后高級(jí)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相比，由于水生環(huán) 境的復(fù)雜性和直接接觸性，魚(yú)類可能需要多種不同組抗菌肽存在，并且在先天性免疫系統(tǒng) 中作為主要成分。對(duì)!fepcidin抗菌肽的研究必然加深人們對(duì)低等脊椎動(dòng)物免疫防御機(jī)制 的認(rèn)識(shí)，同時(shí)hepcidin抗菌肽作為潛在的海水水產(chǎn)養(yǎng)殖抗菌和治療藥物，具有很好的推廣 應(yīng)用前景。但直接從魚(yú)類組織或分泌物中生物化學(xué)提取或利用化學(xué)方法人工合成天然的 h印cidin抗菌肽，很難獲得大量的抗菌肽，且費(fèi)時(shí)費(fèi)錢。利用分子生物學(xué)技術(shù)可以克隆獲得 海水養(yǎng)殖魚(yú)類的抗菌肽基因，通過(guò)建立海水養(yǎng)殖魚(yú)類h印cidin抗菌肽基因表達(dá)工程菌，可 以在體外大量生產(chǎn)抗菌肽，進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)和替代抗生素添加到飼料中，用于預(yù)防和治 療水產(chǎn)動(dòng)物疾病。由于h印cidin多肽含有8個(gè)半胱氨酸，具有特殊的4個(gè)二硫鍵結(jié)構(gòu)，國(guó)內(nèi)外 h印cidin體外表達(dá)見(jiàn)報(bào)道的不多，有報(bào)道真鯛h印cidin成熟肽基因的酵母表達(dá)，但只 限于對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌和嗜水氣單胞菌的劑量依賴性抑制實(shí)驗(yàn)，也沒(méi)有闡明其上清 表達(dá)的量和小肽抗菌穩(wěn)定性等詳盡問(wèn)題。Zhang等([3]Zhang H, Yuan QP，Zhu YP, Ma RY. Expression and preparation ofrecombinant hepcidin in Escherichia coli [J]. Protein. Expr. Purif.，2005,41 409-416)利用合成的人 hepcidin 核酸片段重組到 pGEX-hpc表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白，但其表達(dá)產(chǎn)物是以包涵體形式存在，需要 經(jīng)過(guò)復(fù)性過(guò)程才能獲得有生物活性的h印cidin，因而利用pGEX-hpc這一類表達(dá)載體制備hepcidin 的工藝相對(duì)復(fù)雜，成本較高。B. Srinivasulu 等([4]B. Srinivasulu, R. Syvitski， J.-K.Seo, N. R. Mattatall, L. C. Knickle, S. E. Douglas. Expression, purificationand structural characterization of recombinant hepcidin, Anantimicrobial peptide identified injapanese flounder, Paralichthys olivaceus[J]. Protein. Expr. Purif., 2008(61) 36-44)報(bào)道利用大腸桿菌融合表達(dá)6His_h印cidin，也主要是包涵體表達(dá)。本 申請(qǐng)人:在前期工作中也已證明大黃魚(yú)PC-h印c和黑鯛AS-h印c2成熟肽都具有顯著的抗 菌活性(見(jiàn)[5]Ke-Jian Wang, Jing-JingCai, Ling Cai, Hai-Dong Qu, Ming Yang, Min Zhang. Cloning and expression of a hepcidin genefrom a marine fish(Pseudosciaena crocea)and the antimicrobial activity of its syntheticpeptide[J]. Peptides, 2009(30) :638-646)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供兩種魚(yú)類抗菌肽基因的串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物及其兩種魚(yú)類 Hepcidin串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建和串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)構(gòu)建一種串聯(lián)大黃魚(yú)h印cidin(前導(dǎo)肽和成熟肽的 cDNA序列)和黑鯛h印cidin(前導(dǎo)肽和成熟肽的cDNA序列)基因的pET32/hepcidins 表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)可溶性產(chǎn)物，以及純化不帶任何標(biāo)簽的串聯(lián) hepcidin多肽的方法，從而獲得抗菌譜比單一表達(dá)其中一種h印cidin更廣的h印cidin串
聯(lián)表達(dá)產(chǎn)品。所述兩種魚(yú)類抗菌肽基因的串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物的串聯(lián)抗菌肽hepcidins基因分別 來(lái)自于大黃魚(yú)抗菌肽h印cidin(簡(jiǎn)寫為PC-h印c)和黑鯛抗菌肽h印cidin2(簡(jiǎn)寫為 AS-hepc2)，均包含前導(dǎo)肽基因，兩者通過(guò)連接肽編碼基因相連。所述的兩種魚(yú)類H印cidin串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建和串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物的制備方法如 下1)重組表達(dá)載體pET32/h印cidins的構(gòu)建(1)根據(jù)大黃魚(yú)抗菌肽？(-11印(3基因和黑鯛抗菌肽45-11印(32基因合成？1、1^2、 R2四條引物，其中引物Fl和引物Rl配對(duì)擴(kuò)增大黃魚(yú)h印cidin基因，引物F2和引物R2配 對(duì)擴(kuò)增黑鯛h印cidin基因，引物Fl和引物R2配對(duì)，與相應(yīng)模板反應(yīng)可擴(kuò)增的h印cidins 串聯(lián)目的產(chǎn)物；35個(gè)PCR反應(yīng)后，分別得到大黃魚(yú)h印cidin基因、真鯛h印cidin基因和 hepcidin串聯(lián)基因，瓊脂糖凝膠電泳分別顯示大小為212bp、222bp和416bp ；(2)將回收的h印cidins PCR產(chǎn)物和pET32a載體用NcoI和XhoI進(jìn)行雙酶切，得 到具有與處理好的預(yù)連接DNA片段和pET32a線性載體，通過(guò)基因克隆常規(guī)方法進(jìn)行連接、 轉(zhuǎn)化和單克隆篩選及鑒定，酶切和測(cè)序結(jié)果顯示h印cidins串聯(lián)序列成功插入到表達(dá)載體 并且讀碼正確；2)pET32/hepcidin重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)用熱擊法將pET32a空質(zhì)粒和pET32/h印cidins重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，以pET32a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21 (DE3)為對(duì)照，采用聚丙烯酰胺凝膠 電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)融合蛋白表達(dá)量；3)pET32/hepcidins重組質(zhì)粒融合表達(dá)產(chǎn)物的純化
(l)hepcidins融合表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析將pET32/hepCidinS重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物離心收集菌體，用PBS懸 浮菌體，超聲破碎；離心超聲液取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確認(rèn)表達(dá)產(chǎn)物的可溶性；(2)親和層析法純化h印cidin融合表達(dá)產(chǎn)物將具有較高可溶性表達(dá)h印cidin的菌株大量誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，采用金屬鏊 合層析柱進(jìn)行親和層析，金屬鏊合層析填料為s印harose fast flow (GE Healthcare)，所 用層析試劑為溶液A、B、C和D;所述溶液A為Ni2+金屬離子，溶液B洗去多余的Ni2+，溶液C平衡層析柱，將經(jīng) 0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后的表達(dá)菌超聲上清液上柱，溶液C過(guò)柱洗去未結(jié)合的蛋白，溶液D過(guò)柱 洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定即為h印cidins融合表達(dá)產(chǎn)物；(3)融合蛋白的酶切反應(yīng)和不帶標(biāo)簽h印cidins多肽的純化將融合蛋白于Tris-Cl緩沖液中低溫透析，充分透析后按照帶6XHis重組腸激酶 操作手冊(cè)對(duì)該融合蛋白進(jìn)行酶切，因?yàn)槿诤系鞍酌盖泻竽艿玫讲粠?biāo)簽序列和融合蛋白的 h印cidins多肽，而未完全切割和載體蛋白及重組腸激酶均有6 XHis標(biāo)簽，酶切后混合物 用酶切緩沖液適當(dāng)稀釋后以1. 5ml/min流速過(guò)Ni2+親和層析柱，收集穿過(guò)峰后，便得到目的 多肽；Hepcidins多肽從緩沖液A緩慢更換透析液至超純水中，去除多肽中鹽類成分。再以 0. 22 μ m膜過(guò)濾除菌后-80°C低溫冰箱凍存至低溫冷凍干燥而濃縮目的多肽，冷凍干燥處 理后的樣品置于_20°C冰箱保存；所述緩沖液A為50mM Tris-Cl、50mM NaCl, ρΗ 8. 0 ；(4)Hepcidins串聯(lián)多肽抗菌活性的測(cè)定a.微滴定肉湯稀釋方法通過(guò)測(cè)定最小抑菌濃度來(lái)評(píng)價(jià)h印cidins串聯(lián)多肽的抗 菌活性；b.以最小抑菌濃度10倍MIC濃度劑量h印cidins多肽對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行殺 滅分析，設(shè)定固定的時(shí)間間隔從培養(yǎng)孔中吸取相等的體積，進(jìn)行同樣的稀釋后接種到普通 瓊脂板，次日計(jì)數(shù)每板克隆。在步驟3)的第(3)部分中，所述Tris-Cl緩沖液為20mM Tris-Cl, 150mM NaCl, ρΗ 8. 0。通過(guò)與硫氧還蛋白TrxA融合得到串聯(lián)h印cidin基因可溶性表達(dá)產(chǎn)物后，可通 過(guò)M親和層析柱純化，純化后多肽在經(jīng)帶6XHis標(biāo)簽的活性腸激酶切割，酶切混合物再 經(jīng)M親和層析柱純化，收集穿過(guò)峰而獲得不帶任何標(biāo)簽的兩種h印cidin串聯(lián)產(chǎn)物，所得 hepcidin串聯(lián)產(chǎn)物用于受試菌種抑菌活性測(cè)定。本發(fā)明所述的黑鯛抗菌肽AS-h印c2基因的表達(dá)載體pET32a含有T7啟動(dòng)子、Trx 融合蛋白編碼基因及組氨酸標(biāo)簽(His-Tag)，利用其NcoI和XhoI兩個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)克隆大 黃魚(yú)PC-h印c基因序列-linker-黑鯛AS_h印c2基因序列的串聯(lián)多肽基因，而得到pET32/ h印cidins表達(dá)載體。通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件，可溶性串聯(lián)融合表達(dá)產(chǎn)物可通過(guò)N末端His-Tag 親和層析純化，純化的融合產(chǎn)物可用腸激酶酶將融合蛋白中的Trx標(biāo)簽切除，再次過(guò)純化 柱，收集穿過(guò)峰可獲得純化的h印cidin串聯(lián)融合表達(dá)產(chǎn)物。通過(guò)計(jì)算得知，pET32a空載體 誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白為158aa，理論分子量為17. IkDa ；Trx/hepcidins重組載體誘導(dǎo)表達(dá)的蛋 白為292aa，理論分子量為32. 2kDa。本發(fā)明與已有h印cidin研究報(bào)道對(duì)比其特點(diǎn)是本發(fā)明通過(guò)疏水性連接肽
6(linker)串聯(lián)大黃魚(yú)PCH^pc和黑鯛AS_h印c2基因，并且融合了 pET32a原核表達(dá)載 體上的硫還氧蛋白，在低溫和適當(dāng)濃度的IPTG誘導(dǎo)下，大量地表達(dá)出兩種魚(yú)類的抗菌肽 hepcidin可溶性融合蛋白。通過(guò)親和層析純化了該融合蛋白，再利用自帶6 XHis的活性腸 激酶切割融合蛋白，經(jīng)二次親和層析柱純化，得到?jīng)]有任何標(biāo)簽的串聯(lián)hepcidin多肽。抑 菌實(shí)驗(yàn)表明該串聯(lián)h印cidin多肽對(duì)金色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)MIC濃 度達(dá)到6 μ M和6 μ M，對(duì)嗜水氣單胞菌、溶壁微球菌也有顯著的抑菌效果。另外，本發(fā)明選擇 將兩個(gè)h印cidin的前導(dǎo)肽和成熟肽序列串聯(lián)表達(dá)，結(jié)果證明，h印cidin的前導(dǎo)肽和成熟肽 串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物也具有顯著的抗菌活性。


圖 1 為 hepcidin 和 hepcidins 的擴(kuò)增。在圖 1 中，(a)M :DNA Marker,DL2000 ；1 h印cidinsPCR 產(chǎn)物；2 黑鯛 h印cidin ；3 大黃魚(yú) h印cidin ； (b)M :DNA Marker, DL2000 ；4 pET32/hepcidins 質(zhì)粒酶切鑒定(NcoI 和 XhoI) ； (c)M =DNAMarker, DL2000 ；5 9 表達(dá)菌 株陽(yáng)性克隆菌液PCR鑒定；10 黑鯛hepcidin;圖中箭頭指向條帶均為hepcidins串聯(lián)基 因。圖2為pET32a和pET32/h印cidins表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳。在圖2中，M proteinmarker (KDa), Fermentas SM0431 ；1 :pET32a ^ii^la；2 :pET32/hepcidins
表達(dá)菌超聲上清。圖3為純化前后h印cidins融合蛋白SDS-PAGE電泳。在圖3中，M :protein marker FermentasSM0431 ；1 :h印cidins融合蛋白純化后樣品；2 :pET32/h印cidins表達(dá)上清樣 品；A為流穿部分，B為洗脫峰。圖4為h印cidins融合蛋白腸激酶切割效果。在圖4中，1 :hepcidins融合蛋白； 2 6 酶切作用時(shí)間(下同)，l、2、3、4、5h ；M 蛋白marker 圖5為h印cidins融合蛋白酶切產(chǎn)物和二次過(guò)親和層析柱SDS-PAGE電泳圖。在 圖5中，M :protein marker ；1 :hepcidins融合蛋白酶切產(chǎn)物和二次過(guò)親和層析柱穿過(guò)；2 hepcidins融合蛋白酶切產(chǎn)物。圖6為h印cidins串聯(lián)多肽長(zhǎng)時(shí)相殺滅金色葡萄球菌曲線。在圖6中，橫坐標(biāo)為 作用時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(Tn)平板克隆數(shù)與起點(diǎn)(即Omin, TO)克隆數(shù)的比 值 CFU (100% )。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。1.重組表達(dá)載體pET32/h印cidins的構(gòu)建1)含有串聯(lián)大黃魚(yú)h印cidin (前導(dǎo)肽和成熟肽的cDNA序列)和黑鯛h印cidin (前 導(dǎo)肽和成熟肽的cDNA序列)基因的重組pPMDIS-T陽(yáng)性質(zhì)粒模板的獲得(1)利用Trizol試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司)提取大黃魚(yú)、黑鯛幼魚(yú)肝總RNA 后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增在按常規(guī)方法進(jìn)行TA克隆，并測(cè)序正確，質(zhì)粒置于-20°C保存，菌種添加 15%甘油凍存于-80°C。(2)同上述分別設(shè)計(jì)Fl、Rl、F2和R2四條引物，根據(jù)大黃魚(yú)抗菌肽PCH^pc基因(Genbank登錄號(hào)EU443735)和黑鯛抗菌肽AS_h印c2基因(Genbank登錄號(hào)AY669377)合 成如下引物Fl 5' -CACCCATGG CG GTCCCAGCCAATGAAGAGCAAG-3‘(下劃線部分為 NcoI 酶切 位點(diǎn))Rl 5' - KCCGGAACCTGGAGAACCGAACCTGCAGCAGATACC 3‘(粗體
部分為編碼linker基因，斜體字部分為擴(kuò)增大黃魚(yú)h印cidin下游引物)F2 5' - GGTTCTCCAGGTTCCGGTGGCTCATTCACTGAGGTGC 3‘(粗體
部分為編碼linker基因，斜體部分為擴(kuò)增黑鯛h印cidin基因的上游引物)R2 5' -CA CTCGAGTTA GAACCTGCAGCAGACACCAC-3 ‘(下劃線部分為 XhoI 酶 切位點(diǎn))分別以包含大黃魚(yú)、黑鯛Wpcidin(CDNA)重組pMD18_T質(zhì)粒為擴(kuò)增模板(本申請(qǐng) 人自行構(gòu)建并測(cè)序正確)，以Fl-Rl為配對(duì)引物擴(kuò)增大黃魚(yú)h印cidin基因(包含前導(dǎo)肽和 成熟肽編碼基因)，擴(kuò)增條件為:100μ 1 體系，941、51^11，941、308，601、308，721、308， 共35個(gè)循環(huán)，pfu高保真Taq酶擴(kuò)增(下同)；F2、R2為上、下游引物，擴(kuò)增黑鯛h印cidin 基因(包含前導(dǎo)肽和成熟肽編碼基因)，反應(yīng)條件為100 μ 1體系，94°C、5min，94°C、30s， 60°C、30s，72°C、30s，35個(gè)循環(huán)。分別利用瓊脂糖凝膠回收兩種h印cidin基因后各去5 μ 1 作為搭橋模板，并以F1、R2為上、下游引物擴(kuò)增h印cidins(h印cidin-linker-h印cidin)串 聯(lián)序列。PCR 擴(kuò)增條件如下:100μ 1 體系，941、51^11，941、308，551、308，721、308，5個(gè) 循環(huán)，只改變退火溫度為65°C后再反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。三步PCR擴(kuò)增目的片段的回收操作如 下PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5% (W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳分離后，切下含有目的片段的瓊脂糖 凝膠，按照Qiaquick Gel Extraction Kit(購(gòu)自QIAGEN)說(shuō)明書(shū)操作回收DNA片斷。因?yàn)?大黃魚(yú)h印cidin和黑鯛h印cidin前導(dǎo)肽和成熟肽有超過(guò)62%得同源性，并且兩者下游引 物序列只相差兩個(gè)堿基，所以很容易相互配對(duì)，當(dāng)使用Fl、R2配對(duì)引物時(shí)，便能擴(kuò)增出兩條 DNA帶型，較小的是大黃魚(yú)h印cidin序列，較大的是h印cidins串聯(lián)序列，當(dāng)進(jìn)行回收時(shí)，只 切下較大的h印cidins序列。表達(dá)載體pET32/h印cidins中目的融合基因?qū)?yīng)的氨基酸序 列如下，其目的基因表達(dá)產(chǎn)物包含腸激酶切位點(diǎn)、6XHis-Tag和連接肽氨基酸序列(將其 編碼的串聯(lián)多肽序列命名為h印cidins) (3)hepcidins目的片段與pET32a載體的酶切、連接與鑒定用NcoI和XhoI雙限 制性內(nèi)切酶酶切h印cidins目的片段和pET32a載體，置于37°C溫箱，8h以上，利用瓊脂糖 凝膠電泳回收酶切后h印cidins片段和pET32a線性載體，回收后的片段再進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳檢測(cè)，依照回收量配制ΙΟμΙ連接體系，采用Τ4連接酶(購(gòu)自寶生物工程(大連)有 限公司)，16°C冷循環(huán)水浴過(guò)夜，次日按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，次日用無(wú)菌牙簽挑取10-20個(gè)陽(yáng)性克隆，以Fl和R2為配對(duì)引物，菌落PCR鑒定克隆子，再選取兩個(gè)PCR陽(yáng)性克隆 接種6ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm搖床培養(yǎng)過(guò)夜，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用NcoI和 XhoI雙限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒，反應(yīng)體系為質(zhì)粒10 μ 1，IOX酶反應(yīng)緩沖液2 μ 1，限制 性內(nèi)切酶各1 μ 1，無(wú)菌MiliQ水補(bǔ)至總反應(yīng)體積20 μ 1，于37°C溫箱反應(yīng)3h ；取8μ 1反應(yīng) 液進(jìn)行2% (W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳鑒定。將能夠被酶切的重組陽(yáng)性克隆送公司進(jìn)行 DNA核苷酸序列測(cè)定。根據(jù)大黃魚(yú)抗菌肽PC-t^pc基因和黑鯛抗菌肽AS-h印c2基因合成Fl、Rl、F2、R2 四條引物，其中引物Fl和引物Rl配對(duì)擴(kuò)增大黃魚(yú)h印cidin基因，引物F2和引物R2配對(duì)擴(kuò) 增黑鯛h印cidin基因，引物Fl和引物R2配對(duì)，與相應(yīng)模板反應(yīng)可擴(kuò)增的h印cidins串聯(lián)目 的產(chǎn)物；35個(gè)PCR反應(yīng)后，分別得到大黃魚(yú)h印cidin基因、真鯛h印cidin基因和h印cidin 串聯(lián)基因，瓊脂糖凝膠電泳分別顯示大小為212bp、222bp和416bp(參見(jiàn)圖1)。2. pET32/hepcidins重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)1)小量誘導(dǎo)表達(dá)用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取經(jīng)測(cè)序鑒定正確的pET32/ h印cidins重組質(zhì)粒，用熱擊法將pET32a空質(zhì)粒和pET32/h印cidins重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于表達(dá)用LB瓊脂平板(含50 μ g/ml Amp)，37°C培養(yǎng)過(guò)夜； 挑取若干pET32a空質(zhì)粒和pET32/h印cidins重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板生長(zhǎng)的單菌落，分別接種 于IOml LB表達(dá)用培養(yǎng)基中(含50 μ g/ml Amp)，200rpm/min, 37°C培養(yǎng)至菌濃度0D600約 為0. 5 0. 6，然后加入IPTG至終濃度為0. 4mMol/ml，在29°C、180rpm,搖床培養(yǎng)7h。離心 收集菌體，用PBS約20ml懸浮菌體，超聲破碎后，12000rpm, 30min離心超聲液，取上清，以 12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，可見(jiàn)菌體上清中可溶性的表達(dá)產(chǎn)物(參見(jiàn)圖2)。3.親和層析法純化h印cidin融合表達(dá)產(chǎn)物1)上柱樣品的制備將具有較高可溶性表達(dá)hepcidin的菌株，大量誘導(dǎo)表達(dá)1升LB培養(yǎng)基，離心收集 菌體；用預(yù)冷的PBS(15ml/g濕菌)懸浮菌體，冰浴放置30min ；冰浴下超聲破碎菌體至菌液 較清無(wú)粘性；12，OOOrpm高速冷凍離心30min，取上清用0. 45 μ m膜過(guò)濾后，至此準(zhǔn)備好了上 柱樣品。2)準(zhǔn)備金屬鏊合層析柱金屬鏊合層析填料為s印harose fast flow (GE Healthcare)，親和層析介質(zhì)裝柱 后，先過(guò)5ml溶液A鏊合Ni2+金屬離子，用3個(gè)柱體積MiliQ水洗柱；再過(guò)3個(gè)柱體積的溶 液B洗去多余的Ni2+，并用3個(gè)柱體積MiliQ水洗柱；接著過(guò)5個(gè)柱體積溶液C平衡層析 柱，等待上樣。層析試劑為溶液A :200mM硫酸鎳；溶液B :25mM NaH2P04+500mM NaCl pH 4. 0 (用磷酸調(diào) pH)；溶液C :50mM 磷酸緩沖液 +200mM NaCl+40mM 咪唑 pH 8. 0 ；溶液D :50mM 磷酸緩沖液 +150mM NaCl+400mM 咪唑 pH 8. 0 ；全部溶液用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾。3)上柱純化將過(guò)濾后的可溶性上清液全部上柱，同時(shí)用10個(gè)柱體積的溶液C過(guò)柱，洗去未結(jié)
9合的蛋白；再用5個(gè)柱體積的溶液D過(guò)柱洗脫目標(biāo)蛋白；收集洗脫峰，取少量進(jìn)行SDS-PAGE 電泳鑒定，通過(guò)凝膠掃描計(jì)算得知，掃描凝純化后的融合表達(dá)產(chǎn)物具有90%以上的純度 (參見(jiàn)圖3)。4. Hepcidin串聯(lián)融合蛋白的酶切反應(yīng)將融合蛋白于Tris-Cl 緩沖液(20mM Tris-Cl, 150mM NaCl (pH 8.0))中低溫透 析，充分透析后按照帶6XHis重組腸激酶(廣州中大生物科技有限公司)操作手冊(cè)對(duì)該 融合蛋白進(jìn)行酶切(參見(jiàn)圖4)。因?yàn)槿诤系鞍酌盖泻竽艿玫讲粠?biāo)簽序列和融合蛋白的 h印cidins多肽(h印cidins)，而未完全切割和載體蛋白及重組腸激酶均有6 XHis標(biāo)簽，酶 切后混合物用酶切緩沖液適當(dāng)稀釋后以1. 5ml/min流速過(guò)Ni2+親和層析柱，收集穿過(guò)峰后， 便得到目的多肽(參見(jiàn)圖5)。H印cidins多肽從緩沖液(50mM Tris_Cl、50mM NaCl pH 8.0) 緩慢更換透析液至超純水中，去除多肽中鹽類成分。再以0. 22μπι膜過(guò)濾除菌后-80°C低溫 冰箱凍存至低溫冷凍干燥而濃縮目的多肽。冷凍干燥處理后的樣品置于-20°C冰箱保存。5. Hepcidin串聯(lián)蛋白抗菌活性的測(cè)定1)應(yīng)用Bradford法測(cè)定BSA標(biāo)準(zhǔn)品得到蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)公式可計(jì)算出 h印cidins融合表達(dá)蛋白的濃度。2)Hepcidins串聯(lián)多肽抗菌活性的測(cè)定(1)通過(guò)測(cè)定最小抑菌濃度來(lái)評(píng)價(jià)h印cidins串聯(lián)多肽的抗菌活性。①蛋白樣品的稀釋目的蛋白的稀釋按照MIC設(shè)定濃度進(jìn)行，用μ M為單位進(jìn)行稀釋配比，如96、48、 24、12、6、3、1. 5 μ M為梯度在96孔微量培養(yǎng)板上進(jìn)行。蛋白樣品要經(jīng)過(guò)0. 22 μ m過(guò)濾膜過(guò) 濾除菌菌再進(jìn)行稀釋配比，每個(gè)濃度設(shè)置一個(gè)平行孔。②取被測(cè)細(xì)菌，在MH平板上劃線，倒置培養(yǎng)12 16h ；挑取單克隆接種于MH斜面， 繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜達(dá)到中期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段；用DPBS清洗斜面培養(yǎng)物，調(diào)整稀釋至0D600 = 0. 1， 取18 μ 1 0D600 = 0. 1的稀釋菌加入終體積為Iml的MH稀釋培養(yǎng)基(DPBS 600 μ 1，MH 400 μ 1)中，該菌濃度則為MIC工作濃度。其中表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)溫度為 370C，副溶血弧菌、溶壁微球菌、枯草芽孢桿菌和嗜水氣單胞菌培養(yǎng)溫度為28°C。(2)MIC在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，每種被測(cè)細(xì)菌按照以下操作設(shè)置空白對(duì)照組、 陰性對(duì)照組和待測(cè)樣品實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置2個(gè)平行樣①空白對(duì)照組加50 μ 1蛋白樣品和50 μ 1 DPBS ；②陰性對(duì)照組加50 μ 1菌懸液和50 μ 1 DPBS ；③樣品實(shí)驗(yàn)組加50 yd待測(cè)各濃度蛋白樣品和50 μ 1菌懸液；28°C培養(yǎng)24h后，判定h印cidins串聯(lián)多肽對(duì)細(xì)菌的MIC，判定標(biāo)準(zhǔn)為該濃度孔細(xì) 菌數(shù)少于或等于對(duì)照孔(沒(méi)有抗菌肽成分)中的一半。結(jié)果表明，串聯(lián)hepcidins多肽對(duì)表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌、 嗜水氣單胞菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌模式菌和臘狀芽孢桿菌(均購(gòu)自中 國(guó)科學(xué)院微生物研究所(CGMCC)菌種保藏中心)均具有劑量依賴的抑菌活性，h印cidins串 聯(lián)多肽抗菌活性參見(jiàn)表1。表 1
10 (3)以10倍MIC (60 μ Μ)濃度劑量h印cidins多肽對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行殺滅分 析，設(shè)定固定的時(shí)間間隔從培養(yǎng)孔中吸取相等的體積，進(jìn)行同樣的適當(dāng)稀釋后接種到普通 瓊脂板，次日計(jì)數(shù)每板克隆，曲線圖中CFU為各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(Tn)平板克隆數(shù)與起點(diǎn)(即Omin， TO)克隆數(shù)的比值:CFU = Τη/Τ0*100% (η = 15、30、60、90、120 和 180min)(參見(jiàn)圖 6)。一序列表
<110>廈門大學(xué)
<120>兩種魚(yú)類抗菌肽基因的串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物及其表達(dá)方法
<160>3
<170>Patentin
<210>1
<211>198
<212>DNA
<220>
<221>PC-hepc <222>(1)…(198) <400>1
60 120 180 198
gccatggcga atggtgtccc gctgatccag agatgccagt cagggcagcc ctgctagatg ggtatctgct gcaggttc
agccaatgaa gagcaagagc ggaatcatgc aagatgccgt caggttttgc tgccgttgct
tggagcagca aatttatttt attacatgcg tgagaatcgi gtcctagaat gaggggatgt
<210>2 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <221>linker <222>(1)...(18)
<223>根據(jù)大小和鏈接肽要求設(shè)計(jì)，以用作PC-hepc蛋白和AS-hepc2蛋白的接頭的肽。 <400>2
ggt tct cca ggt tcc ggt Gly Ser Pro Gly Ser Gly 15
<210>3 <211>201 <212>DNA <220〉
<221>AS-hepc2
<222>(1)...(201)
<400>3
ggctcattca gcacatgaag agccccgctg
tgctgcaggt
ctgaggtgca agaagtcaga gttgtcgctt
tctaactcga
agagccggag ggagtcctgg
ttgctgcggt g
gagccaatga acaatgagag aagatgccgt ataacaacag tgctgtccta acatgagagg
tccagttgct Eicacaagcgc atgtggtgtc
60 120 180
20權(quán)利要求
兩種魚(yú)類抗菌肽基因的串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物，其特征在于所述兩種魚(yú)類抗菌肽基因的串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物的串聯(lián)抗菌肽hepcidins基因分別來(lái)自于大黃魚(yú)抗菌肽hepcidin和黑鯛抗菌肽hepcidin2，均包含前導(dǎo)肽基因，兩者通過(guò)連接肽編碼基因相連。
2.如權(quán)利要求1所述的兩種魚(yú)類Hepcidin串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建和串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物的制 備方法，其特征在于包括以下步驟1)重組表達(dá)載體pET32/h印cidins的構(gòu)建(1)根據(jù)大黃魚(yú)抗菌肽PC-h印c基因和黑鯛抗菌肽AS-h印c2基因合成Fl、Rl、F2、R2 四條引物，其中引物Fl和引物Rl配對(duì)擴(kuò)增大黃魚(yú)h印cidin基因，引物F2和引物R2配對(duì)擴(kuò) 增黑鯛h印cidin基因，引物Fl和引物R2配對(duì)，與相應(yīng)模板反應(yīng)可擴(kuò)增的h印cidins串聯(lián)目 的產(chǎn)物；35個(gè)PCR反應(yīng)后，分別得到大黃魚(yú)h印cidin基因、真鯛h印cidin基因和h印cidin 串聯(lián)基因，瓊脂糖凝膠電泳分別顯示大小為212bp、222bp和416bp ；(2)將回收的h印cidinsPCR產(chǎn)物和pET32a載體用NcoI和XhoI進(jìn)行雙酶切，得到具 有與處理好的預(yù)連接DNA片段和pET32a線性載體，通過(guò)基因克隆常規(guī)方法進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化 和單克隆篩選及鑒定，酶切和測(cè)序結(jié)果顯示h印cidins串聯(lián)序列成功插入到表達(dá)載體并且 讀碼正確；2)pET32/hepcidin重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)用熱擊法將pET32a空質(zhì)粒和pET32/h印cidins重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)感受 態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，以pET32a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21 (DE3)為對(duì)照，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)檢測(cè)融合蛋白表達(dá)量；3)pET32/hepcidins重組質(zhì)粒融合表達(dá)產(chǎn)物的純化(1)hepcidins融合表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析將pET32/h印cidins重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物離心收集菌體，用PBS懸浮菌 體，超聲破碎；離心超聲液取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確認(rèn)表達(dá)產(chǎn)物的可溶性；(2)親和層析法純化hepcidin融合表達(dá)產(chǎn)物將具有較高可溶性表達(dá)hepcidin的菌株大量誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，采用金屬鏊合層 析柱進(jìn)行親和層析，金屬鏊合層析填料為s^harose fast flow，所用層析試劑為溶液A、B、 C 禾口 D ；所述溶液A為Ni2+金屬離子，溶液B洗去多余的Ni2+，溶液C平衡層析柱，將經(jīng)0. 45 μ m 濾膜過(guò)濾后的表達(dá)菌超聲上清液上柱，溶液C過(guò)柱洗去未結(jié)合的蛋白，溶液D過(guò)柱洗脫目標(biāo) 蛋白，收集洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定即為h印cidins融合表達(dá)產(chǎn)物；(3)融合蛋白的酶切反應(yīng)和不帶標(biāo)簽hepcidins多肽的純化將融合蛋白于Tris-Cl緩沖液中低溫透析，充分透析后按照帶6XHis重組腸激酶操 作手冊(cè)對(duì)該融合蛋白進(jìn)行酶切，因?yàn)槿诤系鞍酌盖泻竽艿玫讲粠?biāo)簽序列和融合蛋白的 hepcidins多肽，而未完全切割和載體蛋白及重組腸激酶均有6XHis標(biāo)簽，酶切后混合物 用酶切緩沖液適當(dāng)稀釋后以1. 5ml/min流速過(guò)Ni2+親和層析柱，收集穿過(guò)峰后，便得到目的 多肽；Hepcidins多肽從緩沖液A緩慢更換透析液至超純水中，去除多肽中鹽類成分。再以 0. 22 μ m膜過(guò)濾除菌后-80°C低溫冰箱凍存至低溫冷凍干燥而濃縮目的多肽，冷凍干燥處 理后的樣品置于_20°C冰箱保存；所述緩沖液A為50mM Tris-Cl、50mM NaCl, ρΗ 8. O ；(4)Hepcidins串聯(lián)多肽抗菌活性的測(cè)定a.微滴定肉湯稀釋方法通過(guò)測(cè)定最小抑菌濃度來(lái)評(píng)價(jià)h印cidins串聯(lián)多肽的抗菌活性；b.以最小抑菌濃度10倍MIC濃度劑量h印cidins多肽對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行殺滅分 析，設(shè)定固定的時(shí)間間隔從培養(yǎng)孔中吸取相等的體積，進(jìn)行同樣的稀釋后接種到普通瓊脂 板，次日計(jì)數(shù)每板克隆。
3.如權(quán)利要求2所述的兩種魚(yú)類Hepcidin串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建和串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物的 制備方法，其特征在于在步驟3)的第(3)部分中，所述Tris-Cl緩沖液為20mM Tris-Cl, 150mMNaCl, pH 8· 0。
全文摘要
兩種魚(yú)類抗菌肽基因的串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物及其表達(dá)方法，涉及一種海洋生物的基因工程技術(shù)。提供兩種魚(yú)類抗菌肽基因的串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物以及兩種魚(yú)類Hepcidin串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建和串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物的制備方法。通過(guò)pET32a原核表達(dá)載體串聯(lián)表達(dá)兩種魚(yú)類hepcidin基因，實(shí)現(xiàn)兩種抗菌肽hepcidin同時(shí)可溶性表達(dá)，兩種串聯(lián)抗菌肽表達(dá)量超過(guò)50mg/L，可溶性串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)N末端His-Tag親和層析純化后，再以腸激酶切除串聯(lián)蛋白標(biāo)簽，切后混合物再經(jīng)Ni親和層析柱，獲得純化的Hepcidin串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物。純化表達(dá)產(chǎn)物對(duì)金色葡萄球菌、嗜水單胞氣菌，溶壁微球菌等均有顯著的抑制作用。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101906165SQ201010225669
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者丁建, 王克堅(jiān), 蔡晶晶 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)