專利名稱：聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替甘露糖基馬來(lái)酸)及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)雙嵌段聚合物及其制備方 法，以及其作為外用避孕藥和抑制艾滋病病毒-1型(HIV-1)傳染方面的醫(yī)療用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的外用避孕藥，其主要成分為垸苯醇醚或壬苯醇醚。性生活前將外用避孕藥置放于 陰道內(nèi)，外用避孕藥溶化后可以殺死精子或產(chǎn)生形成油膜和泡沫，使精子失去活動(dòng)能力，而 起到避孕的作用。精子細(xì)胞表面表達(dá)有識(shí)別、結(jié)合卵子細(xì)胞表面甘露糖的蛋白受體(l、Youssef, H. M.; Doncel, G. F.; Bassiouni, B. A.; Acosta, A. A., Mannose-binding sites on human spermatozoa and sperm morphology. FeWz7 Sfen7 1996， 66, (4), 640-5)。甘露糖或甘露糖的衍生物結(jié)合精子細(xì) 胞表面的甘露糖受體后，可以抑制精子細(xì)胞與卵子的結(jié)合(2、 Mori, K.; Daitoh, T.; Kamada, M.; Maeda, N.; Maegawa, M.; Hirano, K.; Irahara, M.; Aono, T" Blocking of human fertilization by carbohydrates. i e/ rad 1993， 8, (10)， 1729-1732; 3、 Tanghe, S.; Van Soom， A.; Duchateau, L.; De Kruif, A., Inhibition of bovine sperm-oocyte fiision by the p-aminophenyl derivative of D-mannose. Mo/及e，odDev 2004， 67, (2), 224-322)。因此甘露糖的衍生物是新型潛在的外用避 孕藥。但是由于甘露糖單糖與蛋白受體的結(jié)合力很弱，需要較高劑量的甘露糖才能達(dá)到有效 抑制精子與卵子的結(jié)合。
人的受孕過(guò)程與艾滋病病毒(HIV-l)的性感染都是在生殖系統(tǒng)進(jìn)行的(4、 Fletcher, P. S.; Wallace, G. S.; Mesquita, P. M.; Shattock, R. J., Candidate polyanion microbicides inhibit HIV-1 infection and dissemination pathways in human cervical explants.及"ravZra/ogy 2006， 3， 46)。艾 滋病患者的精子與HIV-1是結(jié)合在一起的，而且精子可以促進(jìn)HIV-1病毒的感染(5、 Lopez-Herrera, A.; Liu, Y.; Rugeles, M. T.; He, J. J.， HIV-1 interaction with human mannose receptor (hMR) induces production of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) through hMR陽(yáng)mediated intracellular signaling in astrocytes.歷ocW附歷optysXcta 2005， 1741， (1-2), 55-64)。殺微生物齊廿 是性生活前應(yīng)用于陰道內(nèi)，能夠直接殺滅或中和HIV- 1等病原體的、人工合成的或天然的 物質(zhì)。已有預(yù)防HIV -1傳播的殺微生物劑上市，更多的進(jìn)入臨床試驗(yàn)(6、Klasse, P. J.; Shattock, R.; Moore， J. P., Antiretroviral drug-based microbicides to prevent HIV-1 sexual transmission. JwwwMed 2008， 59, 455-71)。殺微生物劑的有效成分為帶有多個(gè)負(fù)電荷的物質(zhì)。這些物質(zhì)與 HIV-1病毒表面的糖蛋白gpl20的帶有多個(gè)正電荷的V3片段結(jié)合，從而阻礙gpl20與CD4 等受體結(jié)合，達(dá)到抑制HIV-1感染的目的(4、 Fletcher, P. S.; Wallace, G. S.; Mesquita, P. M.;
Shattock, R. J.， Candidate polyanion microbicides inhibit HIV-1 infection and dissemination pathways in human cervical explants. i e加v/ra/ogy 2006， 3, 46)。
本發(fā)明的目的在于提供一種聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)。 本發(fā)明的另一目的在于提供聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)作為外用避孕
藥和抑制艾滋病病毒-l型(HIV-1)傳染方面的醫(yī)療用途。
本發(fā)明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)的組成及其按質(zhì)量百分比的
含量為聚苯乙烯30%，聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)70%，分子量為22000，其結(jié)構(gòu)
式為
式中，m， n為聚合度。
本發(fā)明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)可通過(guò)以下方法制備。 將聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-馬來(lái)酸酐)溶解在二甲基甲酰胺溶劑中，在三乙胺的催化下， 加入含有氨基的甘露糖，攪拌反應(yīng)，向反應(yīng)體系中加入水，然后在超聲波下超聲后得到聚苯 乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒溶液。將聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基 馬來(lái)酸)納米顆粒溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中透析，除去反應(yīng)體系中的含有氨基的甘露糖、二甲基甲 酰胺和三乙胺，得到表面連接甘露糖的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒 水溶液。
本發(fā)明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)可用于制備外用避孕藥物。 本發(fā)明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)可用于制備外用抗艾滋病藥物。
本發(fā)明將聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-馬來(lái)酸酐)與含有氨基的甘露糖通過(guò)化學(xué)反應(yīng)和超聲
發(fā)明內(nèi)容波處理得到聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒。
聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)顆粒與精子孵育后，在熒光共聚焦顯微鏡下 檢測(cè)細(xì)胞表面，發(fā)現(xiàn)連接甘露糖的納米顆粒與精子結(jié)合在一起，形成高度聚合體。
表達(dá)HIV-1病毒受體CD4、 CCR5、 CXCR4的Hela細(xì)胞(TZM-W細(xì)胞株)很容易被外 源HIV-1病毒感染。TZM-bl細(xì)胞株含有單拷貝報(bào)告基因pgal。 TZM-B1細(xì)胞被HIV-1感染后， 報(bào)告基因Pgal被激活導(dǎo)致P-半乳糖水解酶的表達(dá)。被HIV-1感染TZM-bl細(xì)胞內(nèi)的P-半乳糖 水解酶催化水解底物X-gal后，產(chǎn)生藍(lán)色顏料沉積在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞顯藍(lán)色。HIV-1病毒對(duì)細(xì)胞 的感染被聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒抑制后，由于沒(méi)有p-半乳糖水 解酶的表達(dá)，TZM-bl與X-gd混合后，細(xì)胞不變色。因此通過(guò)計(jì)量顯色細(xì)胞的比例可以得到 聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒隊(duì)HIV-1感染的抑制效果。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明的有益效果是
(1) 聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒與精子有較強(qiáng)的結(jié)合力，可以 置于陰道內(nèi)，用于阻斷精子與卵子的結(jié)合而達(dá)到避孕的效果。
(2) 該納米顆粒對(duì)HIV-1的感染有很強(qiáng)抑制效果，達(dá)到半抑制率的劑量為lpg/mL。由 于對(duì)細(xì)胞的毒性很低，聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆?？梢宰鳛橛行У?殺微生物劑，置于陰道或者直腸內(nèi)預(yù)防HIV-1的性傳播。
(3) 制備的連接聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒表面含有多個(gè)甘露 糖。納米顆粒表面的多個(gè)甘露糖與精子表面的多個(gè)甘露糖蛋白受體可以同時(shí)結(jié)合，得以大大 提高納米顆粒與精子的結(jié)合力，在低劑量下可以抑制精子參與受孕。制備的聚苯乙烯-聚(苯 乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒表面含有多個(gè)帶有負(fù)電荷的碳酸根集團(tuán)，可以作為新型 殺微生物劑預(yù)防HIV-1傳播。兼有殺精子作用的新型高效殺微生物劑是具有潛在的應(yīng)用前景 和廣泛市場(chǎng)。
(4) 聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒與精子有很強(qiáng)的結(jié)合力，在抑 制精子參與受孕，作為外用避孕藥方面有很好的應(yīng)用前景；這些納米顆粒高效抑制HIV-1對(duì) T細(xì)胞的感染，可以作為潛在新型殺微生物劑預(yù)防HIV-1傳播。
具體實(shí)施例方式
將0.4g聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-馬來(lái)酸酐)溶解在3ml二甲基甲酰胺(DMF)溶劑中， 在三乙胺的催化下，加入0.3g含有氨基的甘露糖，攪拌反應(yīng)5h。向反應(yīng)體系中加入17ml水， 然后在超聲波下超聲30min后得到聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒水溶 液(50 110nm),轉(zhuǎn)移到透析袋(MWCO: 3000)中透析，除去反應(yīng)體系中的含有氨基的甘露糖、DMF和三乙胺，得到表面連接甘露糖的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米 顆粒的水溶液。將透析過(guò)的水溶液冷凍干燥得到聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸) 納米顆粒的粉末狀固體。
將得到的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒10mg與熒光分子羅丹明 (Rhodamine 6G) lmg溶解在0.3ml DMF中。向反應(yīng)體系中加入2.7ml水后在超聲波下超聲 30min，得到包含有羅丹明6G的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒。
將精子細(xì)胞與包含有羅丹明的、聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒在 37'C孵育，20min后，離心分離細(xì)胞，除去沒(méi)有與細(xì)胞結(jié)合的納米顆粒。在熒光共聚焦顯微 鏡下觀察，精子細(xì)胞表面含有高強(qiáng)度的熒光。說(shuō)明聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸) 納米顆粒吸附在精子細(xì)胞表面。與不加入該納米顆粒的參照對(duì)比，與聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交 替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒孵育的精子之間聚集成團(tuán)，說(shuō)明聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露 糖基馬來(lái)酸)納米顆粒表面的甘露糖與多個(gè)精子細(xì)胞表面的蛋白受體結(jié)合力強(qiáng)，導(dǎo)致聚集。由 此可見(jiàn)，本發(fā)明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)可用于制備外用避孕藥 物。
表達(dá)HIV-1受體CD4、 CCR5、與CXCR4的TZM-B1細(xì)胞，HIV-1病毒，與不同含量的 聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒加入到DMEM中，于37。C在C02培養(yǎng) 箱培養(yǎng)48h。通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因X-gal的表達(dá)量來(lái)測(cè)量納米顆粒對(duì)HIV-1病毒感染的抑制作用。 聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒的半抑制率(ICso)為lpg/mL。由此可 見(jiàn)，本發(fā)明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)可用于制備外用抗艾滋病藥 物。
MT4細(xì)胞與不同劑量的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒在C02培養(yǎng) 箱37'C培養(yǎng)。每隔24h，用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)量細(xì)胞的數(shù)量，以及死亡率。在劑量高達(dá)2pg/mL 時(shí)，6天以后細(xì)胞生長(zhǎng)速度降低30%，但是細(xì)胞無(wú)明顯死亡。在低劑量時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度沒(méi) 有明顯變化。說(shuō)明聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)納米顆粒的細(xì)胞毒性很低。
權(quán)利要求
1.聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替甘露糖基馬來(lái)酸)，其特征在于其組成及其按質(zhì)量百分比的含量為聚苯乙烯30％，聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)70％，分子量為22000，其結(jié)構(gòu)式為式中，m，n為聚合度。
2. 如權(quán)利要求1所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)在制備外用避孕藥 物中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)在制備外用抗艾滋 病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替甘露糖基馬來(lái)酸)及其制備方法與應(yīng)用，涉及一種聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)以及其作為外用避孕藥和抑制艾滋病病毒-1型傳染方面的醫(yī)療用途。其組成及其按質(zhì)量百分比的含量為聚苯乙烯30％，聚(苯乙烯-交替-甘露糖基馬來(lái)酸)70％，分子量為22000?？捎糜谥苽渫庥帽茉兴幬??？捎糜谥苽渫庥每拱滩∷幬?。
文檔編號(hào)A61P15/00GK101319022SQ20081007144
公開(kāi)日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2008年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月22日
發(fā)明者磊 李, 蘇榮敏, 陳小平, 韓守法, 韓家淮 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)