專利名稱：金黃色葡萄球菌免疫組合物的制作方法
金黃色葡萄球菌免疫組合物(一) 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及金黃色葡萄球菌免疫組合物，屬于獸藥技術(shù)領(lǐng)域。(二) 發(fā)明背景奶牛乳腺炎是危害奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病之一，乳腺炎不但能使奶 的產(chǎn)量和奶的品質(zhì)下降，嚴(yán)重者還能導(dǎo)致病牛生產(chǎn)性能的喪失。金黃色葡萄球菌是引發(fā)奶牛乳腺炎的主要病原菌，大約50%以上的乳腺炎是由該菌引起。而通 過(guò)對(duì)金葡菌感染機(jī)體過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌黏附蛋白與哺乳動(dòng)物上 皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)黏附的能力的大小，與金黃色葡萄球菌的致病力成正相關(guān)。 在金黃色葡萄球菌致病過(guò)程中，纖連蛋白連接蛋白和聚集因子被認(rèn)為是金黃色 葡萄球粘附于寄主細(xì)胞的最重要粘附因子。黏附蛋白的表達(dá)更是有助于細(xì)菌的 侵入、定植和感染。聚集因子是金黃色葡萄球菌粘附素中最重要的蛋白之一。在兔心內(nèi)膜炎模 型中，缺少聚集因子的金黃色葡萄球菌突變株毒力下降，而能引起心內(nèi)膜炎弱 毒菌株(像鏈球菌)引入聚集因子基因后，細(xì)菌的毒力極大的增強(qiáng)。目前研究 認(rèn)為，金黃色葡萄球菌分泌的粘附素蛋白可以粘附或穿透宿主細(xì)胞的纖維蛋白 原或纖維蛋白。并且在粘附素蛋白溶解纖維蛋白原后，細(xì)菌能夠有效的躲避機(jī) 體的吞噬作用。本發(fā)明對(duì)聚集因子基因進(jìn)行了擴(kuò)增，構(gòu)建了克隆和重組原核表達(dá)載體，并 進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，制備了抗體。通過(guò)序列分析可以發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌聚集因 子高度保守。通過(guò)聚集因子抗血清活性檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)抗聚集因子抗體，可以阻 止一定量的金黃色葡萄球菌與細(xì)胞的黏附。綜上所述，聚集因子蛋白高度保守，其抗體可以阻止金黃色葡萄球菌對(duì)細(xì) 胞的黏附作用。因此聚集因子作為保護(hù)性抗原免疫動(dòng)物，可以降低金黃色葡萄球菌對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，從而降低金黃色葡萄球菌的在動(dòng)物粘膜的定植能 力，。從而起到降低感染金黃色葡萄球菌的機(jī)會(huì)。通過(guò)用金黃色葡萄球菌纖連蛋白連接蛋白的抗體對(duì)細(xì)菌進(jìn)行粘附阻止試驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)，可阻止73.24%的金黃色葡萄球菌粘附到哺乳動(dòng)物細(xì)胞。不僅如此，該抗體還是一種調(diào)理素，可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)細(xì)菌的清除作用。本發(fā)明獲教育部高校科技創(chuàng)新工程重大項(xiàng)目培育資金項(xiàng)目，"金黃色葡萄球菌黏附素基因激發(fā)奶牛乳腺抗感染免疫作用研究"(CN0706039 )資助。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是依據(jù)金黃色葡萄球菌感染機(jī)體過(guò)程，首先是通過(guò)其黏附素基因 表達(dá)的黏附蛋白黏附于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，而且其黏附的能力的 大小，與金黃色葡萄球菌的致病力成正相關(guān)。因此，克隆奶牛乳腺炎金黃色葡 萄球菌黏附素主要功能基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物與免 疫增效劑和保護(hù)劑配合后，用于阻止和防御金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺的黏附 和感染，保障乳品衛(wèi)生安全，減少養(yǎng)殖戶的損失，促進(jìn)奶牛業(yè)的發(fā)展和人類健 康。本發(fā)明涉及金黃色葡萄球菌黏附素基因表達(dá)產(chǎn)物即纖連蛋白連接蛋白和聚 集因子，以及免疫增效劑和保護(hù)劑，各有效成分按重量所占比例為纖連蛋白 連接蛋白和聚集因子各350mg，免疫增效劑白介素-18 1000萬(wàn)單位，保護(hù)劑甘 油生理鹽水1000ml，經(jīng)加工制備后混合即成。本發(fā)明對(duì)聚集因子基因進(jìn)行了擴(kuò)增，構(gòu)建了克隆和重組原核表達(dá)載體，并 進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，制備了抗體。通過(guò)序列分析可以發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌聚集因 子高度保守。通過(guò)聚集因子抗血清活性檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)抗聚集因子抗體，可以阻 止一定量的金黃色葡萄球菌與細(xì)胞的黏附。通過(guò)用金黃色葡萄球菌纖連蛋白連 接蛋白的抗體對(duì)細(xì)菌進(jìn)行粘附阻止試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，可阻止73. 24%的金黃色葡萄球菌 粘附到哺乳動(dòng)物細(xì)胞。不僅如此，該抗體還是一種調(diào)理素，可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)細(xì) 菌的清除作用通過(guò)試驗(yàn)證明纖連蛋白連接蛋白和聚集因子蛋白抗體可以阻止金黃色葡萄 球菌對(duì)細(xì)胞的黏附作用。并通過(guò)小鼠體內(nèi)試驗(yàn)證明可以對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生 防御作用。因此，纖連蛋白連接蛋白和聚集因子作為保護(hù)性抗原免疫動(dòng)物，可 以降低金黃色葡萄球菌對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的轱附，從而降低金黃色葡萄球菌的在動(dòng) 物粘膜的定植能力，從而起到降低感染金黃色葡萄球菌機(jī)會(huì)的作用。(四) 發(fā)明附1為金黃色葡萄球菌免疫組合物制備工藝流程圖。圖中l(wèi)是纖連蛋白連接蛋白基因引物和聚集因子基因引物，2是基因擴(kuò)增， 3是纖連蛋白連接蛋白的基因表達(dá)及其產(chǎn)物和聚集因子的基因表達(dá)及其產(chǎn)物，4 是兩種表達(dá)產(chǎn)物的混合物，5是添加免疫增效劑，6是添加保護(hù)劑；7是混均分 裝，8是凍干質(zhì)檢，9是入庫(kù)。(五) 最佳實(shí)施方式 本免疫組合物的加工工藝流程纖連蛋白連接蛋白基因引物—擴(kuò)增—表達(dá)—產(chǎn)物+聚集因子基因引物—擴(kuò) 增—表達(dá)—產(chǎn)物+免疫增效劑+保護(hù)劑—混均—分裝—凍干—質(zhì)檢—入庫(kù)。首先分別設(shè)計(jì)纖連蛋白連接蛋白基因引物和聚集因子基因引物U)，然后 分別進(jìn)行擴(kuò)增(2)，分別重組載體質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)(3);兩種表 達(dá)產(chǎn)物各取350mg混合(4),添加免疫增效劑白介素-18 1000萬(wàn)單位(5),保 護(hù)劑甘油生理鹽水1000ral (6),混均后分裝(7)，凍干質(zhì)檢(8)，入庫(kù)(9 )。本組合物的使用方法(1) 每瓶用50ml注射用水溶解后，按每頭牛2ml劑量，注射于乳房基部。(2) 時(shí)間干乳期和分娩2周后個(gè)一次。
權(quán)利要求
1、一種金黃色葡萄球菌免疫組合物，其特征在于纖連蛋白連接蛋白和聚集因子的擴(kuò)增表達(dá)后，各取350mg，添加免疫增效劑白介素-18 150mg和甘油生理鹽水1000ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及金黃色葡萄球菌免疫組合物，主要由纖連蛋白連接蛋白和聚集因子，以及免疫增效劑和保護(hù)劑組成，各有效成分按重量所占比例為纖連蛋白連接蛋白和聚集因子各350mg，免疫增效劑和保護(hù)劑各150mg。本黏附素基因表達(dá)產(chǎn)物組合物用于預(yù)防奶牛金黃色葡萄球菌性乳腺炎。其加工工藝為分別設(shè)計(jì)金黃色葡萄球菌黏附素主效基因纖連蛋白連接蛋白和聚集因子的基因引物，通過(guò)擴(kuò)增和批量表達(dá)，制備為黏附素基因表達(dá)產(chǎn)物，再加入免疫增效劑白介素-18和保護(hù)劑甘油生理鹽水1000ml，混均后分裝，50ml/瓶、凍干、質(zhì)檢、入庫(kù)。使用方法每瓶用50ml注射用水溶解后，按每頭牛2ml劑量，注射于乳房基部。
文檔編號(hào)A61K39/095GK101322843SQ20081013824
公開(kāi)日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2008年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日
發(fā)明者張善瑞, 楊宏軍, 趙宏坤, 志 陳 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)