專利名稱：牛皮質(zhì)骨植骨材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于骨組織工程學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種植骨材料的制備方法。
背景技術(shù)：
由于創(chuàng)傷、骨病等造成骨缺損的修復(fù)一直是骨科治療的一個難題。自體骨和同種異體骨 移植應(yīng)用廣泛，療效較好，但均有一定局限性。自體骨存在著來源受限，影響供區(qū)功能，增 加手術(shù)創(chuàng)傷及感染等缺點；同種異體骨來源也受到限制，且有傳染艾滋病病毒、肝炎病毒等 疾病的危險。人工骨的孔隙結(jié)構(gòu)、降解能力及生物性能遠(yuǎn)不及天然骨。異種骨作為一種生物 組織，具有來源廣泛、價格低廉、易于大量獲取等優(yōu)點，具備天然的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較好的 生物力學(xué)強度，比人工合成骨材料更易于吸收、替代和降解，目前越來越受到骨組織工程學(xué) 的重視。異種骨包括牛骨、豬骨、鹿骨，羊骨等，其中以牛骨和豬骨研究較多，又以牛骨的 應(yīng)用研究最多，因其尺寸和力學(xué)強度更符合骨移植材料的要求。但牛骨作為一種異種骨具有 較強的抗原性，植入人體后能夠誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，因此必須通過各種處理方式來減弱其抗 原性。目前用于實驗和臨床的牛骨植骨材料是通過高溫煅燒、冷凍和凍干、物理化學(xué)等處理， 植骨后效果多不理想。煅燒骨是將牛骨經(jīng)高溫煅燒除去骨中有機質(zhì)而成，雖能徹底消除抗原 性，但對材料的力學(xué)性能和降解性能有影響，且破壞了骨中的天然活性誘導(dǎo)成分。通過理化 方法處理的牛骨由于強氧化劑的應(yīng)用，去除抗原的同時破壞了成骨誘導(dǎo)因子和膠原結(jié)構(gòu)，降 低了其成骨誘導(dǎo)性和力學(xué)強度。因此，經(jīng)處理后力學(xué)性能較差，含成骨因子較低。因此，如 何對異種骨進行加工處理，使其在降低抗原性的同時也能很大程度地保留成骨誘導(dǎo)活性和適 當(dāng)?shù)纳锪W(xué)強度，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員開發(fā)出新型的植骨材料具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗原性低、成骨誘導(dǎo)能力強、 生物力學(xué)強度高的牛皮質(zhì)骨植骨材料的制備方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種牛皮質(zhì)骨植骨材料的制備方法，包 括以下步驟將潔凈后的牛皮質(zhì)骨塊先進行脫脂、脫鈣，再將其放入骨形態(tài)發(fā)生蛋白降解酶 的抑制劑中浸泡，然后再經(jīng)脫蛋白處理，最后經(jīng)冷凍干燥后制得牛皮質(zhì)骨植骨材料。
上述制備方法具體包括以下步驟 (1)潔凈處理將牛皮質(zhì)骨周圍的軟組織、骨膜及骨髓去凈并切割成牛皮質(zhì)骨塊(大小
可為長3mmx寬3mmx高5 mm)，用溫水沖洗牛皮質(zhì)骨塊、瀝干；所述牛皮質(zhì)骨優(yōu)選牛的長 管狀骨中的皮質(zhì)骨；
(2) 脫脂在可密閉容器中盛入氯仿-甲醇混合溶液，將潔凈后的牛皮質(zhì)骨塊放入該密 閉容器內(nèi)浸泡，不斷更換新的氯仿-甲醇混合溶液直至其不再變渾濁， 一般脫脂浸泡的時間為 48~72小時；所述氯仿-甲醇混合溶液中氯仿與甲醇的體積比為(1~3) : 1，優(yōu)選控制在1 : 1， 而浸泡時的牛皮質(zhì)骨塊與氯仿-甲醇混合溶液的體積比優(yōu)選控制在1 : 3;浸泡脫脂完畢后可用 蒸餾水將殘留在牛皮質(zhì)骨塊上的有機溶劑沖洗干凈；
(3) 脫鈣將脫脂后的牛皮質(zhì)骨塊放入盛有鹽酸(濃度為0.6mol/L)的可密閉容器中浸 泡脫鈣， 一般浸泡18~36小時即可，浸泡過程中可對鹽酸進行更換，浸泡時的溫度優(yōu)選控制 在4t;浸泡脫鈣完畢后可用蒸餾水漂洗至pH值接近中性，以使其接近人體生理的pH值水 平，漂洗后瀝干；
(4) BMP的穩(wěn)定化將脫鈣后的牛皮質(zhì)骨塊放入盛有6~12mmol/L的N-乙基馬來酰亞 胺溶液的容器中(濃度優(yōu)選10mmol/L)，室溫下一般浸泡24~48小時即可，再瀝干；N-乙基 馬來酰亞胺溶液可以對抗骨組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)降解酶，從而減少BMP的溶解， 提高植骨材料的成骨活性；
(5) 脫蛋白處理將BMP穩(wěn)定化后的牛皮質(zhì)骨塊放入盛有木瓜蛋白酶(;w/7d")溶液 的密閉容器中進行脫蛋白，每克牛皮質(zhì)骨塊需要300 900u(優(yōu)選500u)木瓜蛋白酶進行處理， 所述木瓜蛋白酶溶液的pH值控制在5.0~7.5，牛皮質(zhì)骨塊與木瓜蛋白酶溶液的體積比控制在 1 : (1~6);在木瓜蛋白酶溶液中浸泡的溫度控制在39 68'C (優(yōu)選控制在50'C 6(TC)，浸泡 時間一般不短于18小時(優(yōu)選18 36小時)；脫蛋白后可用蒸餾水沖洗、瀝干；
(6) 冷凍干燥脫蛋白處理后的牛皮質(zhì)骨塊在-72'C -80'C的溫度下凍結(jié)干燥得到植骨 材料，并滅菌密封保存。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于首先，本發(fā)明選擇了抗原性低、含成骨誘導(dǎo)因子 BMP較高且生物力學(xué)強度好的牛皮質(zhì)骨作為原料，在選材上進行了第一次優(yōu)化；其次，在植
骨材料的制備過程中加入了BMP降解酶抑制劑以減少BMP的自溶，穩(wěn)定BMP的活性，通 過不斷釋放自身BMP持續(xù)作用于宿主的間充質(zhì)細(xì)胞，可使之不斷分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞 誘導(dǎo)新骨形成，提高了植骨材料的成骨活性；再次，本發(fā)明使用較溫和的木瓜蛋白酶進行脫 蛋白處理，減少了對植骨材料中膠原蛋白和成骨因子的破壞，同時結(jié)合脫脂、脫鈣、冷凍干
燥協(xié)助降低抗原性，最大限度地保留了成骨活性。由于加強了對成骨誘導(dǎo)因子和膠原蛋白的 保護，本發(fā)明制備的牛皮質(zhì)骨植骨材料植入動物骨缺損處后傷口未見明顯滲液，無感染發(fā)生; 組織學(xué)觀察淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤較少；植入動物肌肉內(nèi)可見異位成骨跡象，說明該材料
具有低抗原性、較好的成骨誘導(dǎo)能力、更好的生物力學(xué)強度和生物相容性，既可以作為骨缺 損的充填材料，又可以復(fù)合各種成骨因子、種子細(xì)胞以構(gòu)建組織工程骨。此外，本發(fā)明的制 備方法步驟簡單、用料來源廣泛、成本低，在今后的骨移植醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及臨床骨缺損的修復(fù)上 具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施例方式
實施例
一種本發(fā)明的牛皮質(zhì)骨植骨材料，通過以下方法制備得到-
(1) 取材及潔凈處理清潔條件下，取檢驗合格(經(jīng)瘋牛病毒原檢測)宰殺6小時內(nèi)的 小牛(1~3歲)的長管狀骨，用電鋸鋸去兩側(cè)干骺端，骨刀去凈周圍軟組織、骨膜及骨髓，最 后用電鋸切割成約長3mmx寬3mmx高5 mm大小皮質(zhì)骨塊；用40'C 5(TC溫水將牛皮質(zhì)骨塊表 面的脂肪和血跡沖洗干凈，瀝干；
(2) 脫脂在可密閉的玻璃容器中盛入氯仿與甲醇體積比為1 : 1的氯仿-甲醇混合溶液 (簡稱脫脂液)，將潔凈處理后的牛皮質(zhì)骨塊按骨液體積比約1 : 3放入玻璃容器內(nèi)并在室溫
下浸泡，浸泡脫脂過程中每隔4小時用無菌玻棒攪拌3~5分鐘，每12小時更換一次脫脂液， 直到更換后的脫脂液經(jīng)一段時間脫脂后顏色仍然澄清為止(浸泡時間約為72小時)；更換脫 脂液時用蒸餾水沖洗凈容器內(nèi)的軟組織殘渣，并將骨塊置入離心機內(nèi)離心約30分鐘(3000 轉(zhuǎn)/分)以清除骨塊內(nèi)脂滴；脫脂完畢后用蒸餾水反復(fù)沖洗牛皮質(zhì)骨塊至無氯仿、甲醇?xì)馕叮?再用蒸餾水透析24小時，以去除殘留的有機溶劑，最后瀝干；
(3) 脫鈣將脫脂后的牛皮質(zhì)骨塊放入盛有0.6mol/L鹽酸的可密閉容器中，在4'C環(huán)境 下浸泡脫鈣20小時，期間每12小時更換一次鹽酸；浸泡脫鈣后用蒸餾水漂洗牛皮質(zhì)骨塊至 pH值接近中性，以使其接近人體生理的pH值水平，然后瀝干；
(4) BMP的穩(wěn)定化將脫鈣后的牛皮質(zhì)骨塊放入盛有1Ommol/L的N-乙基馬來酰亞胺 溶液的容器中，室溫下浸泡30小時，瀝干；
(5) 脫蛋白處理將BMP穩(wěn)定化后的牛皮質(zhì)骨塊放入盛有木瓜蛋白酶溶液(酶溶液可現(xiàn) 配現(xiàn)用)的密閉容器中脫蛋白，木瓜蛋白酶溶液的pH值控制在7.0左右，每克牛皮質(zhì)骨塊用500u
的木瓜蛋白酶進行處理，骨液體積比控制在i : 3，然后將密閉容器放入恒溫水浴箱內(nèi)，水浴
溫度控制在5(TC，處理時間為18小時，期間每隔6小時更換木瓜蛋白酶溶液一次；脫蛋白完畢 后用蒸餾水反復(fù)沖洗浸泡24小時后瀝干；
(6)冷凍干燥將脫蛋白處理后的牛皮質(zhì)骨塊放入-72'C -8(TC凍干機內(nèi)凍結(jié)干燥24小 時，得到本發(fā)明的牛皮質(zhì)骨植骨材料；將冷凍千燥的牛皮質(zhì)骨塊用雙層塑料袋包裝好封口放 入環(huán)氧乙垸滅菌器內(nèi)滅菌，環(huán)氧乙烷的質(zhì)量濃度控制在500mg/L，溫度是40。C，濕度為50%, 作用時間4小時，消毒強度在2000 mg/ (h七)；消毒后隨機進行抽樣細(xì)菌培養(yǎng)，無菌生長后 置fC冰箱中保存。
權(quán)利要求
1、一種牛皮質(zhì)骨植骨材料的制備方法，包括以下步驟將潔凈后的牛皮質(zhì)骨塊先進行脫脂、脫鈣，再將其放入骨形態(tài)發(fā)生蛋白降解酶的抑制劑中浸泡，然后再經(jīng)脫蛋白處理，最后經(jīng)冷凍干燥后制得牛皮質(zhì)骨植骨材料。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白降解酶的抑制劑為 N-乙基馬來酰亞胺溶液，其濃度為6 12mmol/L。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于在所述N-乙基馬來酰亞胺溶液中浸泡 的時間為24~48小時。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述脫蛋白處理主要是指將牛皮質(zhì)骨塊 浸泡于木瓜蛋白酶溶液中進行脫蛋白，每克牛皮質(zhì)骨塊需要300 900u木瓜蛋白酶進行處理， 所述木瓜蛋白酶溶液的pH值控制在5.0~7.5，牛皮質(zhì)骨塊與木瓜蛋白酶溶液的體積比控制在 1 : (1~6)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于在木瓜蛋白酶溶液中浸泡的溫度控制在 39~68 °C ，時間為18~36小時。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的制備方法，其特征在于所述牛皮質(zhì)骨為牛的長管狀 骨中的皮質(zhì)骨。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的制備方法，其特征在于所述脫脂過程主要是指將潔 凈后的牛皮質(zhì)骨塊放入氯仿-甲醇混合溶液中浸泡脫脂，不斷更換新的氯仿-甲醇混合溶液直 至其顏色不再變渾濁。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述氯仿-甲醇混合溶液是由體積比為 (1~3) : 1的氯仿和甲醇配制而成，牛皮質(zhì)骨塊與氯仿-甲醇混合溶液的體積比控制在1 : 3。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的制備方法，其特征在于所述脫鈣過程主要是指將牛 皮質(zhì)骨塊放入鹽酸中浸泡脫鈣，浸泡時間為18~36小時。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于所述鹽酸的濃度為0.6mol/L，在鹽酸 中浸泡時的溫度控制在4'C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛皮質(zhì)骨植骨材料的制備方法，包括以下步驟將潔凈后的牛皮質(zhì)骨塊先進行脫脂、脫鈣，再將其放入骨形態(tài)發(fā)生蛋白降解酶的抑制劑中浸泡，然后再經(jīng)脫蛋白處理，最后經(jīng)冷凍干燥后制得牛皮質(zhì)骨植骨材料。本發(fā)明的制備方法步驟簡單、用料來源廣泛、成本低，制備得到的植骨材料具有抗原性低、成骨誘導(dǎo)能力強、生物力學(xué)強度高等優(yōu)點。
文檔編號A61F2/28GK101380488SQ20081014342
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月27日
發(fā)明者華 劉, 胡懿郃, 董松庚 申請人:胡懿郃