專利名稱：：用于關(guān)節(jié)軟骨愈合和修復(fù)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及組織修復(fù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及穩(wěn)定的功能性關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)再生。因此，本發(fā)明可以用于整復(fù)外科或用于關(guān)節(jié)軟骨再生或修復(fù)的其它方法。
背景技術(shù)：
：關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)仍是當(dāng)前矯形外科學(xué)的一個(gè)挑戰(zhàn)。目前的幾種治療策略基于軟骨組織和骨軟骨組織的移植。自體骨軟骨移植提供了最合適的生理材料。然而，供體組織是有限的，通常需要在第二個(gè)部位接受手術(shù)，以獲得用于移植的組織。因此，盡管在該領(lǐng)域進(jìn)行了相當(dāng)大的努力，但仍需要一種關(guān)節(jié)軟骨缺損和損傷修復(fù)的有效方法，提供適當(dāng)?shù)纳硇迯?fù)，而不需要/人患者收集自體組織。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供用于合乎生理要求的功能性組織修復(fù)再生的方法和組合物，用于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷和缺損。具體地說(shuō)，本發(fā)明包括治療關(guān)節(jié)軟骨損傷或缺損患者的方法。本發(fā)明的方法和組合物的優(yōu)點(diǎn)是它們利用骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，所述蛋白已知具有骨發(fā)生和/或軟骨發(fā)生特性，并且可以通過(guò)重組DNA^支術(shù)來(lái)生產(chǎn)，因此具有可能無(wú)限的供應(yīng)。本發(fā)明的方法和組合物的另一優(yōu)點(diǎn)是可以加速功能性關(guān)節(jié)軟骨的再生，或功能性關(guān)節(jié)軟骨的再生可能具有更大的最終強(qiáng)度和穩(wěn)定性，并且在缺損或損傷部位形成的組織是合乎生理要求的。應(yīng)用BMP增進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損和損傷的修復(fù)可能產(chǎn)生更好的骨關(guān)節(jié)炎治療方法，因此避免、延遲或減小對(duì)人工髖關(guān)節(jié)置換和其它常用干涉的需要。臨床前評(píng)估表明，rhBMP-2改善了兔子關(guān)節(jié)軟骨全厚度缺損的早期愈合。發(fā)明詳述按照本發(fā)明，提供用于治療患有某些形式的關(guān)節(jié)軟骨損傷或缺損的患者的方法和組合物。所述損傷可能是急性壓迫的結(jié)果、或諸如由于參加體育運(yùn)動(dòng)或可能撕裂、擦傷或者傷害關(guān)節(jié)軟骨的意外發(fā)生所引起的損傷。所述方法和組合物的優(yōu)點(diǎn)是修復(fù)或改善關(guān)節(jié)軟骨缺損、特別是全厚度關(guān)節(jié)軟骨缺損。其它缺損也可以用本發(fā)明的方法和組合物治療，特別是加上使所述缺損部位進(jìn)一步加重以便到達(dá)作為基礎(chǔ)的軟骨下骨的另一種方法。在本發(fā)明中，將活性生長(zhǎng)因子例如一種BMP加入合適的組織源中。所述組織源或者可以是該患者自體的骨軟骨移植物，或者可以包含同種移植物或人工制備的組織。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組織源可以是軟骨細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，例如已經(jīng)通過(guò)離體細(xì)胞培養(yǎng)法、并且加入或不加入額外的生長(zhǎng)因子制備的軟骨細(xì)胞或千細(xì)胞培養(yǎng)物。例如，參見(jiàn)US5226914、US5811094、US5053050、US5486359、US5786217和US5723331的說(shuō)明書。所有這些申請(qǐng)的說(shuō)明書均通過(guò)引用結(jié)合到本文中。所述組織也可以用傳統(tǒng)的基于非細(xì)胞培養(yǎng)的方法獲得，采用例如鑲嵌成形術(shù)(mosaicplasty)的技術(shù)，其中用市售的儀器例如Acufex7[Smith和Nephew,Inc.,AndoverMA]、COR系統(tǒng)[InnovasiveTechnologies,MarlboroughMA]或Arthrex7骨軟骨自體移植物轉(zhuǎn)移系統(tǒng)[Arthrex,Munich,德國(guó)]收集軟骨。所獲得的組織可以直接用于本發(fā)明方法中，或可以與上述基于組織的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)相結(jié)合。生長(zhǎng)因子用于本發(fā)明中的活性生長(zhǎng)因子最好來(lái)自通常稱為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的蛋白亞類，它們已經(jīng)4皮公開為具有骨發(fā)生、軟骨發(fā)生和其它生長(zhǎng)和分化類型的活性。這些BMP包括rhBMP-2、rhBMP-3、rhBMP-4(也稱為rhBMP-2B)、rhBMP-5、rhBMP-6、rhBMP-7(rhOP-l)、rhBMP-8、rhBMP-9、rhBMP-12、rhBMP-13、rhBMP-15、rhBMP陽(yáng)16、rhBMP-l7、rhBMP-l8、rhGDF-l、rhGDF-3、rhGDF-5、rhGDF-6、rhGDF-7、rhGDF-8、rhGDF-9、rhGDF-10、rhGDF-ll、rhGDF-12、rhGDF-14。例如在美國(guó)專利5，108,922、5,013,649、5，116,738、5,106,748、5,187,076和5,141，905中公開的BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7;在PCT說(shuō)明書WO91/18098中公開的BMP-8;和在PCT說(shuō)明書WO93/00432中公開的BMP畫9、在美國(guó)專利5,637,480中公開的BMP-IO、在美國(guó)專利5,639,638中公開的BMP-ll、或在美國(guó)專利5,658,882中公開的BMP-12或BMP-13、在美囯專利5,635,372中公開的BMP-15以及在共同待審的專利申請(qǐng)序號(hào)08/715,202中公開的BMP-16。也可能有用的其它組合物包括Vgr-2和任何生長(zhǎng)分化因子(GDF)，包括在PCT申請(qǐng)W094/15965、W094/15949、WO95/01801、WO95/01802、W094/21681、W094/15966、W095/10539、WO96/01845、WO96/02559和其它申請(qǐng)中公開的那些因子。在本發(fā)明中也有用的是在WO94/01557中公開的BIP、在JP公布號(hào)7-250688中公開的HP00269和在PCT申請(qǐng)WO93/16099中公開的MP52。所有這些申請(qǐng)的說(shuō)明書均通過(guò)引用結(jié)合到本文中。上述蛋白和修飾的蛋白或其部分缺失產(chǎn)物的異二聚體也可用于本發(fā)明。這些蛋白可以單獨(dú)地使用，或作為兩種或更多種蛋白的混合物使用，最好使用rhBMP-2。BMP可以重組產(chǎn)生，也可以/人蛋白組合物中純化。所述BMP可以是同二聚體，或者可以是與其它BMP的異二聚體(例如由BMP-2和BMP-6各一個(gè)單體組成的異二聚體)或與TGF-P超家族其它成員例如活化素、抑制素和TGF-pi的異二聚體(例如由一種BMP和一種TGF-p超家族的相關(guān)成員各一個(gè)單體組成的異二聚體)。這類異二聚體蛋白的實(shí)例描述于例如公開的PCT專利申請(qǐng)WO93/09229中，其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中。此中有用的骨發(fā)生蛋白的量是有效刺激浸潤(rùn)性祖細(xì)胞的骨發(fā)生活性增加的量，這將取決于待治療的缺損的大小和性質(zhì)、以及使用的載體。一般而言，待傳遞的蛋白量范圍為約0.05mg至約1.5mg。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述骨發(fā)生蛋白與能夠誘導(dǎo)腱樣組織或韌帶樣組織形成的有效量的蛋白一起給予。這類蛋白包括BMP-12、BMP-13和BMP-12亞家族的其它成員以及MP52。這些蛋白及其在腱樣組織和韌帶樣組織再生方面的應(yīng)用公開于1994年12月22日申請(qǐng)的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)08/362,670中，其i兌明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，按照下述方法，給予其中一種單體單位是一種骨發(fā)生蛋白例如BMP-2、而另一種單體亞單位是腱誘導(dǎo)蛋白例如BMP-12的一種異二聚體，以誘導(dǎo)結(jié)締組織和骨之間形成功能連接。生長(zhǎng)因子的應(yīng)用生長(zhǎng)因子可以以緩沖液的形式應(yīng)用于組織源。一種優(yōu)選的緩沖液是除包含所述活性生長(zhǎng)因子外還包括約1.0至約10.0%(w/v)甘氨酸、約0.1至約5.0%(w/v)糖最好是蔗糖、約1至約20mM谷氨酸鹽酸鹽和任選的約0.01至約0.1%非離子表面活性劑例如多乙氧基醚的組合物。優(yōu)選的溶液是約1%至約20%w/v纖維素載體/緩沖液。如有需要，可以加入一種鹽?？蛇m用于本發(fā)明方法和組合物中的生長(zhǎng)因子應(yīng)用方面的其它材料包括透明質(zhì)酸、手術(shù)用網(wǎng)或縫線、polyglyconate、溫度敏感聚合物、脫礦質(zhì)骨、礦物質(zhì)和陶瓷，例如磷酸鈣、羥基磷灰石等，以及上述材料的組合。然而在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中不使用載體。在例如上述的適當(dāng)緩沖液中或者與合適的載體組合的本發(fā)明的生長(zhǎng)因子，可以直接應(yīng)用于需要組織修復(fù)的組織和/或部位。例如，所述生長(zhǎng)因子可以通過(guò)噴霧或浸漬、或用刷或其它合適的涂藥器例如注射器，物理應(yīng)用于所述組織?；蛘?，或另外，可以將所述蛋白直接應(yīng)用于需要組織修復(fù)的部位。以下實(shí)施例用BMP-2進(jìn)一步描述本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)施。所述實(shí)施例不是限制性的，正如本領(lǐng)域:技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，可以根據(jù)上述具體描述而變化。具體實(shí)施方式實(shí)施例I.兔同種移植物所有步驟均由IACUC批準(zhǔn)進(jìn)行。使用12只雄性新西蘭白兔(6月齡)。2只兔子作為供體，10只兔子用作受體。從供體的滑車溝(trochleargroove)或股骨中髁獲得骨軟骨移才直物(直徑為3.5mm)，將其移植到受體滑車溝中3.5mm深的缺損中。在移植之前，將移植物或者浸入rhBMP-2(0.5mg/ml)中或者浸入緩沖液對(duì)照中。手術(shù)后4周處死兔子，如Sellers等，丄BoneJointS亂,79-A:1452-1463(1997)描述的，通過(guò)組織學(xué)的組織化學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估移植物和周圍組織。也進(jìn)行組織切片的計(jì)算機(jī)控制圖象分析。用非成對(duì)Studentst檢定評(píng)估結(jié)果。肉眼檢查時(shí)，關(guān)節(jié)未顯示出炎癥體征。所有缺損均充填修復(fù)組織。缺損的表面外觀是可變的，但是可接受的，并且與處理形式無(wú)關(guān)。在3個(gè)關(guān)節(jié)(實(shí)驗(yàn)組中有2個(gè)，對(duì)照H沖液組中有l(wèi)個(gè))中發(fā)現(xiàn)骨贅。在任何缺損的肉目W全查外觀和組織學(xué)外觀之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)。在供體軟骨陷窩中軟骨細(xì)胞的存在和細(xì)胞的散在克隆表明該組織存活。供體軟骨的局灶性退化在對(duì)照組的所有兔子中均存在，但僅在rhBMP-2處理組中的1只兔子中存在。rhBMP-2處理組中缺損的愈合與對(duì)照組相比顯著增加。rhBMP-2處理組的骨整合(bonyintegration)改善，表現(xiàn)為軟骨下骨腔隙中纖維性修復(fù)組織舉交少。用rhBMP-2處理也導(dǎo)致高于原始潮痕(tidemark)的軟骨更多，明顯地由供體組織和新再生的受體軟骨兩者組成。在這兩組之間觀察到的骨總量沒(méi)有顯著差異。表I軟骨修復(fù)的組織學(xué)計(jì)分和組織形態(tài)測(cè)定的測(cè)量結(jié)果，平均值(SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*與對(duì)照有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異&<0.05)。**標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)范圍為O(正常軟骨)至31(未修復(fù))。另一組織形態(tài)測(cè)定分析數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持rhBMP-2對(duì)移植物愈合的有益效應(yīng)。例如，已經(jīng)表明，高于潮痕的新組織在rhBMP-2處理組充填的百分比為81.52%，而在對(duì)照中為57.63%。在rhBMP-2處理組中(23.83%)移植物軟骨退化比對(duì)照組(44.52%)少。移植物或新形成的軟骨與宿主軟骨的整合在rhBMP-2處理組(56.48%)中比對(duì)照組(21.89%)有所改善。在rhBMP-2的影響下，或者在移一直物邊緣或者在移4直物頂部形成更新的軟骨，在移植物邊緣，這消除了移植物和宿主之間的間隙，而在移植物頂部，使得移植物與關(guān)節(jié)表面更好地融合。上述結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨缺損中的同種異體骨軟骨移植物的愈合由于加入rhBMP-2而得到改善。所述活性生長(zhǎng)因子可能加速了軟骨下骨的愈合，為關(guān)節(jié)軟骨組織提供支持和營(yíng)養(yǎng)。生長(zhǎng)因子的加入也可能刺激了骨髓和/或滑膜組織中由受體間質(zhì)干細(xì)胞形成新的軟骨。這些結(jié)果表明，活性生長(zhǎng)因子特別是骨形態(tài)發(fā)生蛋白和骨軟骨同種移植物的組合可能提供用于治療關(guān)節(jié)軟骨缺損、特別是全厚度關(guān)節(jié)軟骨缺損的有效策略。II.兔自體移植物從兔子的滑車溝或股骨髁獲得骨軟骨移植物(直徑為2.7mm，長(zhǎng)30mm),將其移植到該兔子的滑車溝或膝關(guān)節(jié)的股骨髁上寬2.7mm、長(zhǎng)3.5mm的供體部位中。在移植之前將緩沖液滴加到一半動(dòng)物的所述受體部位，然后將該移植物浸入纟爰沖液中2分鐘，然后置于受體部位中。在移植之前將5嗎rhBMP-2滴加到另一半動(dòng)物的受體部位，然后將該移植物浸入含500fig/mlrhBMP-2的緩沖液中2分鐘，然后移植到受體部位中。手術(shù)后4周處死動(dòng)物，用組織學(xué)的組織化學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[Sellers等，J.BoneJointSurg.,79-A:1452-63(1997)]和組織的定量計(jì)算機(jī)控制圖象分析，對(duì)受體部位進(jìn)4亍組織評(píng)價(jià)。數(shù)據(jù)表明，用rhBMP-2處理改善了自體移植物的愈合。最突出的效應(yīng)是移植物軟骨退化減少(rhBMP-2的8.18%對(duì)對(duì)照的36.25%)以及移植物邊緣形成更多的軟骨(rhBMP-2的88.23%對(duì)對(duì)照的50%)。III.非人類靈長(zhǎng)類自體移植物用于自體移植物實(shí)驗(yàn)的非人類靈長(zhǎng)類是南美彌猴(cynomologousmacaques)。從6只南美彌猴的滑車溝收集骨軟骨移植物(3.5mm直徑x6mm長(zhǎng))，將其移植到鉆入同一動(dòng)物(總共n=12移植物)的股骨中髁和股骨側(cè)髁中的受體部位。在移植之前，將25嗎rhBMP-2滴入6個(gè)受體部位，然后將來(lái)自那6個(gè)移植物的移植物浸入1.25mg/mlrhBMP-2的溶液中達(dá)2分鐘。在另外6個(gè)移才直物中，僅將緩沖液滴入受體部位，并且在移植之前將移植物浸入單獨(dú)的緩沖液中2分鐘。手術(shù)后用石膏固定肢體達(dá)2周，手術(shù)后9周將動(dòng)物處死。所有動(dòng)物的膝關(guān)節(jié)功能均正常。肉目W企查時(shí)，關(guān)節(jié)沒(méi)有顯示出炎癥體征。在任一關(guān)節(jié)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)骨贅。雖然在肉眼檢查時(shí)缺損表面看來(lái)與周圍軟骨齊平，但顯微鏡觀察表明，在大多數(shù)情況下移植物下沉。肉眼觀察到的覆蓋表面的組織實(shí)際上是在移植物頂部新形成的組織。由不知情的評(píng)價(jià)人員進(jìn)行計(jì)算機(jī)^控制圖象分析，以對(duì)缺損充填百分比、形成的高于原始潮痕的新組織類型以及移植物和周圍的軟骨整合進(jìn)行定量。在rhBMP-2處理組的所有這些參數(shù)中，均觀察到良好結(jié)果。在移植物和宿主軟骨之間形成更新的軟骨，消除了間隙，導(dǎo)致移植物與周圍軟骨之間更好地整合(rhBMP-288.59%對(duì)對(duì)照64.82%)。在對(duì)照組中有更多的纖維組織(11.90%對(duì)rhBMP-2的5.65%),而在rhBMP-2處理組中發(fā)現(xiàn)更多的過(guò)度型組織(36.38%對(duì)對(duì)照20.53%)。兩組之間在總體組織學(xué)的組織化學(xué)計(jì)分上沒(méi)有顯著差異。外周定量計(jì)算機(jī)控制斷層掃描術(shù)(pQCT)表明，隨著時(shí)間的推移在供體部位中骨密度增加。手術(shù)后6周和9周時(shí)，與^于照部位相比，用rhBMP-2處理的供體部位中的組織明顯更為致密，愈合過(guò)程更為提前。在組織學(xué)上，在所有情況下供體部位都含有再生的骨小梁與表面的纖維組織。IV.rhBMP-2的活體外保留用來(lái)自非人類靈長(zhǎng)類的移植物，評(píng)價(jià)采用該技術(shù)的rhBMP-2在骨軟骨移植物的保留。將移植物浸入251標(biāo)記的rhBMP-2和未標(biāo)記的rhBMP-2的混合物溶液中。結(jié)果表明，被吸收到移植物中的rhBMP-2的量與該蛋白的濃度以及浸泡時(shí)間成比例。影響rhBMP-2保留的其它因素包括移植物的大小和骨小梁之間骨髓成分的存在。V.rhBMP-2的體內(nèi)保留時(shí)程在兔子中評(píng)價(jià)rhBMP-2在骨軟骨移植物中的保留時(shí)程。在移植之前，將含有5ugrhBMP-2和20uCi1251的1251標(biāo)記的rhBMP-2和未標(biāo)記的rhBMP-2的混合物溶液加樣至移植物上。在手術(shù)后繼續(xù)的22天時(shí)間內(nèi)，用"攝像機(jī)掃描所述動(dòng)物。與用膠原蛋白海綿作為載體的時(shí)程相比，rhBMP-2在骨軟骨移植物中的半衰期從1天增至3天。10%的起始點(diǎn)放射性的保持從膠原蛋白海綿的11天變?yōu)橐浦参锏?2天。VI.非人類靈長(zhǎng)類同種移植物從12只成年南美彌猴的滑車溝取出供體部位(3.5mm寬x6mm長(zhǎng))，并將其移植到非相關(guān)個(gè)體的股骨中髁和側(cè)髁中的3.5x6mm的受體部位中。在移植之前，將一半的移植物浸泡在1.25mg/mlrhBMP-2中2分鐘，而將另一半移植物在lt沖液中浸泡。在首次手術(shù)后7周，對(duì)另一肢體實(shí)施同樣的步驟。在每次手術(shù)后，手術(shù)后以石膏(inacast)固定肢體2周，在第二次手術(shù)后9周處死動(dòng)物，用于組織學(xué)分析。這些結(jié)果表明，活性生長(zhǎng)因子(特別是骨形態(tài)發(fā)生蛋白)和骨軟骨自體移植物的組合，可能提供一種治療關(guān)節(jié)軟骨缺損、特別是全厚度關(guān)節(jié)軟骨缺損的有效的策略。在其它實(shí)施方案中，也將BMP-2應(yīng)用于冷凍的骨軟骨同種移植物，用于治療局灶性關(guān)節(jié)軟骨缺損。上述描述詳細(xì)說(shuō)明了本發(fā)明目前優(yōu)選的實(shí)施方案。預(yù)計(jì)本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮這些描述時(shí)，會(huì)想到本發(fā)明實(shí)施中的許多修改和變化。那些修改和變化被認(rèn)為包括在所附權(quán)利要求書中。權(quán)利要求1.一種再生關(guān)節(jié)軟骨的方法，包括給予需要再生所述關(guān)節(jié)軟骨的區(qū)域至少一種純化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。2.—種再生關(guān)節(jié)軟骨的方法，包括給予需要再生所述關(guān)節(jié)軟骨的區(qū)域與至少一種純化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)聯(lián)合的一種合適的組織源。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述BMP是BMP-2。4.權(quán)利要求2的方法，其中所述BMP是BMP-2。5.—種再生關(guān)節(jié)軟骨的方法，包括給予需要再生所述關(guān)節(jié)軟骨的區(qū)域至少一種選自Vgr-2、生長(zhǎng)分化因子(GDF)和BIP的純化蛋白。6.權(quán)利要求1的方法，還包^"一種誘導(dǎo)腱樣組織或韌帶樣組織形成的蛋白。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述誘導(dǎo)腱樣組織或韌帶樣組織形成的蛋白選自BMP-12亞家族的BMP-12、BMP-13成員和MP52。8.—種用于再生關(guān)節(jié)軟骨的組合物，所述組合物包含至少一種純化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。9.一種用于再生關(guān)節(jié)軟骨的組合物，所述組合物包含與至少一種純化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)聯(lián)合的一種合適的組織源。10.權(quán)利要求8的組合物，其中所述BMP是BMP-2。11.權(quán)利要求9的組合物，其中所述BMP是BMP-2。12.—種用于再生關(guān)節(jié)軟骨的組合物，所述組合物包含至少一種選自Vgr-2、生長(zhǎng)分化因子(GDF)和BIP的純化蛋白。13.權(quán)利要求8的組合物，還包括一種誘導(dǎo)腱樣組織或韌帶樣組織形成的蛋白。14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述誘導(dǎo)腱樣組織或韌帶樣組織形成的蛋白選自BMP-12亞家族的BMP-12、BMP-13成員和MP52。全文摘要本發(fā)明涉及用于關(guān)節(jié)軟骨愈合和修復(fù)的方法和組合物。本發(fā)明提供涉及所述組織(例如骨軟骨移植物)與活性生長(zhǎng)因子組合的用于治療關(guān)節(jié)軟骨缺損和疾病的方法和組合物。所述活性生長(zhǎng)因子最好是含有至少一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白和一種合適載體的組合物。所述方法導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨組織功能性修復(fù)的再生。文檔編號(hào)A61KGK101385851SQ20081016938公開日2009年3月18日申請(qǐng)日期2000年1月31日優(yōu)先權(quán)日1999年2月1日發(fā)明者D·佩盧索,E·莫里斯,R·張申請(qǐng)人:遺傳研究所公司