專利名稱：：連翹酯苷a在制備治療乙型肝炎藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及連翹酯苷A的醫(yī)藥新用途。
背景技術(shù)：
：連翹酯苷A(ForsythosideA)是從木犀科連翹屬植物連翹(FructusForsythiae)中提取的有效成分。以前是以連翹苷作為考察連翹提取工藝的指標(biāo)，近年來(lái)隨著連翹有效成分研究的深入，發(fā)現(xiàn)連翹苷無(wú)抗菌活性，發(fā)揮抗菌活性的是連翹酯苷A，其結(jié)構(gòu)式如下OH近年來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道，連翹酯苷有良好的抗菌作用如王宏軍等報(bào)道連翹酯苷在體外和體內(nèi)對(duì)引發(fā)奶牛乳房炎的主要致病菌金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌均有較好的抑制作用；如馮淑怡等報(bào)道，連翹酯苷對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡菌球菌致病的模型小鼠具有很好地抗感染作用。連翹酯苷中幾乎全部是連翹酯苷A在起作用。目前現(xiàn)有技術(shù)對(duì)連翹酯苷A的抗病毒藥理活性研究很少。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供連翹酯苷A在制藥中的新用途，具體涉及連翹酯苷A在制備治療乙型肝炎藥物中的用途。本發(fā)明通過(guò)連翹酯苷A體外抗乙肝病毒試驗(yàn)，觀察連翹酯苷A抗乙肝病毒的藥效作用。本發(fā)明試驗(yàn)方案采用的是連翹酯苷A的凍干粉針劑，但連翹酯苷A的作用也適用于口服制劑。本發(fā)明隨后的連翹酯苷A體外抗乙肝病毒試驗(yàn)結(jié)果表明采用H印^2.2.15細(xì)胞模型，連翹酯苷A在體外的細(xì)胞毒性TC5。=739g/mL;對(duì)S抗原的抑制IC5。=149.4yg/mL;對(duì)e抗原的抑制IC50=139.6yg/mL;對(duì)細(xì)胞HBV-DNA的抑制IC50=56.3(yg/mL)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)理解為僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。實(shí)施例1(連翹酯苷A體外抗乙肝病毒試驗(yàn))—、試驗(yàn)?zāi)康挠^察連翹酯苷A抗乙肝病毒的藥效作用。二、試驗(yàn)材料受試藥物連翹酯苷A凍干粉針劑，由上海玉森新藥開發(fā)有限公司提供，批號(hào)060909。連翹酯苷A的制備方法可參見中國(guó)專利CN101081855A、CN101081856A、CN101081857A、CN1899382A或CN101209286A。受試藥物溶于匿S0制備成20mg/mL，然后用DMEM培養(yǎng)液稀釋成不同的濃度。細(xì)胞模型乙型肝炎病毒(HBV)轉(zhuǎn)染IfepG2細(xì)胞，即IfepG22.2.15細(xì)胞。陽(yáng)性對(duì)照藥物恩替卡韋。藥物毒性試驗(yàn)MTT法MTT(Aldrich)。HBV抗原檢測(cè)ELISA法上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司試劑盒。HBVDNA檢測(cè)用熒光定量PCR方法檢測(cè)。三、試驗(yàn)方法(主要參考文獻(xiàn)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局.新藥臨床及臨床前研究指導(dǎo)原則匯編.1993)1、藥物毒性試驗(yàn)96孔培養(yǎng)板每孔加入120ii1(4X105cells/mL)H印G2.2.2.15細(xì)胞，37°C，5%C02單層培養(yǎng)72小時(shí)，棄去上清液，加入按要求配制成5個(gè)濃度的藥液，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組。每3天更換樣品液一次，共培養(yǎng)9天，棄去上清液，加入90iiLofDMEMand10yLofthe5mg/mlMTT在培養(yǎng)箱內(nèi)保持3hours.棄去上清液，加入100ofDMS0，培養(yǎng)板在50rpm振蕩5min，在490nm處讀0.D，測(cè)定無(wú)毒濃度(TCD0)。2、病毒抗原抑制測(cè)試96孔培養(yǎng)板每孔加入120iil(4X105cells/mL)IfepG2.2.215細(xì)胞，37"，5%C02單層培養(yǎng)72小時(shí)，棄去上清液，加入按要求配制成5個(gè)濃度的藥液，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組。每3天，更換樣品液一次，共培養(yǎng)9天，分別取上清液用ELISA方法測(cè)定HBsAg、HBeAg，與細(xì)胞對(duì)照組比較，計(jì)算抗原抑制率(％)及IC50。3、病毒DNA抑制測(cè)試50ml培養(yǎng)加入6.ml(2X105cells/mL)H印G2.2.215細(xì)胞，37°C，5%0)2，單層培養(yǎng)72小時(shí)，棄去上清液，加入按要求配制成3個(gè)濃度的藥液，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組。每3天更換樣品液一次，共培養(yǎng)9天，棄去上清液，細(xì)胞用Trizol試劑提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，，與未用藥的病毒對(duì)照組比較，用熒光定量PCR方法檢測(cè)每個(gè)樣品的HBV-DNA及管家基因的拷貝數(shù)，計(jì)算病毒DNA的抑制X及IC50。HBV上游引物5，-TgTCCTggTTATCgCTgg_3，HBV下游引物5，-CAAACgggCAACATACCTT_3，GAPDH上游引物5，-AAggTCggAgTCAACggATT_3，GAPDH下游引物5，-CTggAAgATggTgATgggATT_3，程序設(shè)置95。C預(yù)變性5min;95。C變性10s，60。C退火和延伸共30s，40個(gè)循環(huán)，分別做HBV和GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，按拷貝數(shù)計(jì)算，顯示樣品中HBV或GAPDH的含量。計(jì)算HBV-DNA抑制率。表1.0.PCR反應(yīng)體系的配制條件<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>四、試驗(yàn)結(jié)果如表1.1和1.2所示。表1.1.連翹酯苷A對(duì)細(xì)胞的毒性和對(duì)抗原的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>五、試驗(yàn)結(jié)論如表1.1和1.2所示，采用！fepG22.2.15細(xì)胞模型，連翹酯苷A在體外的細(xì)胞毒性TC5。=739iig/mL;對(duì)S抗原的抑制IC5。=149.4yg/mL;對(duì)e抗原的抑制IC50=139.6iig/mL;對(duì)細(xì)胞HBV-DNA的抑制IC50=56.3(yg/mL)。試驗(yàn)結(jié)論表明，連翹酯苷A在體外顯示對(duì)乙肝病毒的有效抑制。權(quán)利要求連翹酯苷A在制備治療乙型肝炎藥物中的用途。2.連翹酯苷A在制備抑制乙肝抗原藥物中的用途。3.連翹酯苷A在制備抑制乙肝病毒藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了連翹酯苷A在制備治療乙型肝炎藥物中的用途。連翹酯苷A的體外抗乙肝病毒試驗(yàn)表明，連翹酯苷A能夠有效抑制乙肝抗原以及乙肝病毒采用HepG22.2.15細(xì)胞模型，連翹酯苷A在體外的細(xì)胞毒性TC50＝739μg/mL；對(duì)S抗原的抑制IC50＝149.4μg/mL；對(duì)e抗原的抑制IC50＝139.6μg/mL；對(duì)細(xì)胞HBV-DNA的抑制IC50＝56.3(μg/mL)。文檔編號(hào)A61P31/00GK101757006SQ200810208209公開日2010年6月30日申請(qǐng)日期2008年12月25日優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日發(fā)明者玄振玉申請(qǐng)人:上海玉森新藥開發(fā)有限公司