專利名稱：：一種用于治療肝癌的野生核桃楸樹皮水提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于治療肝癌的野生核桃楸樹皮水提取物。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤已成為威脅人類生命的主要因素之一，化學(xué)藥物仍是當(dāng)今抗癌治療的主要手段之一，但幾乎所有的抗癌藥都存在著比較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，在諸多的副作用中，尤以惡心、嘔吐最為常見，其他還有脫發(fā)，食欲不振等，給服用者帶來很大痛苦。不同的藥物，不良反應(yīng)表現(xiàn)的程度有較大的差別，但總體上化學(xué)藥比中草藥的不良反應(yīng)更為嚴(yán)重，然而目前能夠用來抗腫瘤的中草藥還較少，不能滿足現(xiàn)有的抗腫瘤需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新型的用于治療肝癌的野生核桃楸樹皮水提取物。本發(fā)明的另一目的是提供上述野生核桃楸樹皮水提取物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的—種新型的用于治療肝癌的野生核桃楸樹皮水提取物，是將核桃楸樹皮加5倍重量的水浸泡24h后，加熱至IO(TC持續(xù)30min，過濾，濾渣重復(fù)提取一次，將兩次濾液混合并加熱濃縮即得。上述野生核桃楸樹皮水提取物在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用是制備抗肝癌口服制劑、注射制劑及其他可以用于人體的藥物制劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果在惡性腫瘤類疾病中，肝癌的致病特點(diǎn)是病情隱匿，惡性度高，臨床表現(xiàn)起伏急驟，患者用于此病的治療需投入較多的人力財(cái)力。野生核桃楸樹皮水提取物為患者節(jié)省大量開支，減輕家庭負(fù)擔(dān)。同時(shí)野生核桃楸樹皮水煎劑等成果的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化必將受到更廣大患者的青睞，其市場(chǎng)潛力非常巨大，因此其經(jīng)濟(jì)效益是巨額的。另外一方面，我國(guó)核桃楸樹皮資源豐富，來源廣泛，本發(fā)明提供的技術(shù)方案充分利用了我國(guó)的天然藥用材料優(yōu)勢(shì)，發(fā)揮了我國(guó)中醫(yī)中藥的文化精髓。野生核桃楸樹皮水煎劑未來在臨床上的推廣和應(yīng)用，有助于完成肝癌的早期預(yù)防、前早期治療以及提高生存率，從而可以很好地促進(jìn)社會(huì)人口健康，提高人口素質(zhì)，增強(qiáng)社會(huì)生產(chǎn)力，其社會(huì)效益同樣是巨大的。圖1是實(shí)施例2的細(xì)胞加入核桃楸樹皮水煎劑后的形態(tài)改變的照片。圖2是實(shí)施例2的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。圖3是實(shí)施例2的細(xì)胞存活率曲線。圖4是實(shí)施例2的MTT實(shí)驗(yàn)抑制率曲線。具體實(shí)施例方式自黑龍江省伊里嘎山采購(gòu)了此種野生型核桃楸樹皮，為曬干后的天然制品。稱取核桃楸樹皮100g加水500g浸泡24h后，加熱IO(TC30min，過濾，將濾渣再加500g水，加熱IO(TC30min，過濾，將兩次濾液混合并加熱濃縮至200ml。將核桃楸樹皮水煎劑反復(fù)進(jìn)行硅膠柱色譜。以氯仿-無水乙醇進(jìn)行梯度洗脫(i:o-o:i)，將氯仿提取物同樣進(jìn)行硅膠柱色譜。經(jīng)氣相色譜儀/質(zhì)譜儀法測(cè)定、分析核桃楸樹皮水煎劑的的藥用成分。測(cè)定核桃楸樹皮水煎劑的生藥含量，并用0.22ym微孔濾器過濾除菌，過濾膜除菌后所獲得的核桃楸樹皮水提取物生藥含量為0.5g/ml，放入冰箱fC保存?zhèn)溆?。?shí)施例1核桃楸樹皮水煎劑抗肝癌藥效及作用機(jī)理研究1.人肝癌細(xì)胞株S匪C-7721的培養(yǎng)傳代。將人肝癌S匪C-7721細(xì)胞接種于含10X新生小牛血清、100U/ml青/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，放入37°C5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿后用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，每3-5天傳代一次。2.形態(tài)學(xué)觀察。將細(xì)胞消化后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入37t:5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后加入山核桃樹皮水煎劑，設(shè)置4個(gè)藥物實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)PBS陰性對(duì)照組、一個(gè)空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的藥物終濃度分別為34mg/L、17mg/L、8.5mg/L、l.7mg/L，陰性對(duì)照組加入10y1PBS，空白對(duì)照組不加任何組分，繼續(xù)培養(yǎng)24h后在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，拍攝照片。3.MTT法觀察核桃楸樹皮水煎劑對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的抑制作用。細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液后調(diào)細(xì)胞濃度至5X107L，并接種于96孔板的中間各孔，實(shí)驗(yàn)組每孔190ii1，對(duì)照組每孔200ii1，調(diào)零組只加200ii1RPMI1640培養(yǎng)液，37°C5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后實(shí)驗(yàn)組加入核桃楸樹皮水煎劑，藥物按2倍稀釋，設(shè)置8個(gè)藥物實(shí)驗(yàn)組，每組3復(fù)孔，空白對(duì)照組和調(diào)零組各6復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后吸掉上清，加入80ii1新鮮的RPMI1640培養(yǎng)液和20ii1MTT，避光培養(yǎng)4h后倒掉上清，加入150y1DMSO，輕輕振蕩使沉淀溶解后在酶標(biāo)儀上490nm處檢測(cè)吸光度值，計(jì)算抑制率=1-藥物組0D值/對(duì)照組0D值。4.流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞周期。S匪C-7721細(xì)胞消化后調(diào)細(xì)胞濃度至1X107/L，接種于6孔板中，每孔2ml，培養(yǎng)24小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組加入核桃楸樹皮水煎劑，設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞，用PBS洗一遍細(xì)胞，倒掉上清，加入lmlPBS重懸，70%冰預(yù)冷的乙醇4。C固定lh以上，離心，加500iilPBS重懸，加入lmg/ml的RNA酶5yl，37。C孵育10min后，加入lmg/ml的PI染料2iil，避光染色30min。后樣品液過300目尼龍網(wǎng)以除去雜質(zhì)，488nm激發(fā)光波長(zhǎng)測(cè)定樣品，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和檢測(cè)細(xì)胞凋亡峰。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果在MTT實(shí)驗(yàn)中，未用藥組細(xì)胞0D值為0.6458±0.0915，而0.025g/ml藥物組0D值為0.5963±0.0639，細(xì)胞抑制率為7.65%，0.lg/ml藥物組OD值為0.5788±0.0942，細(xì)胞抑制率為10.37%，當(dāng)藥物濃度達(dá)到3.2g/ml，0D值為0.2013±0.1704，細(xì)胞抑制率為68.86%?？梢娂?xì)胞增殖抑制率隨著藥物濃度的升高而增高，經(jīng)計(jì)算藥物的半數(shù)致死濃度IC50為1.56mg/ml。實(shí)施例2核桃楸樹皮水煎劑對(duì)BALB/c小鼠肝癌模型腫瘤生長(zhǎng)抑制、腫瘤生成的治療作用及激發(fā)免疫作用的研究1.核桃楸樹皮水煎劑體外鼠移植瘤抑制實(shí)驗(yàn)。取50只SPF級(jí)BALB/c雌性鼠，SPF環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)。SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，取2乂107細(xì)胞接種于實(shí)驗(yàn)鼠右后背皮下，當(dāng)瘤組織長(zhǎng)至約1Xlcm時(shí)開始給藥。實(shí)驗(yàn)將BALB/c鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(生理鹽水)、核桃楸樹皮水煎劑不同劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺)。于瘤體內(nèi)注射藥物，隔天l次。分別于治療前、治療后l周、2周、3周、4周剝離皮下瘤塊，測(cè)定瘤體平均體積，測(cè)定瘤重，計(jì)算抑瘤率(％)。2.核桃楸樹皮水煎劑對(duì)肝癌模型實(shí)驗(yàn)鼠血象系統(tǒng)影響的研究。在BALB/c鼠移植瘤治療實(shí)驗(yàn)中，分別與給藥前、給藥后1周、2周、3周采集實(shí)驗(yàn)鼠尾血，并與給藥后4周處死動(dòng)物，摘眼球取血。取血后制備加入肝素的混勻抗凝血，分別進(jìn)行白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、淋巴系統(tǒng)等血象指標(biāo)檢測(cè)。3.核桃楸樹皮水煎劑對(duì)肝癌模型實(shí)驗(yàn)鼠免疫功能影響的研究。①制備肝癌模型實(shí)驗(yàn)鼠脾細(xì)胞及胸腺細(xì)胞懸液，調(diào)整至所需濃度進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、胸腺細(xì)胞自發(fā)摻入實(shí)驗(yàn)。②實(shí)驗(yàn)鼠在三、2方法取血后制備無抗凝血，并放入4t:冰箱靜置24小時(shí)，后按常規(guī)操作制備血清。取血清進(jìn)行淋巴細(xì)胞因子(IL-2、IL-10)活性檢測(cè)、Y干擾素活性檢測(cè)、NK細(xì)胞活性測(cè)定，其測(cè)定技術(shù)采用間接ELISA法的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)分子生物學(xué)手段檢測(cè)野生型核桃楸樹皮抗肝癌作用試驗(yàn)結(jié)果如下(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?cè)诘怪孟嗖铒@微鏡下觀察可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞皺縮，細(xì)胞體積變小，密度比對(duì)照組低，實(shí)驗(yàn)組死亡的細(xì)胞較多，因此可見到很多的細(xì)胞碎片，這種現(xiàn)象隨著藥物濃度的增加越來越明顯，見圖1所示。(2)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線細(xì)胞加入核桃楸樹皮水煎劑后的生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞存活率分別見圖2和圖3。由圖2和圖3可以看出實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖速度較對(duì)照組慢，同一時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞濃度較對(duì)照組細(xì)胞濃度低，同一濃度時(shí)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組時(shí)間延后。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率較對(duì)照組低，且這些趨勢(shì)隨著藥物濃度的增加更加明顯。(3)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)不同濃度藥物組OD值及抑制率分別見表1和圖4，由圖4可以看出隨著藥物濃度的增加OD值減小，抑制率增加。用公式計(jì)算IC50(藥物半數(shù)致死濃度)為1.56mg/ml。表1MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(X士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組測(cè)得的細(xì)胞周期不同階段所占比例見表2，表2是各組細(xì)胞周期分布情況數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件做x2檢驗(yàn)的結(jié)果表2細(xì)胞周期分布情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與對(duì)照組相比，*為p<0.05，**為p<0.01，微為p〈0.001結(jié)果可見，人肝癌S匪C-7721細(xì)胞體積縮小，透明度降低，細(xì)胞膜皺縮；細(xì)胞生長(zhǎng)曲線向右下移；藥物的半數(shù)致死濃度IC50為1.56mg/ml;高濃度藥物可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期阻滯在S—G2期。肝癌移植瘤BALB/c鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示核桃楸樹皮水煎劑可抑制腫瘤生長(zhǎng)、激發(fā)免疫系統(tǒng)機(jī)能和達(dá)到治療腫瘤的目的。所以核桃楸樹皮水煎劑具有明確的抗肝癌作用。權(quán)利要求一種用于治療肝癌的野生核桃楸樹皮水提取物，其特征在于所述水提取物是將核桃楸樹皮加5倍重量的水浸泡24h后，加熱至100℃持續(xù)30min，過濾，濾渣重復(fù)提取一次，將兩次濾液混合并加熱濃縮制得。2.權(quán)利要求1所述野生核桃楸樹皮水提取物在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是應(yīng)用于制備抗肝癌口服制劑、注射制劑及其他可以用于人體的藥物制劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種新型的用于治療肝癌的野生核桃楸樹皮水提取物，所述水提取物是將核桃楸樹皮加5倍重量的水浸泡24h后，加熱至100℃持續(xù)30min，過濾，濾渣重復(fù)提取一次，將兩次濾液混合并加熱濃縮制得。本發(fā)明還公開了上述野生核桃楸樹皮水提取物在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。我國(guó)核桃楸樹皮資源豐富，來源廣泛，本發(fā)明提供的技術(shù)方案充分利用了我國(guó)的天然藥用材料優(yōu)勢(shì)，發(fā)揮了我國(guó)中醫(yī)中藥的文化精髓。文檔編號(hào)A61K36/52GK101711790SQ20081021843公開日2010年5月26日申請(qǐng)日期2008年10月17日優(yōu)先權(quán)日2008年10月17日發(fā)明者張?jiān)伬蛏暾?qǐng)人:廣東藥學(xué)院