專利名稱：一株兼性厭氧海洋紅假單胞菌的活性提取物及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
背景技術(shù)：
發(fā)明內(nèi)容0.3pm 0.5^imxl.(^m 1.5^im，革蘭氏染色為陰性，兼性厭氧，胞內(nèi)含菌綠素a和類胡蘿卜素。最佳生長溫度范圍26 3(TC，最佳生長pH為7.0。對有機(jī)碳源的利用情況如下在(1)乙酸鹽，(2)丙酮酸鹽，(3)蘋果酸鹽等條件下生長良好。
海洋菌株P(guān)SB-02的16S rDNA序列(1249bp)已向美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank基因序列數(shù)據(jù)庫提交，登陸號為EU919184。其全序列如下CACCGCCCGTCACACCATGGG
這種海洋菌株P(guān)SB-02可以利用常規(guī)的液體培養(yǎng)方式，可使培養(yǎng)基中含有用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源及其他營養(yǎng)源。對溫度、時間等培養(yǎng)條件并無嚴(yán)格的限制，以適宜于PSB-02海洋菌株生長為準(zhǔn)，并以選擇使培養(yǎng)物的活性提取物的收率最高的條件為好。當(dāng)然這些培養(yǎng)基的組分、氫離子的濃度、培養(yǎng)溫度、攪拌條件等均應(yīng)根據(jù)所使用的菌株種類及外部條件等進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，并獲得最好的效果。由以上所得的培養(yǎng)物出發(fā)，通過一些適當(dāng)?shù)姆椒ň湍芴崛∑渲械幕钚越M分，這些方法是常用于提取代謝物的方法，例如可利用活性提取物與其它雜質(zhì)在溶解度、離子結(jié)合力、吸附親和力及分子量等方面的差別進(jìn)行提取，這些方法可以單獨(dú)使用，也可以適當(dāng)配合或反復(fù)使用。其中，以如下培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和提取方法來培養(yǎng)海洋菌株P(guān)SB-02產(chǎn)生抗生素最佳
液體培養(yǎng)基為
蛋白胨酵母膏
人工海水(或陳海水)調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0。
人工海水配方
NaClNa2S。4KC1
NaHC03KBrH3B03NaF
1.0mol/LMgCl2溶液
2.5g;2.5g;
1000 ml;
25.0g;4.0g;0.7g;0.20g;
0.10g;0.03g;O扁g;
53 mL;1.0 mol/1 CaCl2溶液 10 mL;
0.1 mol/L Sr02溶液 0.90 ml;
蒸餾水1000 ml，調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0。
A. 種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血 清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121、 0.105Mpa滅菌20min;冷卻后 接種海洋菌株P(guān)SB-02,并用無菌培養(yǎng)基補(bǔ)滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于 28 3(TC下恒溫光照培養(yǎng)，采用白熾燈作光源，功率為15W 40W為宜，光源 距離培養(yǎng)容器20厘米 30厘米，兩側(cè)安置。培養(yǎng)時間為7 10天；
B. 擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比5 10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器， 采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株P(guān)SB-02菌液，于26 3(TC恒溫培 養(yǎng)10 15天；
C. 提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓濃縮至原 體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提 后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50 。C減壓蒸干，得兩份干固體。
D. 提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，點(diǎn)樣于分析型硅膠
薄層板上，分別選用體積比為二氯甲垸甲醇=10: 1的展開劑展開，采用薄 層層析生物自顯影活性測試法追蹤活性斑點(diǎn)。再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠 薄層板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，分別用體積比為二氯甲烷甲 醇=2: 1的混合溶劑洗脫。洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一步純化，使用ds反
相柱，用體積濃度為5~100%的甲醇水作為流動相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再 用100%甲醇洗脫20分鐘，檢測254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備 出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得三份油狀物。
本發(fā)明中從海洋菌株P(guān)SB-02中提取得到的活性提取物，通過抗菌模型篩選， 采用瓊月旨稀釋 去(National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Approved standard: M2 A7， 7th ed. NCCLS， Wayne， Pa.)測定對熒光假單胞菌、 銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC值，證實其培養(yǎng)液的乙酸乙 酯提取相和正丁醇提取相均具有抗菌活性乙酸乙酯相中制備出的兩份活性組 分抗熒光假單胞菌的MIC值為0.80嗎/mL;抗銅綠假單胞菌的MIC值為0.74可以用于制備抗菌的藥物。
Mg/mL;正丁醇相中制備出的活性組分抗熒光假單胞菌的MIC值為1.25 pg/mL; 抗銅綠假單胞菌的MIC值為0.61 jig/mL;抗表皮葡萄球菌的MIC值為0.86 pg/mL; 抗枯草芽孢桿菌的MIC值為0.78 pg/mL。
利用本發(fā)明的活性提取物中的有效組分， 以下用實施例對本發(fā)明作進(jìn)一歩說明。
具體實施例方式
實施例l.液體培養(yǎng)基為
蛋白胨 酵母膏
人工海水(或陳海水)
調(diào)節(jié)pH為6.8~7.0。
人工海水配方
2,5g; 2.5g;
1000 ml;
NaCl 25.0g; Na2S04 4.0g; KC1 0.7g; NaHC03 0.20g; KBr O.lOg; H3B03 0.03g; NaF 0.003g; 1.0 mol/L MgCl2溶液 53 mL;
1.0 mol/1 CaCl2溶液 10 mL;
0.1 mol/L Sr02溶液 0.90 ml;
蒸餾水1000 ml，調(diào)節(jié)pH為6.8 7.0。
A. 種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血 清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121、 0.105Mpa滅菌20min;冷卻后 接種海洋菌株P(guān)SB-02，并用無菌培養(yǎng)基補(bǔ)滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于 28 30。C下恒溫光照培養(yǎng)，采用白熾燈作光源，功率為15W 40W為宜，光源 距離培養(yǎng)容器20厘米 30厘米，兩側(cè)安置。培養(yǎng)時間為7 10天；
B. 擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比5~10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器，采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株P(guān)SB-02菌液，于26 30。C恒
溫培養(yǎng)10 15天；
C. 提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50。C減壓濃縮至原 體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提 后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50 'C減壓蒸干，得兩份干固體。
D. 提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，點(diǎn)樣于分析型硅膠 薄層板上，分別選用體積比為二氯甲烷甲醇=10: 1的展開劑展開，采用薄 層層析生物自顯影活性測試法追蹤活性斑點(diǎn)。再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠 薄層板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，分別用體積比為二氯甲烷甲 醇=2: 1的混合溶劑洗脫。洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一歩純化，使用ds反
相柱，用體積濃度為5 100%的甲醇水作為流動相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再 用100%甲醇洗脫20分鐘，檢測254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備 出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得三份油狀物。 實施例2.液體培養(yǎng)基為
酵母膏 丁二酸鈉 KH2P04 MgS04 7H20 NH4C1
CaCl2 2H20 檸檬酸鐵(0.1%)
30.4 g;
1.0 g;
1.0 g;
0.5 g;
3.0 g;
0.4 g; 0.05 g; 5.0 mL;
1.0 mL;
其中SL.
無水乙醇
調(diào)節(jié)pH為6.8 ±0.2。 為微量元素溶液，配方為:
0.5 mL;
H3B03 CoCl2.6H20
0.3 g; 0.2 g;ZnS04.7H20 MnCl2.4H20
0.1 g; 0.03 g ;
0.03 g;
0.02 g;
0.01 g; 100 mL;
NaMo04.2H20
MC12.6H20 CuCl2.2H20
蒸餾水
用HCl調(diào)節(jié)pH為3.4。
A. 種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血 清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121、 0.105Mpa滅菌20min;冷卻后 接種海洋菌株P(guān)SB-02,并用無菌培養(yǎng)基補(bǔ)滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于 28 30。C下恒溫光照培養(yǎng)，采用白熾燈作光源，功率為15W 40W為宜，光源 距離培養(yǎng)容器20厘米 30厘米，兩側(cè)安置。培養(yǎng)時間為7 10天；
B. 擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比5 10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器， 采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株P(guān)SB-02菌液，于26 3(TC恒溫培
養(yǎng)10 15天；
C. 提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓濃縮至原 體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提 后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50 'C減壓蒸干，得兩份干固體。
D. 提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，點(diǎn)樣于分析型硅膠
薄層板上，分別選用體積比為二氯甲烷甲醇=10: 1的展開劑展開，采用薄 層層析生物自顯影活性測試法追蹤活性斑點(diǎn)。再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠 薄層板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，分別用體積比為二氯甲垸甲 醇=2: 1的混合溶劑洗脫。洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一步純化，使用d8反 相柱，用體積濃度為5~100%的甲醇水作為流動相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再 用100%甲醇洗脫20分鐘，檢測254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備 出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得三份油狀物。 實施例3.活性組分活性測定結(jié)果
采用瓊月旨禾希禾畢f(xié)去(National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000.Approved standard: M2 A7， 7th ed. NCCLS, Wayne, Pa.)測定對熒光假單胞菌、 銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC值，證實其培養(yǎng)液的乙酸乙 酯提取相和正丁醇提取相均具有抗菌活性乙酸乙酯相中制備出的兩份活性組 分抗熒光假單胞菌的MIC值為0.80 pg/mL;抗銅綠假單胞菌的MIC值為0.74 pg/mL;正丁醇相中制備出的活性組分抗熒光假單胞菌的MIC值為1.25 ng/mL; 抗銅綠假單胞菌的MIC值為0.61 pg/mL;抗表皮葡萄球菌的MIC值為0.86 jig/mL; 抗枯草芽孢桿菌的MIC值為0.78 pg/mL。 序列表
<110>大連交通大學(xué)
〈120〉 一株兼性厭氧海洋紅假單胞菌的活性提取物及其制法和用途 <160〉 1
〈170〉 Patentln version 3. 3 <210〉 1 <211〉 1249 〈212〉 腿
〈213〉 海洋菌株P(guān)SB-02的16S rDNA序列 〈400〉 1
gggtgagtaa cgcgtgggaa tctacccagt ggtacgggat aacccgagga aactcgagct 60 aataccgtat acgcccttcg ggggaaagat ttattgccat tggatgagcc cgcgtcggat 120 tagcttgttg gtggggtaac ggcctaccaa ggcaacgatc cgtagctggt ctgagaggat 180 gatcagccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 240 tcttggacaa tgggggaaac cctgatccag ccatgccgcg tgagtgaaga aggccctagg 300 gttgtaaagc tctttcagcg gggaagataa tgacggtacc cgcagaagaa gccccggcta 360 acttcgtgcc agcagccgcg gtaatacgaa gggggctagc gttgttcgga attactgggc 420 gtaaagcgcg cgtaggcgga ttgttaagtc aggggtgaaa tcccagagct caactctgga 480 actgcctctg atactggcaa tctcgagtcc ggaagaggtt ggtggaattc cgagtgtaga 540 ggtgaaattc gtagatattc ggaggaacac cagaggcgaa ggcggccaac tggtccgaga 600 ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 660 ccgtaaacga tggatgctag ccgttggtgg gtatactcat cagtggcgca gctaacgcat 720 taagcatccc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc 780<formula>formula see original document page 12</formula>
權(quán)利要求
1. 一株兼性厭氧海洋紅假單胞菌PSB-02CGMCC No.2730培養(yǎng)液的活性提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的海洋菌株P(guān)SB-02活性提取物，其特征在于為乙 酸乙酯提取物和正丁醇提取物，對熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球 菌和枯草芽孢桿菌有抗性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的海洋菌株P(guān)SB-02活性提取物的制備方法，其特 征在于包括下列步驟A. 種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血 清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121、 0.105Mpa滅菌20min;冷卻后 接種PSB-01菌株，并用無菌培養(yǎng)基補(bǔ)滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于28 30 'C下恒溫光照培養(yǎng)，采用白熾燈作光源，功率為15W 40W為宜，光源距離培 養(yǎng)容器20厘米 30厘米，兩側(cè)安置。培養(yǎng)時間為7 10天；B. 擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比5-10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器， 采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)PSB-02菌株菌液，于28 3(TC恒溫培養(yǎng) 20 25天；所述種子培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)中，液體培養(yǎng)基為蛋白胨 酵母膏人工海水(或陳海水) 調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0。(2.5g; 2.5g; 1000 ml;人工海水配方:<formula>formula see original document page 0</formula>(1.0mol/LMgCl2溶液 53mL; 1.0mol/lCaCl2溶液 10mL; 0.1 mol/L Sr02溶液 0.90 ml;蒸餾水1000 ml，調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0。C. 提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓濃縮至原 體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提 后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50 。C減壓蒸干，得兩份干固體。D. 提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，點(diǎn)樣于分析型硅膠薄層板上，分別選用體積比為二氯甲垸甲醇=10: 1的展開劑展開，采用薄層層析生物自顯影活性測試法追蹤活性斑點(diǎn)。再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠薄層板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，分別用體積比為二氯甲烷甲 醇=2: 1的混合溶劑洗脫。洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一步純化，使用ds反相柱，用體積濃度為5~100%的甲醇水作為流動相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再 用100%甲醇洗脫20分鐘，檢測254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備 出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得三份油狀物。
4.權(quán)利要求1或2所述的海洋菌株P(guān)SB-02活性提取物在制備抗細(xì)菌藥物 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及一株兼性厭氧海洋紅假單胞菌、該菌株培養(yǎng)物的活性提取物及其制法，以及該提取物在抗菌藥物方面的應(yīng)用價值。一株從中國渤海分離獲得的海洋菌株P(guān)SB-02，鑒定為紅假單胞菌Rhodopseudomonassp.，其乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相經(jīng)硅膠薄層層析和反相高效液相分離，得到三個有效部分的油狀物，對熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抗性，具有作為抗菌藥物的潛在用途。
文檔編號A61K35/74GK101455688SQ20081022946
公開日2009年6月17日 申請日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日
發(fā)明者翼 張, 朱秀華, 軍 穆, 董學(xué)偉, 趙友寶, 顧曉潔 申請人:大連交通大學(xué)