專利名稱：包含纖維素和糖肽木葡聚糖-grgds的可植入材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療或手術(shù)用的可植入材料，其包含改變所述材料的
團。更具體地:本發(fā)明涉及包含聚合碳^化合物:可植入材料、制1
這些可^U^材料的方法以及通過這些方法制成的材料的用途和包含這 些材料的產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
器官或組織衰竭是嚴重的健康問題。組織工程提供了使用來自 不同來源的功能性健康細胞(即，自體、異源或異種細胞)和/或細 胞外天然或合成聚合物來重建組織功能的潛力。
具有各種不同性質(zhì)的大量合成聚合物材料如今在醫(yī)療和美容用 途中使用，如組織工程用的假體、植入物和支架。這些合成聚合物 材料通常可分成兩個主要類別臨時M物/可生物再吸收和長期植 入物/不可生物再吸收。可生物再吸收的合成材料的實例包括包含聚 1-乳酸(PLLA)和聚1-乙醇酸(PLGA)的聚合物。長期可植入和 不可生物再吸收材料的實例是聚(四氟乙烯)PTFE，其已用在多種醫(yī) 療可^制品，包括血管移植物和組織修復片材和補片中。
但是，這些合成材料也具有限制和缺點，如聚合物與細胞之間 的不合適相互作用在體內(nèi)造成異物反應(yīng)，如炎癥、感染、無菌性木> 動、局部組織廢物和植入物包嚢以及血栓形成和栓塞。因此，有前 景的聚合物的成功部分取決于相關(guān)細胞在其表面上的附著和生長。 表面化學介導細胞對該材料的應(yīng)答并影響細胞在該表面上的粘附、 增殖、遷移和功能。
在動脈血管重建領(lǐng)域中，越來越需要功能性小直徑人工移植物 (內(nèi)徑<6毫米)。當自身替換血管不可得時(例如由于患者差的血管 系統(tǒng)狀況)，外科醫(yī)生除;j4X合成聚合物Juk管外別無選擇。在;j^后，關(guān)于這些血管的最初的主要問JlgA在相對低的流動條件下由血 液凝固和血小板沉積引起的幾乎立即阻塞。由于造成表面誘發(fā)性血 栓形成的相互作用發(fā)生在血液-生物材料界面處，所以表面改性已是 提高血液相容性的方式。在不同的改性中，用多糖(如肝素)的改
性也已廣泛用于使AJt器官上的血栓形成最小化。但是，問題在于
當肝素直接結(jié)合到表面上時，肝素的活性顯著降低。迄今，最成功
類型的生物相容表面是端點連接(end-point-attached)肝素表面。
另一有吸引力的表面改性是引入可防止血漿蛋白質(zhì)吸附、血小 板粘附和血栓形成的親水性基團。問題在于使它們保留在長期器件
(如血管移植物)的表面上。尤其是已將水溶性聚合物，如聚丙烯 酰胺(PAAm);聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)(PDMAAm);聚(乙二醇)
(PEG)、乙烯-乙烯醇共聚物(EVA)和聚(曱基丙烯酸2-羥乙酯)
(PHEMA)移植到固體表面上以防止蛋白質(zhì)吸附。
將材料改性以改進其血液相容性的其它理念必須設(shè)法模仿生物 惰性表面。在血管中，這種惰性表面由單層內(nèi)皮細胞構(gòu)成。目前用 作血管移植物的材料，如膨體聚四氟乙烯(ePTFE)和聚酯不會促 i^A體內(nèi)皮細胞的粘附或增殖。因此用血纖維蛋白原、粘連蛋白或 用固定的RGD (Arg-Gly-Asp )(其是粘附蛋白，如血纖維蛋白原、 粘連蛋白和von Willbrand因子的活性位點的最小片段)進行表面改 性。除用肝素表面改性外，已經(jīng)進行大量研究和試驗以將內(nèi)皮細胞 接種到PTFE管上。但問題在于使細胞長期保持在表面上。
但是，上文提到的這些合成材料，例如PTFE和聚酯，也具有 其它限制和缺點，包括有限范圍的物理和生化性質(zhì)。因此，仍然需 M尋更適用于特定外科應(yīng)用的替代性可^材料。
一些調(diào)查人員已經(jīng)研究纖維素及其衍生物的組織生物相容性并 且審查該材料的一些特定應(yīng)用。具體而言，已經(jīng)調(diào)查將由微生物產(chǎn) 生的纖維素用在組織工程中。微生物源纖維素具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其中
由高度結(jié)晶和高度單軸取向的纖維素構(gòu)成的非常細的帶狀纖維復雜 地彼此纏結(jié)，且這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在其內(nèi)部空隙中含有大量液體。由于該纖維素由具有高結(jié)晶度的許多帶狀纖維構(gòu)成，該纖維素即使在濕 狀態(tài)下也可以抵抗外力如拉伸力。微生物纖維素并非在結(jié)構(gòu)上不同 于源自植物的纖維素，但在植物源纖維素中沒有發(fā)現(xiàn)高度有序的結(jié) 構(gòu)如上述結(jié)構(gòu)，它是微生物纖維素的特性。相應(yīng)地，微生物纖維素
盡管呈:^狀，但具有高強度。
US 6 800 753描述了使用再生纖維素(RC )和氧化再生纖維素 (ORC)制備組織工程用支架。RC和ORC復合材料通過首先將纖 維素溶解在溶劑體系中，然后使該纖維素再生成所需的支架結(jié)構(gòu)來 制備。為了制造多孔支架，在該溶劑體系中引入成孔劑以在支架結(jié) 構(gòu)中產(chǎn)生孔?？呻S后將該支架氧化以在其表面上引入象基、搭和/或 酮官能團。這些官能團充當細胞粘附或進一步化學改性的位點以誘 導細胞粘附和隨后增殖。
Seo S等人("Alginate microcapsules prepared with xyloglucan as a synthetic extracellular matrix for hepatocyte attachment", Biomaterials,第26巻no. 17 (2005)，第3607-3615頁)描述了用木 葡聚糖(XG)改性的藻酸鉀聚合碳水化合物膠嚢以制備原代小鼠肝 細胞的合成細胞外基質(zhì)。提高的肝特異性功能歸因于XG的半乳糖 部分與肝細胞上的去唾液酸糖蛋白受體之間的特異性相互作用。
Yang Y等人("Biodegradable scaffolds — delivery systems for cell therapies", Expert Opinion on Biological Therapy第6巻，no.5 (2006)，第485-498頁)是論述使用生物分子將可生物降解材料表面 改性的綜述文章?？缮锝到獾闹Ъ軗?jù)說在方便細胞療法的應(yīng)用方 面是重要的。論述了支架材料的選擇，特別是在生物相容性方面。 概述了仿生支架的形成、能夠控制支架構(gòu)造和微結(jié)構(gòu)的新型制造技 術(shù)以及可注射和原位交聯(lián)的支架的制造。概述了在提供能夠恰當?shù)?引導其所接觸的細胞的可生物降解支架方面仍然存在挑戰(zhàn)。
Zhou Q等人("Xyloglucan and xyloglucan endotransglycosy-
lases (XET): Tools for ex vivo cellulose surface modification", Biocatalysis and Biotransformation,第24巻，no. 1-2 (2006)，第107-120頁)是木纖維技術(shù)領(lǐng)域中的綜述文章，描述了木纖維的改性 以提供新型生物材料和纖維素的新型表面改性方法。提供了用于使 官能團連接到木漿上的新系統(tǒng)，包括將木葡聚糖與纖維素之間的高 親和力相互作用、木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶催化多糖-寡糖偶聯(lián)反應(yīng)的 獨特性質(zhì)和傳統(tǒng)的碳水化合物合成組合。但是，在提供具有良好生物相容性，尤其是具有包含生物活性 因子的表面的可^材料方面仍存在挑戰(zhàn)。根據(jù)US 6 800 753制成的再生纖維素(RC )和氧化再生纖維素 (ORC)的使用存在各種問題。例如，用溶劑處理纖維素可能并不 理想，因為這種處理可以因纖維素材料的結(jié)構(gòu)改變而復雜化。這些 結(jié)構(gòu)改變會導致收縮和改變的形態(tài)以及得到B的材料。目前，如上所述，可植入材料受制于與它們的物理和生化性質(zhì) (如它們的表面化學)相關(guān)的問題。無疑目前一個長期存在但尚未 滿足的需要是開發(fā)新的可^材料并改進它們的性質(zhì)，以使它們可 成功用在醫(yī)療應(yīng)用中。相應(yīng)地，本發(fā)明的主要目的是提供用于制備具有與活體極好相 容性的可^材料的改進方法，并提供用該方法制成的可#^材料。本發(fā)明的另 一 目的是提供具有期望機械性質(zhì)(如機械和拉伸強 度、伸長和可縫合性)的可M材料。本發(fā)明的另一目的是提供帶有細胞附著位點或影響細胞粘附、 增殖、遷移和功能的其它因子的可^V材料。本發(fā)明的再一 目的是提供適用于體內(nèi)^UV的可^材料。從下面發(fā)明描述中會清楚看出實現(xiàn)各上述目的以及其它目的的方 法和手段。發(fā)明內(nèi)容為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明人提供了制備可M材料的新方 法，包括通過使包含化學基團的碳水化合物連接分子(CLM)鍵合 到聚合碳水化合物材料(PCM)上來將PCM改性，其中所述化學9基團賦予該PCM改進的生物相容性。本發(fā)明的制備包含用化學基團改性的PCM的可^UV材料的方 法的主要優(yōu)點之一是避免化學處理PCM。這種處理會改變PCM的 構(gòu)象(confirmation)或取向以及其它物理化學性質(zhì)。因此，本發(fā)明 的方法避免了在PCM的直^f匕學改性中常遇到的纖維結(jié)構(gòu)和性能 的損失。例如，由于使用有機溶劑，水凝膠如細菌纖維素的化學改性會 因結(jié)構(gòu)改變而復雜化。通過將水性化學S^沖支術(shù)用于細菌纖維素的 表面改性，本發(fā)明避免了這些結(jié)構(gòu)改變。在本發(fā)明的其它方面中，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法制成的可植 入材料；該可植入材料用于制造組織工程用支架的用途；包含根據(jù)本發(fā)明制成的材料的組織工程用支架；和體內(nèi)組織置換和/或再生方法。根據(jù)一個具體實施方案，本發(fā)明包括包含根據(jù)本發(fā)明制成的可^材料的AJtifc管。本發(fā)明的Ait^管的特征在于高的耐穿透性、 高爆裂壓力和良好的生物相容性。下面尤其參照附圖更詳細地描述本發(fā)明。


圖1示出了未改性的聚合碳水化合物材料(PCM) (1)和改性 PCM ( 6 )。改性PCM包含碳水化合物連接分子(CLM) (2 )，所 述CLM (2)包含至少一部分可溶性聚合碳水化合物(SCP) (3) 和化學基團(5 )和任選復合的包含該化學基團的碳水化合物聚合物 片段(CPF) (4)。圖2示出使用酶和CPF (4 )制備CLM (2 )。使SCP (8)與 酶(7)和包含化學基團(5)的CPF (4)接觸。該酶(7)使SCP 斷裂并引入該含化學基團的CPF，得到產(chǎn)物CLM(2)。圖3示出用Direct Red 28 (剛果紅)染色的細菌纖維素A和棉絨*的朗繆爾吸附等溫線(A)。圖B中的線表示線性回歸的結(jié)果。圖4示出吸附有木葡聚糖參和木葡聚糖-GRGDSA的細菌纖維素的朗繆爾吸附等溫線(A)。圖B中的線表示線性回歸的結(jié)果。圖5示出吸附有木葡聚糖^和木葡聚糖-GRGDSA的棉絨的朗繆爾吸附等溫線(A)。圖B中的線表示線性回歸的結(jié)果。圖6示出木葡聚糖參和木葡聚糖-GRGDSA的吸附量與纖維素底物的比表面積的函數(shù)關(guān)系。該線表示線性回歸的結(jié)果。圖7示出細菌纖維素、棉絨和溶解性纖維(lyocell)的結(jié)晶度。圖8示出GRGDS木葡聚糖^t (XGO-GRGDS )的化學結(jié)構(gòu)。圖9示出了細胞培養(yǎng)基吸附到纖維素上(一)、木葡彩瞎然后細 胞培養(yǎng)基吸附到纖維素上(…)、木葡I^I-GRGDS然后細胞培養(yǎng)基 吸附到纖維素上(一 )的QCM吸附等溫線。箭頭代表水洗。圖10示出了未改性的細菌纖維素(A)，木葡聚糖改性的細菌 纖維素(B)和木葡聚糖-GRGDS改性的細菌纖維素(C)的ECs 的光學顯微圖像。圖11示出了未處理的細菌纖維素(A)、在丙酮中處理后的細菌 纖維素(B)和用木葡聚糖-GRGDS改性的細菌纖維素(C)的SEM 圖像。
具體實施方式
本發(fā)明涉及開發(fā)醫(yī)療或手術(shù)用的可植入聚合碳水化合物材料 (PCM )，在其表面上包含特定化學基團以改變所述材料的物理化學 性質(zhì)。特別地，所述化學基團賦予該PCM改進的生物相容性，例如 通過提供細胞的附著位點或影響細胞在該表面上的粘附、增殖、遷 移和功能的其它因子。此外，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明的可植入材料的方法以及通過這 些方法制成的材料的用途，和包含這些材料的產(chǎn)品。在本說明書中，除非另行指明，"一"或"一種"是指"一種或多種"。關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語"生物相容性"涉及材料的性質(zhì)，即材料與活體相容的性質(zhì)。換言之，與生命體協(xié)調(diào)；對生物功能沒有有毒或 損害的影響。如果例如在使材料與活體的一部分接觸時誘發(fā)不良反 應(yīng)，則該材料與活體具有差的相容性。這種不良反應(yīng)會造成異物反 應(yīng)，如炎癥、感染、無菌性松動、局部組織廢物和^物包嚢以及 血栓形成和栓塞。相反，如果沒有發(fā)生這類不良反應(yīng)，則觀察到與 活體的良好相容性。此外，改進的生物相容性意味著材料與活體的 改進的相容性。生物相容性的實例是血液相容性，即材料與血液相 容的性質(zhì)。制備可;tiA^材料的方法根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了通過使包含化學基團的碳水化 合物連接分子(clm)鍵合到pcm上而將聚合碳水化合物材料 (pcm)改性來制備可植入材料的方法，其中所述化學基團賦予該 pcm改進的生物相容性。該方法的一個實施方案示在圖1中，其示出了未改性的PCM( 1) 和碳水化合物連接分子(CLM) (2)，所述CLM (2)包含至少一 部分SCP (3)和化學基團(5)和任選復合的包含該化學基團的碳 水化合物聚合物片段(CPF) (4)。由于該CLM能夠鍵合到PCM 上，所以在使PCM與CLM接觸時發(fā)生鍵合。在本發(fā)明的一個實施方案中，該方法包括下列步猓(a)提供 包含化學基團的碳水化合物聚合物片段(CPF); (b )使所述包含該 化學基團的CPF與可溶性聚合碳水化合物(SCP)在導致形成由所 述包含該化學基團的CPF和SCP組成的復合物的條件下接觸，所述 CPF和SCP —起形成碳7K化合物連接分子(CLM);和(c)使所述 復合物與要改性的pcm在使該復合物鍵合到pcm上的條件下接 觸。在一個優(yōu)選實施方案中，使包含化學基團的clm接觸pcm并 鍵合到其上的步驟在水性條件下進行。這樣的優(yōu)點在于，在使CLM接觸并鍵合到PCM上的步驟中PCM形態(tài)沒有改變。制備包含化學基團的CLM的方法，即制備由所述CLM和所述 化學基團組成的復合物的方法與PCM分開進行。由此，制備包含化 學基團的CLM的方法可以擴大規(guī)模并包括若干個步驟和嚴苛的條 件?？s寫為"PCM"的術(shù)語"聚合碳水化合物材料"涉及包含不溶 于水的聚合碳水化合物材料和/或水溶性聚合碳水化合物材料的材 料，其全部或部分由一種或多種單糖的重復單元組成。這類PCM通 常是含兩種或更多種不同類型的聚合碳水化合物或含碳水化合物聚 合物和另一聚合物如蛋白質(zhì)的復合材料。根據(jù)本發(fā)明，PCM可以是適合用作可^材料，例如用作組織 工程用支架的主要組分的任何聚合碳水化合物材料。本發(fā)明中可用 的不同PCM例如描i^fc WO 03/033 813中。在一個具體實施方案中，該PCM是纖維素材料形式，即包含纖 維素。在本發(fā)明中，纖維素可提取自一年生植物(如亞麻、；^或 谷物)或多年生植物(如棉、白楊、樺樹、柳樹、桉樹、落葉松木、 松樹或云杉)。適當?shù)睦w維素材料的實例包括純化棉、棉絨、(X-纖維 素、木漿、純木漿、粉末化纖維素、微晶纖維素和/或改性為其它聚 合物的纖維素。與植物纖維素相比具有不同性質(zhì)的另一纖維素來源是微生物源 纖維素。微生物源纖維素在用作生物材料中已受到關(guān)注，這主要由 于針對給定應(yīng)用將其模制成不同形狀的可能性以及其生物相容性和 高純度。這種纖維素是胞外多糖并通過培養(yǎng)木醋桿菌Uceto鈿cter ^///i"附)而相當便宜地制造。與植物纖維素相比，該纖維素以其純 形式擠出和不與任何其它聚合物或蛋白質(zhì)結(jié)合。細菌纖維素可以用 氫氧化鈉有效純化，以實現(xiàn)FDA關(guān)于與血液接觸的移植物的內(nèi)毒素 值，即每器件〈20EU。細菌纖維素含有99%水并且被視為(盡管不 是通過定義)水凝膠。盡管其固含量低，但納米纖維素原纖維的分 枝網(wǎng)絡(luò)提供了好的機械性能(mechanics )。術(shù)語"微生物源纖維素"涉及如上所述由微生物(如細菌)產(chǎn)生的纖維素。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使用纖維素合成細菌(如木醋桿菌屬)的培養(yǎng)物。
縮寫為(SCP)的術(shù)語"可溶性碳水化合物聚合物"涉及包含
一種或多種不同單糖或其衍生物的聚合物，其可溶解在水性或有機
溶劑中。實例包括歸類為半纖維素(不只是由P(l-4)-連接葡萄糖單元組成的那些碳水化合物聚合物，即纖維素)、果膠(多糖醛酸和酯)和淀粉(含或不含a(l-6)側(cè)鏈分支的a(l-4)-連接聚葡萄糖)的多糖。木葡聚糖是由帶有a(l-6);Mt殘基的p( l-4)-連接聚葡萄糖骨架組成的多糖，其中a(l-6);Mt^本身可進一步被其它糖如巖藻糖和阿糖取代；它是這類SCP的實例，具體而言是半纖維素。在一個優(yōu)選實施方案中，SCP能夠^t合到PCM上，例如經(jīng)由一個或多個氳鍵、離子相互作用、 一個或多個共俏i鍵、范德瓦爾斯力或這些的任何組合。在本發(fā)明的一個實施方案中，SCP可以是根據(jù)下文描述的CPF。在一個優(yōu)選實施方案中，SCP來自于木葡聚糖(XG)。
"來自于木葡聚糖"是指由帶有a(l-6);Mt殘基(該a(l-6);Mt^^本身可進一步被其它糖如巖藻糖和阿糖取代)的p(l-4)-連接聚葡萄糖骨架組成的多糖，及其進一步化學取代和改性的變化形式和片段。
縮寫為"CPF"的術(shù)語"碳水化合物聚合物片段"涉及可以是SCP的酶促制備或化學制備片段的分子。這類片段的實例包括所述SCP的任意數(shù)量的重復單元。
因此合適的片段可以在聚合物骨架中含有2至大約5000個單糖單元，如2國10、 4-10、 3-100、 11-15、 20-25、 26-40、 41-60、 61-100、101-200 、 201-300 、 301-400 、 401-500 、 501-1000 、 1001-2000 、 2001-3000 、3001-4000或4001-5000個單糖單元。該CPF可進一步包含具有不同長度和組成的側(cè)鏈。具體實例包括但不限于木葡IMt (xylogluco)-寡糖(XGO)或其片段，或用一個或多個巖藻糖^或其它單糖進一步改性。
14XGO —般根據(jù)Fry等人(1993 ) Physiologia Plantarum， 89， l國3中概述的命名系統(tǒng)命名，其中G代表未取代的p-吡喃葡萄糖基M，X代表吡喃;Mt基-a(l-6)吡喃葡萄糖基單元，L代表吡喃半乳糖基-卩(1-2)-吡喃;^基-a(l-6)葡糖基單元，F(xiàn)代表吡喃巖藻糖基-0[(1-2)-吡喃半乳糖基-P(l-2)-吡喃;^t基-a(l-6)-葡糖基單元。這些不同單元可經(jīng)由p(l-4)連M在吡喃葡萄糖基單元之間連接以形成P(l-4)-葡聚糖多糖骨架。使用這種命名法，通常在對羅望子木葡聚糖進行內(nèi)切葡聚糖酶消化后分離出的XGO是XXXG、 XLXG、 25 XXLG和XLLG。如果這些寡糖的還原端葡萄糖(G)是還原的糖醇形式，該單元用"Gol"表示。因此，例如來自羅望子木葡聚糖的上述寡糖的還原(糖醇)衍生物記為XXXGol、 XLXGol、 XXLGol和XLLGol。
優(yōu)選地，CPF衍生自木葡聚糖并且可以含有3至100個，包括4至10個聚合物骨架單糖單元。
縮寫為"CLM"的術(shù)語"碳水化合物連接分子"涉及含有根據(jù)上文描述的SCP的至少部分和化學基團的分子或復合物。CLM能夠^^合到PCM上，例如經(jīng)由一個或多個氬鍵、離子相互作用、 一個或多個共^h鍵、范德瓦爾斯力或這些的^T組合。
CLM可以通過有機或化學合成和/或通過利用某些酶的催化活性制備。
在本發(fā)明的一個實施方案中，CLM可以利用WO 2004/094646Al中所述的方法制備。例如，該包含化學基團的CLM可通過包括下列步驟的方法制備由木葡聚糖聚合物制備木葡聚糖片段；和將一個或多個化學基團連接到該木葡IMI片段的還原端和/或側(cè)鏈上，由此制得可用于鍵合到PCM上的包含化學基團的CLM。
使用酶和CPF制備CLM的實施方案示在圖2中。使SCP (8)與酶(7)和包含化學基團(5)的CPF(4)接觸。在此實施方案中，酶(7 )使SCP斷裂而引入該含化學基團的CPF，從而產(chǎn)生產(chǎn)物CLM(2)。
該CLM可以包含一個或多個化學基團。在本發(fā)明的一個實施方案中，該CLM可以使用能夠?qū)⑻烊换蚧瘜W改性的單糖或寡糖轉(zhuǎn)移到寡糖或多糖末端上的酶來制備。這類酶包括但不限于具有高糖基轉(zhuǎn)移活性但低的水解活性的酶、具有高的
固有糖基轉(zhuǎn)移活性的葡糖基水解酶、已經(jīng)工程化以提高它們的糖基轉(zhuǎn)移活性的酶和使用核苷酸糖作為底物的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
在WO 03033813中更詳細描述了根據(jù)本發(fā)明可使用的不同的酶及其性質(zhì)以及如何獲得所述酶。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，該酶是木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XET,EC 2.4.1.207 )。
在性質(zhì)上，糖基轉(zhuǎn)移酶如XET酶在活植物體內(nèi)發(fā)揮作用，因此該酶明顯能夠在水性環(huán)境中工作。本發(fā)明的方法因此可以在水溶液中實施，或它可以在水中在某些組分如緩沖劑和/或潤濕劑和/或穩(wěn)定劑和/或聚合物和/或降低水活性的有機組分(如DMSO )存在下實施。關(guān)于這些組分的進一步細節(jié)，參見WO 03/033 813。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，可以通過首先在溶液中使用XET酶將化學改性的XGO偶聯(lián)到木葡IMt (XG)上，然后使改性XG吸附到纖維素材料上，將新的化學基團添加到不含固有木葡聚糖的纖維素材料中。
在本發(fā)明中，術(shù)語"化學基團"涉及潛在可用于PCM改性的任何化學基團。改性是指改變PCM的功能性質(zhì)。改變PCM的功能性質(zhì)的能力在此意義上是該化學基團中固有的。根據(jù)本發(fā)明，該改性賦予該PCM改進的生物相容性。因此，該化學基團改變所述PCM的物理化學性質(zhì)以使其生物相容性更好。
生物相容性涉及材料與活體相容的性質(zhì)。改進材料的生物相容性的一種方式是影響與該材料接觸或相互作用的細胞的粘附、發(fā)育、遷移、增殖、分化、形狀、極性和/或代謝功能。改進材料的生物相容性的一種具體方式是降低該材料誘發(fā)與該材料接觸的血液凝固的趨勢。對AJt血管中所用的材料而言，這種抗凝血性質(zhì)尤其有用。本發(fā)明的化學基團中所含的改變PCM物理化學性質(zhì)以使其生物相容性更好的成分包括但不限于抗凝血因子、ECM粘附分子、生長因子、細胞粘附分子和粘附肽片段以及細胞培養(yǎng)底物和細胞營養(yǎng)素。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，該成分列舉不是窮盡性的，在本發(fā)明中可以使用改變PCM的物理化學性質(zhì)以使其生物相容性更好的其它合適成分。
在本發(fā)明中，術(shù)語"抗凝血因子"涉及降低血液凝固趨勢的分子。用于本發(fā)明的這類分子的優(yōu)選實例是肝素、低分子量肝素和Xa因子的五糖抑制劑，如磺i^Jf素和艾卓肝素(idraparinux )。
關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語"ECM粘附分子"涉及構(gòu)成細胞外基質(zhì)(ECM)的細胞外大分子。這些大分子(主要是蛋白質(zhì)和多糖)局部分泌出并在多數(shù)組織的細胞外空間中裝配成有組織的3-D網(wǎng)絡(luò)。ECM分子包括糖胺聚糖和蛋白聚糖，如硫酸軟骨素、粘連蛋白、硫a素、透明質(zhì)酸酶(hyahiron)、石克^膚素、硫酸角蛋白、層連蛋白、膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和彈性蛋白。細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)細胞骨架的組織、細胞分化以及細胞和組織的空間構(gòu)造。實際上，ECM在通過影響與其接觸的細胞&育、遷移、增殖、分化、形狀、極性和代謝功能來調(diào)節(jié)該細胞的行為方面起到關(guān)鍵作用。
關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語"生長因子"涉及引起細胞增殖的生物活性多肽。它們包括但不限于表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、神經(jīng)生長因子、酸性和堿性成纖維細胞生長因子和血管生成因子、血小板源生長因子、胰島素和胰島素樣生長因子包括生長調(diào)節(jié)素、粘液瘤和牛痘病毒源生長因子。
關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語"細胞粘附分子"涉及含有細胞結(jié)合序列的細胞粘附分子。細胞粘附分子的實例包括整聯(lián)蛋白、鈣粘附蛋白(cadherin)、選擇蛋白、和免疫球蛋白超家族的粘附分子，如VCAM、 ICAM、 PECAM和NCAM。
術(shù)語"ECM粘附分子"、"生長因子"或"細胞粘附分子"包括其任何活性類似物、活性片段或活性衍生物。
17關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語"粘附肽片段"涉及為細胞或影響細胞在該表面上的粘附、增殖、遷移和功能的其它因子提供附著位點的肽序列，例如改進細胞附著效率的肽序列。
幾種這類粘附肽片段是本領(lǐng)域已知的。可以根據(jù)標準技術(shù)測試特定肽片段的結(jié)合能力或粘附能力。這類肽序列的實例包括但不限
于含RGD的肽序列；含YIGSR的肽序列；和/或含IKVAV的肽序列。
含Arg-Gly-Asp (RGD)的肽序列被/iH人為是細胞識別基序。RGD肽不僅有效觸發(fā)細胞粘附，還可用于選擇性尋址某些細胞系并引發(fā)特定細胞應(yīng)答。關(guān)于本發(fā)明中可用的不同含RGD的肽和它們的具體性質(zhì)的進一步細節(jié)描述在Hersel等人，Biomaterials 24 (2003 )4385-4415中。
本發(fā)明中可用的含RGD的肽序列的實例包括但不限于RGD、RGDS、 GRGDS、 GRGD、 YRGDS、 YRGDG、 YGRGD、 GRGDSP、GRGDSG、 GRGDSY、 GRGDSPK、 CGRGDSY、 GCGYGRGDSPG和RGDSPASSKP。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該肽序列為Gly-Arg國Gly-Asp腸Ser (GRGDS )。
含Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR)的肽序列發(fā)現(xiàn)在層連蛋白的Bl鏈上，其促進上皮細胞附著(Graf等人，Biochemistry, 26,第6896-卯0頁(1987))。
含Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV)的肽序列發(fā)現(xiàn)在層連蛋白的A鏈上，并已被報道促進神經(jīng)突長出(Tashiro等人，J. Biol. Chem., 264，pp. 16174-182 (1989))。
本發(fā)明的化學基團可以包含重復肽序列(肽單體)。這些重復肽序列可以是由單種重復肽單體組成的均聚物或可以是由兩種或更多種不同的重復肽單體或亞基組成的雜聚物。通常,該化學基團可以由2至100個肽單體，通常2至50個，優(yōu)選3至15個組成。各肽單體的長度可以為2至40個，通常2至30個，優(yōu)選2至10個M 酸絲。
技術(shù)人員會認識到，肽單體可以化學合成或通過重組遺傳學制 備。類似地，包含重復肽序列的化學基團可以通過將肽單體化學連 接在一起來制備，或它們可以重組表達。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的化學基團包含含 RGD肽序列的重復肽序列。
組織工程用支架
根據(jù)本發(fā)明制成的可M材料可用于制造組織工程用支架。本 發(fā)明的可植入材料的優(yōu)點之一在于其包含賦予該支架改進的生物相 容性的化學基團。
關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語"組織工程用支架"涉及組織替代物或植入 物，例如(受損)組織的功能性替^R物。
本發(fā)明在人和動物醫(yī)療和整容外科中具有廣泛的特殊應(yīng)用，并 可用于之前描述的組織工程用支架的任何和所有適應(yīng)癥，和用于本 領(lǐng)域中尚未明文公開但本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定的其它用途。
本發(fā)明的可^材料的特殊應(yīng)用的實例包括但不限于血管(即 Ait血管)、淋巴管、輸尿管、氣管、消化道、皮膚、口腔、食道、 腹壁、尿道以及牙周組織、軟骨組織和皮下組織的替代材料或組織 植入物。其它應(yīng)用是微神經(jīng)縫合線的護罩；和培養(yǎng)的皮膚栽體 (cultured skin carriers X
本發(fā)明的支架針對其各自應(yīng)用而具體成型。不同的可能形狀包 括但不限于中空管、條帶、圓柱體、桿和薄片。
根據(jù)某些實施方案，微生物源纖維素用作本發(fā)明的支架中的 PCM。微生物纖維素在這方面具有許多有利性質(zhì)，例如其可以合成 各種形狀或尺寸并具有優(yōu)異的形狀保持性。微生物纖維素的這些性 質(zhì)主要歸因于其獨特的薄片狀微原纖維三維結(jié)構(gòu)。以無紡形式排列 的這些微原纖維比植物纖維素(如棉纖維)細大約200倍，從而每單位體積具有巨大的表面積。用于制造成型微生物纖維素材料的方
法在例如JP 8 126 697 A2、 EP186 495、 JP 3 165 774 Al和JP 63 205 109Al中有描述。此外，在JP3 272 772A2和EP396 344A2中描述 了用作血管替代物的中空管微生物纖維素的制造。
除本發(fā)明的可^材料外，本發(fā)明的支架還可以包含輔助材料。 用于此目的的合適輔助材料包括水溶性、可溶于極性溶劑的或形成 親水性凝膠的聚合物材料如瓊脂、葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚乙烯基 p比咯烷酮、藻酸鹽、透明質(zhì)酸、熱凝膠多糖(curdlan)、聚丙烯酸鹽、 肝素、硫酸化多糖、支鏈淀粉、角叉菜膠、葡甘露聚糖、纖維素衍 生物、聚乙二醇、聚乙烯基醇、明膠、膠原、昆布醇、粘連蛋白、 角蛋白、絲水解產(chǎn)物、聚氨基酸、聚有機酸和酶。通過如浸漬、層 壓或吸附之類的方式將本發(fā)明的可^材料與上述輔助材料組合以 獲得復合材料。
根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明的支架包含用含有下述成分的化學 基團衍生化的PCM，所述成分影響與該衍生化PCM接觸或相互作 用的細胞的粘附、發(fā)育、遷移、增殖、分化、形狀、極性和/或代謝 功能。
因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法，可以通過提供適當?shù)姆肿?基序來影響任何類型細胞的行為(即，粘附、發(fā)育、遷移、增殖、 分化、形狀、極性和/或代謝功能)。
特別地，根據(jù)本發(fā)明使用包含影響細胞粘附的成分的化學基團。
本發(fā)明的PCM可用于將細胞粘附分子或粘附肽片段呈遞給各 種類型的細胞。這些類型的細胞包括通常在體內(nèi)與^材料接觸的 任何細胞。這類細胞包括但不限于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細 胞、成肌細胞、成軟骨細胞、成骨細胞和干細胞?？捎迷诒景l(fā)明的 方法和產(chǎn)品中的其它細胞包括Schwann細胞、星形細胞、少突細胞 和它們的前體、腎上腺嗜鉻細胞等。
干細胞代表在培養(yǎng)中可容易膨脹并且可通過施用特定生長因子 使其后代終末分化的一類細胞。成肌細胞是最初由中胚層干細胞群得到的肌肉前體細胞，例如L-6和0-CH3細胞。
要認識到，用在本發(fā)明中的化學基團的選擇可例如取決于所需 靶細胞類型。本領(lǐng)域技術(shù)人員可常恥險測任何特定細胞粘附分子或 粘附肽片賴L^序?qū)λx類型細胞的粘附能力。
在另一些實施方案中，本發(fā)明的支架可以體外預(yù)接種細胞，由 此使細胞暴露在該PCM中?？梢允褂脕碜圆煌瑏碓吹墓δ苄越】导?胞(即自生、異源或異種細胞)。這些細胞接種的支架可用在組織置 換方案中。才艮據(jù)這些實施方案，組織可以體外重構(gòu)，然后將其^ 需要它的宿主中。例如，可以將心成肌細胞懸浮在本發(fā)明的支架中 以形成厚度相應(yīng)于心臟壁的組織補片。該重構(gòu)的心臟補片隨后作為 組織置換療法的一部分植入?？梢钥紤]用于血管、軟骨、腱、骨、 皮膚、神經(jīng)和其它組織的類似方案。
使用本發(fā)明的方法，可以將該可植入材料即支架在所需位置改 性。例如，可以僅將支架片材或管的一側(cè)改性。PCM的密度以及 CLM的長度會影響是PCM的整個網(wǎng)絡(luò)還是僅一側(cè)被改性。因此， 可以通過改變PCM的密度或CLM的長度并由此改變CLM的滲透 和吸附可達性來優(yōu)化PCM的改性程度和改性位置。根據(jù)該實施方 案，本發(fā)明使得可以在特定位置改性并由此賦予該支架/植入物雙重 功能。例如，人it^管的內(nèi)壁可以用促iiA內(nèi)皮細胞的粘附或增殖 的化學基團改性，而同一AJtjfiL管的外壁可以用促進與血管周圍組 織的生物相容性的化學基團來改性。
本發(fā)明的支架可以通過在將細胞接種到該材料上之前在細胞培 養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)PCM來進一步改性。由此改進細胞與該材料的粘附。
在某些實施方案中，本發(fā)明的支架可用于制備Ait血管。獲得 包含PCM的AJt^管的方法是本領(lǐng)域中公知的。本發(fā)明的AitiL管 可以具有任何尺寸，是線型、錐形和/或支化的。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，該Aitjfc管包含微生物源纖維素。 EP 0 396 344和JP 3 272 772描述了獲得包含微生物源纖維素的Ait 血管的方法。該微生物纖維素可例如通過在由例如玻璃紙、Teflon、
21珪、陶乾、無紡織物或機紡織物組成的載體的內(nèi)表面和/或外表面上 培養(yǎng)產(chǎn)生纖維素的微生物來獲得。
Bodin等人,Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes, Biotechnol Bioeng， 2006年12月29日(出版前電子公布)描述了獲得包含微生 物源纖維素的人造血管的改進方法。根據(jù)該方法，通過在作為氧化 栽體的有機眭管上發(fā)酵木醋桿菌并鼓入不同濃度的氧，即21%(空 氣)、35%、 50%和100%來以管形式沉積細菌纖維素。
此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，通過如上所述鍵合賦予微生物纖維 素改進的生物相容性和血液相容性的化學基團將AJt血管的該微生 物纖維素改性。本發(fā)明人造血管的改進的生物相容性和血液相容性 大大降低了阻塞之類的風險。阻塞是主要問題，并且在小直徑Ait 血管的相對低流動條件下普遍。阻塞由血液凝固和血小板沉積引起。 既然造成這些問題的相互作用發(fā)生在血管-植入物界面處，根據(jù)本發(fā)
明改性是提高血、;M目容性和降低阻塞問題的方式。
本發(fā)明的AJtiL管的特征還在于高的耐穿透性和高爆裂壓力。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，該AJt血管的可植入材料包含含 有至少一個含RGD的肽序列的化學基團。這些序列促iiA體內(nèi)皮細 胞與血管壁的粘附或增殖。
此外，該Aitjk管可以在^i^之前預(yù)接種內(nèi)皮細胞。
組織置換和再生
包^^^發(fā)明可^V材料的支架具有^^種醫(yī)療或手術(shù)應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了體內(nèi)組織置換和/或再生的方法， 包括下列步驟a)提供包含根據(jù)本發(fā)明制成的可^材料的組織工 程用支架；和b)將所述材料植入需要它的對象的合適^V位置。
關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語"組織置換"和"組織再生"籠統(tǒng)地指組織 工程，涉及受損組織的功能置換和組織再生。包含本發(fā)明的可植入 材料的支架可充當組織替代物，由此用植入的材料完全或部分替代宿主組織。此外，包含本發(fā)明可植入材料的支架可充當組織再生栽 體，由此宿主細胞滲透該材料。根據(jù)此實施方案，促進了宿主組織 再生。
用于^本發(fā)明支架的方法是常用于例如普通外科、整形外科 或神經(jīng)外科中的組織工程的那些。這些方法根據(jù)對象和植入位置來 采用。植入位置原則上可以是活體的任何部位，例如血管系統(tǒng)、淋 巴系統(tǒng)、皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)等。本發(fā)明的對象可以是需要組織置換的 任何對象，例如哺乳動物，優(yōu)i^A。
在一個具體實施方案中，在植入支架的步驟之前，將所述支架 體外預(yù)接種細胞。
在另一實施方案中，組織工程用的支架;！Ait^血管。
給出下面實施例來舉例說明本發(fā)明。但是，應(yīng)該理解的是，本 發(fā)明并非意在限于這些實施例中描述的具體條件和細節(jié)。
實施例
本發(fā)明人用木葡聚糖-GRGDS綴合物將細菌纖維素表面改性， 并分析GRGDS改性的細菌纖維素對內(nèi)皮細胞粘附的影響。
材料
在剛果紅和木葡聚糖吸附研究中調(diào)查細菌纖維素(BC) 7JCM^ 和Whatmann濾紙(1級，由用于比較的純棉絨制成)。在使用QCM 的吸附研究中使用三甲基甲硅烷基纖維素(TMSC )。該TMSC如 Kontturi等人，Langmuir 19 (2003 ) 5735-5741中所述的合成。使 用Roux燒瓶(工作容積100毫升)，30n下將BC在玉米漿液體培 養(yǎng)基中靜態(tài)生長三天，產(chǎn)生2毫米表膜。用于該生物合成的菌抹是 木醋桿菌亞種做cw/w附e/i似sBPR2001，商品號1700178TM。該菌 林購自American Type Culture Collection,通過在0.1 M NaOH中 60X:下煮沸4小時，隨后在MilliporeTM水中反復煮沸，從而將BC 純化。將該材料蒸汽滅菌并冷藏備用。丙酮處理在冷凍干燥和SEM 分析之前用丙酮處理細菌纖維素過夜。實施例1
木葡聚糖和木葡I^I-GRGDS的制備
基本按以前在Greffe， L.等人,Glycobiology, 2005. 15(4):第 437-445頁中所述的，通過內(nèi)切葡聚糖酶消化直接處理羅望子仁粉
(60。/。木葡聚糖含量，D.N. Palani， Mumbai， India),由此獲得 XXXG、 XLXG、 XXLG和XLLG木葡聚S^t (XGO)的混合物
(15:7:32:46)。如下經(jīng)由l-脫氧-l-M-P-糖苷轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的1-脫氧 -1-#^琥珀酰胺酸鹽衍生物(XGO-succ)，由此將該XGO活化。 將XGO(l克，0.78毫摩爾)溶解在去離子水(IO亳升)中，然后 加入碳酸氫銨(2.5克)，然后在連續(xù)加入碳酸氫銨以保持飽和的同 時將該混合物在42X:下攪拌28小時。通過TLC監(jiān)測反應(yīng)進程(70/30 乙腈/水)。通過三個冷凍干燥循環(huán)除去過量的碳酸氫銨，以產(chǎn)生由 XGO和l-脫氧-l-M-p-糖苷的混合物組成的白色粉末；基于來自原 料和產(chǎn)物的異頭質(zhì)子的iH-NMR信號積分，轉(zhuǎn)化程度為83%。將該 粗制產(chǎn)物溶解在水(10毫升)中，加入琥珀酸酐(157毫克，1.57 毫摩爾，2當量)，并將該溶液在渦旋混合機上劇烈攪拌10分鐘。用 含0.1% TFA的水/乙腈混合物逐步洗脫的反相(C18^J色鐠， 產(chǎn)生白色粉末狀的XGO-琥珀酰胺酸鹽(860毫克，0.63毫摩爾，兩 步收率80% )。力匪R(500 MHz， D20， 25^ ): 8= 2.56 (t， J = 6 Hz， 2H; COCH2CH2COOH), 2.61 (t， J = 7Hz, 2H; COCH2CH2COOH)， 3.24-3.95 (m; Gal， Glc, l-脫氧-l-^J^琥珀酸鹽-Glc的H-2至H-6， Xyl的H-2至H國5 ) , 4.44-4.50 (m; Glc和Gal的H-l) ， 4.85-4.89
(m; Xyl的H畫l) ， 5.08-5.10 (m;帶有Gal-口(l-2)的Xyl的H畫l )。 ESI畫MS [37XXXG陽succ [M+2Na2+， 603.6802計算值(603.7095實 測值)；XLXG- succ和XXLG-succ [M+2Nal2+， 684.7066計算值
(684.7079實測值)；XLLG國succ [M+2Na2+， 765.7330計算值
(765.7475實測值)。
根據(jù)Engfeldt等人Chembiochem FIELD Full Journal Title: Chembiochem: a European journal of chemical biology, 2005. 6(6):
24第1043-50頁描述的方案，使用標準固相Fmoc化學按0.25毫摩爾 的M^合成五肽GRGDS，但有如下不同。在DIPEA (在NMP中 的2.0 M )存在下用HBTU和HOBt( 二者都是在DMF中的0.45 M) 活化Fmoc保護的氨基酸。不進行封端步驟。在最后Fmoc斷開步驟 后，測得該樹脂的肽取代量為0.47亳摩爾/克。在配有玻璃料過濾器
(孔徑P2)的反應(yīng)器中將XGO-succ人工綴合到樹脂結(jié)合肽上。將 XGO-succ( 260毫克，2當量)溶解在DMF( 6毫升)中，并在DIPEA
(66毫升，4當量)存在下用HBTU (215毫克，6當量)和HOBt
(87毫克，6當量)活化。然后加入樹脂結(jié)合肽(200毫克，1當量)。 在1小時后通過用乙醇、NMP、 DIPEA (在DCM中，5% )、 NMP 和DCM (各10亳升)充分洗滌該樹脂來結(jié)束偶聯(lián)。該樹脂隨后在 真空下干燥。在室溫下使用3亳升TFA/H20/TIS (95:2.5:2.5)用30 分鐘從該樹脂中斷掉糖肽，同時除去側(cè)鏈保護基。用水(40毫升) 稀釋該反應(yīng)，用tBME (3x40毫升)萃取，并通過玻璃纖維過濾。 冷凍干燥水相，產(chǎn)生白色固體(82毫克，47%收率)。在相同條件下， 從75毫克樹脂中將未改性的肽斷開和脫保護，產(chǎn)生15亳克GRGDS
(90%收率)。
GRGDS: ill NMR (500 MHz， D20， 25匸)8= 1.52-1.81 (m， 4H; 2 Hp-Arg， 2HX- Arg)， 2.65 ( d， J = 6.5 Hz， 2H; Hp-Asp)， 3.16 (t， J = 7 Hz, 2H; H8-Arg)， 3.80-3.92 (m， 6H; 4 Ha-Gly, 2 Hp-Ser)， 4.26 (t， J = 7 Hz， 1H; H"-Arg)， 4.35 (t, J = 5 Hz, 1H; Ha-Ser)， 4.60 (t, J = 6.5 Hz, 1H; Ha-Asp ) . ESI-MS: [M+H+ 4卯.2376計算值(490.2109實測值)
XGO-succ-GRGDS: S= 1.53-1.86 ( m， 4H; 2HP-Arg， 2HX-Arg )， 2.55-2.60 ( m， 2H ; Hp-Asp ) , 2.80-2.92 ( m， 4H ; XGO-NH-COCH2CH2CO-Gly ) , 3.12-3.16 ( m， 2H; Hs- Arg ), 3.25-3.98 (m:Ha-Gly,Hp-Ser， Gal 、 Glc、 l-脫氧-l-^^琥珀酸鹽-Glc 的H-2至H-6和Xyl的H-2至H-5) ， 4.25-4.30 (m， 1H; Ha-Arg), 4.34-4.36( m， 1H; Ha-Ser )， 4.68-4.74( m， Glc和Gal的H-l )， 4.87-4.91 (m， Xyl的H-l) ， 5.09-5.11 (m，帶有Gal-口(l-2)的Xyl的H-l )。 ESI-MS: XXXG-succ-GRGDS [M+H+Na2+， 828.2988計算值(828.3080實測值)；XXLG-succ-GRGDS和XLXG-succ-GRGDSM+H+2Na3+ 613.8800計算值(613.8911實測值)，[M+H+Na2+ 卯9.3252計算值(909.3289實測值)；XLLG-succ-GRGDS lM+H+2Na3+， 667.8976計算值(667.卯45實測值)，[M+3Na3+ 675.2249計算值(675.2198實測值)，[M+H+Na2+ 9卯,3516計算值
(9卯.3554實測值)。
如下利用木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XET)介導的偶聯(lián)來制備最 終木葡聚糖-GRGDS糖綴合物。將羅望子木葡聚糖(Megazyme， Ireland )溶解在水(2毫克/亳升)中，并將200亳升與 XGO-succ-GRGDS (100毫升，在H20中2毫克/毫升)、H20 (50 毫升)和PttXET16A酶溶液(0.4單位/毫升，50毫升，在100 mM NaOAc中，pH5.5)混合。在35分鐘后，通過將該溶液加熱至 l小時，終止該反應(yīng)。通it^玻璃纖維過濾器上過濾，除去變性酶， 并通過添加乙醇(3倍體積)從濾液中沉淀出產(chǎn)物。將沉淀物收集在 玻璃纖維過濾器上，并通過攪拌和溫和加熱該過濾器^^其重新溶解 在水(20亳升)中。將所得溶液冷凍干燥以產(chǎn)生3卯亳克 XG-GRGDS。通過在DMSO中的HP-SEC分析表明，該產(chǎn)物具有 32000的Mw值(Mw/Mn 1.7 )。使用相同程序制備具有類似分子量(Mw 36000 (Mw/Mn 1.5))的未改性木葡聚糖，不同之處在于用XGO代 替XGO-succ-GRGDS 。
制備木葡聚糖和木葡^^-GRGDS的替代途徑
用纖維素酶消化羅望子仁粉TKP (木葡聚糖，Mw: 1百萬-1.5 百萬道爾頓)，以形成低分子量的木葡聚糖(低Mw的XG) ， Mw 5000- 50 000道爾頓。在GRGDS肽連接到低Mw的XG上之前，用 琥珀酸鹽活化該j氐Mw的XG (見上文的描述)。該GRGDS肽用標 準固相Fmoc化學合成，并根據(jù)上文的描述將其連接到琥珀酸化的 低Mw的XG上。這些GRGDS肽-低Mw的XG可直接用于將細 菌纖維素改性。
實施例2剛果紅的吸附
通過測定剛果紅染料(Direct Red 28,購自Riedel-de Hagn， Germany )最大吸附量來評測細菌纖維素和作為參比的棉的比表面 積。在各吸附濃度下使用6張Whatman 1號紙和6份細菌纖維素凝 膠。將該纖維素材料在含0.5、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0 (w/w)剛果紅的4毫升水溶液中暴露于剛果紅中，并在60C下 以100:1的液體比染色24小時。加入NaC1(20。/0 w/w)作為電解質(zhì)。 利用標準曲線由492納米下的UV吸收來計算剛果紅的殘留濃度[E, 亳克/毫升l。由結(jié)合M前后該溶液在492納米下的吸附差值除以每 體積溶液的纖維質(zhì)量來計算纖維上的剛果紅吸附量[A， mg/g。
實施例3
木葡聚糖(XG)和木葡絲-GRGDS (XG~GRGDS)的吸附
通過測定XG和XG-GRGDS的最大吸附量來評測細菌纖維素 和作為參比的棉絨的比表面積。在各吸附濃度下使用6張Whatman l號紙和6份細菌纖維素^。將該纖維素材料浸在含5、 10、 15、 20% (w/w )木葡聚糖或木葡聚糖-GRGDS的4毫升水溶液中。通過 Kooiman等人描述的比色法(Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas et de la Belgique 79 (1960) 675- 678)測量吸附的XG。 在從0至48小時的各時間間隔下抽取200微升，并將其與5:1的20% (w/v) Na2S04和三碘化物溶液(0.5% 12 + 1% KI)的1毫升溶液 混合。利用標準曲線由620納米下的吸收計算XG的殘留濃度[E，毫 克/亳升]。由結(jié)合反應(yīng)前后該溶液在620納米下的吸附差值除以每體 積溶液的纖維質(zhì)量來計算吸附在纖維上的XG的量[A， mg/g。
實施例4
比表面積、
利用由朗繆爾吸附理論得出的公式1計算由剛果^目對木葡聚 糖和木葡聚糖-GRGDS的吸附得到的棉絨和細菌纖維素的比表面 積
27<formula>formula see original document page 28</formula>
其中[E是吸附平衡時被吸附物的濃度(毫克/亳升)，[A是吸附到纖
維素表面上的被吸附物的量(亳克/克纖維素樣品)，[Amax〗是吸附到 纖維素表面上的被吸附物的最大量(亳克/克纖維素樣品)，K^是吸
附平衡常數(shù)。比表面積Asp表示為<formula>formula see original document page 28</formula>其中Mw是剛果紅(653克/摩爾)；木葡聚糖(36 000克/摩爾)；木 葡IMt-GRGDS (32 000克/摩爾)的分子量，NA是阿伏加德羅常數(shù)， AcR是被一個剛果紅(1.73平方納米)；木葡聚糖(69平方納米)； 木葡聚糖-GRGDS (61平方納米)占據(jù)的面積。Ougiya等人, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 62 (1998) 1714-1719 計算過剛果紅的值。通過假設(shè)木葡聚糖占據(jù)面積隨分子量線性下降， 即將Ougiya等人的高分子量木葡M( 980 000克/摩爾)的ACR1870 平方納米的值外推至較低分子量的木葡IMt，即32 000和36 000克 /摩爾，由此得到木葡聚糖和木葡IMI-GRGDS的值。 如圖3B中所示，由公式(1)獲得直線，表明剛果紅在這兩種 底物上的吸附都符合朗繆爾模型。因此剛果紅最可能以單層形式吸 附在這兩種纖維素表面上。對這兩種表面而言，由斜率值計算出的 吸附最大值(Amax)都達到47 mg/g。 BC的比表面積(79平方米/ 克)與棉絨的(72平方米/克)大致相等，參見公式(2)。棉絨的比 表面積相當好地對應(yīng)于在關(guān)于染料吸附研究的文獻中找到的值，而 BC的比表面積略低于早先報道的值。但是，這種差異是預(yù)期的，因 為BC在這種情況下沒有崩解，并且極其可能具有更少的用于吸附 的暴露面積。
木葡聚糖和木葡IMt-GRGDS也符合朗繆爾吸附行為，參見圖4B和5B。 XG和XG國GRGDS的吸附最大值(Amax)在BC上達到 大約180亳克/克，且僅為在棉絨上的值的大約3倍，參見圖4A和 5A。用木葡聚糖和木葡IMI-GRGDS測得的BC的比表面積為大約 200平方米/克，棉絨的比表面積小幾乎三倍，60平方米/克。這兩種 纖維素表面都符合線性關(guān)系，即較大表面積對應(yīng)于較高的木葡聚糖 吸附量，參見圖6。
木葡聚糖吸附量的差異可能通過細菌纖維素的溶脹網(wǎng)絡(luò)和相比 棉絨更多的暴露和可達到的體積來解釋。已知被吸附物分子的尺寸 對可達到的表面積具有顯著影響，這可以得出結(jié)論較少的棉表面 可用于吸附木葡彩瞎。剛果紅分子沿其縱軸的長度為大約2.5納米， 而DP為26的完全伸展的木葡聚糖骨架為大約30納米。吸附到這 兩種纖維素底物上的木葡聚糖的比表面積差異還可能是由于結(jié)晶結(jié) 構(gòu)差異。細菌纖維素和棉絨具有相同的晶體結(jié)構(gòu)，即纖維素I，參見 圖7,且這兩種底物的相對結(jié)晶度均為70%。但是，該材料具有不 同量的結(jié)晶亞-同質(zhì)異晶(Ia或ip)，在BC中為60o/。Ia:40。/oip， 在棉絨中為僅30。/。Ia:70。/。ip。這可能影響纖維素的物理性質(zhì)，因 為同質(zhì)異晶具有不同的晶體堆積、分子構(gòu)象和氫^合。
實施例5
掃描電子顯微術(shù)(SEM)
使用SEM研究未改性和改性纖維素材料的表面形態(tài)。將該細菌 纖維素材料在冷凍干燥之前在液氮中驟冷。然后在分析之前用金涂 布表面，這用在10kV下運行的Zeiss DSM 940A進行。
實施例6
共聚焦激光顯微術(shù)
使用配有纖維耦合ArKr激光器的共聚焦顯微^研究細菌纖維 素在其濕狀態(tài)下的形態(tài)和整個凝膠中的改性。針對染料的發(fā)射波長 [3iex = 495nm且Xem = 516選擇過濾器。該濕細菌纖維素樣品用熒光 標記的木葡聚糖(XG-FITC)進行熒光標記。按Brumer， H.等人,Journal of the American Chemical Society, 2004. 126(18): 第 5715-5721頁中所述合成XG-FITC。用2毫克/亳升XG-FITC儲液 將該濕剿&染色24小時。染色后，通過在溫和攪拌下將樣品置于去 離子水中過夜，除去過量XG-FITC。
實施例7
ESCA
在用木葡聚糖表面改性之前和之后，用ESCA測定細菌纖維素 的化學組成。在改性之后和在測量之前，將該材料在30n下烘干。 4吏用Physical Electronics的Quantum 2000進4亍測量。被分才斤的面 積為500 x 500平方微米，光束尺寸為100微米。樣品與檢測器之間 的角度為45° 。測量峰強度，并4吏用Physical Electronics的MultiPak 軟件進行曲線擬合。纖維素的特征ESCA光鐠具有在286.7eV對應(yīng) 于與氧單鍵合的碳的一個峰，和在287.9eV對應(yīng)于與兩個氧鍵合的 碳的一個峰。用最高分辨率Cls峰的高斯曲線擬合計算不同鍵合碳 的相對量。C-C、 C-O、 O-C-O或c=o和o-c=o的不同位置分別 為285.0±0.2 eV、 286.7±0.2 eV、 281.1 ±0.2 eV和289.4 ±0.2 eV。
ESCA表明，該表面已經(jīng)用木葡聚糖改性?？梢钥吹芥I合到木 葡聚糖側(cè)基的氧上的碳量#增加。但是，可能由于該基團尺寸小 并可能在烘干時嵌入和指向^內(nèi)部，所以無法量化GRGDS的量。 木葡聚糖和纖維素本身也存在痕量氮，這^^征進一步復雜化。
實施例8
與水的動態(tài)接觸角
在6張烘干的纖維素薄膜(未改性以及用XG或XG-GRGDS 改性的纖維素)上進行靜態(tài)接觸角測量。在各纖維素表面上施加5 微升液滴。使用測角儀通過記錄在該固體和與液滴表面的切線之間
形成的角度來測量接觸角ee。
相比較未改性的細菌纖維素，用木葡聚糖和木葡聚糖-GRGDS 改性時，潤濕性略高(表l)。表l
表面接觸角，ee±sD
細菌纖維素44 ± 5.3
細菌纖維素+XG29 ± 4.8
細菌纖維素+ XG-GRGDS32 ± 5.8
未改性的細菌纖維素與水的接觸角相對大是由于壓實結(jié)構(gòu)、較 少的孔(對毛細力而言)和較少的可用羥基(由于高結(jié)晶度)。用木
葡聚糖改性增加了可用的羥基，并由此提高潤濕性。引入GRGDS 不會顯著降低潤濕性，參見圖8中的結(jié)構(gòu)。潤濕性仍高于未改性BC。
實施例9
使用OCM的蛋白質(zhì)吸附
使用QCM-D儀器(Q-sense AB， Giiteborg， Sweden)研究蛋白 質(zhì)在纖維素表面上的吸附受表面改性的影響。
在鍍金QCM-D晶體上制備模型纖維素表面。將表面在UV/臭 氧室中清洗10分鐘，然后在Milli-Q水、H202 (30% )和NH3 (25% ) 的5:1:1混合物中于70n下浸漬10分鐘。該表面用Milli-Q洗滌并 用氮氣干燥。將三甲基曱^基纖維素(在甲苯中，1毫克/毫升) 以4000 rpm、 1分鐘旋涂到^T表面上。除去三甲基甲硅烷基，并在 氯化氫蒸汽(10%溶液)上生成纖維素。在第三諧波(15Hz)下進 行測量。f的變化反映偶聯(lián)到晶體表面上的質(zhì)量。對于薄的均勻分布 的剛性薄膜，如Sauerbrey公式所述將吸附誘發(fā)的頻移Uf)與質(zhì) 量吸取相關(guān)聯(lián)
m — S
其中m是質(zhì)量(ng )， A是面積(cm2 )， nr是諧波數(shù)(=1,3...) C是
31質(zhì)量靈敏度常數(shù)(17.7 ng/cm2/Hz)。 一式三份地進行測量。在2亳 克/亳升濃度下吸附木葡聚糖和木葡聚糖-GRGDS。在引入細胞培養(yǎng) 基之后，在各吸附后進行用水解吸的步驟。使用與細胞接種中所用 相同的培養(yǎng)基研究蛋白質(zhì)吸附。該細胞培養(yǎng)基含有蛋白質(zhì)混合物， 包括含RGD基序的細胞粘附蛋白粘連蛋白。為了闡明用 XG-GRGDS改性是否造成從細胞培養(yǎng)基中吸附蛋白質(zhì)(特別是粘連 蛋白)的增加，使用QCM-D在模型纖維素表面上進行吸附研究。 在引入細胞培養(yǎng)基之后引入粘連蛋白抗體(粘連蛋白抗體(Biotin ) (ab6584) , Abcam)，以證實任何可能被吸附的蛋白質(zhì)是否是粘連 蛋白。在所有吸附后進行用水解吸的步驟。
如圖9中所示，大約100納克/平方厘米來自細胞培養(yǎng)基的蛋白 質(zhì)被吸附到未改性的纖維素表面上。當先吸附木葡聚糖時，沒有蛋 白質(zhì)被吸附。當用帶有粘附五肽的木葡聚糖將纖維素改性時，與未 改性的纖維素相比，更少蛋白質(zhì)被吸附(50納克/平方厘米)。在用 木葡聚糖-GRGDS和細胞培養(yǎng)基改性后引入粘連蛋白抗體IgG?？?粘連蛋白的IgG不吸附，表明所吸附的蛋白質(zhì)不是粘附蛋白粘連蛋 白或至少不是活化形式。
實施例10
廣角X-射線散射(WAXS)
將BC的冷凍干燥丸粒壓成直徑1厘米的丸粒。在Siemens D5000衍射儀上記錄X-射線衍射圖。使用波長1.54A的CuKa陽極。 通過20=5-30°進行掃描。測量非晶衍射的晶體衍射峰的強度。相對 結(jié)晶度測定為晶體部分與總部分之間的比率。
實施例11
細胞接種
使用S^法v^A隱靜脈的健康部位分離出內(nèi)皮細胞(HSVEC )。 細胞在M199 (PAA Laboratories GmbH， Linz， Austria)中培養(yǎng)，該 M199補充有含1.7國3.4 g/dl清蛋白且總蛋白質(zhì)含量為3 - 4.5g/ml的20。/。胎牛血清(FBS; PAA Laboratories GmbH )、青霉素-鏈霉素(100 U/mL; PAA Laboratories GmbH)、 1.2 mM L國谷氨酰胺(PAA)、 牛腦提取物(75mg/500mL;實驗室中制得)和肝素(13U/mL; Leo Pharma， Malm6， Sweden )，并將其保持在下含5% C02的加濕 培養(yǎng)器中。在細胞鋪板之前，用相當于BC干重量的15%的木葡聚 糖和XG-GRGDS將該BC改性過夜。在細胞鋪板之前，將改性纖維 素用PBS洗滌兩遍。
為了評估細胞形態(tài)，將HSVEC以3 x 105個細胞/平方厘米的密 度鋪板在改性和未改性的BC板上。在第1天和第3天取出樣品進 行評測。將細胞固定在3.7%甲醛中并在0.2% Triton X-100中透化 處理。為了使f-肌動蛋白可見，用結(jié)合到Alexa Fluor 546( Molecular Probes Inc., Eugene, OR， USA)上的鬼筆環(huán)肽將細胞染色。將細胞 核用DAPI( Sigma-Aldrich Sweden AB， Stockholm, Sweden )復染色。 將樣品^^ SlowfadeTM Antifade封固劑(Molecular Probes Inc.)中 并用Axio Imager Ml ( Carl Zeiss, G6ttingen， Germany)分析。用 AxioCamHRc (Zeiss)對圖片進行數(shù)字捕獲。
細胞粘附
初始細胞粘附研究表明，細胞粘附在木葡IMt-GRGDS改性的 纖維素上比在未改性的和木葡聚糖改性的纖維素上更快更好。光學 顯微圖像表明，在改性表面上存在更多細胞，且伸展和粘附更發(fā)達， 參見圖10。
實施例12
形態(tài)
棉絨和細菌纖維素的形態(tài)在許多方面不同。棉絨由其表面被微 原纖維覆蓋的纖維組成。纖維尺寸為大約6微米。另一方面，細菌 纖維素是由尺寸為70-100納米的納米原纖維組成的溶脹三維網(wǎng)絡(luò)。
在水相中用木葡聚糖改性細菌纖維素不會改變該形態(tài)(圖11C )。 如果在有機溶劑(例如丙酮)中進行改性則情況并非如此，此時網(wǎng)絡(luò)明顯收縮，比較圖11A和11B。為了保持BC的網(wǎng)絡(luò)，優(yōu)選在水 中改性。用熒M葡IM奮(木葡聚糖-FITC)改性的細菌纖維素的共聚 焦Z43描表明，該納米纖維素材料整個被均勻改性。
結(jié)論
本發(fā)明的發(fā)明人描述了在納米原纖維網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)不受影響的情 況下將纖維素納米原纖維改性的新方法。如用比色法證實的那樣， 用木葡IMI-GRGDS將細菌纖維素成功改性。吸附量達到最多190 毫克/克。如通過SEM和在共聚焦顯微術(shù)中的z-掃描觀察到的那樣， 納米纖維素材料的整個材料被均勻改性。此外，在水相中改性比在 有機溶劑中明顯有利于保持形態(tài)。該改性提高潤濕性，這可能解釋 QCM-D所示的被吸附蛋白質(zhì)減少或量可忽略不計。初始細胞研究已 經(jīng)證實，當BC水凝膠用木葡IMt-GRGDS改性時，內(nèi)皮細胞的粘 附改進。如QCM-D證實的，改進的細胞粘附并不是由于從培養(yǎng)基 中非特異性吸附粘連蛋白，而是由于因XG的特異性呈遞RGD表位。
盡管已經(jīng)通過實施例詳細描述本發(fā)明的具體實施方案，但本領(lǐng) 域技術(shù)人員顯然能想到對本發(fā)明進行修改和調(diào)整。但是，要明確理 解到，這類修改和調(diào)整在如權(quán)利要求所述的本發(fā)明范圍內(nèi)。
3權(quán)利要求
1.通過將聚合碳水化合物材料(PCM)改性來制備可植入材料的方法，所述改性通過使包含化學基團的碳水化合物連接分子(CLM)結(jié)合到PCM上，其中所述化學基團賦予所述PCM改進的生物相容性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述包含化學基團的CLM通過 包括下列步驟的方法制備由木葡聚糖聚合物制備木葡聚糖片段；和 將一個或多個化學基團連接到所述木葡聚糖片段的還原端和/或側(cè)鏈 上，由此制得適用于結(jié)合到所述PCM上的包^^化學基團的CLM。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將所述PCM改性的步驟利用下 列步驟進行(a) 提供包含化學基團的碳7jc化合物聚合物片段(CPF);(b) 使所述包含化學基團的CPF與可溶性聚合碳水化合物 (SCP)在導致形成由所述包含化學基團的CPF和SCP組成的復合物的條件下接觸，所述CPF和SCP —起形成碳水化合物連接分子 (CLM);和(c) 使所述CLM與要改性的PCM在使所述CLM結(jié)合到所述 PCM上的條件下接觸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的制備可^LX材料的方法，其通過結(jié)合木葡聚 糖源分子將纖維素材料改性，在所述木葡聚糖源分子上已連接有賦予 所述纖維素材料改進的生物相容性的化學基團。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的制備可^材料的方法，所述方法通過將纖 維素材料改性來進行，并包括下列步驟(a) 提供其上已連接有賦予改進的生物相容性的化學基團的木(b) 使所述木葡聚糖-寡糖與來自于木葡聚糖的碳水化合物聚合 物在導致形成碳水化合物連接分子(CLM)的條件下接觸，所述連接 分子包含帶有連接的化學基團的木葡聚糖-寡糖和來自于木葡聚糖的 碳^c化合物聚合物；和(c)使所述CLM與要改性的纖維素材料在使CLM結(jié)合到纖維 素材料上并改進纖維素材料的生物相容性的條件下接觸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4-5的方法，其中所述賦予改進的生物相容性的 化學基團是蛋白質(zhì)或肽。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6的方法，其中使共價連接的化學基團連接到 木葡聚糖-寡糖的還原端。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述CLM的形成通過木葡IMt 內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XET， EC 2.4.1.207)催化。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述PCM是纖維素材料，所述 SCP來自于木葡聚糖，所述CPF來自于木葡聚糖并^^有3-100個聚合 物骨架單糖單元，所述化學基團是賦予改進的生物相容性的因子。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述來自于木葡聚糖的CPF含 有4-10個聚合物骨架單糖單元。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10-11的方法，其中使所述化學基團共價連接到 CPF的還原端。
12. 根據(jù)權(quán)利要求l-ll中任一項的方法，其中使包含化學基團的 CLM與PCM接觸并結(jié)合的步驟在水性條件下進行。
13. 根據(jù)權(quán)利要求3、 5-7或9-12中任一項的方法，其中使包含所 述化學基團的CPF與SCP在具有糖基轉(zhuǎn)移活性的酶的存在下接觸， 所述酶能夠促進形成由所述包含化學基團的CPF和SCP的至少一部 分組成的復合物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述具有糖基轉(zhuǎn)移活性的酶是 木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XET， EC 2.4.1.207 )。
15. 根據(jù)權(quán)利要求3或12-14中任一項的方法，其中所述CPF是 木葡聚糖-寡糖(XGO)，所述SCP的至少一部分來自于木葡聚糖(XG)'
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項的方法，其中所述PCM是纖維素材料形式。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項的方法，其中所述PCM是微生 物源纖維素，優(yōu)選所述微生物源纖維素由木醋桿菌(a:W""附)生成。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其中所述賦予PCM改 進的生物相容性的化學基團包含下列至少一種細胞外基質(zhì)(ECM) 粘附分子、生長因子、細胞粘附分子或粘附肽片段。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項的方法，其中所述賦予PCM改 進的生物相容性的化學基團包含抗凝血因子。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述粘附肽片段是含 Arg-Gly-Asp (RGD)的肽序列；含Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) 的肽序列；和/或含Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV)的肽序列。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述化學基團包含至少一個含 RGD的肽序列。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述化學基團包含至少一個 Gly隱Arg畫Gly-Asp國Ser (GRGDS)肽序列。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項的方法制成的醫(yī)療或手術(shù)用的可 ^材料。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項的方法制成的可^材料用于制 造組織工程用支架的用途。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其用于制itAJt血管、AJt皮膚、 神經(jīng)支架或整形外科^物。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其用于制itAit血管。
27. 包含根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項的方法制成的材料的組織工 程用支架。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27的支架，其中所述組織工程用支架已體外預(yù) 接種細胞。
29. 包含根據(jù)權(quán)利要求l-22中任一項的方法制成的材料的AJtir管。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29的AJt血管，其中所^Ait血管已體外預(yù)接 種細胞。
31. 體內(nèi)組織置換和/或再生的方法，包括下列步驟a) 提供包含根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項制成的可^材料的組 織工^E用支架；和b) 將所述材料^需要它的對象的合適^位置。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中在植入所述組織工程用支架的 步驟之前，將所述支架體外預(yù)接種細胞。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31-32中任一項的方法，其中所述組織工程用支 架是AJtjfiL管。
全文摘要
醫(yī)療或手術(shù)用的可植入材料，在其表面上包含特定化學基團以改變所述材料的物理化學性質(zhì)，從而賦予其合適的植入性質(zhì)或生物相容性質(zhì)。
文檔編號A61L27/20GK101668552SQ200880006212
公開日2010年3月10日 申請日期2008年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月26日
發(fā)明者保羅·加滕霍爾姆, 博·里斯貝里, 哈里·布魯默, 奧瑟·博丁, 尼爾斯·拉格·阿倫斯泰特, 海倫·芬克 申請人:瑞典樹木科技公司