專利名稱：：用于生產(chǎn)基于酵母的疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在中性pH培養(yǎng)酵母培養(yǎng)物以改善酵母培養(yǎng)物的產(chǎn)率和某些特征的方法。本發(fā)明還涉及通過這些方法產(chǎn)生的組合物。
背景技術(shù)：
：疫苗是衛(wèi)生護(hù)理產(chǎn)業(yè)可利用的費(fèi)效比最高的措施之一。然而對于多種疾病而言依然急需研發(fā)安全有效的疫苗和佐劑，包括由于致病因子感染、癌癥、遺傳缺陷所致的那些疾病及其他免疫系統(tǒng)紊亂。有關(guān)疫苗的出版物，例如Rabinovich等，265，1401-1404(1994)指出，仍然需要能夠口服給藥以及僅需少次、優(yōu)選在生命早期給藥的安全熱穩(wěn)定的疫苗。還優(yōu)選能夠保護(hù)個(gè)體對抗不止一種疾病的組合疫苗，以及不需要佐劑的疫苗和能夠亂t粘膜免疫的疫苗。迄今為止，如果有的話，也只有極少的疫苗滿足所有這些標(biāo)準(zhǔn)。亞單位疫苗的研發(fā)因?yàn)橹亟MDNA技術(shù)而成為可能，^il今為止一直令人失望，因?yàn)樗鼈儍H呈現(xiàn)出有限的免疫原性。一個(gè)例子是最近幾種HIV(人類免疫缺陷病毒)亞單位疫苗的臨床測試已被終止，這不僅是因?yàn)檫@些疫苗功效有限，而且還因?yàn)樵谝恍┣闆r下經(jīng)免疫的個(gè)體在隨后接觸HIV時(shí)表現(xiàn)出加劇的病程ii^;例如參見Cohen，Sc/ewce264:1839(1994)和Cohen，Sc/^ice264:660(1994)。亞單位疫苗以及殺死的病毒和重組活病毒疫苗的一個(gè)劣勢在于雖然它們似乎刺激強(qiáng)體液免疫反應(yīng)，但是不能M保護(hù)性細(xì)4胞免疫。1994年國際艾滋病大會(InternationalAIDSConference)的主要結(jié)論是，依然需要細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)來預(yù)防或減輕HIV感染性，而這在迄今為止的臨床疫苗中是一直缺乏的。另外，迄今為止所測試的HIV疫苗不能在粘膜表面(最初HIV感染發(fā)生的位置)激發(fā)免疫。此外，在美國批準(zhǔn)使用的唯一佐劑是鋁鹽，即氫氧化鋁和磷酸鋁，兩者均不能刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。另外，鋁鹽制劑不能進(jìn)行冷凍或凍干，且這樣的佐劑并非對所有抗原都有效。酵母細(xì)胞已經(jīng)用于亞單位蛋白疫苗的生產(chǎn)，包括前述HIV疫苗試驗(yàn)中測試的一些。還曾在動物免疫之前對其飼喂酵母，試圖以非特異性方式引發(fā)免疫反應(yīng)(即刺激吞噬作用以及補(bǔ)體和干擾素的產(chǎn)生)。這些結(jié)果模棱兩可，且這樣的方案未產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞免疫；例如參見Fattal-German等，Z)ev.77:115-120(1992)和Bizzini等，F(xiàn)￡7W5Mic/y^/o/./附附mwo/.2:155-167(19卯)。除疫苗之外，許多基因和藥物治療也都需要有效的特異性遞送運(yùn)載體以確保最大的可能益處。缺乏足夠的遞送運(yùn)載體是基因治療應(yīng)用的主要攔路虎，并且大幅限制了許多藥物的治療潛力。例如，最近的報(bào)道顯示目前正在臨床上進(jìn)行基因治療應(yīng)用檢測的腺病毒載體會刺激不期望的免疫和炎性反應(yīng)，且似乎并不以期望的方式發(fā)生整合；例如參見Engdhardt等，i/w附""77^m/7j;5:1217-1229(1994)及其中引述的參考文獻(xiàn)。酵母疫苗技術(shù)的另一主要障礙為生產(chǎn)過程。多年來已在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了酵母細(xì)胞培養(yǎng)，且已經(jīng)確立了標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件。例如參見Me幼^fe0/五wzj^o/0gv,194巻，Guthrie等編輯，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)(1990)。標(biāo)準(zhǔn)操作方案一般包括在以pH水平衡量為酸性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母。然而，在酸性培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母可能導(dǎo)致酵母呈現(xiàn)出對于^f吏用酵母作為抗原攜帶載體用于免疫調(diào)節(jié)或疫苗制備目的而言并非最佳的不同生物學(xué)特性。因此，需要培養(yǎng)酵母的方法，以便酵母呈現(xiàn)出使之更佳地適用于作為抗原攜帶載體的特性。本文公開的發(fā)明部分地基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即，雖然酵母能夠在酸性培養(yǎng)基中生長，但酵母在酸性培養(yǎng)基中生長時(shí)所呈現(xiàn)出的生物學(xué)特性不如酵母在中性pH水平的培養(yǎng)基中生長時(shí)那樣值得期望。特此將本文引述的所有專利、專利申請和出版物的公開內(nèi)容整體并入作為參考用于一切目的。發(fā)明概述本發(fā)明提供了通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母來生長酵母的方法，其中培養(yǎng)基在5.5-8的pH水平維持至少50%的酵母培養(yǎng)時(shí)間。本發(fā)明還提供通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母來生長酵母的方法，其中培養(yǎng)基維持在5.5-8的pH水平，且其中酵母的密度為至少0.5酵母單位/ml。在其他方面，本發(fā)明提供通過在pH水平至少5.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母來生長酵母的方法。本發(fā)明還提供通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母來生長酵母的方法，其中培養(yǎng)基維持在5.5-8的pH水平。在本發(fā)明的一方面，酵母是酉良酒酵母(Sffcc/^w附^c^cereWs/M)。在本發(fā)明的一方面，培養(yǎng)基用琥珀酸鹽或琥珀酸進(jìn)行緩沖，或者培養(yǎng)基額外地含有大豆胨(soytone)。在本發(fā)明的其他方面，酵母激發(fā)免疫反應(yīng)。在本發(fā)明的其他方面，酵母表達(dá)抗原，在一些情況下抗原是異源抗原。在一些情況下，異源抗原在酵母表面表達(dá)。本發(fā)明提供組合物，其含有通過上述任何方法和相關(guān)方面培養(yǎng)的酵母。本發(fā)明提供生產(chǎn)抗原表達(dá)酵母的方法，方式為在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有用于表達(dá)所述抗原的表達(dá)系統(tǒng)的酵母，其中所述培養(yǎng)基的pH為至少5.5。本發(fā)明還提供生產(chǎn)抗原表達(dá)酵母的方法，方式是培養(yǎng)含有用于表達(dá)所述抗原的表達(dá)系統(tǒng)的酵母，其中培養(yǎng)基維持在5.5-8的pH水平。在一個(gè)方面，酵母是釀酒酵母。在其他方面，培養(yǎng)基用琥珀酸鹽或琥珀酸進(jìn)行緩沖，或者培養(yǎng)基可以額外地含有大豆胨。在本發(fā)明的其他方面，酵母M免疫反應(yīng)。在本發(fā)明的其他方面，酵母表達(dá)抗原，在一些情況下抗原是異源抗原。在一些情況下，異源抗原在酵母表面表達(dá)。在一些方面，與在pH低于5.5培養(yǎng)酵母相比，該異源抗原更易獲得用于與其他細(xì)胞或物質(zhì)相互作用。本發(fā)明還提供組合物，含有通過上文所公開的方法培養(yǎng)的酵母。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)個(gè)體Thl型反應(yīng)的方法，包括向個(gè)體施用含有抗原表達(dá)酵母的組合物，其中酵母已在pH水平至少5.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)個(gè)體Thl型反應(yīng)的方法，包括向個(gè)體施用含有抗原表達(dá)酵母的組合物，其中酵母已在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基維持在5.5-8的pH水平。在一個(gè)方面，組合物含有荷載了已在中性pH培養(yǎng)、維持或收獲的酵母的樹突細(xì)胞。在另一方面，酵母是釀酒酵母。在其他方面，培養(yǎng)基用琥珀酸鹽或琥珀酸進(jìn)行緩沖，或者培養(yǎng)基可以額外含有大豆胨。在本發(fā)明的其他方面，酵母激發(fā)免疫反應(yīng)。在本發(fā)明的其他方面，酵母表達(dá)抗原，在一些情況下抗原是異源抗原。在一些情況下，異源抗原在酵母表面表達(dá)。在一個(gè)方面，Thl型反應(yīng)是產(chǎn)生干擾素i。在另一方面，Thl型反應(yīng)是產(chǎn)生IL國12。本發(fā)明還提供了培養(yǎng)酵母的試劑盒，含有培養(yǎng)基和使用培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母的說明書，其中培養(yǎng)基的pH至少5.5。本發(fā)明還提供了培養(yǎng)酵母的試劑盒，含有培養(yǎng)基和使用培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母的說明書，其中培養(yǎng)基的pH維持在5.5-8的pH水平。在其他方面，培養(yǎng)基用琥珀酸鹽或琥珀酸進(jìn)行緩沖，或者培養(yǎng)基可以額外含有大豆胨。在一個(gè)方面，試劑盒額外包括酵母。在一些情況下，酵母是冷凍的或凍干的。在一些情況下，酵母已在至少pH5.5的培養(yǎng)基中進(jìn)行過培養(yǎng)，或已在培養(yǎng)基的pH維持在5.5-8的pH水平的培養(yǎng)基中進(jìn)行過培養(yǎng)。在其他情況下，酵母能夠復(fù)制。附圖的簡短說明圖l描繪了培養(yǎng)基pH水平對細(xì)胞生長以及對培養(yǎng)物pH水平的影響。圖2描繪了培養(yǎng)基pH水平對細(xì)胞壁厚度的影響。圖3描繪了測試pH大約6.5的不同緩沖液的結(jié)果。顯示了對75-15細(xì)胞的生長和培養(yǎng)物pH的影響。圖4描繪了通過葡聚糖酶裂解測量的、多種緩沖劑對細(xì)胞壁厚度的影響。培養(yǎng)基使用琥珀酸鹽或檸檬酸鹽進(jìn)行緩沖，以緩沖培養(yǎng)基至大約6.5的pH水平。圖5描繪了培養(yǎng)基配方研究的結(jié)果，其中測試了多種添加劑對生長和7pH水平的影響。圖6描繪了作為培養(yǎng)基配方研究一部分的酵母細(xì)胞存活力結(jié)果。酵母細(xì)胞表面上HA的表面表達(dá)利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測量。圖7描繪了培養(yǎng)基配方研究中的細(xì)胞生長和pH曲線結(jié)果，其中測試了多種添加劑。圖8描繪了可以自完整酵母釋放的血細(xì)胞凝集素(HA)的免疫印跡測定結(jié)果，當(dāng)在中性條件培養(yǎng)酵母時(shí)相對于在較低pH條件培養(yǎng)酵母時(shí)，完整細(xì)胞顯示出HA可及性的差異。免疫印跡為來自YEX和GI-8103的DTT洗脫物的western印跡(蛋白質(zhì)分析)。圖9描繪了在中性和低pH水平培養(yǎng)酵母細(xì)胞對于荷載酵母細(xì)胞的樹o^rAn必"Ar必rF1工^^、、，7、WJE4nA尺湖力。wyj刀'vuT^w，o發(fā)明詳述本文公開的發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即在中性pH、至少pH5.5、或pH5.5-8、或pH6-8培養(yǎng)酵母將導(dǎo)致酵母具有更為期望的生物學(xué)特征。這些期望特征中的一些在下文詳述，包括但不限于能夠在增大的細(xì)胞密度下生長良好，保持酵母細(xì)胞壁的柔韌性(pliability)和對細(xì)胞壁消化酶消化的敏感性，以及以使抗原更易于被其他細(xì)胞和/或物質(zhì)所獲得的方式展示抗原。除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、核酸化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的解釋，例如M^AoA</五f^yif^/ogv，194巻，Guthrie等編輯，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1990);做da"/v/,/es1"flsts，Skinner等編輯，AcademicPress(1980);Me幼o(hù)ifeZ"crto6omtofy附朋wa/，Rose等，冷7良港實(shí)驗(yàn)室出版牙土(1990);S"cc/^iwwyc":CW/C>c/eCW/J5/o/o^v，Pringle等編輯，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1997);77^S"cc/ra/wwj;ces:(7ewe五a:/7"m/ow,Jones等編輯,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版牙土(1993);T7re投fl對iS"cc/rfl/y7考ces..D"a柳/"，iV。,e/wiS戸幼esis，朋</E"e/^//a，Broach等編輯，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1992);《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Mo/ecM/arC7ow/wg:J丄"6omto/jAf"w做/)第二版(Sambrook等,1989)和《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》第三版(Sambrook和Russe11，2001),(在本文聯(lián)合稱為"Sambrook");Cw/rewf尸rotoco/s/"Mio/ecM/ar丑iV/ogv(F.M.Ausubel等編輯，1987，包括直至2001年的增補(bǔ)本)；尸C/:77^i^(v附emseC%fl/及e""/o"，(MuHis等編輯，1994);Harlow和Lane(1988)Jfift'6orf/^,J丄fl6omtoryMaw"fl/，冷泉港出版公司(ColdSpringHarborPublications),紐約；Harlow和Lane(1999)fZs/"gy4w,幼^'w^1flAom^vM""簡fl/冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(在本文聯(lián)合稱為"Harlow和Lane，，)，Beaucage等編輯，C"frewf/Votoco/s7V"c/e/c/4ciV/C^附/s^JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,2000)和^tc"7im，S.Plotkin和W.Orenstein編輯，第三版(1"9)。定乂如本文所用，一般使用的術(shù)語"中性pH，，是指至少5.5的pH水平。中性pH范圍可以是大約pH5.5至大約pH8，優(yōu)選大約pH6至大約8。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，用pH計(jì)測量時(shí)會發(fā)生微小的波動(例如十分之幾或百分之幾)，照此，在任何給定時(shí)間確定pH水平時(shí)應(yīng)當(dāng)將此考慮在內(nèi)。如本文所用，一般使用的術(shù)語"抗原"指任何能夠?yàn)楂@得性免疫系統(tǒng)所識別的分子。在一個(gè)方面，抗原是與抗體特異性結(jié)合的分子。所迷分子可以是天然存在或合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的任何部分(肽、部分蛋白質(zhì)、全長蛋白質(zhì))；或是細(xì)胞組合物的部分(全細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或破壞的細(xì)胞)；或是生物體的部分(整個(gè)生物體、裂解物或破壞的細(xì)胞)；或是糖或其部分?？乖旧砘蚪柚谄渌衔锶缱魟?像破碎的酵母細(xì)胞)能夠激發(fā)抗原特異性體液免疫反應(yīng)。在另一方面，抗原在主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的環(huán)境中凈皮T、淋巴細(xì)胞(或T細(xì)胞)識別。在另一方面，抗原能夠作為耐受原(toleragen)，對抗在接受該抗原施用的動物細(xì)胞和組織內(nèi)所遭遇的相同或相似抗原。在本發(fā)明的一個(gè)方面，當(dāng)述及刺激免疫反應(yīng)時(shí)，"抗原"可以是"免疫原"。免疫原是能夠激發(fā)獲得性免疫反應(yīng)、例如誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的分子。免疫原在一些情況下能夠產(chǎn)生記憶細(xì)胞，這些細(xì)胞在將來接觸所述抗原時(shí)將產(chǎn)生識別所述抗原的抗體。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的那樣，免疫原也能夠?yàn)門淋巴細(xì)胞所識別，盡管T淋巴細(xì)胞所識別的免疫原的形式將有別于抗體所識別的免疫原的形式。絲發(fā)賴才法本發(fā)明提供了培養(yǎng)酵母的方法，所述酵母產(chǎn)生期望的特征；例如期望抗原的高表達(dá)，細(xì)胞壁的柔韌性，抗原的展示。這些方法廣泛適用于所有酵母。酵母為歸屬于下述三綱之一的單細(xì)胞;微生物子嚢菌綱(^scowj;cC^)、擔(dān)子菌綱(5"wV/zVwycetes)和半知菌綱/附;^/^"0。雖然根據(jù)本發(fā)明能夠使用致病性酵母菌林或其非致病性突變林，但在一個(gè)方面，使用非致病性酵母菌株。非致病性酵母菌林的實(shí)例包括酵母菌屬CSacd^/wi^cM)、假絲酵母屬(OmJfV/a)、隱球菌屬(Oy/^,ococc"s)、漢遜酵母屬(jfiTia"5^""/tf)、克魯維酵母屬(JT/""m附j(luò);ce51)、畢赤酵母屬(尸/c似a)、紅酵母屬(及/^fitotorM/ff)、裂殖酵母屬0Sc/^仍flccAfl/wiij;ce5)和耶氏酵母屬(KwroH^)。在一個(gè)方面，使用酵母菌屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和裂殖酵母屬。而在其他方面，寸吏用酉良酒酵母、卡爾酵母(Sacc/rcar/sAgi^ews/s1)、白假絲酵母(Omf/,V/"fl/ft/cflrts)、乳酒假絲酵母(OmdiV/ff^/3的、熱帶假絲酵母(Om必^！frop/cfl"s)、羅倫隱球酵母(Oj/7tococc附/a"rcMft7)、新型隱球酵母(CV^,oc0ccw51fi^/br附朋力、異常漢遜酵母(J7aw5wiw/aflfio附fl/fl)、多形漢遜酵母(/T"w5WfM/fl/w/戸o/77/ra)、脆壁克魯維酵母(^7wjvmwij^s/nigi7/s)、乳酸克魯維酵母(JT/wjnwwwj;c"/flc泡)、馬克斯克魯維酵母乳酸變種(A/wj;vm考ce51附cm/a""s/"/s)、巴斯德畢赤酵母(尸/c/r/fl/7肪tor/s)、深紅酵母(及/roflfo,or"/tfrw6m)、栗酒裂殖酵母(iSc/r/凍ffCc/f"n附y(tǒng)ces1"附Ae)和解脂耶氏酵母(Kwrow/a/f)w(^/ca)。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不局限于上述物種清單，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)⒈疚牡慕虒?dǎo)應(yīng)用于任何類型的酵母。在另一方面，使用釀酒酵母實(shí)施本發(fā)明的方法。優(yōu)選釀酒酵母是因?yàn)槠湟子谶M(jìn)行分子操作，且用作食品添加劑"公認(rèn)安全"("GenerallyRecognizedAsSafe"，"GRAS，，)(GRAS，F(xiàn)DA提出的細(xì)則62FR18938,1997年4月17日)。pH水平在酵母培養(yǎng)中十分重要。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，培養(yǎng)過程不僅包括酵母培養(yǎng)物的起始，而且還包括培養(yǎng)物的維持。酵母培養(yǎng)物可以始于任何pH水平，可是由于酵母培養(yǎng)物的培養(yǎng)基傾向于隨著時(shí)間的推移而變得更酸(即，pH降低)，因此在培養(yǎng)過程中必須小心監(jiān)測pH水平。在本」t明的一些方面，酵母在pH水平至少5.5的培養(yǎng)^^中生長。在其他方面，酵母在大約5.5的pH水平生長。在其他方面，酵母在5.5-8的pH水平生長。在一些情況下，酵母培養(yǎng)物在5.5-8的pH水平維持。在其他方面，酵母在6-8的pH水平生長。在一些情況下，酵母培養(yǎng)物在6-8的pH水平維持。在其他方面，酵母在6.1-8.1的pH水平生長和/或維持。在其他方面，酵母在6.2-8.2的pH水平生長和/或維持。在其他方面，酵母在6.3-8.3的pH水平生長和/或維持。在其他方面，酵母在6.4-8.4的pH水平生長和/或維持。在其他方面，酵母在5.5-8.5的pH水平生長和/或維持。在其他方面，酵母在6.5-8.5的pH水平生長和/或維持。在其他方面，酵母在大約5.6、5.7、5.8或5.9的pH水平生長。在另一方面，酵母在大約6的pH水平生長。在另一方面，酵母在大約6.5的pH水平生長。在其他方面，酵母在大約6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH水平生長。在其他方面，酵母在大約7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH水平生長。在其他方面，酵母在高于8的pH水平生長。在一個(gè)方面，培養(yǎng)酵母以便培養(yǎng)基的pH水平不降至pH5.5以下。在一些情況下，降至pH5.5以下的時(shí)間不長于5分鐘。在其他情況下，降至pH5.5以下的時(shí)間不長于10分鐘、優(yōu)選20、30、40、50或60分鐘。在ii其他情況下，降至pH5.5以下的時(shí)間不長于l小時(shí)。在另一方面，培養(yǎng)酵母以《更培養(yǎng)基的pH水平不降至pH5.0以下。在一些情況下，降至pH5.0以下的時(shí)間不長于5分鐘。在其他情況下，降至pH5.0以下的時(shí)間不長于IO分鐘、優(yōu)選20、30、40、50或60分鐘。在其他情況下，降至pH5.0以下的時(shí)間不長于l小時(shí)。照此，酵母在至少pH5.5或以上的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時(shí)間越長，就獲得具有下文所述期望特征的酵母而言結(jié)果就越好。在一個(gè)方面，利用中性pH方法生長酵母細(xì)胞意p木著在至少50%的酵母培養(yǎng)時(shí)間中酵母細(xì)胞生長在中性pH。更優(yōu)選，在酵母培養(yǎng)的至少60%時(shí)間中，更優(yōu)選至少70%的培養(yǎng)時(shí)間中，更優(yōu)選至少80%的培養(yǎng)時(shí)間中，最優(yōu)選至少90%的培養(yǎng)時(shí)間中，酵母在中性pH生長。在另一方面；在中性pH生長酵母包括在中性pH培養(yǎng)酵母細(xì)胞至少5分鐘，優(yōu)選在中性pH至少15分鐘，更優(yōu)選在中性pH至少1小時(shí)，更優(yōu)選至少2小時(shí)，甚至更優(yōu)選至少3小時(shí)或更長時(shí)間。如早先所指出的那樣，隨著酵母生長和復(fù)制，細(xì)胞密度變得更大，且培養(yǎng)基的酸度水平升高。照此，建議當(dāng)酵母密度增大時(shí)將酵母培養(yǎng)在至少5.5的pH水平和/或維持在至少pH5.5。在一個(gè)方面，當(dāng)酵母密度為0.5酵母單位(YU)/ml或以上時(shí)，將酵母培養(yǎng)和/或維持在5.5-8的pH。在其他方面，當(dāng)酵母密度為至少0.6YU/ml或以上、優(yōu)選0.7YU/ml或以上、0.8YU/ml或以上、0.9YU/ml或以上、或者1YU/ml或以上時(shí)，將酵母培養(yǎng)和/或維持在5.5-8的pH。在另一方面，當(dāng)酵母密度為0.5YU/ml或以上時(shí)，將酵母培養(yǎng)和/或維持在6-8的pH。在其他方面，當(dāng)酵母密度為至少0.6YU/ml或以上、優(yōu)選0.7YU/ml或以上、0.8YU/ml或以上、0.9YU/ml或以上、或者1YU/ml或以上時(shí)，將酵母培養(yǎng)和/或維持在6-8的pH。在一些方面，優(yōu)選收獲時(shí)酵母培養(yǎng)物處于中性pH水平。在一些情況下，酵母培養(yǎng)物在收獲時(shí)將處于6-8的pH水平。在其他情況下，酵母培養(yǎng)物在收獲時(shí)將處于5.5-8的pH水平。培養(yǎng)基可以通過任何手段達(dá)到至少5.5的pH水平。在一個(gè)方面，利用琥珀酸(及任何相關(guān)形式，如陰離子琥珀酸才艮)緩沖培養(yǎng)基。如實(shí)施例中進(jìn)一步詳述的那樣，利用琥珀酸鹽緩沖培養(yǎng)基至至少pH5.5，允許酵母具有大約兩個(gè)到兩個(gè)半小時(shí)的倍增時(shí)間。琥珀酸鹽可由商業(yè)可獲得來源(例如西格瑪化學(xué)(SigmaChemicals))獲得。在其他方面，可利用檸檬酸鹽使培養(yǎng)基達(dá)到pH至少5.5。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地確定可用來使培養(yǎng)基達(dá)到pH至少5.5而同時(shí)保持酵母存活的其他緩沖劑。緩沖劑保持溶液處于穩(wěn)定pH水平的概念是本領(lǐng)域熟知的，照此本文將不作詳細(xì)討論。如果根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的酵母用于藥物制品(例如疫苗)，則建議使用GMP級的材料。另外，可以向培養(yǎng)基中添加其他增補(bǔ)物以改善培養(yǎng)基。特別有助于添加到培養(yǎng)基中的其他增補(bǔ)物包括大豆胨。大豆胨可容易地由商業(yè)來源(例如BDDifco)獲得。如實(shí)施例和附圖中所顯示的那樣，向培養(yǎng)基中添加大豆胨支持在中性pH更高密度的生長。此外，添加大豆胨支持目的抗原流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)的表達(dá)?？梢韵蚪湍概囵B(yǎng)物中添加其他添加劑用于其他目的，例如包括表達(dá)異源基因。在一些方面，利用銅誘導(dǎo)血細(xì)胞凝集素表達(dá)。不過，中性pH使用銅并不理想，因而，為控制誘導(dǎo)型基因在于中性pH培養(yǎng)的酵母中表達(dá)，建議非銅的添加劑。尹'勝戶好^f棼母培養(yǎng)參時(shí)參詢利用中性pH培養(yǎng)酵母可以促進(jìn)若干生物學(xué)效應(yīng)，就利用酵母作為載體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)和/或激發(fā)免疫反應(yīng)而言這些效應(yīng)是期望的特征。在一個(gè)方面，在中性pH培養(yǎng)酵母允許酵母生長良好而對倍增時(shí)間沒有任何負(fù)面影響(例如減慢倍增時(shí)間)。酵母能夠持續(xù)生長至高密度而不喪失其細(xì)胞壁柔韌性。在另一方面，中性pH的使用，例如至少5.5的pH或pH5.5-8，允許在所有收獲密度產(chǎn)生具有柔韌細(xì)胞壁的酵母，和/或?qū)?xì)胞壁消化酶(例如葡聚糖酶)具有敏感性的酵母。照此，本發(fā)明提供了有關(guān)具有如通過傳統(tǒng)測定法(例如對葡聚糖酶的敏感性)所測量的細(xì)胞壁柔韌性的酵母的方法和組合物。以前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確立酵母在大約0.5YU(酵母單位)/ml的收獲密度時(shí)喪失其對細(xì)胞壁消化酶消化的敏感性。照此，一個(gè)優(yōu)勢在于可以利用與在標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基中以0.5YU/ml培養(yǎng)的酵母進(jìn)行的比較，來比較于任何密度的中性pH生長。這種性狀是期望的，因?yàn)榫哂腥嵝约?xì)胞壁的酵母能夠呈現(xiàn)出獨(dú)特的免疫反應(yīng)，例如促進(jìn)酵母寄宿的細(xì)胞中的細(xì)胞因子(例如INF-力分泌。本領(lǐng)域技術(shù)人員會使用中性pH方法的另一原因在于其允許位于細(xì)胞壁中的抗原具有更高的可及性。這有助于所表達(dá)蛋白質(zhì)的更大的免疫原性和抗體檢測，如通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如流式細(xì)胞儀所測量的那樣。在中性pH培養(yǎng)的酵母中所觀察到的另一期望特征是抗原以有益于免疫調(diào)節(jié)目的的方式表達(dá)。在一個(gè)方面，酵母用作為載體用于抗原表達(dá)(例如參見美國專利No.5,830,463和7,083,787)?？乖梢允墙湍傅奶烊豢乖?，或者是酵母表達(dá)的異源抗原。在一些方面，利用酵母表達(dá)抗原有助于研發(fā)疫苗、預(yù)防劑和治療劑，以對抗多種疾病和紊亂(例如傳染性疾病或癌癥)。利用中性pH方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠產(chǎn)生抗原攜帶酵母，其中抗原更易于被其他細(xì)胞(例如用于免疫共刺激功能或免疫調(diào)控)或其他物質(zhì)(例如抗體用于檢測)所獲得。另外，對一些抗原，例如流感HA抗原，使用中性pH,允許通過二硫蘇糖醇(DTT)處理釋放二硫鍵鍵合的HA，這在HA表達(dá)酵母于pH降至pH5以下的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的情況下是不可能的。在一些情況下，itiC生在pH降至pH5以下任意長的時(shí)間的情況下。在其他情況下，這發(fā)生在pH降至pH5以下1分鐘或幾分鐘或者1或多個(gè)小時(shí)的情況下。按照中性pH方法培養(yǎng)的酵母所呈現(xiàn)的另一期望特征在于與所迷酵母接觸的細(xì)胞將分泌Thl型細(xì)胞因子。Thl型細(xì)胞因子的實(shí)例包括但不限于干擾素個(gè)IL-12和IL-2。如實(shí)施例中進(jìn)一步詳述的那樣，與在低(酸性)pH培養(yǎng)基中培養(yǎng)的酵母相比，荷載了依照中性pH方案培養(yǎng)的酵母的樹突細(xì)胞呈現(xiàn)出增加水平的干擾素-Y分泌和表達(dá)。利用中性pH培養(yǎng)方法時(shí)IL-12的分泌水平并無下降。由此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)⒈疚墓_的中性pH方法用于免疫調(diào)節(jié)目的，例如在罹患將得益于增強(qiáng)的Thl型反應(yīng)的疾病或紊亂的個(gè)體中誘導(dǎo)Thl型反應(yīng)。尹#才法培#的脊#付逸合#本發(fā)明還考慮含有利用本文公開的中性pH方法所培養(yǎng)的酵母的組合物。在一個(gè)方面，組合物含有在其表面、內(nèi)部或表面及內(nèi)部表達(dá)天然抗原的酵母。這類組合物可用于多種目的，例如作為佐劑給藥。在另一方面，組合物含有在其表面、內(nèi)部或表面及內(nèi)部表達(dá)異源抗原的酵母。這類組合物可用于多種目的，例如對需要的個(gè)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)以及研發(fā)疫苗。這些組合物還可以包括可藥用的賦形劑和/或載體?？伤幱玫妮d體可以包括無菌水性或非水性溶液、混懸液和乳液。非水性溶劑的實(shí)例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、以及可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或混懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如基于林格氏葡萄糖液的那些)等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等等。用可藥用賦形劑配制含有中性pH條件下培養(yǎng)的酵母的組合物，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是一般常規(guī)的。本發(fā)效時(shí)試,y盒本發(fā)明考慮含有用于在中性pH條件下培養(yǎng)酵母的培養(yǎng)基組分的試劑盒。在一個(gè)方面，試劑盒包括培養(yǎng)基組分和有關(guān)其4吏用的一務(wù)沈明書，其中所述培養(yǎng)基組分含有琥珀酸鹽或琥珀酸，可用于使培養(yǎng)基達(dá)到至少5.5的pH。在另一方面，試劑盒還包括大豆胨作為附加組分。在另一方面，試劑盒還包括酵母細(xì)胞。酵母細(xì)胞可以是冷凍的，用于通過本文公開的方案起始培養(yǎng)物。在另一方面，酵母細(xì)胞可以在冷凍以包裝為試劑盒的一部分之前就已經(jīng)通過本文公開的方法進(jìn)行過培養(yǎng)。在另一方面，酵母細(xì)胞可以是凍干的，并任選地納入在試劑盒之中。在另一方面，試劑盒含有根據(jù)本文^Hf的方法制備的、能夠復(fù)制的酵母。提供如下實(shí)施例以舉例說明本發(fā)明的某些方面。它們并非旨在以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1酵母培養(yǎng)基配方多種類型的培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)酵母并可以進(jìn)行調(diào)整以使pH水平為中性。下文給出了可以使用的幾種培養(yǎng)基的實(shí)例，不過，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不局限于這些培養(yǎng)基組分或培養(yǎng)基方案的使用。一種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基配方是如下的ULDM培養(yǎng)基:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>另一標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基配方是如下的UL2培養(yǎng)基:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>另一標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基配方是如下的UL3培養(yǎng)基:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>另一標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基配方是如下的UL4培養(yǎng)基:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>另一標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基配方是如下的UDM培養(yǎng)基:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基配方可以補(bǔ)加額外的氨基酸。如下方案為例示性的培養(yǎng)基配方。ULDMaa培養(yǎng)基配方如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>調(diào)整至pH6.9的U3S培養(yǎng)基配方如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例2培養(yǎng)基pH對細(xì)胞生長和培養(yǎng)物pH的影響如圖1所示，測試了培養(yǎng)基pH對細(xì)胞生長和培養(yǎng)物pH的影響。細(xì)胞養(yǎng)生長在補(bǔ)加了Bis-Tris緩沖液，pH7.2或磷酸鹽緩沖液，pH7.2的U2培養(yǎng)基中。對照培養(yǎng)物生長在未向培養(yǎng)基中添加緩沖劑的U2培養(yǎng)基中。對于標(biāo)記為對照(同培養(yǎng)基pH5.5—樣)或培養(yǎng)基pH7.2的條件，這些對照的生長培養(yǎng)基在接種酵母之前用堿(NaOH)調(diào)整至pH5.5或pH7.2。培養(yǎng)物于30。C孵育，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和培養(yǎng)物pH監(jiān)測長達(dá)16小時(shí)。結(jié)果表明在不同pH水平的緩沖液影響酵母的生長速率。如圖l所示，倍增時(shí)間為2.8至4.5小時(shí)。在未緩沖的pH7培養(yǎng)基中pH在2.0YU/mL時(shí)為5.5，這表明需要某種形式的緩沖劑以保持pH處于中性水平。實(shí)施例3培養(yǎng)基pH對細(xì)胞壁厚度的影響測試了培養(yǎng)基pH的效應(yīng)以確定其是否對細(xì)胞壁厚度有任何影響。生長培養(yǎng)基和M與實(shí)施例1相同。在0.5-2.0YU/mL的密度收獲培養(yǎng)物。在圖2的圖例中，培養(yǎng)物收獲時(shí)的密度列為破折號后面的數(shù)字，例如"對照-0.6"表示細(xì)胞在pH5.5的未緩沖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在細(xì)胞達(dá)到0.6YU/mL的密度時(shí)收獲。燒瓶1-3(例如1-0.5、2-2.0或3-1.0)的#^在圖下方列出，而收獲時(shí)的細(xì)胞密度在圖例中標(biāo)出。所用的裂解測定法方案如下(l)將10YU經(jīng)洗滌的細(xì)胞重懸在1mLTris-BME中；(2)抽取"0時(shí)間點(diǎn)，，的樣品，并測量600nm處的OD值；(3)添加加U的葡聚糖酶；(4)于30。C旋轉(zhuǎn)；(5)每10分鐘取樣，并測量OD值。如在圖2中所觀察到的那樣，對照培養(yǎng)物(培養(yǎng)基pH5.5)隨著細(xì)胞密度增大顯示出更為低效的裂解。燒瓶2顯示了培養(yǎng)基在pH7.2無緩沖劑時(shí)的效應(yīng)。燒瓶2顯示了培養(yǎng)基在pH7.2、有Bis-Tris緩沖液時(shí)的效應(yīng)。燒瓶3顯示了培養(yǎng)基在pH7.2、有磷酸鹽緩沖液時(shí)的效應(yīng)。因而，結(jié)果表明緩沖在大約？115.5或更高的培養(yǎng)中酵母在所有收獲密度下保持細(xì)胞壁的柔韌性和對細(xì)胞壁消化酶消化(例如用溶細(xì)胞酶/葡聚糖酶制備原生質(zhì)球)的敏感性。與此形成對照，使用許多酵母實(shí)驗(yàn)室常用的標(biāo)準(zhǔn)方法，在收獲密度X).5YU/mL時(shí)敏感性喪失。為便于比較，0.5YU/mL加標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基常用來與任何密度下的中性pH生長進(jìn)行比較。實(shí)施例475-15細(xì)胞的構(gòu)建對命名為TK75-15的融合蛋白進(jìn)行了工程化，以利用Aga2序列由r￡7。啟動子驅(qū)動在細(xì)胞壁上表達(dá)流感HA蛋白。在此構(gòu)建體中，蛋白質(zhì)經(jīng)構(gòu)建具有C-末端連接Aga2序列的HA序列。當(dāng)此蛋白在也表達(dá)Agalp(在本案中由啟動子驅(qū)動)的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，定位于酵母細(xì)胞的外細(xì)胞壁以及胞質(zhì)溶膠。包含流感HA抗原的融合蛋白為單條多肽，從N-端到C-端具有按讀框融合的下列序列元件(融合蛋白的氨基酸序列在本文以SEQIDNO:l給出)l)全長釀酒酵母Aga2蛋白序列(SEQIDNO:l第1-87位)，包括其天然18個(gè)氨基酸的ER靶向信號序列(SEQIDNO:l第1-18位；2)將Aga2與HA主體分隔開的間隔區(qū)(第88-89位)；3)流感HA蛋白(SEQIDNO:1第90-600位)，該蛋白缺失其信號序列，且缺失HA的36個(gè)C-末端殘基，從而消除了其C-末端的膜錨定序列和胞質(zhì)尾區(qū)；4)將HA蛋白主體與組氨酸標(biāo)簽分隔開的三甘氨酸間隔臂(SEQIDNO:l第601-603位)；和5)C-末端六組氨酸標(biāo)簽(SEQIDNO:l第604-609位)。編碼SEQIDNO:l的融合蛋白的核,列在本文如SEQIDNO:2所示。此融合蛋白及表達(dá)之的Tarmogen可稱為75-15。所用的蛋白質(zhì)序列如下(SEQIDNO:1):MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSLSTTTILANGK50AM(3GVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVFTSDTICIGYHANN100STDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWL150LGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELRE(2LSSVSSF200ERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLK250NSYVNKKGKEVLVLWGIHHPSNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTP300EIAERPKVRD(3AGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFG350SGIITSNASMHECNTKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGERPKYVRSAKL400RMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGF正GGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYA450ADQKSTQNAINGITNKVNTV正KMNIQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVD500DGFLDIWTYNAELLVLXENERTLDFHDS畫KNLYEKVKS(2LKNNAKEIGN550GCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKVDGVKLESMGIYQ600GGGHHHHHH*相應(yīng)的核酸序列如下(SEQIDNO:2):261801GGTGGCGGGCATCACCATCACCATCACTAGTGA實(shí)施例5不同緩沖液(pH6.5培養(yǎng)基)對75-15細(xì)胞生長和培養(yǎng)物DH的影在75-15細(xì)胞上測試了不同的緩沖劑以確定其對細(xì)胞生長的影響以及對培養(yǎng)物pH的影響。這些緩沖劑示于圖3，包括琥珀酸鹽、檸檬酸鹽和碳酸鹽。沒有一種緩沖液導(dǎo)致沉淀形成。所用的所有緩沖劑在標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基中溶解良好。在接種酵母之前將所有測試培養(yǎng)物的pH調(diào)整至pH6.5。培養(yǎng)物隨之在搖瓶中于30。C培養(yǎng)長達(dá)15小時(shí)。當(dāng)細(xì)胞在碳酸鹽緩沖液中培養(yǎng)時(shí)，看到極小程度生長直至無生長。如在圖3中能夠看到的那樣，不同緩沖劑的使用影響生長速率。在中性pH(至少pH5.5)時(shí)生長更快。特別是，具有琥珀酸鹽緩沖液的培養(yǎng)基就倍增時(shí)間(2.5hr的倍增時(shí)間)而言表現(xiàn)最佳。與此形成對照，如果酵母細(xì)胞在低于5.5的pH(更為酸性的條件)生長，則倍增時(shí)間較慢，在3.5hr。檸檬酸鹽具有相似的倍增時(shí)間(3.5hr)。0.05M的檸檬酸鹽比0.02M的琥珀酸鹽具有更大的緩沖能力。在這些實(shí)驗(yàn)中，所有培養(yǎng)物均接受0.35mM的銅以誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)施例6多種緩沖劑對細(xì)胞裂解的影響圖4顯示了用不同緩沖劑如琥珀酸鹽和檸檬酸鹽進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。培養(yǎng)物如實(shí)施例！所述進(jìn)行培養(yǎng)。酵母被葡聚糖酶裂解的能力利用上文的裂解測定法方案測量。對照培養(yǎng)物(培養(yǎng)基pH5.2)中的酵母隨著細(xì)胞密度增大顯示出更為低效的被葡聚糖酶裂解(細(xì)胞密度表示為破折號后面的數(shù)字，如上文有關(guān)附圖2的說明那樣)。然而，對于琥珀酸鹽和檸檬酸鹽緩沖的培養(yǎng)基兩者而言，收獲時(shí)的細(xì)胞密度對酵母在上文所述的裂解測定法中被細(xì)胞壁消化酶裂解的能力沒有任何影響。琥珀酸鹽和檸檬酸鹽緩沖的培養(yǎng)基中的酵母在漸增的細(xì)胞密度(例如0.5YU/ml、0.9YU/ml和2.1或2.2YU/ml)下依然對裂解敏感。實(shí)施例7培養(yǎng)基配方研究測試了添加到酵母培養(yǎng)基中的其他物質(zhì)的貢獻(xiàn)，結(jié)果示于圖5。U2或U4指基本培養(yǎng)基組成。由于蛋白質(zhì)表達(dá)處于銅誘導(dǎo)型啟動子的控制之下，向培養(yǎng)基中添加0.35mM的銅，以誘導(dǎo)酵母細(xì)胞表達(dá)HA蛋白。大豆胨(圖5中的大豆)是可商購的、通過大豆的肽消化獲得的復(fù)雜營養(yǎng)物混合物。添加大豆胨得到最快的生長和最高的產(chǎn)率(30YU/mL)。0,08M琥珀酸的使用顯示出較佳的緩沖能力。細(xì)胞于30。C培養(yǎng)的時(shí)間在x軸上顯示。圖6顯示了培養(yǎng)基配方研究的結(jié)果，其中利用Guava技術(shù)確定細(xì)胞存活力。表達(dá)銅誘導(dǎo)型Aga2-HA的酵母菌林75-15在搖瓶中于30。C培養(yǎng)。當(dāng)向培養(yǎng)物中添加銅時(shí)，Aga2-HA蛋白得以表達(dá)，并展示在細(xì)胞表面，它反映了表面展示HA的酵母細(xì)胞的數(shù)目(陽性信號％)。也可以利用其他方法(例如血球計(jì)數(shù)計(jì)或錐蟲藍(lán))確定細(xì)胞存活力。以U2觀察到最高的信號，甚至是在8YU/mL的細(xì)胞密度(該密度超出了細(xì)胞傾向于減慢其生長速率的細(xì)胞密度)下。使用大豆胨的培養(yǎng)物表現(xiàn)出清晰的細(xì)胞密度效應(yīng)，其中高密度表現(xiàn)出蛋白質(zhì)的下降?？傮w來說U4的使用得到低的信號。這些結(jié)果也表明了由于pH對細(xì)胞壁的影響而帶來的檢測可及性，以及HA特異性抗體檢測所i^面表達(dá)的蛋白質(zhì)的能力。使用不同濃度的大豆胨進(jìn)行了額外的實(shí)驗(yàn)。圖7圖示了結(jié)果。在0.5g/1到lg/l之間的大豆胨，未觀察到生長或pH的差異。在U4-YNB培養(yǎng)基中比在U2培養(yǎng)基中觀察到更快的生長。實(shí)施例8酵母在中性pH條件下培養(yǎng)時(shí)HA可及性的差異利用不同pH水平的培養(yǎng)基評估了特定抗原就與其他物質(zhì)如檢測用抗體相互作用而言的可及性。圖8顯示了當(dāng)酵母細(xì)胞在小于5的pH培養(yǎng)時(shí)以及當(dāng)酵母在大于6的pH培養(yǎng)時(shí)，自完整酵母可釋放的流感血細(xì)胞凝集素(HA)的免疫印跡測定。如流式細(xì)胞儀染色所確定的那樣，就表達(dá)HA的細(xì)胞數(shù)和每個(gè)細(xì)胞的HA量兩者而言，在中性pH培養(yǎng)的酵母使得表面展示的HA對于抗體檢測具有高得多的可及性。另外，在中性pH培養(yǎng)的酵母更易于操作以通過二硫蘇糖醇(二硫化物還原劑)處理釋放二硫鍵鍵合的HA。實(shí)施例9中性pH對細(xì)胞因子生產(chǎn)的影響利用荷栽了在pH維持或未維持在pH5.5以上的培養(yǎng)基中生長的YVEC酵母(不表達(dá)異源抗原)的樹突細(xì)胞(DC),研究了在中性pH培養(yǎng)酵母對細(xì)胞因子生產(chǎn)的影響。小鼠骨髓來源的樹突細(xì)胞通過在RPMI培養(yǎng)基中37。C(與酵母)一起孵育48hr，以每個(gè)DC荷載10個(gè)酵母。然后對上清液分析分泌的細(xì)胞因子。圖9顯示了這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。下圖表明荷載了在中性pH(即至少5.5或更高)生長的酵母的樹突細(xì)胞的IFN-y分泌顯著增加，這種現(xiàn)象在酵母于允許pH降至低于5.5的培養(yǎng)基中生長時(shí)是不存在的。權(quán)利要求1.培養(yǎng)酵母的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母，其中培養(yǎng)基在5.5-8的pH水平維持至少50％的酵母培養(yǎng)時(shí)間。2.培養(yǎng)酵母的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母，其中培養(yǎng)基維持在5.5-8的pH水平，且其中酵母的密度為至少0.5酵母單位/ml。3.培養(yǎng)酵母的方法，其中在至少50%的酵母培養(yǎng)時(shí)間中酵母培養(yǎng)在pH水平至少5.5的培養(yǎng)基中。4.權(quán)利要求3的方法，其中培養(yǎng)基維持在5.5-8的pH水平。5.權(quán)利要求3的方法，其中酵母是釀酒酵母。6.權(quán)利要求3的方法，其中培養(yǎng)基用琥珀酸鹽或琥珀酸進(jìn)行緩沖。7.權(quán)利要求6的方法，其中培養(yǎng)M含有大豆胨。8.權(quán)利要求3的方法，其中在向個(gè)體施用時(shí)酵母激發(fā)免疫反應(yīng)。9.權(quán)利要求8的方法，其中酵母表達(dá)異源抗原。10.權(quán)利要求9的方法，其中異源抗原在酵母表面表達(dá)。11.組合物，含有通過權(quán)利要求l、2或3中任一方法培養(yǎng)的酵母。12.生產(chǎn)抗原表達(dá)酵母的方法，其中在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有用于表達(dá)所述抗原的表達(dá)系統(tǒng)的酵母，其中所述培養(yǎng)基的pH為至少5.5。13.生產(chǎn)抗原表達(dá)酵母的方法，其中培養(yǎng)含有用于表達(dá)所述抗原的表達(dá)系統(tǒng)的酵母，其中培養(yǎng)基維持在5.5-8的pH水平。14.權(quán)利要求12或13的方法，其中酵母是釀酒酵母。15.權(quán)利要求14的方法，其中培養(yǎng)基用琥珀酸鹽或琥珀酸進(jìn)行緩沖。16.權(quán)利要求15的方法，其中培養(yǎng)基還含有大豆胨。17.權(quán)利要求12或13的方法，其中在向個(gè)體施用時(shí)酵母激發(fā)免疫反應(yīng)。18.權(quán)利要求17的方法，其中酵母表達(dá)異源抗原。19.權(quán)利要求18的方法，其中異源抗原在酵母表面表達(dá)。20.權(quán)利要求18的方法，其中與在低于5.5的pH培養(yǎng)酵母時(shí)相比，所述異源抗原更易于獲得用于與其他細(xì)胞或物質(zhì)相互作用。21.組合物，含有通過權(quán)利要求12或13所述的任一方法培養(yǎng)的酵母。22.誘導(dǎo)個(gè)體Thl型反應(yīng)的方法，其中向個(gè)體施用含有抗原表達(dá)酵母的組合物，其中酵母已在pH水平至少5,5的培養(yǎng)基中進(jìn)行過培養(yǎng)。23.誘導(dǎo)個(gè)體Thl型反應(yīng)的方法，其中向個(gè)體施用含有抗原表達(dá)酵母的組合物，其中酵母已在培養(yǎng)基中進(jìn)行過培養(yǎng)，其中所述培養(yǎng)基維持在5.5-8的pH7jC平。24.權(quán)利要求23的方法，其中組合物含有荷載了已在中性pH培養(yǎng)、維持或收獲的酵母的樹突細(xì)胞。25.權(quán)利要求23的方法，其中酵母是釀酒酵母。26.權(quán)利要求23的方法，其中培養(yǎng)基用琥珀酸鹽或琥珀酸進(jìn)行緩沖。27.權(quán)利要求26的方法，其中培養(yǎng)基還含有大豆胨。28.權(quán)利要求23的方法，其中在向個(gè)體施用時(shí)酵母激發(fā)免疫反應(yīng)。29.權(quán)利要求28的方法，其中酵母表達(dá)異源抗原。30.權(quán)利要求29的方法，其中異源抗原在酵母表面表達(dá)。31.權(quán)利要求23的方法，其中Thl型反應(yīng)是產(chǎn)生干擾素^。32.權(quán)利要求23的方法，其中Thl型反應(yīng)是產(chǎn)生IL-12。33.培養(yǎng)酵母的試劑盒，含有培養(yǎng)基和使用培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母的說明書，其中培養(yǎng)基的pH為至少5.5。34.培養(yǎng)酵母的試劑盒，含有培養(yǎng)基和使用培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母的說明書，其中培養(yǎng)基的pH維持在5.5-8的pH水平。35.權(quán)利要求34的試劑盒，其中培養(yǎng)基用琥珀酸鹽或琥珀酸進(jìn)行緩沖。36.權(quán)利要求34的試劑盒，其中培養(yǎng)Ui含有大豆胨。37.權(quán)利要求34的試劑盒，其中試劑盒還包括酵母。38.權(quán)利要求37的試劑盒，其中酵母是冷凍的或凍干的。39.權(quán)利要求37的試劑盒，其中酵母已在至少pH5.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過，或已在培養(yǎng)基的pH維持在5.5-8的pH水平的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過。40.權(quán)利要求37的試劑盒，其中酵母能夠復(fù)制。全文摘要本發(fā)明提供了在中性pH水平培養(yǎng)酵母的方法。在中性pH條件下培養(yǎng)的酵母呈現(xiàn)出可用于生物學(xué)目的如研發(fā)疫苗、預(yù)防劑和治療劑的期望特征。本發(fā)明還提供了含有使用本文公開方法所培養(yǎng)的酵母的組合物和試劑盒。文檔編號A61K36/06GK101687030SQ200880010797公開日2010年3月31日申請日期2008年2月1日優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日發(fā)明者A·弗蘭祖索夫,D·奎克申請人:環(huán)球免疫公司