專利名稱：用于預(yù)防和治療牙周炎的包含熟地黃、三七或其混合物提取物作為有效組分的組合物的制作方法
用于預(yù)防和治療牙周炎的包含熟地黃、三七或其混合物提取物
作為有效組分的組合物
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療牙周炎的組合物，所述組合物包含來(lái)自熟
土也黃(i e/2附aww/ae / acfcc /Ve/ an3to)、三七(jVotog/m^wg i^cfcc)或其、 昆合物的 提取物作為活性成分。
背景技術(shù)：
牙周組織可以分成牙槽骨、牙齦和牙周膜。牙齦是支撐牙齒的結(jié)構(gòu)， 可能會(huì)患牙齦炎。當(dāng)炎癥在牙齒的支撐結(jié)構(gòu)上擴(kuò)展以破壞牙周膜(牙周膜將 牙齒的牙骨質(zhì)連接到牙槽骨上并將牙齒的根部覆蓋到骨內(nèi))和牙槽骨(牙槽 骨形成牙齒周?chē)难啦?時(shí)，就導(dǎo)致牙周炎。
牙周病包括牙齦炎和牙周炎，指由細(xì)菌引起的牙齒支撐結(jié)構(gòu)的炎癥， 其伴有出血、牙周袋的形成和牙槽骨的破壞，導(dǎo)致牙齒缺失。在形成細(xì)菌 菌落、細(xì)菌浸潤(rùn)牙周組織和破壞牙周組織的過(guò)程中產(chǎn)生這種牙周炎。詳細(xì) 來(lái)講，在口腔衛(wèi)生差的條件下形成的細(xì)菌生物被膜可以引起牙齦炎癥并伴 有出血和口臭。這種口腔狀態(tài)的進(jìn)展在牙齒和牙齦之間產(chǎn)生間隙，形成了 牙周袋，后來(lái)細(xì)菌在其中增殖并爆發(fā)牙周炎。在惡化時(shí)，牙周炎使得牙齦 即使在微弱刺激如刷牙時(shí)也會(huì)出血，并常常產(chǎn)生急性炎癥并伴有疼痛的發(fā) 生。這種炎癥降低了成骨功能并提高了骨質(zhì)吸收，減少了牙槽骨，導(dǎo)致牙 齒缺失。
牙周炎有許多原因。局部來(lái)講，當(dāng)牙斑和牙石在牙周袋內(nèi)積聚時(shí)，它 充當(dāng)了附近厭氧性革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)環(huán)境，這些厭氧性革蘭氏陰性菌增 殖到牙周袋的深部核。增殖的厭氧性革蘭氏陰性菌的毒素和產(chǎn)物直接破壞 牙周組織，或刺激免疫系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)然后誘導(dǎo)牙周組織的破壞，并伴有 炎癥。對(duì)于對(duì)抗破壞的防御機(jī)理，多核白細(xì)胞和免疫應(yīng)答充當(dāng)了全身因素。
由于厭氧性革蘭氏菌的代謝，分泌出對(duì)牙周組織有毒的細(xì)菌毒素硫化氫、氨和胺，同時(shí)構(gòu)成細(xì)胞壁的內(nèi)毒素脂多糖直接破壞牙周組織或刺激免 疫系統(tǒng)。受刺激的體液免疫和細(xì)胞免疫的各種作用誘導(dǎo)活性氧、前列腺素、 白三烯、組胺和細(xì)胞因子如白介素的胞外分泌，導(dǎo)致牙周炎癥。而且，由 細(xì)菌和白細(xì)胞分泌的膠原酶消化膠原，即牙周組織的基質(zhì)，引起牙齦退化， 導(dǎo)致牙周病。
因此，預(yù)防和治療牙周病關(guān)鍵是殺滅或抑制厭氧性革蘭氏陰性菌，除 去來(lái)自細(xì)菌的毒性產(chǎn)物，或恢復(fù)退化的牙周組織。
為了治療牙周病，已經(jīng)使用了改善口腔衛(wèi)生、或者非外科或外科療法，
包括牙周再生如刮治、根面平整術(shù)、牙齦刮治術(shù)和新附著(newattachment)。 然而，這些外科療法需要患者前往牙科診所。此外，對(duì)于牙周病已經(jīng)進(jìn)展 到一定程度的情況(在大多數(shù)情況下，進(jìn)展到慢性狀態(tài))下，使用外科療法來(lái) 治療，而不是預(yù)防它們，同時(shí)全身施用抗生素或局部施用緩釋藥劑?？赡?向不必要的部位遞送太大量的藥物而不能避免其副作用。事實(shí)上，據(jù)報(bào)道， 已經(jīng)分離了耐受抗生素的牙周炎細(xì)菌。
因此，需要用于預(yù)防和治療牙周病的具有重建破壞的或缺失的牙周組 織的活性的藥劑或組合物。
根據(jù)Melcher，牙周再生的結(jié)果隨著參與牙周再生的細(xì)胞的來(lái)源而變 化。例如，所述結(jié)果包括當(dāng)源自骨的細(xì)胞參與再生時(shí)的骨整合、當(dāng)源自結(jié) 締組織的細(xì)胞(例如牙齦成纖維細(xì)胞)參與再生時(shí)的牙根吸收、和當(dāng)源自上皮 組織的細(xì)胞參與再生時(shí)的長(zhǎng)附著上皮的產(chǎn)生。然而，這些結(jié)果不同于理想 的牙周組織再生。相反，在源自牙周膜細(xì)胞的細(xì)胞參與再生時(shí)可以誘導(dǎo)理 想的牙周組織再生(Melcher A.H. Journal of Periodontology, 47(5); 256-260， 1976)。
簡(jiǎn)言之，對(duì)牙周組織的再生理想的是促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的生長(zhǎng)，而不影 響牙齦成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。
基于以下事實(shí)，即當(dāng)CD4" T細(xì)胞(它們誘導(dǎo)由免疫系統(tǒng)在受到細(xì)菌毒 素的刺激后分泌的各類細(xì)胞因子(TNF-a、 IFN-y、 GM-CSF、 IL-2、 IL-6)的 分泌)活化時(shí)，它們?cè)谄浔砻嫔媳磉_(dá)骨保護(hù)素配體以促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，從 而在骨的破壞中具有關(guān)鍵作用，所以在本發(fā)明人看來(lái)，治療牙周病需要抑 制細(xì)胞因子釋放以預(yù)防炎癥和牙槽骨的破壞(Kong Y.Y.等人，Nature 402，304-309, 1999)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，減少破骨細(xì)胞的形成和活性 以保護(hù)牙槽骨，并有效地增加牙周膜細(xì)胞的增殖而不影響牙齦成纖維細(xì)胞 的增殖。
本發(fā)明人對(duì)熟地黃、三七的各種生理學(xué)活性進(jìn)行了深入徹底的研究， 發(fā)現(xiàn)來(lái)自熟地黃、三七或其混合物的提取物具有抑制負(fù)責(zé)炎癥的細(xì)胞因子 的釋放以預(yù)防炎癥、促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化并減少破骨細(xì)胞的形成和 活性以保護(hù)牙槽骨、并有效地提高牙周膜細(xì)胞的增殖而不影響牙齦成纖維 細(xì)胞的增殖的功能，因此能夠用于預(yù)防和治療牙周病，從而產(chǎn)生本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題
因此，本發(fā)明的目的是提供用于治療和預(yù)防牙周病的組合物，所述組 合物包含來(lái)自熟地黃和三七的各自提取物的混合物作為用于抑制導(dǎo)致牙周 病的炎癥、促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化、減少破骨細(xì)胞的形成和活性以預(yù) 防牙槽骨的破壞、和剌激牙周膜細(xì)胞的增殖的活性成分。
技術(shù)方案
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了用于治療和預(yù)防牙周病的藥物組合 物，所述藥物組合物包含來(lái)自熟地黃和三七CPamw "otog/me"g (SwH^ A H C&")的各自提取物中的一種、所述各自提取物的混合物、或來(lái)自熟地黃和 三七的混合物的提取物作為活性成分。
而且，本發(fā)明提供了用于治療和預(yù)防牙周病的保健食品組合物，所述 保健食品組合物包含來(lái)自熟地黃和三七的各自提取物中的一種、所述各自 提取物的混合物、或來(lái)自熟地黃和三七的混合物的提取物作為活性成分。
有益效果
由于具有保護(hù)牙槽骨和促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖以及抑制TNF-a釋放的活 性，本發(fā)明的提取物可用于治療和預(yù)防牙周病。附圖描述


圖1顯示本發(fā)明的提取物根據(jù)所述提取物的混合比對(duì)TNF-cx釋放的抑 制效果。
圖2顯示本發(fā)明的草藥混合物提取物對(duì)TNF-a釋放的抑制效果。 圖3顯示本發(fā)明的提取物根據(jù)所述提取物的混合比對(duì)成骨細(xì)胞增殖的 影響。
圖4顯示本發(fā)明的提取物根據(jù)所述提取物的混合比對(duì)成骨細(xì)胞中骨保
護(hù)素(OPG)表達(dá)的影響。
圖5顯示本發(fā)明的草藥混合物提取物對(duì)成骨細(xì)胞中OPG表達(dá)的影響。 圖6顯示本發(fā)明的提取物根據(jù)所述提取物的混合比對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響。
圖7顯示本發(fā)明的草藥混合物提取物對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響。 圖8顯示本發(fā)明的提取物根據(jù)所述提取物的混合比對(duì)破骨細(xì)胞活性的 影響。
圖9顯示本發(fā)明的草藥混合物提取物對(duì)破骨細(xì)胞活性的影響。 圖IO顯示本發(fā)明的提取物根據(jù)所述提取物的混合比對(duì)人牙齦成纖維細(xì) 胞增殖的影響。
圖11顯示本發(fā)明的草藥混合物提取物對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞增殖的影響。
圖12顯示本發(fā)明的提取物根據(jù)所述提取物的混合比對(duì)人牙周膜細(xì)胞增 殖的影響。
圖13提供組織化學(xué)照片，其顯示本發(fā)明的草藥混合物提取物對(duì)患有牙 周炎的大鼠的骨丟失的抑制效果(AC和CEJ分別表示牙槽骨嵴和釉質(zhì)牙骨 質(zhì)界)。
圖14顯示本發(fā)明的草藥混合物提取物對(duì)患有牙周炎的大鼠的骨丟失的 抑制效果。
最佳實(shí)施方式
下面，將詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案。
本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防牙周病的組合物，所述組合物包含來(lái)自熟
8地黃和三七的提取物的混合物。
根據(jù)本發(fā)明，將1:8熟地黃:三七的混合物用熱水提取三次，將溶液過(guò) 濾并在4(TC以下的真空中濃縮，得到可用于預(yù)防和治療牙周病的提取物混 合物。
熟地黃是屬于玄參科的草藥，在中醫(yī)學(xué)中，它的新鮮或干燥的根被用 作藥材。特別是，在經(jīng)過(guò)九輪蒸和干燥后獲得的根具有優(yōu)秀的醫(yī)學(xué)功效。 熟地黃性溫，味甘苦，可以養(yǎng)血補(bǔ)精。因此，在中醫(yī)學(xué)中，熟地黃用于治 療腰膝疼痛、痛經(jīng)和眩暈。而且，己知它們能預(yù)防頭發(fā)脫色。熟地黃是四 物湯的主要成分。它用于治療體弱所致的發(fā)熱、咽干和口渴。在韓國(guó)民間 療法中，將熟地黃與豬肉湯同食以治療慢性便秘。
三七是屬于人參科的多年生草藥，比人參小，有七片葉子，廣泛種植 于中國(guó)南部。其根形似小梭。三七還稱為三七人參，因?yàn)樗谌齻€(gè)莖上長(zhǎng) 有7片葉子，貌似人參。其根中皂苷的含量為3-8%，包含大量的人參皂苷 Rbl、 Rgl和Re以及三七皂苷R1、 R2、 Fa禾Q Fc，少量的人參皂苷R2、 b2、 d、 e和c，以及痕量的人參皂苷RO。其精油數(shù)量少于人參并包含齊墩果酸。 三七根在中醫(yī)學(xué)中用于止血和作為強(qiáng)心藥，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)還 具有增加通過(guò)心臟動(dòng)脈的血流、降低心肌耗氧量以及減少血液中的脂質(zhì)和 膽固醇水平的功能。三七具有優(yōu)秀的抗炎、鎮(zhèn)痛和止血活性，因此還不僅 能用于治療炎性疾病包括肝炎，而且能通過(guò)直接施用到傷口上或口服給藥 來(lái)治療外出血或內(nèi)出血。
可以通過(guò)常規(guī)方法如冷沉淀、熱沉淀、加熱等制備來(lái)自熟地黃、三七 或其混合物的提取物。優(yōu)選地，用水、醇或其混合物處理熟地黃、三七或
其混合物。每重量份的熟地黃優(yōu)選使用8重量份的三七。所述醇優(yōu)選為甲 醇或乙醇。更優(yōu)選地，將熟地黃、三七或其混合物在70-8(TC的甲醇或乙醇 中浸泡3-5小時(shí)。重復(fù)該程序可以提高提取效率?？梢栽?0-4(TC的條件下 在真空中進(jìn)行濃縮，但不限于此。對(duì)于來(lái)自熟地黃或三七的個(gè)體提取物， 可以按照1-16:16-1的重量比將它們相互混合。
已知為與牙周病相關(guān)的骨丟失、炎癥和結(jié)締組織破壞負(fù)責(zé)的主要細(xì)胞 因子是白介素-1 (IL-l)和腫瘤壞死因子(D.T. Graves和D. Cochran， The contribution of Interleukin-1 and Tumor Necrosis Factor to Periodontal TissueDestruction, Journal of Periodontology， 74(3):391-401, 2003)。
試驗(yàn)了本發(fā)明的提取物對(duì)腫瘤壞死因子-a (下文稱為"TNF-a")的分泌 的影響。在這方面上，用脂多糖(LPS)和本發(fā)明的提取物處理人單核細(xì)胞系 THP-1，然后通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)分析細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-a的 水平。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在用0.1mg/ml的本發(fā)明提取物處理后，TNF-a的分泌明 顯受到抑制(圖l和2)。因此，本發(fā)明的提取物可以用作對(duì)抗TNF-a分泌的 抑制劑。
已知牙槽骨的骨發(fā)生隨著OPG分泌的增加而增加(M.A. Taubman, R Valverde, X. Han禾卩T. Kawai， Immune Response: The Key to Bone Resorption in Periodontal Disease, Journal of Periodontology, 76(11 Suppl): 2033-41, 2005)。
當(dāng)用本發(fā)明的提取物處理成骨細(xì)胞時(shí)，它們的增殖隨著提取物濃度的 上升而增加(圖3)。而且，當(dāng)用本發(fā)明的提取物處理人骨肉瘤MG-63時(shí)， 其以劑量依賴性方式分泌OPG (圖4和5)。
破骨細(xì)胞由骨髓中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞產(chǎn)生，單核細(xì)胞祖細(xì)胞 通過(guò)血液循環(huán)，在骨內(nèi)膜層中增殖并彼此融合以形成多核細(xì)胞(Scheven， B.A.A.等人，Nature, 321: 79-81， 1986)。破骨細(xì)胞的特征在于它們表達(dá)耐酒 石酸的酸性磷酯酶(TRAP)，該酶通常被用作組織化學(xué)酶來(lái)分辨破骨細(xì)胞和 其它骨組織細(xì)胞(Minkin, C.， Calcif. Tissue Int.， 34: 285-290， 1982)。
用本發(fā)明的提取物處理可假定的破骨細(xì)胞TRAP(+)多核細(xì)胞導(dǎo)致隨著 提取物濃度的上升極大地抑制TRAP(+)多核細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞的活 性。特別是，熟地黃和三七的混合物提取物對(duì)TRAP(+)多核細(xì)胞的形成和 破骨細(xì)胞的活性具有明顯的抑制效果(圖6-9)。
總結(jié)起來(lái)，所述結(jié)果表明，本發(fā)明的提取物具有抑制TNF-a的分泌、 促進(jìn)OPG的分泌和成骨細(xì)胞的增殖、以及抑制可假定的破骨細(xì)胞TRAP(+) 多核細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞的活性的功能。因此，本發(fā)明的提取物可以用 于預(yù)防和治療牙周病，例如牙齦炎和牙周炎。
除了所述活性成分，本發(fā)明用于治療和預(yù)防牙周病的藥物組合物還可 以包含至少一種藥學(xué)可接受的載體。藥學(xué)可接受的載體的例子包括鹽水溶 液、無(wú)菌水、林格氏液、緩沖鹽水溶液、右旋糖溶液、麥芽糖糊精溶液、丙三醇、乙醇和它們中的兩種或更多種的混合物。如果必要，所述組合物 還可以包含其它常規(guī)添加劑，例如抗氧化劑、緩沖劑和抑菌劑。而且，所 述組合物還可以包含稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤(rùn)滑劑，以 便配制成注射劑型如水溶液劑、混懸劑和乳劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑或 片劑。另外，可以優(yōu)選根據(jù)其成分或目的，使用本領(lǐng)域已知的合適方法，
女口 Remington's Pharmaceutical Science (最新版)，Mack Publishing Company, EastonPA中所述的方法配制所述組合物。
本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑?jīng)]有特別限制，但根據(jù)預(yù)期用途，所 述組合物可以口服或通過(guò)胃腸外途徑如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或局部給藥。 對(duì)于任何特定患者的具體治療有效劑量水平可以根據(jù)各種因素，包括患者 的體重、年齡、性別、 一般健康狀況和飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、所述 組合物的排泄速率以及疾病的嚴(yán)重性而變化。所述組合物可以約0.1 1000 mg/kg、優(yōu)選0.1 500 mg/k的每日劑量給藥。每日劑量可以單劑量或幾個(gè) 分劑量給予。
為了有效地治療和預(yù)防牙周病，可以優(yōu)選將所述藥物組合物配制成口 服制劑。所述口服制劑沒(méi)有特別限制，但可以是常規(guī)形式。所述口服制劑 的例子包括牙膏、嗽口水和口腔清洗劑。根據(jù)劑型，所述口服制劑可以包 含配制它們所必需的各種基質(zhì)成分和添加劑。所述成分和添加劑的種類和 量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇。例如，當(dāng)所述口服制劑為牙膏時(shí)， 它可以包含研磨劑、潤(rùn)濕劑、起泡劑、粘合劑、甜味劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐 劑、醫(yī)學(xué)上有效的成分、漂白劑、著色劑、溶劑等。
本發(fā)明還提供了用于預(yù)防和治療牙周病的保健食品組合物，所述保健 食品組合物包含來(lái)自熟地黃、三七或其混合物的提取物。
可以通過(guò)常規(guī)方法如冷沉淀、熱沉淀、加熱等制備來(lái)自熟地黃、三七 或其混合物的提取物。優(yōu)選地，用水、醇或其混合物處理熟地黃、三七或 其混合物。每重量份的熟地黃優(yōu)選使用8重量份的三七。所述醇優(yōu)選為甲 醇或乙醇。更優(yōu)選地，將熟地黃、三七或其混合物在70-8(TC的甲醇或乙醇 中浸泡3-5小時(shí)。重復(fù)該程序可以提高提取效率?？梢栽?0-40'C的條件下 在真空中進(jìn)行濃縮，但不限于此。對(duì)于來(lái)自熟地黃或三七的個(gè)體提取物， 可以按照l(shuí)-16"6-l的重量比將它們相互混合。為了緩解牙周病，可以將本發(fā)明的提取物添加到保健食品中。作為食 品添加劑，所述草藥混合物提取物可以根據(jù)常規(guī)方法適當(dāng)?shù)貑为?dú)或與其它 食品成分組合使用。所述草藥混合物提取物的量可以根據(jù)其目的(預(yù)防、改 善健康或治療性治療)而變化。通常，當(dāng)用于制備食品或飲料時(shí)，以材料重
量計(jì)，本發(fā)明的提取物可以100wt。/。以下、優(yōu)選50wt。/。以下的量添加。在 將所述提取物用于設(shè)計(jì)成習(xí)慣性使用的保健食品中的情況下，其含量可以 低于上述范圍。然而，所述提取物對(duì)身體沒(méi)有安全性問(wèn)題，因此可以超過(guò) 所述范圍的量使用。
對(duì)于可以使用所述提取物的食品的種類沒(méi)有特別限制。所述食品的例 子包括肉、香腸、面包、巧克力、糖果、快餐、糖食、比薩、拉面(ramen)、 面條、奶制品、湯、飲料、飲品、酒精性飲料、維生素片等，并且不限于 此。所有通常接受的保健食品都可以包含本發(fā)明的提取物。
像目前可用的茶一樣，本發(fā)明的保健食品組合物還可以包含各種香料 或天然碳水化合物。這些天然碳水化合物的例子包括單糖如葡萄糖和果糖、 二糖如麥芽糖和蔗糖、多糖如糊精和環(huán)糊精、以及糖醇如木糖醇、山梨糖 醇和赤蘚醇。而且，可以將甜味劑例如天然甜味劑比如祝馬丁(thaumatin) 和甜葉菊提取物或合成甜味劑如糖精和阿司帕坦添加到使用本發(fā)明提取物 的保健食品中。以100ml本發(fā)明的組合物計(jì)，所述天然碳水化合物可以約 0.1 20g、優(yōu)選約1 10g的量使用。此外，本發(fā)明的組合物可以包含各種 養(yǎng)分、維生素、礦物質(zhì)(電解質(zhì))、調(diào)味劑(flavor)、著色劑、果膠酸或其鹽、 藻酸或其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)性膠體增稠劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、抗菌劑、 甘油、醇類和用于碳酸飲料的碳酸化劑。而且，本發(fā)明的組合物可以包含 果肉用于制備天然果汁、水果飲料和蔬菜飲料。這些成分可以單獨(dú)或組合 使用。這些添加劑的比率不重要，但通常在0.05 50重量份/100重量份的 本發(fā)明組合物的范圍內(nèi)選擇。
實(shí)施例
通過(guò)下列實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，給出所述實(shí)施方案是為了說(shuō) 明，而不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明。實(shí)施例l:從熟地黃和三七中制備草藥混合物提取物 實(shí)施例1-1:用水從熟地黃和三七中制備草藥混合物提取物 從草藥店里購(gòu)買(mǎi)熟地黃和三七。在檢查草藥三七和熟地黃的雜質(zhì)后， 只選擇干凈的草藥用于下列實(shí)驗(yàn)。將三七切碎，并將熟地黃切成1 2 cm 大小的片。將200g8:l熟地黃:三七的混合物放到3L的燒瓶中，然后在流 動(dòng)條件下，在10(TC用2000ml蒸餾水提取三輪，共8小時(shí)。合并后，將所 得溶液過(guò)濾并使用蒸發(fā)器在4(TC以下，在真空中濃縮成500ml的體積。離 心(3000rpm， 20min)，然后將上清液凍干成粉末，用于實(shí)驗(yàn)(收率62%)。
實(shí)施例1-2:用乙醇從熟地黃和三七中制備草藥混合物提取物
實(shí)施與實(shí)施例l-l相同的程序，除了用乙醇代替水。
實(shí)施例1-3:用75%乙醇從熟地黃和三七中制備草藥混合物提取物 實(shí)施與實(shí)施例1-1相同的程序，除了用25%水和75%乙醇的混合物代 替水。
實(shí)施例2:從三七中制備提取物
將100g三七磨成細(xì)粉并放到，或?qū)⑵浞勰┓诺?L的提取器中，并添 加10重量份的蒸餾水，然后在95 100'C熱提取8小時(shí)。將所得溶液通過(guò) 吸濾器過(guò)濾，離心(3000rpm， 20min)。在過(guò)濾上清液后，使用真空蒸發(fā)器 在4(TC將濾液濃縮，并凍干成粉，用于實(shí)驗(yàn)(收率33%)。
實(shí)施例3:從熟地黃中制備提取物
將100 g熟地黃放到2 L的提取器中并添加10重量份的蒸餾水，然后 在95 10(TC熱提取8小時(shí)。將所得溶液通過(guò)吸濾器過(guò)濾，使用真空蒸發(fā)器 在4(TC將濾液濃縮，并保存在冰箱中直到使用(收率45%)。
實(shí)驗(yàn)例l: TNF-a分泌的抑制
評(píng)價(jià)了本發(fā)明的提取物對(duì)抗人單核細(xì)胞系THP-1釋放TNF-a的抑制活性。人單核細(xì)胞系THP-1 (ATCC No. TIB-202)購(gòu)自ATCC (Rockville, USA), 并且在用于實(shí)驗(yàn)前培養(yǎng)在補(bǔ)充有10% FBS (胎牛血清)的RPMI 1640培養(yǎng)基 (Gibco BRL， USA)中。將細(xì)胞以5xl()S個(gè)細(xì)胞/ml的密度置于96孔板中并用 LPS刺激以分泌TNF-a。
對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，將來(lái)自熟地黃和三七的各自提取物以0 1.6 mg/ml的量 組合并與LPS —起添加?；蛘?，用0 1.6 mg/ml混合物提取物和LPS —起 處理實(shí)驗(yàn)組。在處理24小時(shí)后，使用ELISA分析培養(yǎng)基的TNF-a水平， 并將結(jié)果總結(jié)于圖1和2以及表1。
表1
三七(mg/ml》熟地黃(mg/ml)00.10.20.40.81.6
0107.93± 1.5894.16± 2.3281,89± 4.1471.26± 3.4455.39± 0.4045.21± 1.82
0.198.35± 6.0383.23± 3.1470,36 3.5463.47± 3.5860.48± 6.5946.56± 6.14
0.293.41± 1.4479.64± 2.8770.96± 1.4460.33± 3.4852,25± 2.6042.96± 1.43
0.4111.09± 3.78107.09± 5.7393.22± 2.1491.22± 3.7568.10± 3.1355.16± 1.26
0.8100.77± 3,1592.60± 3.9377.97± 1.3481,66± 4,8457.47± 1.4748.07± 0.71
1.6103.85± 1.0887.67± 4.7585.05± 3.9569.49± 2.0761.79± 5.6347.92± 0.82
在圖l和表l中看到，觀察到與對(duì)照相比，用0 1.6 mg/ml熟地黃和 三七的各自提取物的各種組合處理的細(xì)胞以劑量依賴性的方式明顯抑制了 TNF-a釋放。
而且，在圖2中看到，發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明的草藥混合物提取物處理，與沒(méi) 有用其處理的對(duì)照相比，以劑量依賴性的方式明顯抑制了 TNF-a的分泌。 因此，本發(fā)明的提取物有效地抑制TNF-a的分泌。實(shí)驗(yàn)例2:測(cè)定成骨細(xì)胞增殖 分析本發(fā)明的提取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響。
鼠顱蓋MC3T3-E1(ATCC No. CRL-2593)細(xì)胞購(gòu)自ATCC (Rockville， USA)并且培養(yǎng)在補(bǔ)充有10% FBS(胎牛血清)的DMEM (Gibco BRL， USA) 中，用作成骨細(xì)胞。
將成骨細(xì)胞以20000個(gè)細(xì)胞/孔的密度涂到24孔板中并在5% C02培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)48小時(shí)。然后，用添加有0 1.6mg/ml來(lái)自熟地黃和三七的各自 提取物的組合的新鮮介質(zhì)代替培養(yǎng)基，然后再培養(yǎng)48小時(shí)。在吸掉培養(yǎng)基 后，用胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。將結(jié)果制成圖3。
在圖3中看到，觀察到用本發(fā)明的提取物處理使細(xì)胞的增殖提高了高 達(dá)20%(按濃度計(jì))。觀察到與對(duì)照相比，用0 1.6mg/ml來(lái)自熟地黃和三 七的各自提取物的各種組合處理的細(xì)胞增加了細(xì)胞數(shù)目。
實(shí)驗(yàn)例3:測(cè)定OPG (骨保護(hù)素)的表達(dá)
將人骨肉瘤MG-63細(xì)胞(ATCC No. CRL-1427)在60 mm組織培養(yǎng)皿中 培養(yǎng)到融合，并在包含0 1.6 mg/ml來(lái)自熟地黃和三七的各自提取物的各 種組合或者0 1.6 mg/ml草藥混合物提取物的2 ml DMEM中溫育24小時(shí)。 其后，使用OPG-ELISA試劑盒(Oscotec Inc.)分析培養(yǎng)基的OPG水平。結(jié) 果示于圖4和5。
在圖4中看到，觀察到與各自的提取物相比，當(dāng)用0.1 L6 mg/ml來(lái) 自熟地黃和三七的草藥混合物提取物處理細(xì)胞時(shí)，進(jìn)一步促進(jìn)了成骨細(xì)胞 中OPG(抑制破骨細(xì)胞形成的蛋白)的表達(dá)。與用個(gè)體提取物處理的組相比， 用草藥混合物提取物處理的組的OPG表達(dá)水平以劑量依賴性的方式增加了 高達(dá)300%。
而且，在圖5中看到，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，用來(lái)自熟地黃和三七的混合 物提取物處理明顯提高了 OPG的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)例4:抑制TRAP(+)多核細(xì)胞的形成
在通過(guò)脫頸處死7 9周大的雄性小鼠后，無(wú)菌切除股骨和脛骨并清除 軟組織。然后，在相對(duì)端切開(kāi)髂骨，并通過(guò)用26號(hào)針頭將包含0.1%膠原
15酶(Gibco)、 0.05%胰蛋白酶和0.5 mMEDTA(Gibco)的1 ml酶溶液注射到一 端的骨髓腔中來(lái)抽取骨髓。通過(guò)將骨髓攪拌30分鐘來(lái)獲得骨髓細(xì)胞，并將 其在補(bǔ)充有10%FBS的a-MEM中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)以獲得非粘附細(xì)胞，即破 骨細(xì)胞祖細(xì)胞。將它們以2xl()S個(gè)細(xì)胞/孔的密度涂板并培養(yǎng)。
將培養(yǎng)的細(xì)胞中的粘附細(xì)胞用PBS洗滌并用擰檬酸鹽-乙酸鹽-甲醛固 定5分鐘，然后通過(guò)在37'C下在包含萘酚AS-BI磷酸鹽緩沖液、Fast Garnet GBC緩沖液和7 mM酒石酸鹽緩沖液(pH 5)的乙酸鹽緩沖液(pH 5.0)中溫育 1小時(shí)，來(lái)進(jìn)行TRAP染色。將具有三個(gè)以上細(xì)胞核的TRAP(+)多核細(xì)胞 認(rèn)為是破骨細(xì)胞。
為了誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，利用其中存在破骨細(xì)胞祖細(xì)胞的骨髓。將 TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞認(rèn)為是破骨細(xì)胞，然后將其在0 ~ 1.6 mg/ml個(gè)體草藥 提取物或0 ~ 1.6 mg/ml草藥混合物提取物的存在下培養(yǎng)，然后監(jiān)測(cè)TRAP-陽(yáng)性多核細(xì)胞的計(jì)數(shù)。結(jié)果制成圖6和7。在圖6和7中看到，觀察到用本 發(fā)明提取物處理的組的TRAP(+)多核細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下降。從這些結(jié)果中證 實(shí)，本發(fā)明的提取物可用于抑制破骨細(xì)胞的形成。
實(shí)驗(yàn)例5:抑制破骨細(xì)胞活性
為了監(jiān)測(cè)破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性，在涂布碳磷酸l^(carbonated calcium phosphate)的板(OAAS， OCT Inc.)中培養(yǎng)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞，觀察破骨細(xì)胞標(biāo) 記TRAP的活性和吸收。
從實(shí)驗(yàn)例4分離和培養(yǎng)的破骨細(xì)胞祖細(xì)胞中除去培養(yǎng)基。用蒸餾水洗 滌OAAS板以除去粘附細(xì)胞，在5%次氯酸鈉溶液中溫育5分鐘，然后用 蒸餾水洗滌，再使用Image Pro plus觀察吸收區(qū)域。也就是說(shuō)，為了檢驗(yàn)負(fù) 責(zé)骨組織中的骨吸收的破骨細(xì)胞的活性，在本發(fā)明提取物的存在下，將破 骨細(xì)胞袓細(xì)胞培養(yǎng)在涂布有鈣和磷酸鹽的板中，所述板被設(shè)計(jì)以制造類似 于骨組織的礦物質(zhì)部分的條件。監(jiān)測(cè)吸收面積的改變，并將結(jié)果示于圖8 和9。
在圖8和9中看到，觀察到通過(guò)用于培養(yǎng)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞的涂有鈣-磷 酸鹽的板進(jìn)行測(cè)定，本發(fā)明的提取物明顯抑制了破骨細(xì)胞的活性和吸收。實(shí)驗(yàn)例6:對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞的增殖的影響 測(cè)定本發(fā)明的提取物對(duì)人牙周膜細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞的增殖的影響。
用刮匙對(duì)為了正牙而從健康人中拔出的前磨牙的牙周膜進(jìn)行無(wú)菌刮擦
并置于培養(yǎng)皿中，然后在補(bǔ)充有10% FBS (胎牛血清)的DMEM (Gibco BRL， USA)中培養(yǎng)。分離拔出的前磨牙的部分牙齦并以相同的方式培養(yǎng)，獲得牙 齦成纖維細(xì)胞。在培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)程中，用顯微鏡檢查細(xì)胞從外植體的外生 長(zhǎng)。在形成細(xì)胞集落后，從中取出各自的組織樣本，使其單層生長(zhǎng)，并進(jìn) 行傳代培養(yǎng)直到用于實(shí)驗(yàn)。將人牙周膜細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞各自以20000 個(gè)細(xì)胞/孔的密度涂到24孔板上并在5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，然后 用0 1.6 mg/ml個(gè)體提取物或0 1.6 mg/ml混合物提取物處理細(xì)胞，另外 再培養(yǎng)48小時(shí)。在除去培養(yǎng)基后，添加胰蛋白酶-EDTA并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器 將細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果制成圖IO、 11和12。
在圖10和11中看到，觀察到在用草藥混合物提取物處理后，牙齦成 纖維細(xì)胞的增殖水平與用個(gè)體提取物處理后一樣低或者更低。
在圖12中看到，與用來(lái)自熟地黃或三七的個(gè)體提取物處理相比，用草 藥混合物提取物處理后，牙周膜細(xì)胞的增殖進(jìn)一步提升了高達(dá)40%。
因此，本發(fā)明的提取物能有效促進(jìn)在牙周組織的再生中起關(guān)鍵作用的 牙周膜細(xì)胞的增殖，而不明顯影響牙齦成纖維細(xì)胞的增殖。
實(shí)驗(yàn)例7:對(duì)患有牙周病的動(dòng)物模型的治療功效
牙周病是由復(fù)雜因素引起的慢性疾病。其中，最重要的因素是細(xì)菌。 牙齒表面附著有細(xì)菌生物膜，它是微生物與唾液蛋白和食物的復(fù)雜聚集體。 患有牙周病的患者大多數(shù)在免疫防御細(xì)胞的功能上有缺陷，不能抵御來(lái)自 細(xì)胞的各種產(chǎn)物并且遭受?chē)?yán)重的組織破壞的痛苦。
在實(shí)驗(yàn)性大鼠模型中，將絲線拴到牙齒上，以在牙齒上自然產(chǎn)生牙斑 和牙石，然后引起炎癥，導(dǎo)致牙槽骨吸收。
用結(jié)扎線綁住大鼠磨牙以誘導(dǎo)牙周病，向大鼠給藥本發(fā)明的提取物。 切除包括牙齒的上頜骨并觀察，檢驗(yàn)所述提取物對(duì)牙周病的預(yù)防和治療效 果。在通過(guò)腹部注射氯胺酮(100 mg/kg)和賽拉嗪(10 mg/kg)的混合物將大 鼠全身麻醉后，用結(jié)扎絲線(4/0)綁住下頜的第二磨牙以誘導(dǎo)牙周病。
在同樣的4周時(shí)間內(nèi)，假手術(shù)組和陰性對(duì)照口服給予固體食物和5 ml/kg水，而實(shí)驗(yàn)組還口服給藥本發(fā)明的提取物(100mg/kg)。
在完成口服給藥后，從用C02麻醉的大鼠切除下頜骨并用布安液固定
2小時(shí)。然后，用5%硝酸將它脫鈣72小時(shí)，除去包括鈣的礦物質(zhì)，將組 織軟化到適合組織切片的程度。隨后，用流動(dòng)水將牙齒洗滌12小時(shí)并按順 序用70°/。、 80%、 90%和100%的醇脫水三次，每個(gè)濃度2小時(shí)，然后換成 二甲苯脫水三輪，每輪2小時(shí)。通過(guò)用液體石蠟處理三輪，每輪2小時(shí)， 將樣品包埋到石蠟中。
在形成石蠟塊后，通過(guò)用輪轉(zhuǎn)切片機(jī)將石蠟塊切成5pm的厚度，將切 片附著到載玻片上并使用載玻片加溫器(40土3'C)干燥，來(lái)制備樣本。使用二 甲苯將完全干燥的載玻片脫除石蠟，用醇脫水，并用蘇木精-伊紅或三色法 染色。其后，染色的組織通過(guò)再次經(jīng)過(guò)醇和二甲苯，然后在60'C的培養(yǎng)箱 中干燥過(guò)夜，將其包封。在光學(xué)顯微鏡下觀察它們并拍照。
使用圖像分析系統(tǒng)(Image-proplus; 3.0版)，測(cè)定照片中牙槽骨嵴(AC) 與釉質(zhì)牙骨質(zhì)界(CEJ)之間的距離。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組或陰性對(duì)照 的AC與CEJ之間的距離，測(cè)定來(lái)自熟地黃和三七的草藥混合物提取物的 抑制效果。結(jié)果示于圖13和14。
如圖13和14所示，與假手術(shù)組相比，在誘導(dǎo)牙周病后只喂給水的陰 性對(duì)照的骨缺失上升了三倍，但給藥來(lái)自熟地黃和三七的草藥混合物提取 物的組只上升了兩倍。
正如在患有牙周病的大鼠中證實(shí)的，本發(fā)明的提取物可用于治療和預(yù) 防牙周病。
下面，將描述本發(fā)明組合物的配制實(shí)施例。 配制例l:藥物制劑 1.散劑的制備 本發(fā)明的提取物 2g 乳糖 lg
將這些成分混合并裝入密封囊中，制備散劑形式。2.片劑的制備 本發(fā)明的提取物 100 mg 玉米淀粉 100 mg
硬脂酸鎂 2 mg
將這些成分混合并根據(jù)一般方法壓片，制備片劑。
3.膠囊劑的制備 本發(fā)明的提取物100 mg 玉米淀粉 100 mg
乳糖 100 mg
硬脂酸鎂 2 mg
將這些成分混合并根據(jù)一般方法裝入明膠膠囊中，制備膠囊劑。
4.嗽口水的制備
本發(fā)明的提取物
木糖醇
乙醇
山梨糖醇
糖精鈉
單氟磷酸鈉
月桂硫酸鈉
聚山梨酯20
薄荷調(diào)味劑
苯甲酸鈉
凈化水
總計(jì)
0.01~1.0g
5~10g
5~15g
5~15g
10~廳mg
500-1000 mg 100~200mg IO(MOOO mg
l(MOO mg
10 謂g
100 g
根據(jù)一般方法將這些成分混合，制備可用于預(yù)防和治療牙周炎的嗽口
水,配制例2:食品的制備 如下制備包含本發(fā)明提取物的食品。
1. 調(diào)味品的制備
制備包含20 95 wt。/。的本發(fā)明提取物的健身調(diào)味品。
2. 番茄醬和番茄汁(tomato source)的制備
通過(guò)將0.2 1.0 wt。/。的本發(fā)明提取物添加到一般的番茄醬或番茄汁中， 制備促進(jìn)健康的番茄醬或番茄汁。
3. 面食的制備
使用包含0.5 5.0 wtQ/。的本發(fā)明提取物的面粉混合物制備面包、蛋糕、 餅干和面條。
4. 湯和肉汁的制備
將量為0.1 5.0 wty。的本發(fā)明提取物添加到一般的湯或肉汁中，制備 用于肉制品或面條的促進(jìn)健康的湯或肉汁。
5. 絞牛肉的制備
將量為10wt。/。的本發(fā)明提取物添加到一般的絞牛肉中，制備促進(jìn)健康 的絞牛肉。
6. 乳制品的制備
使用包含5 10 wto/。的本發(fā)明提取物的牛奶制備各種乳制品如黃油和 冰淇淋。
7. 禪食(zen food)的制備
使用一般方法將糙米、大麥、糯米和未脫殼的薏苡預(yù)膠化，干燥并烘 干，然后磨成粒度為60目的粉末。
根據(jù)一般方法將黑豆、黑芝麻和野芝麻蒸煮，干燥并烘干，然后磨成粒度為60目的粉末。
使用真空濃縮器將本發(fā)明的提取物在真空中濃縮并在對(duì)流烘箱中干 燥，然后磨成粒度為60目的粉末。
按下列比率配制由所述谷物、所述種子和本發(fā)明的提取物組成的粉末， 獲得禪食。
谷物(糙米30wt。/。，未脫殼的薏苡15wty。，大麥20wty。)， 種子(野芝麻7wt。/。，黑豆8wt。/。，黑芝麻7wt。/。)， 本發(fā)明提取物的干粉(3 wt%)， 靈芝(Ga"ocferwa /wczV/wm) (0.5 wt%)， 毛地黃(Foxglove) (0.5 wt%)。
配制例3:飲料的制備 1碳酸飲料的制備
將包含5 lt)o/o糖、0.05 0.3%檸檬酸、0.005 0.02%焦糖和0.1 1% 維生素C的混合物與79 94%的凈化水混合，得到糖漿，然后將其在85 98。C滅菌20 180秒。將滅菌的糖漿與冷水以l:4的比率混合，然后注射 0.5 0.82%的二氧化碳，得到包含本發(fā)明提取物的碳酸飲料。
2. 保健飲料的制備
將液體果糖(0.5%)、低聚糖(2%)、糖(2%)、鹽(0.5%)和水(75%)與本發(fā) 明的提取物均勻調(diào)配，將配制物進(jìn)行巴氏滅菌并裝入瓶子如玻璃瓶、PET 瓶等內(nèi)。
3. 蔬菜汁的制備
將5g本發(fā)明的提取物添加到1000 ml —般的番茄汁或胡蘿卜汁中，得 到藥用蔬菜汁。
4. 果汁的制備
將lg本發(fā)明的提取物添加到1000 ml —般的蘋(píng)果汁或葡萄汁中，得到 藥用果汁。
權(quán)利要求
1.用于預(yù)防和治療牙周病的藥物組合物，所述藥物組合物包含來(lái)自熟地黃(Rehmanniae Radix Preparata)和三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)的各自提取物中的一種、所述各自提取物的混合物、或來(lái)自熟地黃和三七的混合物的提取物作為活性成分。
2 權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述來(lái)自熟地黃和三七的各自提取物 的混合物中來(lái)自熟地黃的提取物:來(lái)自三七的提取物的重量比為1:16-16:1。
3 權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述熟地黃和三七的混合物中熟地黃 與三七的重量比為1:8。
4 權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述來(lái)自熟地黃和三七的各自提取物、 或所述來(lái)自熟地黃和三七的混合物的提取物是通過(guò)使用水、醇或醇與水的 混合物作為提取溶劑來(lái)制備的。
5 權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述醇為甲醇或乙醇。
6 權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述藥物組合物起抑制腫瘤壞死因子 分泌的作用。
7 權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述藥物組合物起促進(jìn)骨保護(hù)素分泌
8.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述牙周病是牙齦炎。
9.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述牙周病是牙周炎。
10.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述藥物組合物是口服組合物。
11.權(quán)利要求IO的藥物組合物，其中所述口服組合物選自牙膏、嗽口水、 口腔清洗劑及它們的組合。
12.用于預(yù)防和治療牙周病的保健食品組合物，所述保健食品組合物包含 來(lái)自熟地黃和三七的各自提取物中的一種、所述各自提取物的混合物、或 來(lái)自熟地黃和三七的混合物的提取物作為活性成分。
13.權(quán)利要求12的保健食品組合物，其中所述來(lái)自熟地黃和三七的各自提 取物的混合物中來(lái)自熟地黃的提取物:來(lái)自三七的提取物的重量比為 1:16畫(huà)16:1。
14.權(quán)利要求12的保健食品組合物，其中所述熟地黃和三七的混合物中熟 地黃與三七的重量比為1:8。
15.權(quán)利要求12的保健食品組合物，其中所述來(lái)自熟地黃和三七的各自提取物、或所述來(lái)自熟地黃和三七的混合物的提取物是通過(guò)使用水、醇或醇 與水的混合物作為提取溶劑來(lái)制備的。
16.權(quán)利要求15的保健食品組合物，其中所述醇為甲醇或乙醇。
17.權(quán)利要求12的保健食品組合物，其中所述牙周病是牙齦炎。
18.權(quán)利要求12的保健食品組合物，其中所述牙周病是牙周炎。
19.用于治療牙周病的方法，所述方法包括給藥治療有效量的來(lái)自熟地黃 和三七的各自提取物中的一種、所述各自提取物的混合物、或來(lái)自熟地黃 和三七的混合物的提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于治療和預(yù)防牙周病的藥物組合物，所述藥物組合物包含來(lái)自熟地黃(Rehmanniae Radix Preparata)、三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)或其混合物的提取物作為活性成分。由于具有保護(hù)牙槽骨和促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖以及抑制TNF-α釋放的活性，所述提取物可用于制備可用于治療和預(yù)防牙周病的藥物組合物或保健食品組合物。
文檔編號(hào)A61K36/804GK101657209SQ200880012373
公開(kāi)日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2008年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月18日
發(fā)明者白東憲, 金世源, 金正根, 金炯建 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Oscotec