專利名稱：：干燥蛋白組合物的方法、干燥的蛋白組合物和包含干燥的蛋白的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白溶液的干燥方法和干燥的蛋白產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及含有這種干燥的蛋白的藥物組合物，使用本發(fā)明的干燥的蛋白治療糖尿病和高血糖的方法，和這種干燥的蛋白在治療糖尿病和高血糖中的用途。
背景技術(shù)：
：干燥是通過從固體、半固體或液體蒸發(fā)除去水分的質(zhì)量轉(zhuǎn)移過程，最終形成固態(tài)。可能的干燥法是真空干燥，其中通過接觸導(dǎo)熱或輻射(或微波)來提供加熱，同時(shí)通過真空系統(tǒng)除去所產(chǎn)生的蒸汽。另一個(gè)技術(shù)是轉(zhuǎn)鼓式干燥，其中用加熱的表面提供能量，抽氣機(jī)將蒸汽抽出到外部。冷凍干燥或干凍是生物化學(xué)行業(yè)通常使用的干燥法。在干燥之前將溶劑冷凍，然后升華，即在溶劑熔點(diǎn)以下直接從固相到達(dá)氣相。冷凍干燥常常在高真空下進(jìn)行，以合理的速率進(jìn)行干燥。蛋白和肽的變性可以在冷凍期間發(fā)生，導(dǎo)致質(zhì)量差的冷凍干燥產(chǎn)品。在化學(xué)工業(yè)、食品工業(yè)和生物化學(xué)和藥學(xué)工業(yè)內(nèi)，噴霧干燥具有廣泛應(yīng)用。從1940年代早期以來，噴霧干燥已經(jīng)用于藥物加工業(yè)。由于它可提供獲得預(yù)定特性的粉末的手段，例如粒度分布和成型，因此它是加工藥物的使用方法。另外，許多制劑加工可以在噴霧干燥器中一步實(shí)現(xiàn)這些包括包封，復(fù)合物形成，甚至聚合。噴霧干燥還是干燥熱敏藥物(例如蛋白藥物)的便利方法，活性損失最小。國際專利申請(qǐng)WO00/00176公開了通過將基本上純的治療劑溶液(沒有不合需要的高濃度鹽的伴隨產(chǎn)品或其它賦形劑)進(jìn)行噴霧干燥得到的微粒制劑。據(jù)說鹽是不合需要的，因?yàn)樗鼪]有穩(wěn)定效果，實(shí)際上，降低鹽的量可以使穩(wěn)定性更高。胰島素微?？扇缦碌玫皆谒?HC1)中溶解Zn-胰島素，加入堿(NaOH),得到胰島素溶液，例如使pH值高于7，將胰島素溶液噴霧干燥。加入的鹽酸和氫氧化鈉使得噴霧干燥的微粒制劑帶有鹽分。進(jìn)一步的，獲得的制劑(若加入到水中)則具有與送進(jìn)噴霧干燥器的蛋白溶液相同的pH值。國際專利公開WO95/24183涉及肺部遞送胰島素的方法和組合物。胰島素粉末是如下制備的在含有賦形劑(甘露糖醇和/或棉子糖)的枸櫞酸鈉緩沖液中，將團(tuán)塊結(jié)晶胰島素混合，得到7.5mg/ml的最終固體濃度和6.7±0.3的pH值，而后將胰島素溶液噴霧干燥。國際專利〃^開WO05/092301涉及噴霧干燥胰島素的澄清溶液(pH值在胰島素的等電點(diǎn)下，優(yōu)選低于5.4)。人GLP-1是37個(gè)氨基酸殘基肽，源于預(yù)高血糖素原，其是在回腸遠(yuǎn)端、胰腺和腦的L-細(xì)胞中合成的。GLP-1是重要的胃腸激素，在葡萄糖代謝和胃腸分泌與代謝中具有調(diào)節(jié)功能。GLP-1可以以葡糖依賴方式促進(jìn)胰島素分泌，促進(jìn)胰島素生物合成，促進(jìn)(3-細(xì)胞救援，降低胰高血糖素分泌、胃排空和食物攝入。人GLP-1可水解為GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)-酰胺，這兩個(gè)都是促胰島素分泌肽。治療激素胰島素是影響血糖水平的小蛋白。其每天用于數(shù)百萬人的糖尿病藥物治療。糖尿病是由絕對(duì)或相對(duì)缺乏胰島素和胰島素抗性所引起的慢性病，其導(dǎo)致高血糖水平(高血糖癥)，產(chǎn)生長期并發(fā)癥。目前，糖尿病(i型和n型糖尿病)的治療依賴所謂的增強(qiáng)胰島素療法的增加程度。按照這種方案，每天用多次胰島素注射來治療患者，包括每天一或兩次注射長效胰島素，來保證基本的胰島素需求，通過快速起作用的胰島素的快速濃注進(jìn)行補(bǔ)充，以保證與膳食相關(guān)的胰島素要求。胰島素的分子由兩個(gè)鏈A和B組成，分別具有21和30個(gè)殘基。A鏈?zhǔn)怯蓛蓚€(gè)螺旋片段組成的，兩個(gè)螺旋片段被與其中一個(gè)螺旋連接(通過內(nèi)鏈二硫鍵)的短的延長部分分開。兩個(gè)額外的二硫鍵將A鏈與較大的B鏈連接起來。在生物學(xué)活性形式中，胰島素以單體形式存在，其中B鏈包括中心螺旋區(qū)域(與兩個(gè)延長部分側(cè)接)。在二價(jià)離子例如鋅的存在下，單體組裝成六聚體，其中兩個(gè)中心鋅離子的每一個(gè)與三個(gè)組氨酸殘基配位。胰島素易產(chǎn)生原纖化作用，其是一種導(dǎo)致良序交叉-P組裝的錯(cuò)折疊加工過程。防止p細(xì)胞中的原纖化作用是通過鋅六聚體內(nèi)的敏感單體的多價(jià)螯合來提供的。當(dāng)在胰島素的噴霧干燥期間發(fā)生原纖化作用時(shí)，噴嘴可能阻塞，導(dǎo)致干燥過程中斷。5進(jìn)一步的，干燥蛋白的pH值是非常重要的。通常合乎需要的是，獲得具有特定pH值的干燥產(chǎn)品，例如，可與生理pH值相比較的pH值。本發(fā)明概述本發(fā)明涉及干燥蛋白溶液的方法，其中a)如下獲得蛋白溶液將蛋白與水混合，任選包含賦形劑，用揮發(fā)堿、不揮發(fā)的堿和任選不揮發(fā)的酸調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值，使其成為堿性，和b)將蛋白溶液干燥另外，本發(fā)明涉及利用所提及方法得到的干燥蛋白，包含該干燥蛋白的藥物組合物和治療糖尿病的方法。定義本文提及的"蛋白溶液"是指不使用酸而溶解的、pH值高于蛋白的等電點(diǎn)的胰島素、胰島素類似物、胰島素^"生物、GLP-1、GLP-1類似物、GLP-1書f生物或胰高血糖素的溶液。"揮發(fā)堿"是指一種堿，在某種程度上，在加熱和/或減壓條件下，其可蒸發(fā)，例如，在室溫下蒸汽壓力高于65Pa的堿，或包含在室溫下蒸汽壓力高于65Pa的堿的含水共沸混合物。本文提及的"不揮發(fā)堿"是指一種堿，其不蒸發(fā)或在加熱條件下僅僅部分蒸發(fā)，例如在室溫下蒸汽壓力低于65Pa的堿。本文提及的"不揮發(fā)酸"是指一種酸，其不蒸發(fā)或在加熱條件下僅僅部分蒸發(fā)，例如在室溫下蒸汽壓力低于65Pa的酸，例如磷酸。本文提及的"強(qiáng)酸"是指pKa值低于-l的酸，例如鹽酸和石克酸。本文使用的"胰島素，，是指人胰島素、豬胰島素或牛胰島素，其在CysA7和CysB7之間和在CysA20和CysB19之間具有二硫鍵，在CysA6和CysAll之間具有內(nèi)部二石克鍵，或胰島素類似物或其書f生物。本文使用的"GUM"是指胰高血糖素樣肽-1。人GLP-1是37個(gè)氨基酸殘基的肽。人GLP-1可水解為GLP-l(7-37)和GLP-l(7-36)-酰胺，這兩個(gè)都是促胰島素分泌肽。"蛋白溶液/胰島素溶液/GLP-l溶液/胰高血糖素溶液的pH<直"是指用揮發(fā)性和不揮發(fā)堿調(diào)節(jié)之后、在蛋白溶液的噴霧干燥之前的蛋白/胰島素/GLP-l/胰高血糖素溶液的pH值。"干燥蛋白/胰島素/GLP-l/胰高血糖素的pH值，，是指當(dāng)至少20mg噴霧干燥/干燥蛋白與0.5ml軟化水混合、得到每ml軟化水至少40mg蛋白/胰島素/GLP-l的濃度并且測(cè)定pH值時(shí)，干燥/噴霧干燥蛋白/胰島素/GLP-l/胰高血糖素的pH值。干燥蛋白/胰島素/GLP-l的pH值可以如下測(cè)定將至多大約300mg噴霧干燥/干燥蛋白/胰島素/GLP-l與0.5ml軟化水混合，測(cè)定pH值。例如，如下測(cè)定pH^f直將大約20至大約250mg噴霧干燥/干燥蛋白/胰島素/GLP-l/胰高血糖素與0.5ml軟化水混合，將大約20至大約200mg噴霧干燥/干燥蛋白/胰島素/GLP-l/胰高血糖素與0.5ml軟化水混合，將大約20至大約150mg噴霧干燥/干燥蛋白/胰島素/GLP-l/胰高血糖素與0.5ml軟化水混合，或?qū)⒋蠹s20至大約100mg噴霧干燥/干燥蛋白/胰島素/GLP-l/胰高血糖素與0.5ml軟化水混合，測(cè)定pH^直。"干燥蛋白的目標(biāo)pH值"是指獲得干燥蛋白所需要的干燥蛋白/胰島素/GLP-l/胰高血糖素的pH值，例如在干燥蛋白的化學(xué)穩(wěn)定性是最佳的情況下的pH值，或可與生理pH值相比較的干燥蛋白的pH值。"蛋白溶液的目標(biāo)pH值"是指當(dāng)?shù)鞍兹芤?胰島素溶液/GLP-l溶液/胰高血糖素溶液應(yīng)當(dāng)被干燥時(shí)的合乎需要的pH值，例如，由于溶解蛋白的高溶解度或低聚集趨勢(shì)，pH值是溶解蛋白處于最佳時(shí)的pH值。本文使用的"類似物，，是指一種多肽，通過除掉和/或交換至少一個(gè)存在于天然存在蛋白中的氨基酸殘基和/或加入至少一個(gè)氨基酸殘基，其具有形式上可以源自于蛋白結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)。加入和/或交換的氨基酸殘基可以是可編碼的氨基酸殘基或其它天然存在的殘基或純粹合成的氨基酸殘基。胰島素類似物可以是這樣的類似物，其中B鏈的28位可以從天然Pro殘基改變?yōu)锳sp、Lys或Ile之一。在另一個(gè)方面，胰島素的B29位的Lys改變?yōu)镻ro或Glu。同樣，A21位的Asn可以改變?yōu)锳la、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val,尤其是改變?yōu)镚ly、Ala、Ser或Thr,優(yōu)選Gly。此外，B3位的Asn可以改變?yōu)長ys、Thr、Ser、Gln、Glu或Asp。胰島素類似物的進(jìn)一步例子是des(B30)人胰島素；des(B30)人胰島素類似物；其中PheBl已被除掉的胰島素類似物；其中A-鏈和/或B-鏈具有N端延伸的胰島素類似物，和其中A-鏈和/或B-鏈具有C端延伸的胰島素類似物。由此，一或兩個(gè)Arg可以加到Bl位上。簡單系統(tǒng)用于描述GLP-1肽的類似物。由此，例如，[Gly8]GLP-l(7-37)稱為GLP-1(7-37)的類似物，形式上衍生自GLP-1(7-37),通過在8位用GIy取代天然存在的氨基酸殘基(Ala)。GLP-1類似物可以是這樣的類似物，其中天然存在的GLP-1(7-37)的34位的Lys被Arg取代。將不說明旋光異構(gòu)體的所有氨基酸被理解為L-異構(gòu)體。在本發(fā)明的某些方面，已經(jīng)改變了最多17個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的某些方面，已經(jīng)改變了最多15個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的某些方面，已經(jīng)改變了最多IO個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的某些方面，已經(jīng)改變了最多8個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的某些方面，已經(jīng)改變了最多7個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的某些方面，已經(jīng)改變了最多6個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的某些方面，已經(jīng)改變了最多5個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的某些方面，已經(jīng)改變了最多4個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的某些方面，已經(jīng)改變了最多3個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的某些方面，已經(jīng)改變了最多2個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的某些方面，已經(jīng)改變了1個(gè)氨基酸。"desB30胰島素，，、"desB30人胰島素，，是指缺乏B30氨基酸殘基的胰島素或其類似物。"母體胰島素，，是指天然存在的胰島素，例如人胰島素或豬胰島素?；蛘?，母體胰島素可以是胰島素類似物。本文使用的"衍生物，，是指化學(xué)上已經(jīng)改變的天然存在的蛋白或其類似物，例如在蛋白骨架的一個(gè)或多個(gè)位置引入取代基，或?qū)⒌鞍字械陌被釟埢幕鶊F(tuán)氧化或還原，或?qū)⒂坞x氨基或羥基?；?。本發(fā)明的說明用本發(fā)明的方法，可以獲得干燥蛋白粉末，其pH值不同于所干燥的蛋白溶液的pH值。本發(fā)明涉及干燥蛋白溶液的干燥方法，其中a)如下獲得蛋白溶液將蛋白與水混合，任選包含賦形劑，用揮發(fā)堿、不揮發(fā)的堿和任選不揮發(fā)的酸調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值，使其成為堿性，和b)將蛋白溶液干燥在本發(fā)明的一方面，該方法包括a)選擇干燥蛋白的目標(biāo)pH值，b)選擇蛋白溶液的目標(biāo)pH值，c)提供水相，d)力口入蛋白，e)4壬選加入l武形劑，f)用不揮發(fā)的堿和任選不揮發(fā)的酸將pH值調(diào)節(jié)至干燥蛋白的目標(biāo)pH值，g)用揮發(fā)的堿將pH值調(diào)節(jié)至所干燥的蛋白溶液的目標(biāo)pH值，和h)將蛋白溶液噴霧干燥。其中步驟d、e、f和g可以以任何順序進(jìn)4亍，同時(shí)連續(xù)攪拌。在本發(fā)明的一方面，步驟d、e和f可以以^壬何順序進(jìn)行，同時(shí)連續(xù)攪拌。在一方面，用揮發(fā)堿和不揮發(fā)堿調(diào)節(jié)蛋白溶液。在該方法的一方面，蛋白溶液是在溫度低于大約8。C、低于大約6。C、低于大約5。C、低于大約4。C、低于大約3'C、低于大約2'C或低于大約1'C下獲得的。在一方面，抑制水的水點(diǎn)，并且在低于(TC的溫度獲得蛋白溶液。在一方面蛋白溶液具有高于大約7.4、高于大約7.6、高于大約7.8、高于大約8.0、高于大約8.2、高于大約8.4或高于大約8.6的pH值或目標(biāo)pH值。當(dāng)?shù)鞍兹芤涸诖蠹s7.6和大約11.0之間、在大約7.6和大約10.5之間、在大約7.8和大約11.0之間、在大約7.8和大約10.5之間、在大約8.0和大約ll.O之間、在大約8.0和大約10.5之間、在大約8.2和大約11.0之間、在大約8.4和大約11.0之間、在大約8.6和大約10.0之間、在大約8.8和大約10.0之間、在大約9.0和大約10.0之間或在大約9.2和大約10.0之間時(shí)，較少發(fā)布蛋白細(xì)纖維化的傾向。在本發(fā)明的一方面，將蛋白加入到水溶液中。水溶液可以是純水，或可以含有U武形劑或石咸。9在本發(fā)明的一方面，用包含不揮發(fā)堿的堿性溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值。不揮發(fā)-咸可以選自》威金屬鹽、》咸金屬氫氧^i物、-喊土金屬鹽、石咸土金屬氬氧化物和氨基酸或其組合。例如，可以用氫氧化鈉、氫氧4^鉀、氬氧化釣、氧化釣或其任一組合來調(diào)節(jié)pH值。在本發(fā)明的一方面，用包含揮發(fā)堿的堿性溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值。揮發(fā)堿可以選自氫氧化銨，四烷基氬氧化銨，仲胺，叔胺，芳基胺，脂肪胺或碳酸氬銨或其組合。例如，揮發(fā)堿可以是碳酸氫鹽，碳酸鹽，氨，肼或有機(jī)堿，例如低級(jí)脂肪族胺，例如三曱胺，三乙胺，二乙醇胺，三乙醇胺和它們的鹽。進(jìn)一步的，揮發(fā)堿可以是氫氧化銨、乙基胺或甲胺或其組合。一旦將氳氧化銨加入到含有胰島素、蛋白的水溶液中，例如，胰島素將會(huì)更快速地溶解。在本發(fā)明的一方面，用包含揮發(fā)堿和不揮發(fā)堿的堿性溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值。在一方面，用氬氧化鈉將蛋白溶液的pH值調(diào)節(jié)到干燥蛋白的目標(biāo)pH值，用氳氧化銨調(diào)節(jié)，獲得蛋白溶液(用于噴霧干燥)的所選擇的pH值。在本發(fā)明的一方面，揮發(fā)堿用于調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值，調(diào)節(jié)至少大約0.5pH單位，至少大約0.7pH單位，或至少大約0.9pH單位，或至少大約l.lpH單位，或至少大約1.3pH單位，或至少大約1.5pH單位。在溶液中，胰島素的自我結(jié)合型式是蛋白濃度、金屬離子、pH值、離子強(qiáng)度和溶劑成分的復(fù)合功能。對(duì)于一些目前使用的含有胰島素、鋅離子、鹽和酚類化合物的溶液，認(rèn)為必須具有下列平4軒6Ing3In23In2+2Zn2+HeIn6(T6)T6gT3R3eR6其中In是胰島素，In2是二聚胰島素，i!l6是六聚胰島素，丁6是丁6構(gòu)象形式的六聚胰島素，丁3!13是丁3113構(gòu)象形式的六聚胰島素，R6是六聚R6狀態(tài)的六聚胰島素。胰島素的已知降解型包括a)細(xì)纖維形成；b)在A18、A21和B3的脫酰胺作用；c)通過酰胺基轉(zhuǎn)移作用或Schiff堿形成的二聚作用；d)二辟u4t物交纟灸反應(yīng)。按照Brange(StabilityofInsulin,Kl歴erAcademicPress,1994),這些降解反應(yīng)的每一個(gè)在單體狀態(tài)中比在六聚狀態(tài)中進(jìn)行的顯著更快。因此，穩(wěn)定胰島素制品的最有效的方法是盡可能向右推動(dòng)上述平tf。除了質(zhì)量作用的這種綜合影響之外，根據(jù)它們?cè)赥—R構(gòu)型變化中的直接涉及程度，進(jìn)一步改變所選擇殘基的反應(yīng)性。由此，在R狀態(tài)下(當(dāng)殘基存在于alfa-螺旋中時(shí))，B3Asn的反應(yīng)性比在T-狀態(tài)下的反應(yīng)性低得多。通過與T3R3和R6形式結(jié)合的配體，調(diào)節(jié)兩個(gè)鋅胰島素六聚體的T6、T3R3和R6構(gòu)象之間的相互轉(zhuǎn)化。陰離子例如氯化物對(duì)T3R3和R6的金屬離子中的第四個(gè)配位位置具有親合性，而防腐劑例如酚與位于T3R3和Biochemistry33,130557,1994)。因此，在溶液中，有利于胰島素R6構(gòu)象的條件在干燥過程期間(以免胰島素的變性)和在擱置存儲(chǔ)期間(以便極大化化學(xué)穩(wěn)定性)都是優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明的一方面，蛋白溶液包含酚。在一方面，每摩爾蛋白的蛋白溶液包含至少大約2摩爾酚，或每摩爾蛋白至少大約3摩爾酚，或每摩爾蛋白至少大約4摩爾酚。在一方面，蛋白溶液包含大約4摩爾酚(每摩爾胰島素)。在一方面，蛋白溶液包含大約4摩爾酚(每摩爾胰島素)，并且蛋白溶液包含鋅。當(dāng)?shù)鞍兹芤喊葝u素時(shí)，酚可以使胰島素六聚體穩(wěn)定。在本發(fā)明的一方面，蛋白選自胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物和GLP-1衍生物，月夷高血糖素和/或其4壬一組合。在本發(fā)明的一方面，蛋白溶液包含蛋白，該蛋白選自胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，并且溶液進(jìn)一步包含鋅。包含胰島素的蛋白溶液的鋅含量可以是每個(gè)胰島素六聚體大約2到大約4個(gè)鋅離子的范圍之內(nèi)，或鋅含量可以是每個(gè)胰島素六聚體大約2.1到大約3個(gè)鋅離子的范圍之內(nèi)，或鋅含量可以是每個(gè)胰島素六聚體大約2.2到大約2.7個(gè)鋅離子的范圍之內(nèi)。包含胰島素的蛋白溶液的鋅含量可以是每個(gè)胰島素六聚體大約2.3個(gè)鋅離子。在本發(fā)明的一方面，蛋白溶液包含緩沖液，清凈劑，穩(wěn)定劑，蛋白酶抑制劑，調(diào)味劑，載體，吸收促進(jìn)劑，填充劑或改善流動(dòng)特性的試劑或滲透增強(qiáng)劑。在本發(fā)明的一方面，蛋白溶液包含雙甘氨肽。當(dāng)雙甘氨肽加入到蛋白溶液中時(shí)，蛋白溶解更迅速。在一方面，將雙甘氨肽加入到包含胰島素的水溶液中。在溶液中，雙甘氨肽的濃度在大約4mM和大約200mM之間。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明涉及干燥或噴霧干燥蛋白溶液的方法，并且測(cè)定干燥蛋白的目標(biāo)pH值。要干燥的或噴霧干燥的蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的目標(biāo)pH值。蛋白溶液的pH值可以至少高于干燥蛋白的pH值0.5個(gè)pH單位。蛋白溶液的pH值可以高于噴霧干燥蛋白的pH值至少大約0.7、至少大約0.9、至少大約l.l、至少大約1.3或至少大約1.5、或至少大約2.0、或至少大約2.5個(gè)pH單位。在本發(fā)明的一方面，噴霧干燥蛋白的pH值或目標(biāo)pH值在大約6.0和大約8.5之間，在大約6.2和大約8.4之間，在大約6.4和大約8.3之間，在大約6.6和大約8.2之間，在大約6.8和大約8.1之間，在大約7.0和大約8.0之間，在大約7.2和大約7.9之間，在大約7.4和大約7.8之間，或在大約7.6和大約7.7之間。在本發(fā)明的一方面，將蛋白溶液干燥或噴霧干燥，獲得低于大約10%的水含量。水含量可以低于大約6%、低于大約4%、低于大約2%或低于大約1%,按照實(shí)驗(yàn)部分中所陳述的方法、基于干燥失重試驗(yàn)(重力法)計(jì)算/測(cè)定。在本發(fā)明的一方面，要干燥或噴霧干燥的蛋白選自AspB28人胰島素；LysB28ProB29人胰島素和LysB3GluB29人胰島素。在一方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法獲得的干燥蛋白。在一方面，本發(fā)明涉及實(shí)施例中描述的干燥蛋白。在一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含治療有效量的按照本發(fā)明的干燥蛋白，例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-1，GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一組合，該組合物可以在需要這種治療的患者中治療I型糖尿病、II型糖尿病及其它導(dǎo)致高血糖的狀況。在一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含治療有效量的纟妄照本發(fā)明的干燥蛋白以及可藥用載體和/或可藥用添加劑，干燥蛋白例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其^f壬一組合，該組合物可以在需要這種治療的患者中治療I型糖尿病、II型糖尿病及其它導(dǎo)致高血糖的狀況。在本發(fā)明的一方面，提供了在需要治療的患者中治療I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖狀況的方法，包括給予患者治療有效量的藥物組合物，藥物組合物包含按照本發(fā)明的干燥蛋白，例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-1，GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一組合。在本發(fā)明的一方面，提供了在需要治療的患者中治療I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖狀況的方法，包4舌給予患者治療有效量的藥物組合物，藥物組合物包含按照本發(fā)明的干燥蛋白以及任選的可藥用載體和/或藥學(xué)可接受的添加劑，干燥蛋白例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一組合。在本發(fā)明的一方面，提供了在需要治療的患者中治療I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖狀況的藥物組合物，該組合物包含治療有效量的按照本發(fā)明的千燥蛋白與一或兩種按照本發(fā)明的噴霧千燥蛋白以及任選的可藥用載體和/或添加劑的混合物，干燥蛋白例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-1，GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素，噴霧干燥蛋白例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物，GLP-1衍生物,胰高血糖素。在本發(fā)明的一方面，提供了在需要治療的患者中治療I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖狀況的方法，包括給予患者治療有效量的藥物組合物，藥物組合物包含按照本發(fā)明的干燥蛋白與一或兩種3姿照本發(fā)明的干燥蛋白以及任選的可藥用載體和/或藥學(xué)可接受的添加劑的混合物，本發(fā)明的干燥蛋白例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血lt素，一或兩種3要照本發(fā)明的干燥蛋白例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-1,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及藥物組合物，其包含治療有效量的按照本發(fā)明的干燥蛋白以及任選的可藥用載體和/或可藥用添加劑，干燥蛋白例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一組合，該藥物組合物可以在需要這種治療的患者中為I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖的狀況提供肺部治療。在一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物在需要治療的患者中用于I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖狀況的肺部治療，藥物組合物包含治療有效量的按照本發(fā)明的干燥蛋白，干燥蛋白例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一組合，任選與具有速效作用的胰島素或胰島素類似物以及可藥用載體和/或添加劑混合。在本發(fā)明的一方面，提供了制備藥物組合物的方法，該藥物組合物用于治療I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖狀況，該組合物是肺部使用的，并且包含治療有效量的按照本發(fā)明的干燥蛋白，干燥蛋白例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-1，GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一組合，任選與具有速效作用的胰島素或胰島素類似物以及可藥用載體和/或藥學(xué)可接受的添加劑混合。胰島素的制備胰島素或其前體物可以利用眾所周知的肽合成或利用眾所周知的重組體制備方法(在合適轉(zhuǎn)化的微生物中)來制備。由此，胰島素可以利用包括如下的方法制備在合宜的營養(yǎng)劑介質(zhì)中，在允許肽的表達(dá)的條件下，將含有編碼多肽和能夠表達(dá)多肽的DNA序列的宿主細(xì)月包進(jìn)行培養(yǎng)，而后，從培養(yǎng)物中回收得到的肽。當(dāng)制備用于按照本發(fā)明的藥學(xué)制劑中的胰島素衍生物時(shí)，可以利用眾所周知的肽合成方法或眾所周知的重組體制備方法(在合適轉(zhuǎn)化的微生物中)，制備用于代替的起始產(chǎn)品、母體胰島素或胰島素類似物或其前體物。由此，胰島素起始產(chǎn)品可以利用包括如下的方法制備在合宜的營養(yǎng)劑介質(zhì)中，在允許肽的表達(dá)的條件下，將含有編碼多肽和能夠表達(dá)多肽的DNA序列的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，而后，從培養(yǎng)物中回收得到的肽。參考國際專利申請(qǐng)WO2005/012347。藥物組合物14本發(fā)明的干燥蛋白可以例如皮下、口月良、鼻部或肺部施用。對(duì)于皮下施用，用配制已知胰島素的類似方法來配制干燥胰島素。此外，對(duì)于皮下施用，利用類似于施用已知胰島素的方法來施用本發(fā)明的干燥胰島素，通常，醫(yī)生熟悉這種方法。本發(fā)明的干燥胰島素可以以增加循環(huán)胰島素水平和/或降低循環(huán)葡糖水平的劑量有效方式通過吸入劑施用。這種施用可以有效治療例如糖尿病或高血糖病癥。獲得有效的胰島素劑量需要施用本發(fā)明的干燥胰島素的吸入劑量，劑量大于大約0.5)Llg/kg至大約50|Llg/kg。專業(yè)人員可以確定治療有效量，其將考慮各種因素，包括患者的胰島素水平、血糖水平、身體病癥、患者的肺部狀態(tài)，等等。按照本發(fā)明，本發(fā)明的干燥胰島素可以通過吸入遞送，以將其快速吸收。吸入給藥可以產(chǎn)生與皮下施用胰島素相比擬的藥物動(dòng)力學(xué)。本發(fā)明的干燥胰島素吸入可以導(dǎo)致循環(huán)胰島素水平的快速升高，而后血液中葡糖水平迅速下降。當(dāng)比較類似大小的顆粒和類似水平的肺沉積時(shí)，不同的吸入裝置典型地提供類似的藥物動(dòng)力學(xué)。按照本發(fā)明，本發(fā)明的干燥胰島素可以通過本領(lǐng)域已知的、用于吸入給予治療劑的任何種類的吸入裝置來遞送。這些裝置包括計(jì)量吸入器、霧化器、干燥粉未發(fā)生器、噴霧器，等等。本發(fā)明的干燥胰島素通過干粉吸入器或噴霧器遞送。用于給予本發(fā)明干燥胰島素的吸入裝置具有一些所需要的特征。例如，通過吸入裝置遞送是有利可靠的、可再現(xiàn)的和4青確的。吸入裝置應(yīng)該遞送小顆粒，例如顆粒小于大約10|um,例如大約l-5ium，以便良好呼吸。適合于本發(fā)明實(shí)踐的可商購的吸入裝置的一些具體例子是TurbohalerTM(Astra)，Rotahaler(Glaxo),Diskus(Glaxo),SpirosTM吸入器(Dura)，InhaleTherapeutics銷售的裝置，AERxTM(Aradigm),Ultravent⑧霧化器(Mallinckrodt),Acorn11⑧霧化器(MarquestMedicalProducts),Ventolin⑧定量吸入器(Glaxo),Spmhale^粉末吸入器(Fisons)，等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠了解，本發(fā)明的干燥蛋白制劑、遞送制劑的數(shù)量和單一劑量的給予周期取決于所使用吸入裝置的類型。對(duì)于一些氣溶膠遞送系統(tǒng)，例如霧化器，給予頻率和系統(tǒng)啟動(dòng)的時(shí)間長短主要取決于氣溶膠中的胰島素共軛物的濃度。例如，較短的給藥周期可以使用于高濃度的胰島素共軛物(在霧化器溶液中)。裝置例如定量吸入器可以產(chǎn)生更高氣溶膠濃度，并且可以操作較短的遞送目標(biāo)數(shù)量的胰島素共軛物的周期。裝置例如粉末吸入器可以遞送活性劑，直到給定的試劑荷載從裝置中排出為止。在這類吸入器中，在所得到數(shù)量的粉末中的本發(fā)明干燥胰島素的量決定了單次給藥中所遞送的劑量。關(guān)于胰島素進(jìn)入到肺中和進(jìn)入到下呼吸道或肺泡中的能力，在制劑中通過吸入裝置遞送的本發(fā)明的干燥胰島素的粒徑是關(guān)鍵性的?？梢耘渲票景l(fā)明的干燥胰島素，以使至少大約10%的所遞送的胰島素共軛物沉積在肺中，例如大約10至大約20%,或更多。已知的是，對(duì)于張口呼吸的人，肺部沉積的最高效率是用大約2pm至大約3|Lim大小的顆粒得到的。當(dāng)顆粒大小超過大約5jum時(shí)，肺部的沉積會(huì)大量地降低。低于大約1lum尺寸的顆粒會(huì)導(dǎo)致肺部沉積降〗氐，并且變得難以遞送足夠質(zhì)量的治療有效的顆粒。由此，通過吸入遞送的干燥蛋白的顆粒具有小于大約10pm的粒徑，例如在大約1pm至大約5jam范圍內(nèi)。選^^干燥蛋白的制劑，以便在所選擇的吸入裝置中得到目標(biāo)粒徑。優(yōu)選，對(duì)于干粉形式給藥，以小于大約10jam粒徑的顆粒形式制備本發(fā)明的干燥蛋白，例如大約1至大約5pm。該粒徑可有效遞送至患者的肺泡中。干粉基本上由制備的顆粒組成，大部分顆粒應(yīng)該具有目標(biāo)范圍的尺寸。優(yōu)選，至少大約50%的干粉由具有小于大約lOium直徑的顆粒組成。在容器中，顆粒通常與干粉制劑分離，而后通過載體空氣流輸送到患者的肺中。典型地，在現(xiàn)行的干粉吸入器中，破碎固體的力僅僅是通過患者的吸入所提供的。在另一個(gè)類型的吸入器中，通過患者吸入產(chǎn)生的氣流啟動(dòng)葉輪馬達(dá)，其可以使顆粒解聚。對(duì)于用干粉吸入器施用的本發(fā)明的干燥蛋白的制劑，典型地包括含有干燥蛋白的細(xì)分散干粉，但粉末還可以包括填充劑、載體、賦形劑、另一種添加劑，等等。添加劑可以包括在胰島素共軛物的干粉制劑中，例如，根據(jù)具體粉末吸入器的遞送需要來稀釋粉末，便于制劑的加工，以提供給制劑有利的粉末特性，便于從吸入裝置中出來的粉末的分散，使制劑穩(wěn)定(例如，抗氧化劑或緩沖液)，提供制劑味道，等等。優(yōu)選，添加劑不會(huì)不利地影響患者的呼吸道?？梢砸苑肿铀綄⒏稍锏鞍着c添加劑混合，或固體制劑可以包括蛋白共軛物的顆粒，其中蛋白共軛物與添加劑的顆?；旌?，或涂漬在添加劑的顆粒上。典型的添加劑包4舌單、二和多糖；糖醇及其它多元醇，例如，乳糖，葡糖，棉子糖，松三糖，乳糖醇，麥芽糖醇(maltitol),海藻糖，蔗糖，甘露糖醇，淀粉，或其組合；表面活化劑，例如山梨糖醇，二磷脂酰膽堿，或卵磷脂；等等。典型地，添加劑，例如填充劑，以對(duì)上述目的有效的數(shù)量提供，常常是制劑重量的大約50%至大約99%。對(duì)于蛋白制劑，例如胰島素類似物蛋白，本領(lǐng)域已知的其它試劑還可以包括在制劑中。蛋白溶液可以任選與適合于呼吸和肺部給藥的藥學(xué)載體或賦形劑混合。當(dāng)希望載體降低給予患者的粉末中的胰島素濃度時(shí)，這種載體可以簡單地以填充劑形式提供，但也可以用來增強(qiáng)胰島素組合物的穩(wěn)定性、提高粉末在粉末分散裝置內(nèi)的分散性，以便提供胰島素的更有效和可再現(xiàn)的遞送，改進(jìn)胰島素的處理特性，例如流動(dòng)性和黏稠度，<更于制備和裝填粉末。合適載體材料可以是非晶形粉末、晶體粉末或非晶形和晶體粉末的組合形式。合適物質(zhì)包括碳水化合物，例如單糖，例如果糖，半乳糖，葡糖，D-甘露糖，山梨糖，等等；二糖，例如乳糖，海藻糖，纖維二糖，等等；環(huán)糊精，例如2-羥基丙基-環(huán)糊精；和多糖，例如棉子糖，麥芽糖糊精，葡聚糖，等等；(b)氨基酸，例如甘氨酸，精氨酸，門冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，賴氨酸，等等；(c)用有機(jī)酸和堿制備的有機(jī)鹽，例如枸櫞酸鈉，抗壞血酸鈉，葡萄糖酸鎂，葡糖酸鈉，氨基丁三醇鹽酸鹽，等等；(d)肽和蛋白，例如阿斯巴甜，人血清白蛋白，凝膠，等等；(e)糖醇，例如甘露糖醇，木糖醇，等等。優(yōu)選的一組載體包括乳糖，海藻糖，棉子糖，麥芽糖糊精，甘氨酸，枸櫞酸鈉，氨基丁三醇鹽酸鹽，人血清白蛋白和甘露糖醇。這種載體物質(zhì)可以在噴霧干燥之前與胰島素混合，即，向準(zhǔn)備噴霧干燥的蛋白溶液或水溶液中加入載體。用這種方法，能夠與蛋白顆粒同時(shí)并且作為蛋白顆粒的一部分形成載體。典型地，當(dāng)載體通過與蛋白一起噴霧干燥形成時(shí)，蛋白存在于每個(gè)單個(gè)顆粒中，其重量百分?jǐn)?shù)在5%至95%的范圍，優(yōu)選20%至80%。顆粒的剩余部分主要是載體物質(zhì)(典型地是5%至95%重量，通常是20%至80%重量)，但也包括緩沖液，還可以包括如上所述的其它組分?；蛘撸梢元?dú)立地制備干粉形式的載體，并且通過共混而與干粉蛋白混合。獨(dú)立制備的粉末載體通常是晶體(避免吸水)，但在某些情況下可以是非晶形的或晶體和非晶體的混合物?？梢赃x擇載體顆粒的尺寸，以提高胰島素粉末的流動(dòng)性，典型地在25m至100m的范圍。在該尺寸范圍的載體顆粒通常不滲入到肺的蜂窩狀區(qū)域中，并且在吸入之前常常在遞送裝置中從胰島素中分離出來。由此，滲入肺的蜂窩狀區(qū)域的顆粒基本上由胰島素和緩沖劑組成。優(yōu)選的載體材料是具有上述范圍尺寸的晶體甘露糖醇。本發(fā)明的干燥胰島素粉末還可以與其它活性組分混合。例如，合乎需要的是，在胰島素粉末中混合少量的糊精或活性糊精類似物，以改善糖尿病的治療。糊精是在正常(非糖尿病患者)個(gè)體中由胰腺0-細(xì)胞胰島素分泌的激素。人們相信，糊精可調(diào)節(jié)胰島素體內(nèi)活性，并且認(rèn)為與胰島素一起給予糊精，可以改善血糖控制。在本發(fā)明的組合物中，干粉糊精與胰島素混合可提供用于這種同時(shí)給藥尤其方便的產(chǎn)品。糊精可以與胰島素混合，重量從0.1%至10%(基于劑量中的胰島素的總重量)，優(yōu)選從0.5%重量至2.5%重量。糊精可得自于商品供應(yīng)商，例如AmylinCorporation,SanDiego,California,并且可以容易地配制在本發(fā)明的組合物中。例如，糊^"可以與胰島素以及任選的載體一起溶于水溶液或其它合適溶液，并且將溶液噴霧干燥，產(chǎn)生粉末產(chǎn)品。包含本發(fā)明干燥蛋白的噴霧可以在壓力下強(qiáng)迫蛋白共軛物的懸浮液或溶液通過噴嘴來產(chǎn)生。可以選擇噴嘴尺寸和構(gòu)造、外加壓力和液體進(jìn)料速度，以獲得所需輸出量和粒徑。可以產(chǎn)生電噴霧，例如，通過電場(chǎng)與毛細(xì)管或噴嘴進(jìn)料結(jié)合。優(yōu)選，通過噴霧器遞送的胰島素共軛物的顆粒具有小于大約10)Lim的粒徑，例如在大約1fim至大約5nm的范圍內(nèi)。適合使用噴霧器的本發(fā)明的干燥蛋白的制劑，典型地包含在水溶液中的蛋白，其濃度為每ml溶液大約lmg至大約20mg蛋白共軛物。制劑可以包含試劑，例如賦形劑、緩沖劑、等滲試劑、防腐劑、表面活化劑，和例如鋅。制劑還可以包含賦形劑或用以穩(wěn)定晶體的試劑，例如緩沖劑、還原劑、原液(bulk)蛋白或碳水化合物。用于配制干燥蛋白共軛物的原液蛋白包括白蛋白、精蛋白等等。用于配制蛋白共軛物的典型碳水化合物包括蔗糖，甘露糖醇，乳糖，海藻糖，葡糖，等等。晶體制劑還可以包括表面活化劑，其可以降低或預(yù)防由氣溶膠形式溶液的霧化所引起的表面誘導(dǎo)的胰島素共軛物的聚集。可以使用各種常規(guī)表面活化18劑，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。數(shù)量通常介于制劑的大約0.001和大約4%重量的范圍之間。含有按照本發(fā)明的干燥蛋白的藥物組合物還可以鼻部施用。藥物組合物可以以液體組合物、干燥組合物或凝膠形式給藥。對(duì)于通過鼻子給藥，晶體可以超過10|um,以便保證沉積在鼻腔中，并且避免顆粒^皮進(jìn)一步攜帶到氣管支氣管和肺部區(qū)域。不太了解尺寸的上限，但可以這樣限制粒徑的上限超過該粒徑時(shí)，顆粒(因?yàn)樵S多原因)表明沒有效果，并且甚至可能導(dǎo)致局部刺激性。含有按照本發(fā)明的干燥蛋白的藥物組合物還可以胃腸外給予需要這種治療的患者。腸胃外給藥可以借助于注射器通過皮下、肌注或靜脈注射進(jìn)行，任選筆類注射器?；蛘撸c胃外給藥可以借助于輸液泵進(jìn)行。本發(fā)明干燥蛋白的注射組合物可以使用制藥工業(yè)的傳統(tǒng)方法制備，該方法涉及將組分溶解和混合(視情況而定)，得到目標(biāo)最終產(chǎn)物。由此，按照一個(gè)方法，將包含按照本發(fā)明胰島素的晶體溶于適量的水中，水的體積稍微少于所制備組合物的最終體積。根據(jù)需要，加入等滲試劑、防腐劑和緩沖劑，如果需要的話，4吏用酸例如鹽酸或石咸例如氳氧化鈉水溶液(按照需要)調(diào)節(jié)溶液的pH值。最后，用水調(diào)節(jié)溶液的體積，得到組分的目標(biāo)濃度。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，緩沖劑選自乙酸鈉，碳酸鈉，檸檬酸鹽，雙甘氨肽，組氨酸，甘氨酸，賴氨酸，精氨酸，磷酸二氳鈉，磷酸氫二鈉，磷酸鈉，和三(羥曱基)-甲胺，N-二羥乙基甘氨酸，麥黃酮(tricme),蘋果酸，琥珀酸鹽，馬來酸，富馬酸，酒石酸，門冬氨酸或其混合物。這些具體緩沖劑的每個(gè)構(gòu)成了本發(fā)明的替代性的方面。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，制劑進(jìn)一步包含可藥用防腐劑，防腐劑可以選自酚，鄰甲酚，間曱酚，對(duì)曱酚，對(duì)羥基苯甲酸甲酯，對(duì)羥基苯曱酸丙酯，2-苯氧乙醇，對(duì)羥基苯曱酸丁酯，2-苯基乙醇，苯甲醇，氯丁醇，和硫柳汞(thiomerosal),溴硝丙二醇，苯曱酸，咪唑啉基脲(imidurea),雙氯苯雙胍己烷，脫氪醋酸鈉，氯曱紛，對(duì)羥苯甲酸乙酯，千索氯銨，氯酚醚(chlorphenesme)(3p-氯苯氧基丙烷-l,2-二醇)或其混合物。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，防腐劑存在的濃度是O.lmg/ml至20mg/ml。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，防腐劑存在的濃度是0.1mg/ml至5mg/ml。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，防腐劑存在的濃度是5mg/ml至10mg/ml。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，防腐劑存在的濃度是10mg/ml至20mg/ml。這些具體防腐劑的每個(gè)構(gòu)成了本發(fā)明的替代性的方面。防腐劑在藥物組合物中的用途對(duì)于技術(shù)人員是眾所周知的。為方便起見，參考Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，制劑進(jìn)一步包含等滲試劑，其可以選自鹽(例如氯化鈉)，糖或糖醇，氨基酸(例如甘氨酸，L-組氨酸，精氨酸，賴氨酸，異亮氨酸，門冬氨酸，色氨酸，蘇氨酸)，糖醇(alditol)(例如丙三醇(甘油)，1,2-丙二醇(丙二醇)，1,3-丙二醇，1,3-丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400),或其混合物?？梢?吏用任4可糖，例如單、二或多糖，或水溶性的葡聚糖，包括例如果糖，葡糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麥芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，葡聚糖，支鏈淀并分，糊精，環(huán)糊精，可溶性淀粉，羥乙基淀粉和羧甲纖維素鈉。在一方面，糖添加劑是蔗糖。將糖醇定義為具有至少一個(gè)-OH基團(tuán)的C4-C8烴，并且包括，例如，甘露糖醇，山梨糖醇，肌醇，半乳糖醇，衛(wèi)矛醇，木糖醇和阿糖醇。在一方面，糖醇添加劑是甘露糖醇。上述的糖或糖醇可以單獨(dú)或組合使用。對(duì)使用數(shù)量沒有固定限制，只要糖或糖醇可溶于液體藥劑并且不會(huì)不利地影響使用本發(fā)明方法所獲得的穩(wěn)定效果即可。在一方面，糖或糖醇濃度在大約lmg/ml和大約150mg/ml之間。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，等滲試劑存在的濃度是1mg/ml至50mg/ml。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，等滲試劑存在的濃度是lmg/ml至7mg/ml。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，等滲試劑存在的濃度是8mg/ml至24mg/ml。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，等滲試劑存在的濃度是25mg/ml至50mg/ml。這些具體等滲試劑的每個(gè)構(gòu)成了本發(fā)明的替代性的方面。等滲試劑在藥物組合物中的用途對(duì)于技術(shù)人員是眾所周知的。為方便起見，參考Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。典型的等滲試劑是氯化鈉，甘露糖醇，二曱砜和丙三醇，典型的防腐劑是酚，間甲酚，對(duì)羥基苯曱酸曱酯和苯甲醇。合適緩沖劑的例子是乙酸鈉，雙甘氨肽，HEPES(4-(2-羥乙基)-l-p底。秦乙石黃酸)和石壽酸鈉。含有本發(fā)明干燥蛋白(例如胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素)的組合物可以用于治療對(duì)胰島素壽丈感的狀況。由此，它們可以用于治療I型、II型糖尿病和高血糖癥，例如在受到嚴(yán)重傷害的人和進(jìn)行大手術(shù)的人中有時(shí)所看到的癥狀。對(duì)于任何患者，最佳劑量水平取決于各種因素，包括所使用的具體胰島素的效果，患者的年齡、體重、實(shí)際活動(dòng)和飲食，取決于與其它藥物的合適組合，和取決于所治療狀況的嚴(yán)重程度。推薦的是，對(duì)于每個(gè)個(gè)體患者，由本領(lǐng)域技術(shù)人員按照與已知藥物組合物類似的方法來確定本發(fā)明的干燥蛋白的日劑量。在適宜的情況下，本發(fā)明的干燥蛋白可以與具有更速效作用的其它類型蛋白例如胰島素類似物混合使用。這種胰島素類似物的例子描述在例如下列中歐洲專利申請(qǐng)(具有公開號(hào)EP214826(NovoNordiskA/S)，EP375437(NovoNordiskA/S)和EP383472(EliLilly&Co.))。將本文中引用的所有參考文獻(xiàn)(包括出版物，專利申請(qǐng)和專利)以其整體引入本文作為參考，其程度如同每個(gè)參考文獻(xiàn)是單獨(dú)和具體地注明引入作為參考那樣，并且本文以其整體列出(法律所允許的最大程度)。只為方便起見，本文使用所有標(biāo)題和副標(biāo)題，并且不應(yīng)該將其理解為以任何方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。本文提供使用的任何和所有實(shí)施例或示范性術(shù)語(例如，"例如")僅僅是為了更好地說明本發(fā)明，不造成對(duì)本發(fā)明范圍的限制，除非另外要求。在說明書中沒有任何文辭應(yīng)被視為指示對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐是必需的、非權(quán)利要求的要素。本文專利文件的引用和引入只是為了方便，不反映這種專利文件的有效性、專利性和/或可實(shí)施性的任何觀點(diǎn)。本發(fā)明包括本文所附加權(quán)利要求中所列舉主題的適用的法律所允許的所有變體和等效內(nèi)容。下面的段落概括了本發(fā)明1.干燥蛋白溶液的方法，其中a)如下獲得蛋白溶液將蛋白與水混合，任選包含賦形劑，用揮發(fā)堿、不揮發(fā)的堿和任選不揮發(fā)的酸調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值，使其成為堿性，和b)將蛋白溶液干燥2.按照段落1的方法，包括a)選擇干燥蛋白的目標(biāo)pH值，b)選擇蛋白溶液的目標(biāo)pH值，c)提供水相，d)加入蛋白，e)4壬選加入l武形劑，f)用不揮發(fā)的堿和任選不揮發(fā)的酸將pH值調(diào)節(jié)至干燥蛋白的目標(biāo)pH值，g)用揮發(fā)的堿將pH值調(diào)節(jié)至所要干燥的蛋白溶液的目標(biāo)pH值，和h)將蛋白溶液噴霧干燥。其中步驟d、e、f和g可以以任何順序進(jìn)行，同時(shí)連續(xù)攪拌。3.按照段落2的方法，其中步驟d、e和f可以以任何順序進(jìn)行，同時(shí)連續(xù)攪拌。4.按照段落l-3的方法，其中蛋白溶液是在低于8。C的溫度下獲得的。5.按照段落l-4的方法，其中蛋白溶液是在低于6'C、低于5i:、低于4。C、低于3。C、低于2。C或低于1。C的溫度下獲得的。6.按照段落l-5的方法，其中抑制水相的水點(diǎn)，蛋白溶液是在低于0。C的溫度下獲得的。7.按照段落l-6的方法，其中干燥法選自噴霧干燥、噴霧冷凍干燥、流化床干燥、冷凍干燥和真空干燥。8.按照段落l-7的方法，其中蛋白溶液具有高于7.4的pH值。9.按照l殳落l-8的方法，其中蛋白溶液具有高于7.6、高于7.8、高于8.0、高于8.2、高于8.4或高于8.6的pH值。10.按照段落l-8的方法，其中蛋白溶液具有在7.4和11.0之間的pH值。11.按照段落1-8和10的方法，其中蛋白溶液具有在大約7.6和大約ll.O之間、在大約7.6和大約10.5之間、在大約7.8和大約11.0之間、在大約7.8和大約10.5之間、在大約8.0和大約11.0之間、在大約8.0和大約10.5之間、在大約8.2和大約11.0之間、在大約8.4和大約11.0之間、在大約8.6和大約10.0之間、在大約8.8和大約10.0之間、在大約9.0和大約10.0之間或在大約9.2和大約10.0之間的pH值。12.按照段落l-ll的方法，其中不揮發(fā)堿選自堿金屬鹽、堿金屬氫氧化物、堿土金屬鹽、堿土金屬氬氧化物和氨基酸或其組合。2213.按照段落12的方法，其中不揮發(fā)堿是氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化釣、氧化釣或其任一組合。14.按照段落1-13的方法，其中揮發(fā)堿選自氫氧化銨，四烷基氫氧化銨，仲胺，叔胺，芳基胺，脂肪族胺或碳酸氬銨或其組合。15.按照段落14的方法，其中揮發(fā)堿是氫氧化銨、乙基胺或甲胺或其組合。16.按照段落1-15的方法，其中揮發(fā)堿調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值，調(diào)節(jié)至少0.5個(gè)pH單位。17.按照段落1-16的方法，其中揮發(fā)堿調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值，調(diào)節(jié)至少0.7個(gè)pH單位，或至少0.9個(gè)pH單位或至少l.l個(gè)pH單位，或至少1.3個(gè)pH單位或至少1.5個(gè)pH單位。18.按照段落1-17的方法，其中用包含氫氧化鈉和氫氧化4妄的溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值。19.按照段落1-18的方法，其中蛋白選自胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物和GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一組合。20.按照段落1-19的方法，其中蛋白溶液包含選自下列的蛋白胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，并且溶液進(jìn)一步包含鋅。21.按照,殳落20的方法，其中蛋白溶液包含酚。22.按照段落20-21的方法，其中在蛋白溶液中，每摩爾蛋白包含大約4摩爾S^。23.按照段落l-22的方法，其中蛋白溶液包含緩沖劑，清洗劑，穩(wěn)定劑，蛋白酶抑制劑，調(diào)口未劑，載體，吸收促進(jìn)劑(absorptionprotactingagent),填充劑或改善流動(dòng)特性的試劑或滲透增強(qiáng)劑或其組合。24.按照段落23的方法，其中蛋白溶液包含雙甘氨肽。25.按照段落l-24的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值。26.按照段落25的方法，其中蛋白溶液的pH值至少高于干燥蛋白的pH值0.5個(gè)pH單位。27.按照段落l-26的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值，高出至少0.7、至少0.9、至少l.l、至少1.3或至少1.5個(gè)pH單位。28.按照段落l-27的方法，其中干燥蛋白的pH值在大約6.0和大約8.5之間。29.按照段落l-28的方法，其中干燥蛋白的pH值在大約6.2和大約8.4之間，在大約6.4和大約8.3之間，在大約6.6和大約8.2之間，在大約6.8和大約8.1之間，在大約7.0和大約8.0之間，在大約7.2和大約7.9之間，在大約7.4和大約7.8之間或在大約7.6和大約7.7之間。30.按照段落l-29的方法，其中將蛋白溶液干燥，達(dá)到噴霧干燥蛋白的水含量低于大約10%、低于大約6%、低于大約4%、低于大約2%或低于大約1%。31.按照段落l-30的方法，其中蛋白是胰島素類似物，選自AspB28人胰島素；LysB28ProB29人胰島素和LysB3GluB29人胰島素。32.由段落1-31的方法得到的干燥蛋白。33.藥物組合物，其包含治療有效量的按照段落32的噴霧干燥蛋白。34.按照段落33的藥物組合物，其中組合物用于糖尿病或高血糖癥的肺部、腸胃外、鼻部或口^^'臺(tái)療。35.藥物組合物，其在需要治療的患者中用于糖尿病或高血糖癥的治療，其包含治療有效量的按照段落32的干燥蛋白，其中蛋白選自胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一組合。36.在需要治療的患者中治療糖尿病的方法，包括給予患者治療有效量的按照段落32的干燥蛋白或按照段落33-35的任一項(xiàng)的藥物組合物。37.按照段落36的方法，其中蛋白選自胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一組合。38.實(shí)施例中描述的干燥蛋白。la.干燥蛋白溶液的方法，其中a)如下獲得蛋白溶液將蛋白與水混合，任選包含賦形劑，調(diào)節(jié)pH值，使其成為堿性，和b)將蛋白溶液干燥2a.用蛋白溶液制備干燥蛋白的方法，包括a)選擇干燥蛋白的目標(biāo)pH值，b)選擇蛋白溶液的目標(biāo)pH值，C)提供水相，d)加入蛋白，e)^壬選加入l武形劑，f)用不揮發(fā)的堿將pH值調(diào)節(jié)至干燥蛋白的目標(biāo)pH值，g)用揮發(fā)的堿將pH值調(diào)節(jié)至所要干燥的蛋白溶液的目標(biāo)pH值,和h)將蛋白溶液噴霧干燥。其中步驟d、e、f和g可以以任何順序進(jìn)行，同時(shí)連續(xù)攪拌。3a.按照段落la的方法，其中蛋白溶液是用揮發(fā)性堿和不揮發(fā)性堿調(diào)節(jié)的。4a.按照段落la-3a的方法，其中蛋白溶液是在低于8。C的溫度下獲得的。5a.按照段落la-4a的方法，其中蛋白溶液是在低于6。C、低于5。C、低于4。C、低于3。C、低于2。c或低于rc的溫度下獲得的。6a.按照段落la-5a的方法，其中抑制水相的冰點(diǎn)，且蛋白溶液是在低于0。C的溫度下獲得的。7a.按照段落la-6a的方法，其中干燥法選自噴霧干燥、噴霧冷凍干燥、流化床干燥、冷凍干燥和真空干燥。8a.按照段落la-7a的方法，其中蛋白溶液具有高于7.4的pH值。9a.按照段落la-8a的方法，其中蛋白溶液具有高于7.6、高于7.8、高于8.0、高于8.2、高于8.4或高于8.6的pH值。10a.按照段落la-8a的方法，其中蛋白溶液具有在7.4和11.0之間的pH值。lla.按照段落la-8a和10a的方法，其中蛋白溶液具有在大約7.6和大約11.0之間、在大約7.6和大約10.5之間、在大約7.8和大約11.0之間、在大約7.8和大約10.5之間、在大約8.0和大約11.0之間、在大約8.0和大約10.5之間、在大約8.2和大約11.0之間、在大約8.4和大約11.0之間、在大約8.6和大約10.0之間、在大約8.8和大約10.0之間、在大約9.0和大約10.0之間或在大約9.2和大約10.0之間的pH值。12a.按照段落la-lla的方法，其中不揮發(fā)性堿選自堿金屬鹽、堿金屬氫氧化物、堿土金屬鹽、堿土金屬氳氧化物和氨基酸或其組合。2513a.按照段落12a的方法，其中不揮發(fā)性堿是氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氧化鈣或其任一組合。14a.按照段落la-lla的方法，其中揮發(fā)性堿選自氬氧化銨，四烷基氬氧化銨，仲胺，叔胺，芳基胺，脂肪族胺或碳酸氫銨或其組合。15a.按照段落14a的方法，其中揮發(fā)性堿是氬氧化銨、乙基胺或甲胺或其組合。16a.按照段落la-15a的方法，其中揮發(fā)性堿調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值，調(diào)節(jié)至少0.5個(gè)pH單位。17a.按照段落la-16a的方法，其中揮發(fā)性堿調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值，調(diào)節(jié)至少0.7個(gè)pH單位，或至少0.9個(gè)pH單位或至少l.l個(gè)pH單位，或至少1.3個(gè)pH單位或至少1.5個(gè)pH單位。18a.按照段落la-17a的方法，其中用包含氫氧化鈉和氳氧化銨的溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值。19a.按照段落la-18a的方法，其中蛋白溶液包含酚。20a.按照段落la-19a的方法，其中蛋白選自胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，exendm，exendin類似物和衍生物和/或其任一組合。21a.按照段落la-20a的方法，其中蛋白選自糊精，糊精類似物，糊精書f生物，a-MSH,a-MSH類似物，a-MSH書f生物和/或其任一組合。22a.按照段落la-20a的方法，其中蛋白溶液包含選自下列的蛋白胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，并且溶液進(jìn)一步包含鋅。23a.按照段落la-22a的方法，其中蛋白溶液包含緩沖劑，清洗劑，穩(wěn)定劑，蛋白酶抑制劑，調(diào)味劑，載體，吸收促進(jìn)劑，填充劑或改善流動(dòng)特性的試劑或滲透增強(qiáng)劑或其組合。24a.按照段落23a的方法，其中蛋白溶液包含雙甘氨肽。25a.按照段落la-24a的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值。26a.按照段落25a的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值至少0.5個(gè)pH單位。27a.按照段落la-26a的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值，高出至少0.7、至少0.9、至少l.l、至少1.3或至少1.5個(gè)pH單位。28a.按照段落la-27a的方法，其中干燥蛋白的pH值在大約6.0和大約8.5之間。29a.按照段落la-28a的方法，其中干燥蛋白的pH值在大約6.2和大約8.4之間，在大約6.4和大約8.3之間，在大約6.6和大約8.2之間，在大約6.8和大約8.1之間，在大約7.0和大約8.0之間，在大約7.2和大約7.9之間，在大約7.4和大約7.8之間或在大約7.6和大約7.7之間。30a.按照段落la-29a的方法，其中將蛋白溶液干燥，達(dá)到噴霧干燥蛋白的水含量低于大約10%、低于大約6%、低于大約4%、低于大約2%或低于大約1%。31a.按照段落la-30a的方法，其中蛋白是胰島素類似物，選自AspB28人胰島素；LysB28ProB29人胰島素和LysB3GluB29人胰島素。32a.由段落la-31a的方法得到的干燥蛋白。33a.藥物組合物，其包含治療有效量的按照段落32a的噴霧干燥的蛋白。34a.按照段落33a的藥物組合物，其中組合物用于糖尿病或高血糖癥的肺部、腸胃外、鼻部或口服治療。35a.藥物組合物，其用于需要治療的患者中的糖尿病或高血糖癥的治療，其包含治療有效量的按照段落32a的干燥蛋白，其中蛋白選自胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-1，GLP-1類似物，GLP-1書亍生物，exendm,exendm類似物和書f生物和/或其4壬一組合。36a.在需要治療的患者中治療糖尿病的方法，包括給予患者治療有效量的按照段落32a的干燥蛋白或按照段落33a-35a的任一項(xiàng)的藥物纟且合物。37a.按照段落36a的方法，其中蛋白選自胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-1,GLP-1類似物，GLP-1衍生物，exendm,exendin類似物和纟汁生物和/或其4壬一組合。38a.實(shí)施例中描述的干燥蛋白。分析方法基于Ph.Eur方法，利用等度篩析色i普法測(cè)定HMWP含量。使用WatersInsulinHMWP7，8x300mm柱，流動(dòng)相由65%1.0mg/mlL-精氨酸溶液、20%乙腈和15%水醋酸組成，流速0.5ml/mm。注射體積是100pl。柱溫是環(huán)境溫度。檢測(cè)是利用紫外線吸收(在276nm)進(jìn)行的。對(duì)色譜峰面積以總峰面積為基礎(chǔ)進(jìn)行分析。純度是用反相層析方法測(cè)定的，使用WatersSunfireCl8,3.5|um,150x4.6mmi.d.柱。柱溫是35。C,流速是1ml/min。使用梯度系統(tǒng)，流動(dòng)相A含有1.4%(w/w)硫酸鈉、0.2%(w/w)o-磷酸、7.7%(w/w)乙腈，pH值3.6，流動(dòng)相B含有42.8%(w/w)乙腈/水。梯度系統(tǒng)開始以大約42%流動(dòng)相B等度洗脫30分鐘。然后用3分鐘從42%至80%線性增加流動(dòng)相B,而后保持等度洗脫2分鐘。然后初始條件返回到42%流動(dòng)相B,用1分鐘，保持20分鐘。用紫外線吸收(在214nm處)進(jìn)行才企測(cè)。注射體積是10nl。對(duì)色譜峰面積以總峰面積為基礎(chǔ)進(jìn)行分析。該方法檢測(cè)了胰島素相關(guān)的雜質(zhì)，包括胰島素的脫酰氨形式，并且以胰島素相關(guān)雜質(zhì)的形式進(jìn)行報(bào)道。使用激光衍射裝置，以濕才莫式操作Mastersizer(MalvernInstruments,UnitedKingdom)，測(cè)定噴霧干燥粉末的體積粒徑分布。該裝置安裝有濕式分散系統(tǒng)(MalvernQSSmallVolumeSampleDispersionUnit),其中樣吏粒懸浮在含有大約0.05。/。Tween80的異丙醇中。然后測(cè)定樣品，并且基于分散數(shù)據(jù)，使用Malvern軟件計(jì)算粒徑分布。體積中間粒徑D[v,0.5]是在分布狀態(tài)為50%超過和50%低于該值的情況下的直徑。使用model3321AerodynamicParticleSizer(APS)光i普儀(結(jié)合TSI)(其是基于粒子篩選儀器的激光，基于顆粒在流速加速型噴管下游的即時(shí)速率來測(cè)定單個(gè)顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)直徑)，測(cè)定噴霧干粉的空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布。用小型粉末分散器model3433(結(jié)合TSI)將粉末霧化。由這些測(cè)定，以接近實(shí)時(shí)的方式測(cè)定粒徑分布。質(zhì)量中位數(shù)氣動(dòng)粒徑(MMAD)是在分布狀態(tài)為50%超過和50%<氐于此值的情況下的空氣動(dòng)力學(xué)直徑。使用PerkmElmerPyrisTGA1熱重分析儀，通過在ll(TC干燥(最少3小時(shí))后的失重，測(cè)定噴霧干粉的殘留含水量。記錄由水分損失所引起的重量改變，用重量百分?jǐn)?shù)表示。實(shí)施例實(shí)施例l溶解人胰島素(在pH9.5條件下)將10.0g人胰島素分散在387.3g水冷水中。將分散體放置在水浴上，測(cè)定的pH值是pH5.03。然后逐步加入冰冷的0.2N氫氧化鈉，直到pH8.99為止。45分鐘之后，pH值降低至8.77,在接下來4小時(shí)中，加入0.2N氬氧化鈉，直到pH8.75為止。溶液還不清澈，將其放置在;水箱中過夜。第二天，測(cè)定pH值是8.75,溶液還不清澈。用水冷的0.2N氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至9.48,然后將不清澈的溶液放入冰箱中5天。5天之后，溶液變清澈，用0.2N氯化氬將pH值從9.37調(diào)節(jié)到7.59。實(shí)施例2A)噴霧干燥含有揮發(fā)性堿的蛋白溶液，和B)測(cè)定噴霧干燥蛋白的pH值將9.5g人胰島素分散在200g水冷水中。將懸浮液放置在冰浴上，測(cè)定的初始pH值是pH5.12。用5.8g冰冷的0.2N氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.04。將溶液保持在水浴上另外2小時(shí)，而后加入軟化水，至240g的總重量。將50gpH7.04的溶液進(jìn)一步處理。用水冷INNH4OH將pH值/人7.04調(diào)節(jié)至7.50,然后放入冰箱中過夜。第二天，測(cè)定pH值是7.32,并用水冷的1NNH40H將pH值調(diào)節(jié)至pH8.06。然后加入水，至多60.0g。人胰島素的最后濃度是大約30mg/ml。在配備0.7mm并流兩流體噴嘴的BiichiB-290小型噴霧干燥器(Biichi，LabortechmkAGFlawil,Switzerland)上制備干燥固體微粒。將人胰島素溶液噴霧到在干燥室中的熱空氣流中，液體進(jìn)料速度2ml/min,霧化氣流600-800升/小時(shí)。干燥空氣具有150。C的入口溫度，和35mV小時(shí)的干燥空氣流速。出口溫度大約70。C。用連接干燥室的旋流分離器收集固體微粒，而后集聚，并在干燥條件下保存。將噴霧干燥的人胰島素(在噴霧干燥之前，蛋白溶液pH值是8.06)重新溶于軟化水中，濃度為40mg/mL、80mg/mL和160mg/mL,研究是否不同的濃度對(duì)測(cè)定的pH值有影響測(cè)定的pH值是6.9543.5mg加入545fiL水測(cè)定的pH值是6.9581.7mg加入510iuL水測(cè)定的pH值是7.01實(shí)施例3噴霧干燥用各種比例的揮發(fā)性和非揮發(fā)性堿溶解的胰島素阿速帕(aspart)(628~人胰島素)。在噴霧干燥之前，在有和沒有穩(wěn)定賦形劑的條件下，制備各種胰島素阿速帕(aspart)溶液制備A溶液A1:在水浴上，將16g胰島素阿速帕(aspart)懸浮在l50ml水中。然后，逐步加入2.6ml冰冷的濃氨水(25%w/w),直到pH值是7.53并且得到澄清溶液為止。最后，加入水，至200ml的總體積。胰島素阿速帕(aspart)的濃度是80mg/ml。溶液A2:將65ml溶液Al進(jìn)一步稀釋至130ml。胰島素阿速帕(aspart)的濃度是40mg/ml。制備B溶液B1:在水浴上，將16g胰島素阿速帕(aspart)懸浮在150ml水中。開始，逐步加入2.2ml冰冷的lNNaOH,而后加入750pl冰冷的濃氨水(25。/。w/w),直到pH值是7.52并且得到澄清溶液為止。最后，加入水，至200ml的總體積。胰島素阿速帕(aspart)的濃度是80mg/ml。溶液B2:將65ml溶液Bl進(jìn)一步稀釋至130ml。胰島素阿速帕(aspart)的濃度是40mg/ml。制備C溶液C1:在水浴上，將16g胰島素阿速帕(aspart)懸浮在150ml水中。開始，加入4.4ml水冷的lNNaOH,而后逐步加入750iil水冷的濃氨水(25。/。w/w),直到pH值是7.48并且得到澄清溶液為止。最后，加入水，至200ml的總體積。胰島素阿速帕(aspart)的濃度是80mg/ml。溶液C2:將65ml溶液Cl進(jìn)一步稀釋至130ml。胰島素阿速帕30(aspart)的濃度是40mg/ml。制備D溶液D1:在水浴上，將16g胰島素阿速帕(aspart)懸浮在150ml水中。開始，加入6.6ml水冷的lNNaOH,而后逐步加入370iul水冷的濃氨水(25。/ow/w),直到pH值是7.47并且得到澄清溶液為止。最后，加入水，至200ml的總體積。胰島素阿速帕(aspart)的濃度是80mg/ml。溶液D2:將65ml溶液Dl進(jìn)一步稀釋至130ml。胰島素阿速帕(aspart)的濃度是40mg/ml。制備E溶液E1:在水浴上，將16g胰島素阿速帕(aspart)懸浮在l50ml水中。開始，加入6.6ml水冷的lNNaOH，而后逐步加入370iul冰冷的濃氨水(25Q/。w/w),直到pH值是7.47并且得到澄清溶液為止。最后，加入水，至200ml的總體積。胰島素阿速帕(aspart)的濃度是80mg/ml。溶液E2:將65ml溶液El進(jìn)一步稀釋至130ml。胰島素阿速帕(aspart)的濃度是40mg/ml。制備F在冰浴上，將1.8g胰島素阿速帕(aspart)懸浮在40ml水中。開始，逐步加入175iul水冷的濃氨水(25%w/w),直到pH值是7.83為止。將l.lml0.1MZnCh溶液和3.6ml0.32M酚溶液進(jìn)一步加入到溶液中。最后，用85)Lil稀氨水(8%w/w)將pH值調(diào)節(jié)至7.99,加入水，至60ml的總體積。溶液是清澈的，胰島素阿速帕(aspart)的濃度是30mg/ml。制備G在冰浴上，將1.8g胰島素阿速帕(aspart)懸浮在40ml水中。開始，加入288(al水冷的lNNaOH,而后逐步加入120pl冰冷的濃氨水(25%w/w),直到pH值是7.86為止。將l.lml0.1MZnCl2溶液和3.6ml0.32M酚溶液進(jìn)一步加入到溶液中。最后，用80iul稀氨水(8%w/w)將pH值調(diào)節(jié)至8.03，加入水，至60ml的總體積。溶液是清澈的，胰島素阿速帕(aspart)的濃度是30mg/ml。制備H在冰浴上，將1.8g胰島素阿速帕(aspart)懸浮在40ml水中。開始，加入864]Lil水冷的lNNaOH,而后逐步加入50iul水冷的濃氨水(25%w/w),直到pH值是7.85為止。將1.1ml0.1MZnCl2溶液和3.6ml0.32M酚溶液進(jìn)一步加入到溶液中。最后，用60iul稀氨水(8%w/w)將pH值調(diào)節(jié)至7.98,加入水，至60ml的總體積。溶液是清澈的，胰島素阿速帕(aspart)的濃度是30mg/ml。制備I在水浴上，將1.8g胰島素阿速帕(aspart)懸浮在40ml水中。開始，逐步加入150iul冰冷的濃氨水(25%w/w)，直到pH值是7.99為止。將4.6ml0.25M雙甘氨肽溶液、1.1ml0.1MZnCl2溶液和3.6ml0.32M酚溶液進(jìn)一步加入到溶液中。最后，用245iul稀氨水(8%w/w)將pH值調(diào)節(jié)至7.98,加入水，至60ml的總體積。溶液是清澈的，胰島素阿速帕(aspart)的濃度是30mg/ml。制備J在水浴上，將1.8g胰島素阿速帕(aspart)懸浮在40ml水中。開始，加入288pl冰冷的lNNaOH,而后逐步加入125inl;水冷的濃氨水(25%w/w),直到pH值是8.18為止。將4.6ml0.25M雙甘氨肽溶液、1.1ml0.1MZnCl2溶液和3.6ml0.32M酚溶液進(jìn)一步加入到溶液中。最后，用125iil稀氨水(8%w/w)將pH值調(diào)節(jié)至7.98，加入水，至60ml的總體積。溶液是清澈的，胰島素阿速帕(aspart)的濃度是30mg/ml。制備K在冰浴上，將1.8g胰島素阿速帕(aspart)懸浮在40ml水中。開始，加入288pl水冷的lNNaOH,而后逐步加入125pl水冷的濃氨水(25%w/w),直到pH值是7.93為止。將l.lml0.1MZnCl2溶液和1.9ml0.32M酚溶液進(jìn)一步加入到溶液中。最后，用40iul稀氨水(8%w/w)將pH值調(diào)節(jié)至7.98,加入水，至60ml的總體積。溶液是清澈的，胰島素阿速帕(aspart)的濃度是30mg/ml。在配備0.7mm并流兩流體噴嘴的BiichiB-290小型噴霧干燥器(Biichi,LabortechnikAGFlawil,Switzerland)上制備干燥固體微粒。將液體原泮+(制備A1，A2,Bl,B2,CI,C2,Dl,D2，El，E2,F,G,H,I,J和K)噴霧到在干燥室中的熱空氣流中，液體進(jìn)料速度2ml/min,霧化氣流600-800升/小時(shí)。干燥空氣具有15(TC的入口溫度，和35mV小時(shí)的干燥空氣流速。出口溫度在41和6rc之間變化。用連接干燥室的旋流分離器收集固體微粒，而后集聚，并在干燥條件下保存。按照Hvass,2003，(A.Hvass,M.Hach，和M.U.Jars.ComplementaryanalyticalHPLCmethodsforinsulin-relateddegradationproducts.AmericanBiotechnologyLaboratory21(2):8-12,2003)中描述的方法，在40。C儲(chǔ)存1個(gè)月之后，用HPLC分析來研究胰島素化學(xué)不穩(wěn)定性。利用排阻(SE)色鐠分析共價(jià)結(jié)合的二聚物和高分子聚合物(HMWP)。使用反相(RP)色譜(pH3.6)(梯度洗脫)分離降解產(chǎn)物(胰島素的脫酰氨形式及其它胰島素相關(guān)雜質(zhì))。使用PerkmElmerPynsTGA1熱重分析儀，通過在ll(TC干燥(最少3小時(shí))后的失重，測(cè)定干燥微粒的水分含量。記錄由水分損失所引起的重量改變，用重量百分?jǐn)?shù)表示。AerodynamicParticleSizer⑧光語儀(APS)用于測(cè)定粒徑分布(質(zhì)量中位數(shù)氣動(dòng)粒徑)。如下測(cè)定噴霧干燥胰島素的pH值將噴霧干粉溶解在軟化水中，濃度大約為40mg/ml,用電位計(jì)(Radiometer,Denmark)測(cè)定pH值。由噴霧干燥制品A-K的特征產(chǎn)生的結(jié)果列于表1中。表l.噴霧干燥的胰島素阿速帕(aspart)粉末水分溶液pH噴霧千燥MMADA)胰島素阿速帕HMWPC)(%)(%)胰島素的p她((jm)(aspart)相關(guān)雜質(zhì)B)(%)A15.67.55.352.71.10.43A26.67.56.033.31.40.45B16.37.56.043.01.12.17B27.07.56.174.81.3075C16.77.56.273.30.80.63C27.17.56.444.01.40.67D15.97.56.663.30.30.26D25.87.56.893.91.02.87E16.67.57.433.20.40.22E25.27.57.433.90.70.31F6.98.04.912.62.00.35G9.38.05.162.61.90.51H9.68.06.332.81.40.35I7.28.05.042.72.30.308.28.05.792.81.90.24K8.98.05.372.71.80.47A)MMAD是用APS測(cè)定的質(zhì)量中位數(shù)氣動(dòng)粒徑B)在40。C儲(chǔ)存1個(gè)月之后形成的胰島素阿速帕(aspart)相關(guān)雜質(zhì)，用RP-HPLC測(cè)定(包括胰島素阿速帕(aspart)的脫酰氨及其它降解形式)C)在40。C儲(chǔ)存1個(gè)月之后形成的高分子聚合物，用SE-HPLC測(cè)定實(shí)施例4胰島素阿速帕(aspart)的噴霧千燥將361.8g胰島素阿速帕(aspart)分散在4.5升水冷的軟化水中。用水冷的0.2NaOH將pH值調(diào)節(jié)至7.68。然后加入水，至多達(dá)9升。胰島素阿速帕(aspart)的最后濃度是37g/1。通過無菌濾過器(0.2)過濾溶液，而后噴霧干燥。在試'驗(yàn)規(guī)才莫噴霧干燥器(modelMobileMinor,Niro,Denmark)(帶有l(wèi).Omm孔徑的兩流體噴嘴)上進(jìn)行胰島素阿速帕(aspart)溶液的噴霧干燥。使用氮?dú)庾鳛楦稍餁怏w和作為霧化氣體。34入口和出口溫度分別是110和62。C。原料流速大約是1kg/h，氣體/原料比大約是11。噴霧干燥器安裝有旋流分離器和袋式過濾器。在噴霧干燥期間，同時(shí)從旋流分離器和袋式過濾器收集粉末。用激光衍射(Mastersizer,Malvern)和氣動(dòng)粒子篩選光i普(APS)分析粒徑分布。在40。C儲(chǔ)存1個(gè)月之后，用實(shí)施例2中描述的SE或RP-HPLC研究噴霧干燥的胰島素阿速帕(aspart)的化學(xué)完整性。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>A)D50是用激光衍射測(cè)定的體積中間粒徑B)MMAD是用APS測(cè)定的質(zhì)量中位數(shù)氣動(dòng)粒徑實(shí)施例5具有各種pH值的冷凍干燥胰島素阿速帕(aspart)干粉的儲(chǔ)存穩(wěn)定性將0.806g胰島素阿速帕(aspart)分散在10ml冰冷的水中。將懸浮液放置在水浴上，測(cè)定的初始pH值是pH4.58。用水冷的0.2N氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.39，因此將胰島素阿速帕(aspart)溶解。加入軟化水，至20.4g的總重量。將溶解的胰島素阿速帕(aspart)分成6個(gè)2.5ml等分樣品，將它們分別調(diào)節(jié)至pH7.0、7.7、8.0、8.5、9.0和9.5。加入軟化水，至3.06g的總重量。用0.9ml的等分樣品(在小玻璃管中)，使用標(biāo)準(zhǔn)冷凍干燥程序，將胰島素阿速帕(aspart)溶液在ChristAlpha2-4LSC(ChristAlpha,Germany)裝置中冷凍干燥。如下測(cè)定冷凍干燥胰島素阿速帕(aspart)粉末的pH值將0.5ml軟化水加入到大約33mg胰島素阿速帕(aspart)粉末中，而后(15分鐘之后)用配備pH電極的電位計(jì)測(cè)定pH值。在4(TC干燥(在硅膠上)儲(chǔ)存2周之后(相對(duì)于在-18。C的對(duì)照物)，用實(shí)施例2中描述的SE-HPLC研究噴霧干燥胰島素阿速帕(aspart)的化學(xué)完整性。表3.冷凍干燥的胰島素阿速帕(aspart)粉末溶液pH值冷凍干燥胰島素的pH值HMWPA)(%)7.06.690.207.77.580.178.07.830.118.58.420.079.08.810.109.59.270.10A)在40。C儲(chǔ)存2周之后形成的高分子量二聚物和聚合物，用SE-HPLC測(cè)定實(shí)施例6具有各種pH值的噴霧干燥胰島素阿速帕(aspart)干粉的儲(chǔ)存穩(wěn)定性將20.6g胰島素阿速帕(aspart)分散在300ml水冷的水中。將懸浮液放置在冰浴上，測(cè)定的初始pH值是pH4.63。用100ml冰冷的0.1N氳氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.50,因此將胰島素阿速帕(aspart)溶解。將溶解的胰島素阿速帕(aspart)分成6個(gè)65g等分樣品，將它們用冰冷的0.1NNaOH分別調(diào)節(jié)至pH7.0、7.7、8.0、8.5、9.0和9.5。將軟化水加入到每個(gè)等分樣品中，至80.0g的總重量。胰島素阿速帕(aspart)的濃度大約是38mg/ml。在配備0.7mm并流兩流體噴嘴的BiichiB-290小型噴霧干燥器(Biichi，LabortechnikAGFlawil,Switzerland)上制備干燥固體微粒。將液體原料(80ml)噴霧到在干燥室中的熱空氣流中，液體原料速率是2ml/min，霧化氣流是600-800升/小時(shí)。干燥空氣具有15(TC的入口溫度，干燥空氣流速是35mV小時(shí)。出口溫度在49和61。C之間變化。用連接干燥室的旋流分離器收集固體微粒，而后集聚并保存在干燥條件下。如下測(cè)定噴霧干燥胰島素阿速帕(aspart)的pH值將噴霧干粉溶解在軟化水中，至70-80mg/ml的濃度，用電位計(jì)(Radiometer,Denmark)測(cè)定pH值。在4(TC干燥(在硅膠上)儲(chǔ)存4周之后，用實(shí)施例2中描述的SE-HPLC和RP-HPLC研究噴霧干燥胰島素阿速帕(aspart)的化學(xué)完整性(相對(duì)于在-18X:的對(duì)照物)。表3.噴霧干燥的胰島素阿速帕(aspart)粉末的穩(wěn)定性溶液pH值噴霧干燥的胰島素阿速HMWPA)(%)純度印(％)巾白(aspart)的pH值7.57.280.2898.27.77.540.2698.38.07.820.2298.38.58.260.1998.49.08.580.2398.29.59.001.3495.0A)在4(TC儲(chǔ)存4周之后形成的高分子量二聚物和聚合物，用SE-HPLC測(cè)定B)在40。C儲(chǔ)存4周之后噴霧干燥胰島素阿速帕(aspart)的純度，用RP-HPLC測(cè)定實(shí)施例7將20000nmol賴氨酸-?；腉LP1類似物N-epsilon26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4羧基4-(n羧基十七酰氨基)丁?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]-乙氧基)乙氧基)乙?；鵠[八化8,八巧34]00>-1-(7-37)溶于水中，達(dá)到4000nmol/mL(分子量4113g/mo1)。用氳氧化鈉將2mL溶液調(diào)節(jié)至pH7.6，并進(jìn)一步分成2部分，其中一部分中加入氨(25%，在水中)，至pH9.6。類似地，用氫氧4^鈉將2mL溶液調(diào)節(jié)至pH8.7,分成2部分，其中一部分中加入氨(25%,在水中)，至pH10.3。最后，向1mLGLP1類似物溶液中加入氬氧化鈉，至pH10.3。將5個(gè)樣品全部冷凍干燥，并再溶解至40mg/mL。測(cè)定樣品的pH值分別是7.5、7.5、8.6、8.6和9.7。實(shí)施例8含有揮發(fā)堿的GLP-1類似物的噴霧干燥將180mg(43800nmol)賴氨酸-酰化的GLP1類似物N-epsilon26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基4-(H-羧基十七酰氨基)丁?；被鵠乙氧基}-乙氧基)乙酰#^]乙氧基}乙氧基)乙酰基][AibS,Arg34]GLP-l-(7-37)溶于7ml4欠化水中，用0.2N鹽酸將pH值/人7.53調(diào)節(jié)至7.03。然后用0.25%w/w氨水將溶液調(diào)節(jié)至pH9.96,加入軟化水，得到20mg/ml的GLP-1類似物的最后濃度。將溶液噴霧到在配備0.7mm并流兩流體噴嘴的BtichiB-290小型噴霧干燥器(Biichi，LabortechmkAGFlawil，Switzerland)的干燥室中的熱空氣流中，液體進(jìn)料速度2ml/min,霧化空氣流是600-800升/小時(shí)。干燥空氣具有15(TC的入口溫度，干燥空氣流速是35mV小時(shí)。出口溫度是大約63°C。用連接干燥室的旋流分離器收集固體微粒。將粉末再溶解在軟化水中，至120mg/ml,測(cè)定的pH值是pH6.9。實(shí)施例9在強(qiáng)4^性pH值下的胰島素阿速帕(aspart)的化學(xué)不穩(wěn)定性將720mg胰島素阿速帕(aspart)溶解在9ml軟化水中。用2N氬氧化銨溶液將2.25ml溶液的pH值從7.6調(diào)節(jié)至10.0。用2N氬氧化銨溶液將另一個(gè)2.25ml溶液的pH值調(diào)節(jié)至11.0。用2N氳氧化^妄溶液和1N氫氧化鈉溶液將又一個(gè)2.25ml溶液調(diào)節(jié)至pH12.0。用2N氳氧化銨溶液和1N氫氧^f匕鈉溶液將最后2.25ml溶液調(diào)節(jié)至pH12.6。將四個(gè)調(diào)整過pH值的溶液在3-8。C的水箱中保持24小時(shí)，而后用1N鹽酸將四個(gè)溶液調(diào)節(jié)至中性pH值，以便猝滅化學(xué)降解。利用實(shí)施例2中描述的排阻和反相HPLC分析來研究在^皮中和的溶液中的胰島素化學(xué)不穩(wěn)定性。表4.在各種pH值下的胰島素阿速帕(aspart)溶液的化學(xué)穩(wěn)定性溶液pH值HMWPA)(%)純度B)(%)7.60.097.210.00.597.811.01.892.212.049.87.812.639.52.3A)在3-8。C儲(chǔ)存24小時(shí)之后形成的高分子量二聚物和聚合物，用SE-HPLC測(cè)定B)在3-8。C儲(chǔ)存24小時(shí)之后胰島素阿速帕(aspart)的純度，用RP-HPLC測(cè)定權(quán)利要求1.干燥蛋白溶液的方法，其中a)如下獲得蛋白溶液將蛋白與水混合，任選包含賦形劑，用揮發(fā)性堿、不揮發(fā)性的堿和任選不揮發(fā)的酸調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值，使其成為堿性，和b)將蛋白溶液干燥2.按照權(quán)利要求1的方法，包括a)選擇干燥蛋白的目標(biāo)pH值，b)選擇蛋白溶液的目標(biāo)pH值，c)提供水相，d)力口入蛋白，e)4壬選加入f武形劑，f)用不揮發(fā)的堿和任選不揮發(fā)的酸將pH值調(diào)節(jié)至干燥蛋白的目標(biāo)pH值，g)用揮發(fā)的堿將pH值調(diào)節(jié)至所要干燥的蛋白溶液的目標(biāo)pH值，和h)將蛋白溶液噴霧干燥。其中步驟d、e、f和g可以以任何順序進(jìn)行，同時(shí)連續(xù)攪拌。3.按照權(quán)利要求l-2的方法，其中蛋白溶液是在低于8。C的溫度下獲得的。4.按照權(quán)利要求l-3的方法，其中蛋白溶液具有7.4和11.0之間的pH值。5.按照權(quán)利要求l-4的方法，其中揮發(fā)性堿將蛋白溶液的pH值調(diào)節(jié)至少0.5個(gè)pH單位。6.按照權(quán)利要求1-5的方法，其中蛋白選自胰島素，胰島素類似物，胰島素衍生物，GLP-l,GLP-1類似物和GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一組合。7.按照權(quán)利要求1-6的方法，其中蛋白溶液包含緩沖劑，清洗劑，穩(wěn)定劑，蛋白酶抑制劑,調(diào)味劑,載體，吸收促進(jìn)劑(protactmgagent)，填充劑或改善流動(dòng)特性的試劑或滲透增強(qiáng)劑或其組合。8.按照權(quán)利要求l-7的方法，其中蛋白溶液包含雙甘氨肽(N-甘氨酰甘氨酸，glycylglycine)和/或酚。9.按照權(quán)利要求l-8的方法，其中蛋白溶液包含每摩爾蛋白大約4摩爾的酚。10.按照權(quán)利要求l-9的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值。11.按照權(quán)利要求1-10的方法，其中干燥方法選自噴霧干燥、噴霧冷凍干燥、流化床干燥、冷凍干燥和真空干燥。12.用權(quán)利要求1-11的方法得到的干燥蛋白。13.藥物組合物，其包含治療有效量的按照權(quán)利要求12的干燥蛋白。14.按照權(quán)利要求13的藥物組合物，其中組合物用于糖尿病或高血糖癥的肺部、腸胃外、鼻部或口J1良治療。15.在需要治療的患者中治療糖尿病的方法，包括給予患者治療有效量的按照權(quán)利要求11任一項(xiàng)的干燥蛋白或按照權(quán)利要求13-14的任一項(xiàng)的藥物《且合物。16.實(shí)施例中描述的干燥蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及噴霧干燥蛋白溶液的方法和噴霧干燥的蛋白產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及含有這種噴霧干燥蛋白的藥物組合物，使用本發(fā)明的噴霧干燥蛋白治療糖尿病和高血糖的方法，和這種噴霧干燥蛋白在治療糖尿病和高血糖中的用途。文檔編號(hào)A61K38/28GK101674812SQ200880013330公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2008年4月30日優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日發(fā)明者S·B·詹森,S·哈夫倫申請(qǐng)人:諾沃-諾迪斯克有限公司