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      具有高抗過敏活性的乳酸菌組合物和該乳酸菌的制造方法

      文檔序號:1143533閱讀:359來源:國知局

      專利名稱::具有高抗過敏活性的乳酸菌組合物和該乳酸菌的制造方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明涉及具有高抗過敏活性的乳酸菌組合物以及該乳酸菌的制造方法;尤其涉及通過對具有優(yōu)異的抗過敏活性的乳酸菌副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)KW3110株或其變異株進行加熱處理,從而賦予其高而穩(wěn)定的抗過敏活性,制造具有高抗過敏活性的乳酸菌菌體的方法;并且還涉及以該具有高抗過敏活性的乳酸菌菌體為有效成分的抗過敏用組合物。
      背景技術(shù)
      :在發(fā)達(dá)國家,過敏是頻率最高的疾病之一。過敏的發(fā)病機制通常分為I型至IV型四種。I型過敏與IgE抗體有關(guān),以花粉癥、哮喘、蕁麻疹、過敏性休克等為代表。II型過敏與IgG抗體、IgM抗體有關(guān),是將補體系統(tǒng)激活的細(xì)胞傷害性反應(yīng),胎兒成紅細(xì)胞增多癥、自身免疫性溶血性貧血就屬于這種過敏。III型過敏為由抗原抗體復(fù)合體引起的組織傷害,是以7A'7々》反應(yīng)、血清病、腎小球腎炎為代表的反應(yīng)。IV型過敏為與T細(xì)胞有關(guān)的延遲型過敏(延遲型過敏癥),是以結(jié)核菌素反應(yīng)、接觸性皮炎為代表的反應(yīng)。過敏中,食物過敏的發(fā)病與I型、II型和IV型有關(guān)。另一方面,已知環(huán)境過敏,即花粉癥、特應(yīng)性皮炎、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎等過敏,主要具有I型的發(fā)病機制。上述I型過敏的特征在于,過敏原特異性IgE的誘導(dǎo)和組胺、白三烯等化學(xué)介質(zhì)的釋放。免疫應(yīng)答由各種細(xì)胞的相互作用而產(chǎn)生,輔助性T細(xì)胞(Th)是一種與之相關(guān)的細(xì)胞。輔助性T細(xì)胞分類屬于T細(xì)胞亞群,具有識別抗原并產(chǎn)生各種細(xì)胞因子(輔助性因子)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的功能。輔助性T細(xì)胞根據(jù)其細(xì)胞因子產(chǎn)生能力分為Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞兩類。為了使B細(xì)胞中發(fā)生抗體類別轉(zhuǎn)換,產(chǎn)生IgE抗體,IL-4、IL-5、IL-13等Th2細(xì)胞因子是必須的。實際上,已知過敏患者的淋巴細(xì)胞中Th2細(xì)胞增加。S卩,從外界侵入的過敏原通過樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞,以其一部分結(jié)合于MHCII類分子的狀態(tài)呈遞給T細(xì)胞,從而使Th2細(xì)胞激活、分化。Th2細(xì)胞釋放的Th2細(xì)胞因子誘導(dǎo)B細(xì)胞的類別轉(zhuǎn)換,產(chǎn)生IgE抗體,IgE抗體結(jié)合于組織內(nèi)的肥大細(xì)胞、血中的嗜堿性細(xì)胞表面的Fc*R。過敏原在下次侵入時,被結(jié)合在肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞表面的IgE抗體識別,并在IgE抗體間形成交聯(lián)。以該剌激為誘因,肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞爆發(fā)性游離釋放出化學(xué)介質(zhì),從而表現(xiàn)出各種過敏癥狀。在預(yù)防和治療由IgE、化學(xué)介質(zhì)介導(dǎo)的過敏中,例如有下列藥物或方法通過與組胺競爭性結(jié)合組胺受體從而阻斷來自末梢神經(jīng)的信號傳導(dǎo)的抗組胺藥物、通過使產(chǎn)生化學(xué)介質(zhì)的細(xì)胞的活性減弱來試著減輕癥狀的抗過敏藥物、通過降低免疫應(yīng)答性來減輕炎癥的甾體藥物、以及通過定期注射過敏原本身來誘導(dǎo)耐受性的脫敏療法等。但是,這些藥物或方法都存在副作用的問題,并且效果也不確定。近年來,通過調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生來抑制IgE的方法備受關(guān)注。據(jù)報道,結(jié)核菌、溶血性鏈球菌、乳酸菌等一些種類的細(xì)菌,通過增強Thl免疫來抑制Th2,從而達(dá)到降低IgE的效果(臨床免疫,1999年,第32巻,454頁;<>夕一*-〉3*A7—力<7"^才7"7kA¥—7>卜'<厶乂口^一,1998年,第115巻,278頁;日本特開平9-2959號公報)。其中,從安全性方面考慮,乳酸菌較易應(yīng)用于食品等,是有用的原材料。但是,雖然都叫乳酸菌,然而并不是所有的乳酸菌都有很好的增強Thl免疫的效果,必須選擇有用的菌株。據(jù)教導(dǎo),通過將公知的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)LGG菌株作為抗過敏乳酸菌而讓妊娠婦女?dāng)z取,可抑制幼兒的特應(yīng)性皮炎的發(fā)病(,'7卜,2001年,第357巻,1076頁)。在多個專利公報中也公開了將乳酸菌作為抗過敏藥物使用。例如,日本特開平9-2959號公報公開了,在添加嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、短乳桿菌(Latobacillusbrevis)、布赫纟內(nèi)氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、以及干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)等乳酸菌來培養(yǎng)小鼠淋巴細(xì)胞時,將IgE產(chǎn)量為30ng/ml以下的菌株用作抗過敏藥物;日本特開平10-309178號公報公開了,將嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlong咖)、和兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifid咖)等雙歧桿菌作為用于治療特別是食物過敏而使用的抗過敏藥物;以及日本特開2000-95697號公報公開了,將糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)等乳酸菌作為過敏性支氣管哮喘、過敏性鼻炎和特應(yīng)性皮炎等I型過敏的抑制劑使用。另一方面,已知乳酸菌等增強Thl免疫是指,通過產(chǎn)生IL12、IFN-Y等來激活巨噬細(xì)胞、T殺傷細(xì)胞、NK細(xì)胞的細(xì)胞免疫,其與抑制病毒、細(xì)菌感染、癌的發(fā)生有關(guān)。具體而言,巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12,通過將未分化的輔助性T細(xì)胞向Thl細(xì)胞分化,并激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞,從而獲得對入侵物、癌癥的抵抗性。因此,提示能夠誘導(dǎo)大量IL-12產(chǎn)生的乳酸菌株可作為免疫激活劑來使用(*^>寸一<厶乂口-一<厶乂七,匕°一,2000年,第49巻,157頁;日本特開平7-228536號公報;日本特開2002-80364號公報)。近年來,很多被認(rèn)為是發(fā)生了由過敏引起的體質(zhì)變化的人,都出現(xiàn)特應(yīng)性皮炎、花粉癥等癥狀,這已成為社會問題。其中,尤其對于重癥患者來說,使用各種藥物進行治療行為。但事實上,大部分對象并未達(dá)到進行規(guī)范治療的程度,而是在日常生活過程中,應(yīng)對性地進行包括民間療法在內(nèi)的對應(yīng)治療。鑒于這種狀況,最近通過食物來抑制過敏的研究非?;钴S。其結(jié)果發(fā)現(xiàn),例如,紫蘇油、魚油、特定的茶多酚等多種飲食品成分具有抗過敏效果,并將它們用于進行治療。已知作為具有抗過敏效果的飲食品的成分,上述特定的乳酸菌也具有相同效果,使用該乳酸菌的酸奶、乳酸菌飲料,作為具有抗過敏效果的飲食品,已經(jīng)部分得到實際應(yīng)用。雖然采用這種抗過敏用飲食品進行預(yù)防或治療,可以在安全且溫和的條件下攝取,但是需要每天持續(xù)攝取,并且這種持續(xù)攝取需要以可能的量來發(fā)揮功效。然而,在現(xiàn)有技術(shù)中尚未明確選取這種高抗過敏活性菌株的方法,因此未能取得有效的菌株,并且無法滿足實際應(yīng)用。因此,最近公開了發(fā)現(xiàn)顯示出特定數(shù)值以上的白細(xì)胞介素12和特定數(shù)值以下的白細(xì)胞介素4的產(chǎn)量的乳酸菌,對包含該乳酸菌的具有優(yōu)異抗過敏活性的抗過敏用組合物進行了開發(fā)(日本特開2005-139160號公報)。作為該乳酸菌,可以列舉副干酪乳桿菌(Xactobacillusparacasei)KW3110株、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KW4110株、副干酪乳桿菌KW3925菌株、副干酪乳桿菌KW3926菌株、或者唾液鏈球菌4(Streptococcussalivarius)KW3210株。另外,同時公開了在該乳酸菌中,作為具有特別優(yōu)異的抗過敏活性的乳酸菌,對以副干酪乳桿菌KW3110株及其變異株作為有效成分的、具有優(yōu)異抗過敏功能的飲食品進行開發(fā)(日本特開2005-137357號公報;特許3585487號公報)。之后,關(guān)于副干酪乳桿菌KW3110株的抗過敏作用形成了如下報告。例如,體外(invitro)系統(tǒng)試驗中從約100株乳酸菌中選出具有最強的IL-12產(chǎn)生誘導(dǎo)能力和IL-4抑制能力的副干酪乳桿菌KW3110株。據(jù)報道,使用選擇的KW3110株,通過卵白蛋白(OVA,ovalbumin)采用變應(yīng)性致敏小鼠進行體內(nèi)(invivo)試驗后,出現(xiàn)抑制血中IgE、產(chǎn)生IL-12、抑制IL-4傾向等抗過敏效果(Int.Arch.AllergyImmunol.,135,205,2004)。另外,據(jù)報道,使用具有抗過敏效果的KW3110株或效果沒有那么高的德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)B菌株制作酸奶,用其對人進行實驗后,確認(rèn)了使用KW3110株制作的酸奶與Th2細(xì)胞增殖和嗜酸性細(xì)胞的激活抑制有關(guān)(AllergologyIn.54,143,2005)。如上所述,在各種已知的具有抗過敏活性的乳酸菌中,副干酪乳桿菌KW3110株具有特別優(yōu)異的抗過敏作用,然而為了在將該乳酸菌作為有效成分在各種產(chǎn)品形態(tài)及各種使用對象中使用時,進一步增大其有效性,希望進一步增強該有效成分的抗過敏活性,并且開發(fā)出更穩(wěn)定的抗過敏活性成分。專利文獻(xiàn)1:日本特開平7-228536號公報。專利文獻(xiàn)2:日本特開平9-2959號公報。專利文獻(xiàn)3:日本特開平10-309178號公報。專利文獻(xiàn)4:日本特開2000-95697號公報。專利文獻(xiàn)5:日本特開2002-80364號公報。專利文獻(xiàn)6:日本特開2005-137357號公報。專利文獻(xiàn)7:日本特開2005-139160號公報。專利文獻(xiàn)8:特許3585487號公報。非專利文獻(xiàn)l:臨床免疫,1999年,第32巻,454頁。非專利文獻(xiàn)2:<>夕一*-〉3*A7—力<7"^才7"7kA年'一7">卜'<厶乂口-一,1998年,第i15巻,278頁。157頁'非專利文獻(xiàn)3:,>七'7卜,2001年,第357巻,1076頁。非專利文獻(xiàn)4Y>寸一<厶乂口-一<厶乂七,匕。一,2000年,第49巻,非專利文獻(xiàn)5:Int.Arch.AllergyImmunol.,135,205,2004。非專利文獻(xiàn)6-AllergologyInt.54,143,2005。
      發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的課題在于,在使用具有抗過敏活性的乳酸菌時,為了在各種產(chǎn)品形態(tài)及各種使用對象中進一步增大其有效性,提供一種增強該有效成分的抗過敏活性并且具有更穩(wěn)定的抗過敏活性的乳酸菌。本發(fā)明人為了解決上述課題,對包含乳酸菌的具有高抗過敏活性的有效成分進行了深入研究,研究中發(fā)現(xiàn),通過在特定溫度范圍內(nèi),對具有優(yōu)異的抗過敏活性的乳酸菌副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)KW3110株或其變異株進行特定時間的加熱處理,可以使其抗過敏活性得到飛躍性提高,此外還可以停止乳酸菌本身的活動,并且盡量防止由加熱處理造成的菌體本身的變性,得到具有穩(wěn)定的高抗過敏活性的有效成分,從而完成了本發(fā)明。S卩,本發(fā)明包括制造具有高抗過敏活性的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株的方法,該方法通過在60°C以上10(TC以下的溫度下、10分鐘以上60分鐘以下的時間內(nèi),對副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株進行加熱處理,從而得到使該乳酸菌的抗過敏活性得到飛躍性提高、同時具有穩(wěn)定的抗過敏活性且具有高抗過敏活性的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株。另外,本發(fā)明還包括通過特別有效的加熱處理而得到穩(wěn)定的高抗過敏活性的乳酸菌菌體的方法,該方法在培養(yǎng)副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株后,通過對培養(yǎng)菌體進行洗滌處理除去培養(yǎng)基成分,然后對副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株進行加熱處理。此外,本發(fā)明包括提供在各種產(chǎn)品形態(tài)及各種使用對象中使用時,進一步增大其有效性的抗過敏用組合物,該組合物以包含通過本發(fā)明的制造方法制成的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株的、具有穩(wěn)定的高抗過敏活性的乳酸菌菌體作為有效成分。S卩,具體而言,本發(fā)明包括(l)具有高抗過敏活性的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株的加熱處理菌體的制造方法,其特征在于,該方法在60°C以上IO(TC以下的溫度下、10分鐘以上60分鐘以下的時間內(nèi),對副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株進行加熱處理;(2)上述(1)記載的具有高抗過敏活性的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株的加熱處理菌體的制造方法,其特征在于,在培養(yǎng)副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株后,通過對培養(yǎng)菌體進行洗滌處理除去培養(yǎng)基成分,然后進行副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株的加熱處理;(3)通過上述(1)或(2)記載的制造方法制成的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株的加熱處理菌體;(4)以通過上述(1)或(2)記載的制造方法制成的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株的加熱處理菌體作為有效成分的抗過敏用組合物。圖1是表示本發(fā)明的實施例中,本發(fā)明的乳酸菌的加熱條件對應(yīng)的抗過敏活性測定試驗中,各加熱條件對應(yīng)的IL-12產(chǎn)量的比例(相對于對照組的比例)的圖。具體實施例方式本發(fā)明包括,通過在6(TC以上10(TC以下的溫度下、10分鐘以上60分鐘以下的時間內(nèi),對具有優(yōu)異抗過敏活性的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株進行加熱處理,從而制造抗過敏活性得到飛躍性提高并具有穩(wěn)定的高抗過敏活性的乳酸菌。(本發(fā)明中使用的乳酸菌)本發(fā)明中所用的具有優(yōu)異抗過敏活性的乳酸菌即副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei,L.Paracasei)KW3110株,可以從日本乳業(yè)技術(shù)協(xié)會作為干酪乳桿菌(L.case)L14株得到。此外,根據(jù)日本乳業(yè)技術(shù)協(xié)會的記載,L14株記載為Lcasei,但是采用QUALICON公司制RiboPrinter('J求7°'J>夕一)進行限制性片段長度多態(tài)性(RFLP,RestrictionFlagmentLengthPolymorphism)禾口J廣增片段長度多態(tài)性(AFLP,AmplifiedFlagmentLengthPolymorphism)分析后,判斷該菌株為副干酪乳桿菌(L.Paracasei),因此本發(fā)明中記載為副干酪乳桿菌(L.Paracasei)。本發(fā)明中作為抗過敏用組合物的有效成分使用的副干酪乳桿菌(LParacasei)KW3110,如上所述可以從日本乳業(yè)技術(shù)協(xié)會得到,此外,根據(jù)關(guān)于專利微生物保藏的布達(dá)佩斯條約,還保藏于國際保藏單位的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心,保藏號為FERMBP-08634。本發(fā)明的有效成分乳酸菌,可以采用M.R.S.(deMan,Rogosa,Sharpe)培養(yǎng)基等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的乳酸菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基進行適當(dāng)培養(yǎng)增殖后,按照本發(fā)明的方法進行加熱處理,再根據(jù)需要進行冷凍干燥或噴霧干燥而粉末化并加以使用。另外,在工序管理或?qū)χ瞥傻娜樗峋w的抗過敏活性進行測定時,可采用以下利用乳酸菌的抗過敏活性的測定方法進行測定將用過敏原致敏的來源于動物脾臟的淋巴細(xì)胞混懸于含有該過敏原的培養(yǎng)基中,添加被測乳酸菌進行培養(yǎng),從而產(chǎn)生Thl誘導(dǎo)細(xì)胞因子和/或Th2誘導(dǎo)細(xì)胞因子,再對Thl誘導(dǎo)細(xì)胞因子和/或Th2誘導(dǎo)細(xì)胞因子的量進行測定。本發(fā)明中使用的副干酪乳桿菌(L.Paracasei)KW3110的變異株可以通過使該乳酸菌變異,來制作抗過敏活性等較高的變異株并加以使用。作為菌株的變異手段,可以采用UV等公知變異手段進行,例如可以采用以下方法使副干酪乳桿菌(L.Paracasei)KW3110變異,使用本說明書記載的乳酸菌的抗過敏活性評價方法,得到增加了抗過敏活性的變異株。(衍生菌株的選擇)本發(fā)明中,可以將由本發(fā)明得到的乳酸菌株變異后性狀不同的菌株作為衍生菌株進行選擇并加以使用。例如,使用MRS培養(yǎng)基之類的培養(yǎng)基,在規(guī)定溫度下對副干酪乳桿菌(L.Paracasei)KW3110株進行靜置培養(yǎng)至達(dá)到規(guī)定菌數(shù),用新鮮的MRS培養(yǎng)基將培養(yǎng)液稀釋后,將本菌體混懸液以占10X的比例混懸于用鹽酸將pH值調(diào)整為3.0的PBS(以指定的濃度溶解大日本制藥社藥片)中,在37t:下培養(yǎng)3小時。用PBS稀釋酸處理后的菌體混懸液,接種于MRS板(MRSplate)培養(yǎng)基上,形成菌落。以色調(diào)等為指標(biāo)對形成的菌落進行選擇,從根據(jù)該色調(diào)選擇的菌落中再選出1株,在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。用實施例1記載的抗過敏活性的測定法對該培養(yǎng)物的抗過敏活性進行測定,判斷各菌落的抗過敏活性。通過該方法,從試驗菌株中選取高抗過敏活性的菌株。本發(fā)明的實施例中,作為L.paracaseiKW3110株的衍生菌株而分離的菌株被命名為No.90株,根據(jù)關(guān)于專利微生物保藏的布達(dá)佩斯條約,保藏于國際保藏單位的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心,保藏號為FERMBP-08635。(本發(fā)明制造的乳酸菌的抗過敏作用)過敏的發(fā)病機制如下由抗原剌激產(chǎn)生IgE抗體,IgE抗體結(jié)合于組織內(nèi)的肥大細(xì)胞、血中的嗜堿性細(xì)胞表面的Fc受體。過敏原在下次抗原剌激(過敏原的再侵入)時被結(jié)合在肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞表面的IgE抗體識別,并在IgE抗體間形成交聯(lián),以該剌激為誘因,肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞爆發(fā)性游離釋放出化學(xué)介質(zhì),從而表現(xiàn)出各種過敏癥狀。因此,為了治療、預(yù)防過敏,需要抑制IgE,進而需要增強Thl免疫并抑制Th2免疫。本發(fā)明的乳酸菌,在使用小鼠淋巴細(xì)胞的體外系統(tǒng)中,強烈誘導(dǎo)作為Thl免疫指標(biāo)的白細(xì)胞介素12(IL_12)產(chǎn)生,同時強烈抑制作為Th2免疫指標(biāo)的白細(xì)胞介素4(IL-4)產(chǎn)生。因此,本發(fā)明的乳酸菌通過增強Thl免疫并抑制Th2免疫,基于抑制IgE抗體產(chǎn)生這一作用機制,具有治療、預(yù)防7(本發(fā)明的加熱處理)本發(fā)明中,在規(guī)定溫度下、規(guī)定時間內(nèi)對副干酪乳桿菌(L.Paracasei)KW3110株或其變異株進行加熱處理,以謀求其抗過敏活性的增大。作為加熱溫度,可以使用6(TC以上IO(TC以下的溫度;作為加熱時間,可以采用10分鐘以上60分鐘以下的時間。特別優(yōu)選在6085t:、更優(yōu)選85t:左右的溫度下,優(yōu)選10分鐘以上60分鐘以下的加熱處理時間內(nèi)進行加熱處理。本發(fā)明的加熱處理,是在規(guī)定溫度下、規(guī)定時間內(nèi),將培養(yǎng)的乳酸菌菌體以混懸狀態(tài)進行加熱處理,作為這種情況下的加熱手段,可以采用常用手段,沒有特別限制。例如,可以在罐(tank)內(nèi)使用熱交換器對混懸的菌體進行加熱。本發(fā)明中,進行乳酸菌菌體的加熱處理時,為了得到有效的加熱處理效果,特別優(yōu)選以下方法使用例如離心分離機或陶瓷制的膜等,對培養(yǎng)的菌體進行洗滌處理,除去培養(yǎng)基成分,然后將濃縮的菌體以混懸液的狀態(tài)進行加熱處理。為了達(dá)到上述目的,在使用離心或陶瓷制的膜進行的洗滌處理中,可以使用常用的離心分離機、過濾器過濾機。(本發(fā)明的抗過敏用組合物)本發(fā)明制造的乳酸菌的抗過敏用組合物,具有得到飛躍性提高的高抗過敏活性、以及穩(wěn)定的高抗過敏活性,可適合于在各種產(chǎn)品形態(tài)及各種使用對象中有效使用。例如,實施了本發(fā)明的加熱處理的乳酸菌,通過本申請發(fā)明的特定的加熱處理,使乳酸菌本身的活動停止,因而將其作為抗過敏用組合物添加到各種飲食品等中時,可以盡量減少由乳酸菌本身的生物活性造成的對飲食品本來香味的影響,此外,將該抗過敏用組合物制成各種制劑形態(tài)時,也可以作為有效成分維持穩(wěn)定的活性。(本發(fā)明制造的乳酸菌的抗過敏用組合物的應(yīng)用)本發(fā)明制造的乳酸菌的抗過敏用組合物,對花粉癥、特應(yīng)性皮炎、支氣管哮喘、過敏性鼻炎*支氣管哮喘等環(huán)境過敏特別有效。本發(fā)明制造的乳酸菌的抗過敏用組合物,可以通過將本發(fā)明的有效成分與生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑、粘合劑、稀釋劑等混合進行制劑,可以作為抗過敏藥物使用。本發(fā)明的抗過敏藥物可口服給藥或非口服給藥。作為口服劑,可以列舉顆粒劑、散劑、片劑(包括糖衣片)、丸劑、膠囊劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑等。作為非口服劑,可以列舉注射劑(例如,皮下注射劑、靜脈注射劑、肌肉注射劑、腹腔注射劑)、點滴劑、外用劑(例如,經(jīng)鼻給藥制劑、經(jīng)皮制劑、軟膏劑)、栓劑(例如,直腸栓劑、陰道栓劑)。這些制劑可以采用本領(lǐng)域的常用方法,與藥學(xué)上可接受的賦形劑、添加劑一起制成制劑。另外,制成制劑時,本發(fā)明制造的乳酸菌的抗過敏組合物,為了能夠在生物體內(nèi)適當(dāng)且有效地發(fā)揮其功能,即為了控制溶出開始時間、添加作為苦味掩蓋劑的功能、提高對氧和濕度的穩(wěn)定性的形式,例如可以優(yōu)選與用日本專利3349677記載的以酵母細(xì)胞壁為主要成分的包衣(coating)劑包衣形成的包衣處理物、作為通過按照特定方法用軟膠囊或硬膠囊制成膠囊而得到的膠囊劑一起用于醫(yī)藥制劑、健康食品等領(lǐng)域。作為藥學(xué)上可接受的賦形劑、添加劑,可以列舉載體、粘合劑、香料、緩沖劑、增稠劑、著色劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、分散劑、混懸劑、防腐劑等。作為藥學(xué)上可接受的載體,例如可列舉碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石粉、砂糖、乳糖、果膠、糊精、淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠟、可可脂等。制劑例如可采用以下方法來制造。S卩,口服劑可采用以下方法制造作為有效成分,添加例如賦形劑(例如,乳糖、白糖、淀粉、甘露醇)、崩解劑(例如,碳酸鈣、羧甲基纖8維素鈣)、粘合劑(例如,a-淀粉、阿拉伯膠、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素)、或者潤滑劑(例如,滑石粉、硬脂酸鎂、聚乙二醇6000)并壓縮成形,然后為了掩蓋氣味、腸溶性或持續(xù)性,根據(jù)需要采用本身公知的方法進行包衣。作為包衣劑,例如可使用乙基纖維素、羥甲基纖維素、聚乙二醇、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯及丙烯酸樹脂(才<卜',年''7卜,Eudragit)(ROHM公司制,德國,甲基丙烯酸丙烯酸共聚物)等。注射劑可以采用以下方法制造將有效成分與分散劑(例如,吐溫(Tween)80(ATLASPOWDER公司制,美國)、HC060(日光少S力^《制)、聚乙二醇、羧甲基纖維素、海藻酸鈉等)、保存劑(例如,羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、苯甲醇、氯代丁醇、苯酚)、等滲劑(例如,氯化鈉、甘油、山梨醇、葡萄糖、轉(zhuǎn)化糖)等一起,在水性溶劑(例如,蒸餾水、生理鹽水、林格氏溶液等)或者油性溶劑(例如,橄欖油、芝麻油、棉籽油、玉米油等植物油,丙二醇)等中溶解、混懸或乳化。此時,可以根據(jù)需要添加助溶劑(例如,水楊酸鈉、乙酸鈉)、穩(wěn)定劑(例如,人血清白蛋白)、無痛劑(例如,苯扎氯銨、鹽酸普魯卡因)等添加物。外用劑可以通過將有效成分制成固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)的組合物來制造。例如,上述固態(tài)組合物可以采用以下方式制造將有效成分直接形成粉狀,或者添加賦形劑(例如,乳糖、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、白糖)、增稠劑(例如,天然膠類、纖維素衍生物、丙烯酸聚合物)等并混合形成粉狀來制造。上述液態(tài)組合物可以采用與制造注射劑時大致相同的方法來制造。半固態(tài)組合物可以為水性或油性的凝膠劑、或者軟骨狀的制劑。另外,這些組合物均可添加pH調(diào)節(jié)劑(例如,碳酸、磷酸、檸檬酸、鹽酸、氫氧化鈉)、防腐劑(例如,對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯扎氯銨)等。栓劑可以通過將有效成分制成油性或水性的固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)的組合物來制造。作為該組合物中使用的油性基質(zhì),可以列舉高級脂肪酸的甘油酯[例如,可可脂、Wit印sol(々<于7°'/A)類(夕、*7<卜乂一《A社制)]、中級脂肪酸[例如,Miglyol(S夕''J才一^)類(夕M*7<卜乂一《^社制)]、或者植物油(例如,芝麻油、豆油、棉籽油)。作為水性基質(zhì),可以列舉聚乙二醇類、丙二醇。此外,作為水性凝膠基質(zhì),可以列舉天然膠類、纖維素衍生物、乙烯聚合物、丙烯酸聚合物。[OOM](配合飲食品的使用)本發(fā)明制造的乳酸菌的抗過敏用組合物可以配合飲食品,作為具有抗過敏功能的飲食品使用。為了將本發(fā)明制造的乳酸菌的抗過敏用組合物配合在飲食品中使用,可以在飲食品的制造原料階段或制成的產(chǎn)品階段等,添加、配合該有效成分的有效量。其中,"有效成分的有效量"是指,在各種飲食品中以通常攝食量攝取時,使攝取的有效成分在如下所述范圍內(nèi)的含量。S卩,本發(fā)明的有效成分在飲食品中的有效量的給予量或攝取量,可以根據(jù)接受者、接受者的年齡和體重、癥狀、給藥時間、劑型、給藥方法、藥物的組合等來決定。例如,將本發(fā)明的有效成分作為藥物,口服給藥時可以在成人每人O.1100mg/kg體重(優(yōu)選110mg/kg體重)的范圍內(nèi),每日13次,分次給藥;非口服給藥時可以在0.0110mg/kg體重(優(yōu)選O.1lmg/kg體重)的范圍內(nèi),每日13次,分次給藥。與本發(fā)明的有效成分組合使用的具有其它作用機制的藥物,也可以分別以臨床上使用的用量為標(biāo)準(zhǔn)來適當(dāng)決定。如果將本發(fā)明的有效成分在飲食品中的有效量的給予量或攝取量以乳酸菌的菌數(shù)來表示,則每日的攝取量優(yōu)選為5X109個以上、更優(yōu)選每日1X101Q個以上、進一步優(yōu)選5X101Q個以上。因此,通常根據(jù)每日攝取的飲食品的量來決定每種食品所含的乳酸菌的菌數(shù)。本發(fā)明中,可以將本發(fā)明制造的乳酸菌的抗過敏用組合物的有效成分直接配合飲食品,或者以上述制劑形態(tài)配合飲食品。更具體而言,本發(fā)明的飲食品可以采用以下各種使用形態(tài)將本發(fā)明的有效成分與適當(dāng)基材配合,直接作為飲食品進行配制的使用形態(tài);或者進一步配合各種蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、微量元素、維生素類等的使用形態(tài);形成液態(tài)、半液態(tài)或固態(tài)的使用形態(tài);還有向普通飲食品中添加、配合的使用形態(tài)等。以往,在使用乳酸菌的飲食品的領(lǐng)域,作為有效利用的形態(tài)分類,大致分為乳制品類、肉類、面包類、飲料和蔬菜類。在使用這些乳酸菌的飲食品的情況中,作為制成的該飲食品用的添加物,可以使用本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌,對該飲食品賦予抗過敏功能。作為本發(fā)明的食品,可以配制成具有抗過敏功能的健康食品、功能性食品、特定保健用食品或患者用食品。此外,對食品的形態(tài)沒有特別限制,也可以是具有抗過敏功能的飲料形態(tài)。本發(fā)明的有效成分具有抗過敏作用,因此通過在日常攝取的食品、作為營養(yǎng)補充劑攝取的健康食品、功能性食品等中配合本發(fā)明的有效成分,可以提供能夠持續(xù)攝取的、同時具有預(yù)防和治療過敏發(fā)病的功能的食品。通過在例如茶類、飲料劑或片劑這樣的、在該飲食品中不含引起過敏的成分的飲食品中,配合使用本發(fā)明的具有高抗過敏活性的乳酸菌,可以提供具有完全阻斷過敏問題的抗過敏功能的飲食品。(飲食品制劑形態(tài)中的使用)本發(fā)明中,作為與本發(fā)明制造的具有高抗過敏活性的乳酸菌配合的健康食品和功能性食品,可以列舉各種食品,關(guān)于這些健康食品和功能性食品的制造,可以在常用的飲食品制劑形態(tài)下使用,該飲食品制劑形態(tài)除食品素材、食品添加物之外,還可以使用賦形劑、填充齊u、粘合劑、崩解齊u、潤滑齊u、分散齊u、保存齊u、潤濕劑、助溶齊u、防腐齊u、穩(wěn)定齊u、膠囊基質(zhì)等助劑。作為該助劑的具體示例,可以配合乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明膠、碳酸鎂、合成硅酸鎂、滑石粉、硬脂酸鎂、碳酸鈣、甲基纖維素、羧甲基纖維素及其鹽、阿拉伯膠、聚乙二醇、糖漿、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、檸檬酸、氯化鈉、亞硫酸鈉(亜硫酸Y—夕')、磷酸鈉、支鏈淀粉、卡拉膠、糊精、還原帕拉金糖(palatinose)、山梨醇、木糖醇、甜菊、合成甜味劑、檸檬酸、抗壞血酸、酸味劑、碳酸氫鈉、蔗糖酯、植物硬化油脂、氯化鉀、紅花油、蜜蠟、大豆卵磷脂、香料等。關(guān)于這樣的健康食品、功能性食品的制造,可以參考醫(yī)藥品制劑的參考書,例如"日本藥局方解說書(制劑總則)"(廣川書店)等。本發(fā)明中,作為特別適合于健康食品和功能性食品的形狀,可以列舉片狀、膠囊狀、顆粒狀、粉末狀、混懸液狀、乳化液狀等形狀,從本發(fā)明要解決的課題考慮,與本發(fā)明制造的具有高抗過敏活性的乳酸菌配合的健康食品和功能性食品,特別優(yōu)選與不含過敏特定原材料的原材料組合。作為片狀健康食品和功能性食品的制造方法的具體示例,可以列舉將配合本發(fā)明制造的具有高抗過敏活性的乳酸菌的處方藥壓縮成一定形狀來制造,或者使用水或醇之類的溶劑濕潤的捏合物形成一定形狀或流入一定模型中成型來制造。作為膠囊狀健康食品和功能性食品的制造法的具體示例,可以列舉配合本發(fā)明制造的具有高抗過敏活性的乳酸菌的處方藥以液狀、混懸狀、糊狀、粉末狀或顆粒狀等形狀填充到膠囊中,或者用膠囊基質(zhì)包覆成型而制成的硬膠囊劑或軟膠囊劑等。(與食品的配合)另外,本發(fā)明中,可以在食品中配合本發(fā)明制造的具有高抗過敏活性的乳酸菌,制成具有抗過敏功能的食品。作為這種飲食品,具體可列舉布丁、小甜餅干(cookie)、咸餅干(cracker)、馬鈴薯片(potatochips)、餅干(biscuit)、面包、西式蛋糕(cake)、巧克力、炸面圈(doughnut)、果子凍等西式點心,煎餅、羊羹、大福餅、牡丹餅、除此之外的饅頭、蛋糕(力》于,)等日式點心,冷凍點心(糖等)、口香糖等面包、點心類;面條、蕎麥面、扁面條等面類;魚糕、火腿、魚腸等魚肉制品;火腿、香腸、漢堡、罐裝牛肉等畜肉制品;鹽、胡椒、醬、醬油、沙司(sauce)、調(diào)味料(卜'^'7*>,",dressing)、蛋黃醬、番茄醬、甜調(diào)味品、辣調(diào)味品等調(diào)味類;明石燒(明石焼巻)、章魚燒、文字燒(i&i;々焼t)、雜樣煎菜餅(扭好*焼巻)、炒面(焼t子K')、燒面(焼巻^&&)等鐵板燒食品;奶酪、硬質(zhì)酸奶等乳制品;納豆、油炸豆腐(厚揚(f)、豆腐、筠篛、米粉團(団子)、腌漬品(漬物)、咸烹海味(佃煮)、餃子(餃子)、燒賣、炸肉餅、三明治、比薩餅(^平)、漢堡包、沙拉等各種家常菜;各種粉末(牛肉、豬肉、雞肉等畜產(chǎn)品、蝦、扇貝、蜆、海帶等水產(chǎn)品;蔬菜、果實類、植物、酵母、藻類等);將油脂類、香料類(香草、柑橘類、鰹魚等)粉末固化的產(chǎn)品;粉末飲食品(速溶咖啡、速溶紅茶、速溶奶粉、速食湯、醬湯等)等各種食品,但并不僅限于此。(與飲料的配合)本發(fā)明制造的乳酸菌的高抗過敏活性組合物,特別是以飲料的形態(tài)使用,能夠每日持續(xù)攝取,并且這種持續(xù)攝取可以通過作為以可能的量發(fā)揮功效的具有抗過敏功能的飲料來提供。將本發(fā)明制造的具有高抗過敏活性的乳酸菌與飲料配合時,可以適當(dāng)決定乳酸菌的配合量,通常采用以能夠作為飲料持續(xù)攝取的量來充分發(fā)揮乳酸菌所具有的抗過敏活性的配合量。如果將本發(fā)明的有效成分在飲食品中的有效量的給予量或攝取量以乳酸菌的菌數(shù)來表示,則每日的攝取量優(yōu)選為5X109個以上、更優(yōu)選每日1X101Q個以上、進一步優(yōu)選5X101Q個以上。因此,通常通過上述指標(biāo)根據(jù)每日攝取的飲料的量來決定每種飲料所含的乳酸菌的菌數(shù)。例如,如果每日攝取100g飲料,則優(yōu)選在每100g飲料中添加109個以上的菌數(shù)。另一方面,如果考慮到不會因乳酸菌的添加而損害飲料的香味、外觀的范圍,則優(yōu)選10"個以下的菌數(shù)。更優(yōu)選5X10"個以下的菌數(shù)。因此,作為具有抗過敏功能、具有穩(wěn)定性、并且嗜好性、保存性高的飲料的乳酸菌的濃度,特別優(yōu)選在每100g飲料中添加10910"個的范圍的菌數(shù)。另外,對于乳酸菌的菌體數(shù)和干燥菌體重量的關(guān)系,副干酪乳桿菌(L.Paracasei)KW3110株中菌體數(shù)1012個相當(dāng)于干燥菌體重量lg。本發(fā)明中,作為配合本發(fā)明制造的具有高抗過敏活性的乳酸菌的飲料,可以列舉各種飲料,制造這些飲料時,可以使用任何常用于飲料處方設(shè)計的糖類、香料、果汁、食品添加劑等。關(guān)于飲料的制造,可以參考已知的參考書,例如"改訂新版軟飲料(softdrinks)"(株式會社光琳)等。作為配合的飲料的具體示例,可以列舉酒精飲料(威士忌、波旁威士忌、烈性酒、利口酒、葡萄酒(wine)、果子酒、日本酒、中國酒、燒酒(焼酎)、啤酒、酒精度數(shù)1%以下的不含酒精啤酒、發(fā)泡酒(発泡酒)、蘇打酒(酎八<)等)、非酒精飲料(飲料型的酸奶;蘋果、橘子、葡萄、香蕉、梨、梅子、西瓜等的果汁;番茄、胡蘿卜、芹菜、黃瓜等的蔬菜汁;清涼飲料;牛奶、豆奶;咖啡、可可;紅茶、綠茶、麥茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、焙茶、烏龍茶、姜黃茶、普洱茶、路依保斯茶(口<#》^<一茶)、玫瑰茶、菊花茶、薄荷茶、茉莉花茶等各種植物茶(herbtea);運動飲料、礦質(zhì)水、營養(yǎng)飲料等)等各種飲料。根據(jù)飲料的種類來舉例,可以列舉綠茶、烏龍茶、紅茶、麥茶、混合茶等茶類飲料,咖啡、含果汁飲料、蔬菜飲料、運動飲料、營養(yǎng)飲料等。本發(fā)明中,將具有抗過敏功能的飲料制成產(chǎn)品時,可以按照食品衛(wèi)生法所規(guī)定的方法,適當(dāng)進行飲料殺菌。作為該殺菌方法,可以根據(jù)飲料的pH分別使用巴氏("》卜A)殺菌、熱敷包(hotpack)殺菌、超高溫(UHT,UltraHighTemperature)殺菌、蒸餾殺菌等。作為產(chǎn)品形態(tài),特別優(yōu)選用于普通飲料產(chǎn)品形態(tài)的裝在密封容器中的飲料形態(tài),作為該密封容器,可使用罐、瓶、PET、紙容器的任意形態(tài)。另外,對容量沒有特別限制,通??梢钥紤]消費者日常作為飲料攝取的量、配合的乳酸菌的菌數(shù)和每日的必要菌數(shù)來進行適當(dāng)決定。以下,通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明,但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不受這些示例的限制。實施例1〈1.抗過敏活性測定方法>乳酸菌的體外抗過敏活性通過測定將乳酸菌與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞進行混合培養(yǎng)后,釋放到培養(yǎng)基中的IL-12量來進行測定。在第0天和第6天,向7-10周齡BALB/c小鼠(CharlesRiver)同時腹腔注射lmg卵白蛋白(OVA)和2mg氫氧化鋁佐劑。在第13天解剖,取出脾臟,制備淋巴細(xì)胞。用添加有終濃度分別為10%和lmg/ml的FCS(Roche)和0VA的RPMI1640(SIGMA)培養(yǎng)基將脾臟淋巴細(xì)胞混懸,使得細(xì)胞濃度為2.5Xl(f個細(xì)胞/毫升。向上述培養(yǎng)基中添加乳酸菌,使其濃度為0.25iig/ml,然后在37°C、C02濃度5%的條件下培養(yǎng)1周。離心分離,回收培養(yǎng)上清液,用0ptEIAELISA(BectonDickinson)測定IL-12的產(chǎn)量。(實驗結(jié)果的表示)將試樣的IL-12產(chǎn)量與作為對照的副干酪乳桿菌(L.Paracasei)KW3110株的IL-12產(chǎn)量進行比較,以相對值來表示。(對照菌的作制)將使用MRS培養(yǎng)基在37t:下靜置培養(yǎng)48小時的物質(zhì),用滅菌水洗滌3次,混懸于滅菌水后在10(TC下處理30分鐘,進行殺菌。將其冷凍干燥,并混懸于PBS中。〈2.試樣副干酪乳桿菌(L.Paracasei)KW3110株的制備培養(yǎng)>將含有與MRS培養(yǎng)基相同程度的氮源、碳源和無機物的培養(yǎng)基,放入50L罐(tank)中、進行12(TC、20分鐘的蒸氣殺菌。向其中添加用MRS培養(yǎng)基適當(dāng)增殖的乳酸菌體,在32t:、60rpm條件下一邊用氫氧化鈉將pH值調(diào)整至5.5—邊培養(yǎng)48小時。取出制成的培養(yǎng)液,離心洗滌,得到菌體混懸液?!?.加熱處理〉將上述2.所得的菌體混懸液以各溫度調(diào)整的水浴加熱,菌體混懸液到達(dá)各溫度后,在各時間回收樣品。將回收的樣品冷凍干燥,供IL-12產(chǎn)生活性評價使用?!?.實驗結(jié)果〉上述實驗結(jié)果如圖1和表1所示。另外,本實驗中,在85tH式驗組中進行l(wèi)次實12驗,在6(TC試驗組中重復(fù)進行2次實驗、在其它實驗組中每組重復(fù)進行3次實驗,以其平均值表示。"非加熱"表示洗滌培養(yǎng)液后、冷凍干燥所得的產(chǎn)物。圖1表示各加熱條件對應(yīng)的IL-12產(chǎn)量的比例(相對于對照組的比例)。此外,表1表示各加熱條件對應(yīng)的IL-12產(chǎn)生活性值(相對于對照組的相對值(%))。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>工業(yè)適用性本發(fā)明提供可以使具有優(yōu)異抗過敏活性的乳酸菌的抗過敏活性得到飛躍性提高的乳酸菌,此外,通過本申請發(fā)明的特定加熱處理,可以停止乳酸菌本身的活動,并且盡量防止由加熱處理造成的菌體本身的變性,可以提供具有穩(wěn)定的高抗過敏活性的乳酸菌菌體。因此,根據(jù)本發(fā)明,可以提供抗過敏用組合物,其作為具有穩(wěn)定的高活性的抗過敏用組合物的有效成分,可以在各種產(chǎn)品形態(tài)及各種使用對象中適當(dāng)有效使用。權(quán)利要求具有高抗過敏活性的副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)KW3110株或其變異株的加熱處理菌體的制造方法,其特征在于,該方法在60℃以上100℃以下的溫度下、10分鐘以上60分鐘以下的時間內(nèi),對副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株進行加熱處理。2.權(quán)利要求1所述的具有高抗過敏活性的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株的加熱處理菌體的制造方法,其特征在于,在培養(yǎng)副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株后,通過對培養(yǎng)菌體進行洗滌處理除去培養(yǎng)基成分,然后進行副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株的加熱處理。3.通過權(quán)利要求1或2所述的制造方法制成的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株的加熱處理菌體。4.以通過權(quán)利要求1或2所述的制造方法制成的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株的加熱處理菌體作為有效成分的抗過敏用組合物。全文摘要本發(fā)明提供具有高抗過敏活性和穩(wěn)定的抗過敏活性的乳酸菌,該乳酸菌在使用具有抗過敏活性的乳酸菌時,能夠在各種產(chǎn)品形態(tài)及各種使用對象中有效使用。通過在60℃以上100℃以下的溫度下、10分鐘以上60分鐘以下的時間內(nèi),對副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)KW3110株或其變異株進行加熱處理,從而制造具有高抗過敏活性的副干酪乳桿菌KW3110株或其變異株,該乳酸菌的抗過敏活性得到飛躍性提高,并具有穩(wěn)定的抗過敏活性。通過本發(fā)明的加熱處理,可以提供以乳酸菌菌體為有效成分的抗過敏用組合物,該乳酸菌菌體的乳酸菌抗過敏活性得到飛躍性提高,并具有穩(wěn)定的高抗過敏活性。文檔編號A61K35/74GK101772571SQ200880016410公開日2010年7月7日申請日期2008年3月27日優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日發(fā)明者粟山仁,西田武央申請人:麒麟控股株式會社
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