專利名稱：磷鉑及其在治療順鉑和卡鉑耐藥性癌中的用途的制作方法
磷鉑及其在治療順鉑和卡鉑耐藥性癌中的用途相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)根據(jù)35U. S. C.第119(e)款要求2007年8月6日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申 請(qǐng)?zhí)?0/954，126以及2007年9月20日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/973，926的優(yōu)先權(quán) 權(quán)益，這兩個(gè)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)均以其全部?jī)?nèi)容通過(guò)弓I用并入本文。
背景技術(shù)：
由于順二氨合二氯鉬(II)(順鉬)用于治療卵巢癌、睪丸癌、頭頸癌及其他形式癌的極大成功，鉬二胺絡(luò)合物是本領(lǐng)域中熟知的。此外，順鉬與其他治療方案包括放射治療聯(lián) 合應(yīng)用。這種鉬化療藥在細(xì)胞循環(huán)G2期介導(dǎo)凋亡，主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制和通過(guò)復(fù)制抑制進(jìn) 程，尤其在大劑量時(shí)。以鏈內(nèi)和鏈間兩種模式通過(guò)鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤堿基N7位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合至 DNA，通常被認(rèn)為在轉(zhuǎn)導(dǎo)大量的導(dǎo)致凋亡的細(xì)胞響應(yīng)中的關(guān)鍵分子事件。盡管順鉬非常有效，但是它表現(xiàn)出腎臟的、與腎有關(guān)的和神經(jīng)的毒性。而且，許多 患者隨著時(shí)間對(duì)順鉬治療產(chǎn)生耐藥性，因而不能通過(guò)順鉬治療來(lái)治愈。FDA批準(zhǔn)的兩種其他 鉬藥物，卡鉬(二氨合-1，1-環(huán)丁燒二羧酸-鉬(II) (diammine-1,1-dicarcarboxylatocy clobutane-platinum(II))和奧沙利鉬(二氨合-草酸鉬(II))，也被認(rèn)為是以與順鉬類(lèi)似 的方式起作用?？ㄣf對(duì)順鉬耐藥的腫瘤細(xì)胞特別有效，但是為了有效地治療對(duì)順鉬耐藥的 患者，需要相對(duì)大的劑量。這種大劑量同樣具有相關(guān)的毒性。已合成了許多新的鉬胺絡(luò)合物，并測(cè)試了它們的抗癌活性。然而，這些絡(luò)合物中只 有幾個(gè)(其中一些列于

圖14中)表現(xiàn)出有前景的結(jié)果。這些新絡(luò)合物包含了各種可替換 的非胺配體，以及被認(rèn)為對(duì)DNA結(jié)合和細(xì)胞攝取重要的非可替換的胺配體。通常，本領(lǐng)域 中已知的這些及其他相關(guān)的鉬氨合絡(luò)合物是通過(guò)制備順鉬的方法來(lái)合成的，即四氯鉬酸鹽 (PtCl42O接受胺配體而變成PtCl2(胺/ 二胺)。以該四氯絡(luò)合物起始，通常提供其他的產(chǎn) 品，因此為了確保順式異構(gòu)體的高收率和純度，同樣可以使用Ptl42_，隨后將Ptl42_轉(zhuǎn)化為 PtI2 (胺/ 二胺)，且然后轉(zhuǎn)化成PtCl2 (胺/ 二胺)。在將PtI2 (胺/ 二胺)轉(zhuǎn)化為PtCl2 (胺 / 二胺)時(shí)，通過(guò)用二當(dāng)量的硝酸銀或其他可溶性銀鹽在低PH下處理該二碘絡(luò)合物來(lái)將該 二碘絡(luò)合物轉(zhuǎn)化為二水合絡(luò)合物(diaqua complex)。得到的二水合絡(luò)合物易于與氯化鉀 或鹽酸反應(yīng)而生成目標(biāo)的該二氯絡(luò)合物。通常，目標(biāo)鉬絡(luò)合物是從相應(yīng)的二水合絡(luò)合物在 低PH下引入可取代配體而合成的，因?yàn)樵谳^高PH下很快地發(fā)生該二水合絡(luò)合物的二聚或 多聚，產(chǎn)生不期望的產(chǎn)物。在本領(lǐng)域中，鉬胺絡(luò)合物還用氮、硫、羧酸鹽和磷酸鹽作為可替換配體來(lái)代替可替 換的氯配體。然而，那些顯示最有前途治療癌的絡(luò)合物的一個(gè)特點(diǎn)是被配位至鉬(一種軟 酸)的可替換的硬堿配體。這種已顯示優(yōu)異抗癌性質(zhì)的硬-軟結(jié)合的例子是羧酸鉬絡(luò)合物、 碳酸鉬絡(luò)合物、膦酸鉬絡(luò)合物。盡管付出了巨大的努力想用更有效的化療藥代替順鉬，但是帶有磷酸鹽作為可替 換配體的鉬(II)和鉬(IV)絡(luò)合物仍大量未開(kāi)發(fā)。這主要?dú)w因于早期的關(guān)于鉬(II)磷酸 絡(luò)合物的工作通常產(chǎn)生磷酸橋接的雙核絡(luò)合物。盡管已報(bào)道了某些雙核磷酸鉬(II)絡(luò)合 物的優(yōu)異抗癌性質(zhì)，但是對(duì)它們的應(yīng)用的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)由于這些絡(luò)合物在水溶液中溶解性較差而受限。盡管某些單體焦磷酸絡(luò)合物和三磷酸絡(luò)合物是本領(lǐng)域中已知的，但是這種絡(luò)合 物不適用于藥物組合物，因?yàn)樗鼈冊(cè)谥械人嵝匀芤褐羞M(jìn)行磷酸鹽水解，產(chǎn)生不溶性雙核產(chǎn) 物(參見(jiàn)Odani等的US7, 342. 122，描述了在本文中和在Bose等Inorg. Chem. 1985,24, 3989-3996中所描述的單體絡(luò)合物am_2的二聚體；還可參見(jiàn)Odani等的W02005/000858，將 單體的am-2描述為一種潛在的抗癌藥物)。因此，本領(lǐng)域仍然存在這樣的需要用于治療癌的、穩(wěn)定且有效的順鉬及卡鉬替代 物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了磷鉬(phosphaplatins)，穩(wěn)定的、單體的鉬(II)和(IV)磷酸絡(luò)合物 (phosphato complexes)，其具有圖1中所示的通式，其中R1、R2和R3各自獨(dú)立地選自取代 的或未取代的脂肪族胺或芳香族胺，而且其中當(dāng)R1和R2中的一個(gè)為NH3時(shí)，R1和R2中的另 一個(gè)不是NH3 ；而且其中S不存在或者獨(dú)立地選自氫氧化物、乙酸、丁酸和α-羥基酸。本發(fā) 明還提供了制備和分離磷鉬的方法。本發(fā)明還提供了治療癌的方法，通過(guò)對(duì)需要這種治療的患者，單獨(dú)地或者聯(lián)合地， 與藥學(xué)上可接受的載體一起施用有效量的磷鉬，所述癌包括對(duì)順鉬和/或卡鉬耐藥的癌。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示本發(fā)明的鉬(II)和鉬(IV)絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)。Rl、R2和R3各自獨(dú)立地選 自取代的或未取代的脂肪族胺或芳香族胺，其中當(dāng)Rl和R2中的一個(gè)為ΝΗ3時(shí)，則Rl和R2 中的另一個(gè)不是ΝΗ3。在某些實(shí)施方案中，Rl和R2選自胺、甲胺、乙胺、丙胺、異丙胺、丁胺、 環(huán)己胺、苯胺、吡啶和取代的吡啶。在某些實(shí)施方案中，R3選自乙二胺和環(huán)己二胺。S獨(dú)立 地選自氫氧化物、乙酸、丁酸和α-羥基酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明要求了這些化合物 的藥學(xué)上可接受的鹽。圖2顯示一些分離的本發(fā)明絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)，S卩(A) 二氨合(二氫焦磷酸)鉬(II)， 也稱作am-2 ；⑶順式-二氨合-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)，也稱作am-4 ； (C)l，2-乙二胺(二氫焦磷酸)鉬(II)，也稱作en-2; (D)I，2-乙二胺-反式-二羥配位基 (二氫焦磷酸)鉬(1力，也稱作611-4;伍)(反式-1，2-環(huán)己二胺)(二氫焦磷酸)鉬(II)， 也稱作dach-2 ；和(F)(反式-1，2-環(huán)己二胺)-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)， 也稱作dach-4。圖3顯示帶有鈉反離子的am-4的X-射線晶體結(jié)構(gòu)。圖4顯示從焦磷酸一側(cè)所看到的、處于不同構(gòu)象的en-4的X-射線晶體結(jié)構(gòu)。圖5顯示圖2所示絡(luò)合物的質(zhì)子化程度，通過(guò)31P化學(xué)位移作為PH函數(shù)進(jìn)行測(cè)定。 估算的酸度常數(shù)列于表1。這些數(shù)據(jù)提供了對(duì)于這些絡(luò)合物在酸性溶液與中性溶液之間溶 解性差異的了解。在所公開(kāi)的PH值低于2的條件下，這些絡(luò)合物被完全質(zhì)子化，于是預(yù)期表現(xiàn)出降低的溶解性。圖6表現(xiàn)出dach-2在(A) pH 4. 2和(B)pH 8時(shí)差異的穩(wěn)定性。在pH 8時(shí)，通過(guò) 已配位焦磷酸根離子至鉬(II)長(zhǎng)達(dá)六天的保持所證明的，沒(méi)有dach-2分解被觀察到。相 反地，在pH 4. 2時(shí)，因游離焦磷酸鹽信號(hào)的出現(xiàn)，顯著分解是明顯的。在每個(gè)圖板的底部圖 譜起，以24小時(shí)的時(shí)間間隔來(lái)記錄圖譜。圖7是在順鉬和卡鉬耐藥性人卵巢細(xì)胞系(A2780/C30)中作為微摩爾濃度函數(shù)的dach-2、順鉬和卡鉬細(xì)胞毒性作用的對(duì)照?qǐng)D。該細(xì)胞系對(duì)30微摩爾順鉬和100微摩爾卡鉬是耐藥的。圖8是dach-2與FDA已批準(zhǔn)的順鉬和卡鉬抗癌藥對(duì)人卵巢細(xì)胞系(A2780)的細(xì) 胞毒性作用的對(duì)比圖。圖9表示dach-2對(duì)(A)順鉬敏感性和(B)順鉬耐藥性的頭頸癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒 性。dach-2用于順鉬敏感性細(xì)胞的IC50值低于1微摩爾，而用于順鉬耐藥性細(xì)胞的IC50 值，低于5微摩爾。圖10顯示在一定濃度下，相比于順鉬，dach-2被細(xì)胞所攝取的量(用原子吸收光 譜法檢測(cè))減少。例如，在10 μ M濃度下，順鉬在A2780細(xì)胞中的積聚為3. Ong Pt/ΙΟ6細(xì) 胞，而dach-2顯示為1. Ong Pt/ΙΟ6細(xì)胞。對(duì)于其他濃度，鉬積聚保持相似的趨勢(shì)。圖11顯示作為人卵巢細(xì)胞系(A2780)中濃度的函數(shù)的順鉬結(jié)合DNA的程度，在培 育順鉬持續(xù)2小時(shí)后用原子吸收光譜法檢測(cè)。當(dāng)用高達(dá)50微摩爾濃度的dach-2處理A2780 細(xì)胞時(shí)，甚至當(dāng)處理細(xì)胞持續(xù)24小時(shí)后，通過(guò)相同的技術(shù)，沒(méi)有結(jié)合DNA的鉬被檢測(cè)到。圖12是通過(guò)質(zhì)子NMR光譜法在順鉬(底部)、am-2 (中部)和dach-2 (上部)中 鳥(niǎo)嘌呤堿基結(jié)合(順鉬主要的DNA結(jié)合位點(diǎn))的比較。上部的圖譜顯示了游離的鳥(niǎo)嘌呤堿 基的一個(gè)信號(hào)，即在8. 05ppm處的嘌呤環(huán)的H8氫，底部圖譜顯示了由于鳥(niǎo)嘌呤通過(guò)該嘌呤 環(huán)的N7位點(diǎn)結(jié)合至順鉬而導(dǎo)致的在8. 43ppm處的H8質(zhì)子的另一個(gè)信號(hào)，而中部圖譜僅顯 示未結(jié)合的鳥(niǎo)嘌呤H8信號(hào)而非鉬結(jié)合的信號(hào)。在48小時(shí)后記錄底部圖譜。在96和106小 時(shí)后分別記錄中部和上部的圖譜。本發(fā)明絡(luò)合物未共價(jià)地結(jié)合鳥(niǎo)嘌呤堿基(順鉬、卡鉬和 奧沙利鉬的DNA結(jié)合位點(diǎn))，這表明了不同于針對(duì)順鉬所提出的那些凋亡機(jī)理的凋亡機(jī)理。圖13顯示1H NMR光譜數(shù)據(jù)，證實(shí)在經(jīng)dach-2處理的人卵巢細(xì)胞中缺乏DNA結(jié) 合。在相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中，以比細(xì)胞劑量高250倍的濃度，dach-2與雙鏈的小牛胸腺DNA、合成 的寡核苷酸(5’ -ATGATTTAGGTGACACTATAGCAGT-3’)、二核苷酸(dGpG)以及單磷酸核苷酸 (5' -dGMP和5' -dAMP)反應(yīng)。以1H NMR光譜法監(jiān)測(cè)DNA結(jié)合的程度。在平行實(shí)驗(yàn)中， 在同樣條件下進(jìn)行與順鉬相似的反應(yīng)。圖中顯示了使用25-mer寡核苷酸的典型NMR實(shí)驗(yàn) 結(jié)果，其表明了 dach-2未表現(xiàn)出任何可檢測(cè)到的DNA結(jié)合，而順鉬易于與DNA形成共價(jià)加 合物，誠(chéng)如在8. 4至8. 95ppm區(qū)域內(nèi)新信號(hào)形成所證明的。然而，順鉬易于與上述所有的核 苷酸都形成加合物，而甚至7天之后也沒(méi)有dach-2結(jié)合至核苷酸的可檢測(cè)NMR信號(hào)被觀察 到。圖14顯示一些本領(lǐng)域中已知的、有活性的鉬絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)，它們?cè)诒挥米魉幬铩?作為潛在藥物正被評(píng)價(jià)或者在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。圖15顯示用于形成圖1磷鉬絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)；X是鹵素，R1、R2和R3各自獨(dú)立地選 自取代的或未取代的脂肪族胺或芳香族胺。詳述本文提供了用于癌治療的、穩(wěn)定的、單體的鉬(II)和(IV)焦磷酸鹽絡(luò)合物(命名 為磷鉬)，所述癌治療包括順鉬和/或卡鉬耐藥性癌的治療。通常，磷鉬不易進(jìn)行水解，可溶 在中性PH的水溶液中，而且在中性pH水溶液中是穩(wěn)定的。而且，磷鉬顯示在癌細(xì)胞系中普 遍的細(xì)胞毒性，并且在對(duì)順鉬和卡鉬中一種或兩種均耐藥的細(xì)胞系中有效。因此，與已知的 鉬抗癌藥相比，磷鉬在誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡方面是有效的，而且在有些情況下更有效，并且在適于患者用藥的溶液中表現(xiàn)出期望的穩(wěn)定性和溶解性。如本文提及本發(fā)明磷鉬所使用的，穩(wěn) 定的是指當(dāng)被維持在PH范圍為6-8的水溶液中持續(xù)2天至六天之間的時(shí)間段時(shí)該絡(luò)合物 的抗水解性。認(rèn)為與順鉬、卡鉬以及相關(guān)的基于鉬的抗癌劑不同，磷鉬非共價(jià)鍵地結(jié)合DNA。由 于順鉬耐藥性被認(rèn)為是源自包括核切除修復(fù)酶的各種酶對(duì)DNA損傷的有效修復(fù)，而且由于 磷鉬非共價(jià)地結(jié)合DNA，所以因DNA修復(fù)機(jī)理導(dǎo)致磷鉬耐藥性是不可能的。數(shù)據(jù)表明，磷鉬 引發(fā)fas及fas相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和某些促凋亡基因如Bak和Bax的過(guò)度表達(dá)。此外，磷鉬的 細(xì)胞結(jié)合遠(yuǎn)小于順鉬，另外磷鉬表現(xiàn)出極大的細(xì)胞毒性。因此，本發(fā)明提供了具有不同于本 領(lǐng)域那些分子靶的、有效的鉬抗癌劑。在一些實(shí)施方案中，該絡(luò)合物具有圖1所示的通式，其中Rl、R2和R3各自獨(dú)立地選自取代的或未取代的脂肪族胺或芳香族胺，其中當(dāng)Rl和R2中的一個(gè)為NH3時(shí)，則Rl和 R2中的另一個(gè)不是NH3。在某些實(shí)施方案中，Rl和R2選自胺、甲胺、乙胺、丙胺、異丙胺、丁 胺、環(huán)己胺、苯胺、吡啶以及取代的吡啶。在某些實(shí)施方案中，R3選自乙二胺和環(huán)己二胺。S 獨(dú)立地選自氫氧化物、乙酸、丁酸和α-羥基酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明要求了這些化 合物的藥學(xué)上可接受的鹽。因此，本發(fā)明的抗癌劑包括，在某些實(shí)施方案中，圖2中的絡(luò)合 物。本文還提供了合成與分離穩(wěn)定的單體鉬(II)和(IV)焦磷酸鹽絡(luò)合物的方法。在 一種實(shí)例中，該方法包括將含過(guò)量磷酸鹽與圖15所示的式的鉬絡(luò)合物的含水反應(yīng)混合物 維持在溫度為約30至約60攝氏度下持續(xù)約12至約18小時(shí)的時(shí)間段、ρΗ為約7至約9，來(lái) 形成具有圖1式(I)和(III)的絡(luò)合物，其中R1、R2和R3各自獨(dú)立地選自取代的或未取代 的脂肪族胺或者芳香族胺，而且其中當(dāng)R1和R2中的一個(gè)為NH3時(shí)，則R1和R2中的另一個(gè)不 是NH3 ；而且其中X獨(dú)立地選自鹵素。圖15中所示的絡(luò)合物可用任何適宜的方式制備。在一些如本領(lǐng)域通常所描述的 實(shí)例中，可通過(guò)加入碘化鉀而將K2PtCl4轉(zhuǎn)化成K2PtI4來(lái)制備順式-(胺/二胺)二氯鉬(II) 絡(luò)合物。然后它與期望的胺配體反應(yīng)。然后通過(guò)加入二當(dāng)量的硝酸銀，將得到的順式-(胺 /二胺)二碘鉬(II)絡(luò)合物原位轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的順式-(胺/二胺)二水合鉬(II)絡(luò)合物。 通過(guò)加入氯化鉀，將該順式-二水合物[Pt(胺/二胺)2(H2O)22+]轉(zhuǎn)化為順式-二氯絡(luò)合物。應(yīng)當(dāng)理解是，也可采用其他適宜的反應(yīng)條件。例如，在一些實(shí)施方案中，溫度可以 是從約35至約45°C。因此，反應(yīng)溫度可以是從約30-31、31-32、32-33、33-34、34-35、35-36、 36-37,37-38,38-39,39-40,40-41,41-42,42-43,43-44,44-45,45-46,46-47,47-48, 48-49、49-50、50-51、51-52、52-53、53-54、54-55、55-56、56-57、57-58、58-59、59-60 "C,以 及它們之間的增量。在40°C已獲得了優(yōu)良的結(jié)果。在一些實(shí)例中，使反應(yīng)進(jìn)行約13至約16 小時(shí)。因此，反應(yīng)時(shí)間可以是從約12-13、13-14、14-15、15-16、16-17和17-18小時(shí)，以及它 們之間的增量。在反應(yīng)15個(gè)小時(shí)已獲得優(yōu)良的結(jié)果。在一些實(shí)例中，ρΗ可以是從約6-7、 7-8和8-9，以及它們之間的增量。在ρΗ約為8，已獲得了優(yōu)良的結(jié)果。所述方法還包括隨后濃縮含水反應(yīng)混合物使得不形成焦磷酸鹽沉淀。應(yīng)當(dāng)理解 為，可用任何適宜的方式濃縮含水反應(yīng)混合物。例如，可用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮含水反應(yīng)混合物。所述方法還包括通過(guò)加入一種適宜的酸來(lái)將反應(yīng)混合物的ρΗ迅速降至ρΗ小于約 2。在一些實(shí)例中，可用硝酸來(lái)降低ρΗ。在一些實(shí)施方案中，ρΗ是在約1與約2之間的范圍。在pH 1時(shí)已獲得了優(yōu)良的結(jié)果。在一些實(shí)例中，所述方法也包括在濃縮反應(yīng)混合物后使反應(yīng)混合物到5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。在另外的實(shí)例中，所述方法也包括在降低反應(yīng)混合物PH之后將反應(yīng) 混合物冷卻至5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了形成根據(jù)圖I(II)和(IV)絡(luò)合物的方法。該 方法如上所述，但還包括在維持反應(yīng)混合物在約30至約60攝氏度的溫度下持續(xù)約12至約 18小時(shí)的時(shí)間段、pH為約7至約9之后，向反應(yīng)混合物加入過(guò)氧化氫，以及選自乙酸鹽、丁 酸鹽和α-羥基酸的鹽的任選試劑。在一些實(shí)例中，在濃縮反應(yīng)混合物前與過(guò)氧化氫一起加入的任選試劑選自乙酸 鈉、丁酸鈉以及α-羥基丁酸鈉鹽。在另外的實(shí)例中，在濃縮反應(yīng)混合物前與過(guò)氧化氫一起 加入的任選試劑選自乙酸鉀、丁酸鉀以及α-羥基丁酸鉀鹽。本文所述的單體絡(luò)合物的合成和分離方法可以有別于現(xiàn)有技術(shù)，因?yàn)樾路椒ú划a(chǎn) 生二聚或寡聚的磷酸鹽化合物。例如，Bose等在Inorg. Chem. 1985，24，3989-3996 (〃 Bose 1985")中所報(bào)道的方法，它包括通過(guò)在中性pH下將陰離子焦磷酸絡(luò)合物吸附在陰離子交 換樹(shù)脂上并且用較低pH洗脫液對(duì)其洗脫來(lái)從反應(yīng)混合物中分離Pt (NH3) 2 (H2P2O7) (am-2)， 該方法對(duì)于am-4、en-2、en-4、dach-2以及dach-4的合成和分離是無(wú)用的。當(dāng)使用Bose 1985方法時(shí)，在嘗試用較低pH電解液洗脫而進(jìn)行分離時(shí)這些絡(luò)合物在離子交換床上分解。 最初，絡(luò)合物變成棕黑色，隨后在離子交換樹(shù)脂內(nèi)形成不溶性黑色沉淀物。只有對(duì)Bose 1985方法進(jìn)行如本文所述的改進(jìn)，才可能從其各自反應(yīng)混合物中分離am-4、en-2、en-4、 dach-2以及dach-4。用真空蒸發(fā)將每個(gè)反應(yīng)混合物濃縮至當(dāng)在下列步驟中降低pH(焦磷 酸鹽配體的溶解性隨著PH而變化很大)時(shí)未反應(yīng)的焦磷酸不會(huì)沉淀出的程度。為了引起 選擇性沉淀，最終的濃度為0. 05M與0. 08M之間，因?yàn)轶w積的進(jìn)一步減少導(dǎo)致了反應(yīng)過(guò)程中 必須過(guò)量存在的未反應(yīng)焦磷酸鹽的共沉淀。濃縮后，將反應(yīng)混合物冷卻，并將PH迅速調(diào)低 至1. 0，以便利用絡(luò)合物的質(zhì)子化與去質(zhì)子化形式之間的溶解度差異來(lái)誘導(dǎo)沉淀。在中性pH時(shí)，本發(fā)明的分離的單體Pt (II)和Pt (IV)絡(luò)合物是穩(wěn)定的。如31PNMR 譜所示，在PH 6-8的范圍內(nèi)，該絡(luò)合物沒(méi)有經(jīng)受因?yàn)樵谥行詐H水溶液中經(jīng)六天的時(shí)間間隔 后胺或焦磷酸鹽配體喪失而導(dǎo)致的任何解絡(luò)合物形成作用(deligation)。但是，在相同的 時(shí)間間隔、PH 4. 2，通過(guò)在-10. 3ppm處游離焦磷酸鹽信號(hào)的出現(xiàn)，因焦磷酸鹽配體釋放導(dǎo) 致的緩慢的解絡(luò)合物形成作用是明顯的。同時(shí)，形成不溶性焦磷酸橋接的雙核鉬(II)產(chǎn) 物。數(shù)據(jù)也表明酸分解大大地取決于酸度_酸度越高，分解越快(參見(jiàn)圖5，表1和表2)。表1.去質(zhì)子化的鉬(II)和鉬(IV)焦磷酸絡(luò)合物的化學(xué)位移(d，ppm)以及Pt-P偶合常數(shù)δ -31P δ -195Pt絡(luò)合物ppmppmJP-Pt,Hzam-22. 12-1503 23. 44dach-21. 78-172925. 03en-21. 93N/A29. 73am-42. 32173315. 38dach-42. 41161325. 91
en-42. 35158225. 91表2.從磷-31化學(xué)位移確定的Pt (II)-和Pt (IV)-焦磷酸絡(luò)合物的計(jì)算的 PKa (酸度常數(shù)的log)值絡(luò)合物PKa1pKa2am-22. 9 士 0.3 4. 7 士 0. 2(3. 8 士 0.1)en-22. 2 士 0. 1 4. 4 士 0. 1dach-22. 6 士 0.2 4. 4 士 0. 2(3. 3 士 0.1)am-42.0 士 0.1 4. 7 士 0. 1en-4<24. 3 士 0. 1本發(fā)明的絡(luò)合物用于治療各種癌是有用的。人卵巢細(xì)胞系(A2780)和中國(guó)卵巢細(xì) 胞(CHO)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)證明，這些絡(luò)合物作為第一輪治療是有效的，而且對(duì)于順鉬和卡 鉬均耐藥的卵巢細(xì)胞(C30)的試驗(yàn)(參見(jiàn)表3)表明，這些絡(luò)合物適合于耐藥性癌的第二輪 治療。本發(fā)明絡(luò)合物是特別期望的，因?yàn)樗鼈兛蓽p少體內(nèi)毒性。相比于順鉬，這些絡(luò)合物 以減少的量被細(xì)胞所攝取，表明與順鉬及其他鉬抗癌治療藥的劑量相比可能需要較低的劑 量。例如，在10 μ M濃度，在A2780細(xì)胞中順鉬積聚為3. Ong Pt/ΙΟ6細(xì)胞，而dach_2顯示 為l.Ong Pt/ΙΟ6細(xì)胞，而且在耐藥性細(xì)胞系中dach-2顯示為在其IC50值處1. 4ngPt/106 細(xì)胞，而順鉬顯示為> 5ng Pt/106細(xì)胞，然而前者絡(luò)合物的IC5tl值小于后者絡(luò)合物的一半 (參見(jiàn)圖10和表4)。表3.磷鉬、順鉬和卡鉬在A270和A2780/C30、CH0細(xì)胞系中的按μ M濃度的IC50
值絡(luò)合物Α780A2780/C30 CHO順鉬7. 5 士 1.5 110 士 11. 29 29 士 3卡鉬90 士 13 > 200>200dach-220 士 448 士 535 士 5dach-4 180士15 155士17116士17am-2100士 11 > 200120 士 30am-4175 士 22 > 200>200en-4170 士 33 > 200>200表4.順鉬和焦dach-2 (pyrodach-2)在A2780與A2780/C30細(xì)胞系中對(duì)比的鉬細(xì)胞積聚(ng/ΙΟ6細(xì)胞)A2780A2780/C30濃度(μΜ) 順鉬dach-2順鉬dach-2103.00 士 0· 05 1.00 士 0.20 1.00 士 0.10 1.00 士 0.08205. 00 士 0.06 1. 50 士 0. 30 2. 00 士 0.40 1.00 士 0.02306. 00 士 0.10 3. 00 士 1.00 2. 00 士 0.50 1.00 士 0.025020. 00 士 1.00 5. 00 士 0.30 5. 00 士 1.00 2. 00 士 0.10數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的絡(luò)合物可通過(guò)與順鉬和其他鉬藥物不同的分子機(jī)理與細(xì)胞機(jī)理來(lái)誘導(dǎo)凋亡。首先，不存在共價(jià)鍵合(參見(jiàn)圖12和實(shí)施例13)表明了本發(fā)明絡(luò)合物不是通過(guò)DNA結(jié)合途徑發(fā)揮作用的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常認(rèn)為，獲得性順鉬耐藥性是由于核 苷酸切除修復(fù)過(guò)程將鉬從DNA有效地去除。因?yàn)槊黠@不存在DNA結(jié)合，所以在本發(fā)明的絡(luò) 合物上不可能進(jìn)行DNA修復(fù)機(jī)理，對(duì)該絡(luò)合物的細(xì)胞耐藥性可被消除。此結(jié)論在細(xì)胞毒性 數(shù)據(jù)中獲得支持，該數(shù)據(jù)表明dach-2在對(duì)順鉬和卡鉬均耐藥的細(xì)胞系中是有活性的(參見(jiàn) 表3)。第二，本發(fā)明的絡(luò)合物是通過(guò)與順鉬及其他鉬藥物不同的分子機(jī)理和細(xì)胞機(jī)理 來(lái)誘導(dǎo)凋亡的證據(jù)，來(lái)自于使dach-2與半胱氨酸和谷胱甘肽反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)(數(shù)據(jù)未標(biāo)出)。 dach-2的焦磷酸鹽配體容易被通過(guò)巰基的伴發(fā)的絡(luò)合物形成作用而替換，表明通過(guò)半胱氨 酸或甲硫氨酸殘基的細(xì)胞表面蛋白的可能的蛋白質(zhì)錨定位點(diǎn)。第三，本發(fā)明的絡(luò)合物是通過(guò)與順鉬及其他鉬藥物不同的分子機(jī)理和細(xì)胞機(jī)理來(lái) 誘導(dǎo)凋亡的證據(jù)，也來(lái)自于關(guān)于fas及其相關(guān)成員的過(guò)度表達(dá)的實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)實(shí)施例11)。對(duì) 本發(fā)明絡(luò)合物反應(yīng)的這種過(guò)度表達(dá)，說(shuō)明了在表現(xiàn)本發(fā)明絡(luò)合物的細(xì)胞毒性活性方面極可 能涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而非DNA損傷途徑。當(dāng)用本發(fā)明絡(luò)合物處理細(xì)胞時(shí)，平均地，fas被 過(guò)度表達(dá)六倍，而在用順鉬處理的細(xì)胞中沒(méi)有顯著的過(guò)度表達(dá)被觀察到。如本文所述的，本發(fā)明絡(luò)合物與經(jīng)常使用的順鉬和卡鉬相比一樣有效或者更有 效，因此為早期缺乏有效的順鉬和卡鉬治療的替代選擇的患者提供了一種癌治療方法。但 是，患者不必為了用本文所述的絡(luò)合物以及方法治療而先用順鉬或卡鉬治療，這種治療的 用藥可由醫(yī)療人員在醫(yī)院或其他醫(yī)療設(shè)施里實(shí)施。本發(fā)明絡(luò)合物的用藥和劑量是根據(jù)良好醫(yī)學(xué)執(zhí)業(yè)規(guī)范，考慮到個(gè)體患者臨床病 況，用藥的部位和方法，用藥方案，患者的年齡、性別、體重以及醫(yī)療從業(yè)者已知的其他因 素。因此，本文所用的藥學(xué)上“有效量”是由本領(lǐng)域已知的這類(lèi)考慮而決定的。該量必須是 有效的以實(shí)現(xiàn)改善，所述改善包括但不限于改善存活率或更快的康復(fù)，或者改善或消除癥 狀以及被本領(lǐng)域技術(shù)人員選為合適措施的其他指標(biāo)?？蓪⒈景l(fā)明絡(luò)合物向動(dòng)物包括哺乳動(dòng) 物用藥。在本發(fā)明的治療方法中，可以各種方式施用本發(fā)明絡(luò)合物。應(yīng)當(dāng)注意的是，它們可 作為絡(luò)合物而被施用，而且可利用這些絡(luò)合物優(yōu)異溶解性而單獨(dú)地以水溶液施用，或者作 為活性成分與藥學(xué)上可接受載體、稀釋劑、佐劑和媒介物組合。該絡(luò)合物可口服地，皮下地 或非胃腸地包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、扁桃體內(nèi)和鼻內(nèi)用藥，以及鞘內(nèi)和輸注技術(shù) 而給藥。絡(luò)合物植入體也是有用的。治療的患者是溫血?jiǎng)游?，以及特別是包括人的哺乳動(dòng) 物。所述藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、佐劑和媒介物以及植入物載體通常是指與本發(fā)明活 性成分不反應(yīng)的、惰性的、無(wú)毒的固態(tài)或液態(tài)填充物、稀釋劑或包封材料。所述劑量可以是單次劑量或超過(guò)數(shù)天時(shí)間的多次劑量。治療的時(shí)間通常與病程的 時(shí)間和藥物的有效性以及治療患者的種類(lèi)成比例。當(dāng)非胃腸施用本發(fā)明絡(luò)合物時(shí)，通常將它們配制成單位劑量可注射形式(溶液、 混懸劑、乳劑)。適于注射的藥用制劑包括無(wú)菌水溶液或分散液以及重組為無(wú)菌可注射溶液 或分散液用的無(wú)菌粉。所述載體可以是溶劑或分散媒介，其含有例如水、乙醇、多元醇(例 如，甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇及類(lèi)似物)、它們適宜的混合物以及植物油。可保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，例如通過(guò)使用如卵磷脂的包衣，通過(guò)在分散液情形下維持所需的顆粒大小以及通過(guò)使用表面活性劑。非水性媒介物如棉籽油、芝麻油、橄欖油、豆油、 玉米油、向日葵油、或花生油及酯諸如肉豆蔻異丙酯，也可用作組合物的溶劑體系。另外，可 以加入各種提高組合物穩(wěn)定性、無(wú)菌性和等滲性的添加劑，包括抗菌防腐劑、抗氧化劑、螯 合劑和緩沖劑?？赏ㄟ^(guò)各種抗菌劑和抗真菌劑，例如尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及類(lèi)似 物，來(lái)確保防止微生物的作用。在許多情況下，比較理想的是包含等滲劑，例如糖、氯化鈉及 類(lèi)似物?？赏ㄟ^(guò)使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來(lái)產(chǎn)生可注射藥用形式的延長(zhǎng) 的吸收。然而，根據(jù)本發(fā)明，所使用的任何媒介物、稀釋劑或添加劑都得是與本發(fā)明絡(luò)合物 相容的。將實(shí)施本發(fā)明所用的絡(luò)合物與各種所需的其他成分一起加入所需量的合適溶劑中，可制備無(wú)菌的可注射溶液?？梢杂每勺⑸渲苿?duì)患者施用本發(fā)明的藥理學(xué)制劑，該制劑包括任何相容性載體，諸如各種媒介物、佐劑、添加劑和稀釋劑；或者本發(fā)明中所用的絡(luò)合物可以對(duì)患者非胃 腸用藥，以緩釋皮下植入體或靶向傳輸系統(tǒng)如單克隆抗體、定向傳輸、離子導(dǎo)入、聚合物基 質(zhì)、脂質(zhì)體以及微球的形式。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，許多其他這類(lèi)植入體、傳輸系統(tǒng) 和模式都是熟知的。參照下面的實(shí)驗(yàn)性實(shí)例來(lái)進(jìn)一步詳述本發(fā)明。提供這些實(shí)例只是為了舉例說(shuō)明， 而不意欲是限制性的。因此，應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明解釋為包含了由于本文所提供的教導(dǎo)而將會(huì)變 得明顯的任何及全部的變化。以上描述及隨后的實(shí)例說(shuō)明了以與之前所披露的合成方法不同的方式合成焦磷 酸鉬絡(luò)合物。已顯示這些絡(luò)合物具有抗癌活性，包括在順鉬和卡鉬耐藥性癌中。令人預(yù)料 不到地，所顯示的抗癌活性是與一些當(dāng)前施用的鉬絡(luò)合物相當(dāng)?shù)?，并且在相?duì)較低劑量下 是比一些當(dāng)前施用的鉬絡(luò)合物有活性的。同樣令人預(yù)料不到地，數(shù)據(jù)表明了本發(fā)明絡(luò)合物 具有與當(dāng)前施用的鉬絡(luò)合物不同的作用機(jī)理，即它們?cè)谥委熯^(guò)程中不結(jié)合DNA。因此，本發(fā) 明絡(luò)合物代表了用于治療癌有用的新類(lèi)別的鉬治療藥，所述癌包括之前難于實(shí)現(xiàn)有效治療 的順鉬和卡鉬耐藥性癌。本發(fā)明是以示例性方式進(jìn)行描述，并且應(yīng)當(dāng)理解為，所使用的術(shù)語(yǔ)意欲是具有詞 語(yǔ)描述性質(zhì)，而非限制性的。顯然，根據(jù)本文教導(dǎo)，本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化是可能的。因 此，應(yīng)當(dāng)理解為，在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以如具體描述不同的其它方式實(shí) 施。實(shí)施例1 二氨合(二氫焦磷酸)鉬(II) (am-2)將焦磷酸鈉十水合物(0. 4g)和0. Ig順鉬溶于250mL蒸餾水中，pH 8，并于40°C培 育15小時(shí)。培育期后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮該溶液至5-10mL，并過(guò)濾以除掉任何未反應(yīng)的起始 材料。通過(guò)加入IN HNO3來(lái)迅速將pH降至約1.0，沉淀出淡黃色粉末的產(chǎn)物。在冰上冷卻 來(lái)完成沉淀，并且通過(guò)真空過(guò)濾來(lái)分離產(chǎn)物，并用冷水和丙酮洗滌。得到Pt (NH3)2 (H2P2O7) 0. 04g(30% )0 31P NMR譜圖顯示了在2. 12ppm處單峰，pH 7. 99，參照85%磷酸的外標(biāo)。 在-1503ppm處檢測(cè)到195Pt NMR共振。實(shí)施例2 順式-二氨合-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV) (am-4)將焦磷酸鈉十水合物(0. 4g)和0. Ig順鉬溶于250mL蒸餾水中，pH 8，并于40°C培 育15小時(shí)。培育期后，將ImL 30% H2O2加至反應(yīng)混合物，并使反應(yīng)再進(jìn)行3小時(shí)。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮該溶液至5-10mL，過(guò)濾以除掉任何未反應(yīng)的起始材料。通過(guò)加入IN HNO3來(lái)迅速 將PH降至約1. 0，沉淀出淡黃色的粉末的產(chǎn)物。在冰上冷卻來(lái)完成沉淀，并且通過(guò)真空過(guò)濾 來(lái)分離產(chǎn)物，并用冷水和丙酮洗滌。得到順式，反式-Pt (NH3)2 (OH)2 (H2P2O7) 0. 05g(34%)o 31P NMR譜圖顯示了在2.32ppm處單峰，pH 8. 11，以及195Pt-31P耦合常數(shù)為15. 4Hz。195Pt NMR譜圖顯示了在1733ppm處五重峰，以及195Pt-14N耦合常數(shù)為232Hz。實(shí)施例3 :1，2-乙二胺(二氫焦磷酸)鉬(II) (en-2)將焦磷酸鈉十水合物(0. 4g)和0. Ig 二氯(乙二胺)鉬(II)溶于250mL蒸餾水中，pH 8，并于40°C培育15小時(shí)。培育期后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮該溶液至5-10mL，并過(guò)濾以除 掉任何未反應(yīng)的起始材料。通過(guò)加入IN HNO3來(lái)迅速將pH降至約1.0，未沉淀出產(chǎn)物。用 31P NMR來(lái)原位表征產(chǎn)物。在31P NMR譜圖中觀察到1.93ppm處單峰，以及195Pt-31P常數(shù)為 29.73Hz。實(shí)施例4 1，2-乙二胺-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV) (en-4)將焦磷酸鈉十水合物(0. 4g)和0. Ig 二氯(乙二胺)鉬(II)溶于250mL蒸餾水 中，PH 8，并于40°C培育15小時(shí)。培育期后，將ImL 30% H2O2加至反應(yīng)混合物，并使反應(yīng) 再進(jìn)行3小時(shí)。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮該溶液至5-10mL，并過(guò)濾以除掉任何未反應(yīng)的起始材 料。通過(guò)加入IN HNO3來(lái)迅速將pH降至約1. 0，沉淀出淡黃色粉末的產(chǎn)物。在冰上冷卻來(lái)完 成沉淀，并且通過(guò)真空過(guò)濾來(lái)分離產(chǎn)物，并用冷水和丙酮洗滌。得到反式-Pt(OH)2(C2H8N2) (H2P2O7) 0. 07g(49% )。31P NMR 譜圖顯示了在 2. 30ppm 處單峰，pH 8. 13，以及 195Pt-31P 耦 合常數(shù)為25. 9Hz。195Pt NMR譜圖顯示在1582ppm處寬峰。實(shí)施例5 :(反式-1，2-環(huán)己二胺)(二氫焦磷酸)鉬(II) (dach-2)將焦磷酸鈉十水合物(0.4g)和0. Ig 二氯(反式-1，2-二氨基環(huán)己基)鉬(II) 溶于250mL蒸餾水中，pH 8，并于40°C培育15小時(shí)。培育期后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮該溶液至 5-10mL,并過(guò)濾以除掉任何未反應(yīng)的起始材料。通過(guò)加入IN HNO3來(lái)迅速將pH降至約1. 0， 沉淀出淡黃色粉末的產(chǎn)物。在冰上冷卻來(lái)完成沉淀，并且通過(guò)真空過(guò)濾來(lái)分離產(chǎn)物，并用冷 水和丙酮洗滌。得到反式-Pt (C6H14N2) (H2P2O7) 0. 05g(38%)o31P NMR譜圖顯示了在 1. 78ppm 處單峰，pH 7. 93，以及195Pt-31P常數(shù)為25. 03Hz。在-1729ppm處記錄到195Pt NMR信號(hào)。實(shí)施例6:(反式-1，2-環(huán)己二胺)_反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV) (dach-4)將焦磷酸鈉十水合物(0.4g)和0. Ig 二氯(反式-1，2-二氨基環(huán)己基)鉬(II) 溶于250mL蒸餾水中，pH 8，并于40°C培育15小時(shí)。培育期后，將ImL 30% H2O2加至反應(yīng) 混合物，并使反應(yīng)再進(jìn)行3小時(shí)。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來(lái)濃縮該溶液至5-10mL，并過(guò)濾以除掉 任何未反應(yīng)的起始材料。通過(guò)加入INHNO3來(lái)迅速將pH降至約1.0，沉淀出淡黃色粉末的 產(chǎn)物。在冰上冷卻來(lái)完成沉淀，并且通過(guò)真空過(guò)濾來(lái)分離產(chǎn)物，并用冷水和丙酮洗滌。得到 反式-Pt(OH)2(C6H14N2) (H2P2O7) 0. 07g(52% )。31P NMR 譜圖顯示了在 2. 41ppm 處單峰，pH 7. 95，以及195Pt-31P耦合常數(shù)為25. 9Hz。195Pt NMR譜圖顯示了在1613ppm處寬峰。實(shí)施例7可使用31P NMR光譜法以證實(shí)圖2中所示的以及實(shí)施例1_6中所述的各自的二胺 (焦磷酸)鉬(II)和二胺(二羥配位基)(焦磷酸)鉬(IV)絡(luò)合物是用本文所述的新方法 合成和分離的。
這些絡(luò)合物中的每個(gè)顯示了在化學(xué)位移1. 78-2. 12ppm范圍中單一31PNMR共振。這些化學(xué)位移相比于游離焦磷酸鹽配體是在9-llppm的低場(chǎng)，與本領(lǐng)域所報(bào)道的磷酸鹽螯合 物的已觀測(cè)到配位化學(xué)位移相一致。如不存在預(yù)期的兩組二重峰所揭示的，在最終產(chǎn)品中 未檢測(cè)到單齒的焦磷酸絡(luò)合物。31PNMR數(shù)據(jù)也顯示了用H2O2將Pt (II)絡(luò)合物氧化為Pt (IV) 絡(luò)合物是選擇性的，如在每種情況中單一焦磷酸鉬(IV)絡(luò)合物的形成所證明的。實(shí)施例8人卵巢癌細(xì)胞,A2780，獲得自 Thomas Hamilton 博士(Fox Chase CancerCenter, 費(fèi)城，賓夕法尼亞州)。使用補(bǔ)充了 10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.25單位/mL胰島素以 及青霉素/鏈霉素的RPMI 1640，在連續(xù)充氣5% CO2的371培養(yǎng)箱中單層培養(yǎng)細(xì)胞。為了 維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)，使用在HBSS中0. 0625%的胰蛋白酶將細(xì)胞傳代培養(yǎng)。使用集落形成(clonogenic)試驗(yàn)來(lái)測(cè)定IC50值。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在藥物處理前24小 時(shí)，將來(lái)自單個(gè)細(xì)胞懸浮液的500個(gè)A2780細(xì)胞平鋪在60mm Peri培養(yǎng)皿上，以使細(xì)胞貼壁。 在藥物處理當(dāng)天，將培養(yǎng)基傾析，并用藥物替換，而且將這些已處理的細(xì)胞放回37°C培養(yǎng)箱 中，持續(xù)1小時(shí)。對(duì)于每個(gè)藥物濃度建立一式三份的培養(yǎng)皿。在藥物處理1小時(shí)后，傾析含 藥物的培養(yǎng)基并用新培養(yǎng)基替換。將這些培養(yǎng)皿放回37°C培養(yǎng)箱中，持續(xù)集落形成1星期。 固定集落，并且用在純甲醇中2%結(jié)晶紫染色。對(duì)含50個(gè)細(xì)胞以上的集落計(jì)數(shù)。將來(lái)自一 式三份培養(yǎng)皿的計(jì)數(shù)的集落數(shù)目進(jìn)行平均，將這個(gè)數(shù)目除以所平鋪的細(xì)胞數(shù)目，以獲得集 落形成細(xì)胞的分?jǐn)?shù)值。然后，針對(duì)培養(yǎng)皿效率校正這些集落形成細(xì)胞的分?jǐn)?shù)值，通過(guò)將其除 以在藥物未處理培養(yǎng)皿中集落形成細(xì)胞的數(shù)目。表3顯示了本文所述絡(luò)合物的抗癌活性，以IC50值表示，對(duì)比順鉬和卡鉬。如從 這些數(shù)據(jù)可看到的，在耐藥性細(xì)胞系中dach-2表現(xiàn)出比順鉬和卡鉬兩者均更佳的性質(zhì)。而 且，dach-4顯示了比卡鉬高得多的活性。數(shù)據(jù)也表明，對(duì)于順鉬/卡鉬耐藥性癌細(xì)胞和順 鉬敏感性細(xì)胞，dach-4 一樣有效或更有效，這進(jìn)一步表明磷鉬不可能發(fā)展耐藥性。不同于順鉬和卡鉬，預(yù)計(jì)本發(fā)明的磷酸絡(luò)合物由于磷酸配體的存在而表現(xiàn)出較低 的毒性，其可能有助于有效地將這些絡(luò)合物運(yùn)輸至細(xì)胞。而且，與順鉬不同，這些磷酸絡(luò)合 物在72小時(shí)內(nèi)未顯示出任何可檢測(cè)到的對(duì)DNA的結(jié)合，如圖12所示。順鉬被認(rèn)為是通過(guò) 結(jié)合基因組DNA而發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明的磷酸絡(luò)合物具有不同的細(xì)胞靶。實(shí)施例9順鉬耐藥性卵巢細(xì)胞系(C30) (Hamaguchi等，1993)，獲得自ThomasHamilton博 士(Fox Chase Cancer Center，費(fèi)城，賓夕法尼亞州)，用本發(fā)明的單體鉬絡(luò)合物(圖2所 示)進(jìn)行處理。該細(xì)胞系也是卡鉬交叉耐藥性的。使用補(bǔ)充了 10%胎牛血清、2mM谷氨酰 胺、0. 25單位/mL胰島素以及青霉素/鏈霉素的RPMI 1640，在連續(xù)充氣5% CO2的37°C培 養(yǎng)箱中單層培養(yǎng)細(xì)胞。為了維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)，使用在HBSS中0.025%的胰蛋白酶將細(xì)胞 傳代培養(yǎng)。使用集落形成試驗(yàn)來(lái)測(cè)定IC50值。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在藥物處理前24小時(shí)，將來(lái)自單個(gè) 細(xì)胞懸浮液的500個(gè)C30細(xì)胞平鋪在60mm Petri培養(yǎng)皿上，以使細(xì)胞貼壁。在藥物處理當(dāng) 天，將培養(yǎng)基傾析，并用藥物替換，而且將這些已處理的細(xì)胞放回37°C培養(yǎng)箱中，持續(xù)1小 時(shí)。對(duì)于每個(gè)藥物濃度建立一式三份的培養(yǎng)皿。在藥物處理1小時(shí)后，傾析含藥物的培養(yǎng) 基并用新培養(yǎng)基替換。將這些培養(yǎng)皿放回37°C培養(yǎng)箱中，持續(xù)集落形成1星期。固定集落，并且用在純甲醇中2%結(jié)晶紫染色。對(duì)含50個(gè)細(xì)胞以上的集落計(jì)數(shù)。將來(lái)自一式三份培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)的集落數(shù)目進(jìn)行平均，將這個(gè)數(shù)目除以所平鋪的細(xì)胞數(shù)目，以獲得集落形成細(xì)胞的 分?jǐn)?shù)值。然后，針對(duì)培養(yǎng)皿效率校正這些集落形成細(xì)胞的分?jǐn)?shù)值，通過(guò)將其除以在藥物未處 理培養(yǎng)皿中集落形成細(xì)胞的數(shù)目。實(shí)施例10源自人頭頸鱗狀細(xì)胞癌的UMSCClOb (順鉬敏感性)和UMSCC10b/15s(順鉬耐藥 性)細(xì)胞系，是獲得自加州大學(xué)(圣迭戈)的Stephen B. Howell博士的細(xì)胞系。在含有 10%胎牛血清、100單位/ml青霉素和100μ g/ml鏈霉素的1640RPMI中培養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞接種至24孔板，每孔板中大約20，000個(gè)細(xì)胞/500 μ 1培養(yǎng)基。將細(xì)胞曝露于dach-2，可變 的濃度范圍是1. 12 μ M至最大72 μ Μ。制備dach-2絡(luò)合物的貯存液，并且添加這些溶液的 等份小樣以制備那些有效的濃度。然后，使細(xì)胞生長(zhǎng)72小時(shí)。在本研究中使用了十二種不 同的濃度。每個(gè)濃度具有一個(gè)對(duì)照，總計(jì)12個(gè)對(duì)照?？晒烙?jì)UMSCClOb (順鉬敏感性)的IC50低于1.0 μ M。相比之下，在同樣的細(xì) 胞系中順鉬的 IC50 值為17μΜ(參見(jiàn) Zheng 等，Clinical Cancer Research, 1997,3, 1157-1165)。測(cè)得UMSCC10b/15s (順鉬耐藥性)的IC50為5 μ Μ。圖9顯示了順鉬敏感性 細(xì)胞系和順鉬耐藥性細(xì)胞系的細(xì)胞存活曲線。實(shí)施例11使用包含84個(gè)基因的細(xì)胞凋亡陣列、實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行涉及本發(fā)明絡(luò)合物(數(shù)據(jù)未標(biāo) 示)相比于順鉬的初步基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)，包括了 BCL2超家族，促細(xì)胞凋亡及抗細(xì)胞凋亡兩種， 半胱氨酸蛋白酶，BIR-家族，TNF受體激活劑因子，Ρ53及其同源物、以及fas相關(guān)成員。對(duì) 兩組基因表達(dá)的密切觀察清楚地表明了在表達(dá)模式上的一些不同。例如，fas及fas超家 族基因成員在dach-2處理的細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，而順鉬在這些基因的表達(dá)中引起微小變化。 具體地說(shuō)，fas相比于對(duì)照被過(guò)度表達(dá)6倍，而TNFRS基因諸如TNFRSF-10B比對(duì)照被過(guò)度 表達(dá)2-3倍。這些后者的受體因子屬于fas超家族。有趣的是，觀察到dach-2使促細(xì)胞凋 亡的BCL2成員諸如BAKl和BAX被過(guò)度表達(dá)約2_3倍，而順鉬在它們的表達(dá)中沒(méi)有顯著的 變化。實(shí)施例12鉬的細(xì)胞積聚和DNA結(jié)合的鉬的估算由通過(guò)使用水中的順鉬或焦dach-2所建立的校正曲線，來(lái)在石墨爐原子吸收光 譜儀(Perkin Elmer AA-600)上定量地估算鉬含量。將細(xì)胞(5X106)接種在T75cm2燒瓶 中。24小時(shí)后，然后用不同濃度(0yM、10yM、20yM、30yMfP50yM)的順鉬和焦dach-2 處理這些細(xì)胞。用鉬絡(luò)合物曝露1小時(shí)后，除去含藥物的培養(yǎng)基，并用冰冷的磷酸鹽緩沖的 鹽水(PBS)沖洗細(xì)胞。然后，將細(xì)胞胰蛋白酶化并離心成球團(tuán)。根據(jù)McGahan的方法，在分 析前將細(xì)胞球團(tuán)在濃HNO3和H2O2中浸漬。表4所報(bào)告的數(shù)據(jù)收集自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí) 驗(yàn)進(jìn)行兩次。關(guān)于順鉬積聚，數(shù)據(jù)獲得自給定濃度的單一樣品三次操作。關(guān)于DNA-Pt的檢測(cè)，將1.0X IO7細(xì)胞接種在T75cm2燒瓶中。24小時(shí)后，加入不 同濃度0 μ M、10 μ M、20 μ M、30 μ M禾口 50 μ M的鉬絡(luò)合物。用鉬絡(luò)合物處理細(xì)胞，持續(xù)24小 時(shí)。處理后，除去培養(yǎng)基，而且用冰冷的PBS沖洗。將細(xì)胞胰蛋白酶化并離心成球團(tuán)。使 用Wizard SV DNA純化試劑盒(Promega)來(lái)提取DNA。使用NanoDrop UV-Vis儀器來(lái)從 260nm處的吸收定量地估算DNA。
實(shí)施例13 匪R檢測(cè)鉬-DNA結(jié)合在Bruker 500MHz NMR儀器上99% (原子)D2O中以水抑制脈沖序列進(jìn)行質(zhì)子NMR光譜法實(shí)驗(yàn)。樣品含有順鉬(2. OmM)或焦dach-2 (2. OmM)和核苷酸(5’ -dGMP，5，-dAMP， dGpG (5. OmM))，以及單鏈和雙鏈的DNA (小牛胸腺，5. OmM)，用磷酸鹽和碳酸鹽緩沖液 (10-20mM)保持pH 7.0。在相同的條件下，也進(jìn)行順鉬(0. 25mM)和焦dach-2 (0. 25mM)與 合成的 25-mer :5，-ATGATTTAGGTGACACTATAGCAGT-3，(0. 25mM)反應(yīng)。反應(yīng)進(jìn)行長(zhǎng)達(dá) 7 天， 并且以固定時(shí)間間隔記錄了 1H和31P NMR譜圖。通常，檢測(cè)中使用5μ s脈沖寬度以及1.0s 重復(fù)延時(shí)。一般選擇掃描寬度10，OOOHz和32K數(shù)據(jù)點(diǎn)來(lái)收集自由感應(yīng)衰減。對(duì)于所應(yīng)用 的傅里葉變換，線增寬因子為1Hz?；瘜W(xué)位移參照H-O-D峰，位于4. 67ppm。
權(quán)利要求
一種用于治療癌的組合物，其包括一種或更多種如圖1所給出的式I、II、III和IV的分離的單體鉑絡(luò)合物其中R1、R2和R3各自獨(dú)立地選自取代的或未取代的脂肪族胺或芳香族胺，而且其中當(dāng)R1和R2中的一個(gè)為NH3時(shí)，R1和R2中的另一個(gè)不是NH3；而且其中S獨(dú)立地選自氫氧化物、乙酸、丁酸和α-羥基酸；或者其藥學(xué)上可接受的鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中R1和R2各自獨(dú)立地選自氨合物、甲胺、乙胺、丙胺、 異丙胺、丁胺、環(huán)己胺、苯胺、吡啶和取代的吡啶。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中R3選自乙二胺和環(huán)己二胺。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡(luò)合物是1，2_乙二胺(二氫焦 磷酸)鉬(II)。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡(luò)合物是(反式-1，2-環(huán)己二 胺)(二氫焦磷酸)鉬(II)。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡(luò)合物是順式_二氨合_反 式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡(luò)合物是1，2_乙二胺-反 式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡(luò)合物是反式-1，2-環(huán)己二 胺)_反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
9.一種用于治療癌的組合物，其包含一種或更多種選自以下的分離的單體鉬絡(luò)合物(i)順式_二氨合-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)；(ii)l，2-乙二胺(二氫焦磷酸)鉬(II)；(iii)l，2-乙二胺-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)；(iv)(反式-1，2-環(huán)己二胺)(二氫焦磷酸)鉬(II)；(ν)反式-1，2-環(huán)己二胺)-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)；和 (vi)其藥學(xué)上可接受的鹽。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡(luò)合物在PH約6至約8之間 的水溶液中是穩(wěn)定的。
11.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡(luò)合物不結(jié)合DNA。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡(luò)合物引發(fā)fas以及fas相 關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)度表達(dá)。
13.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡(luò)合物引發(fā)促細(xì)胞凋亡基因 的過(guò)度表達(dá)。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述促細(xì)胞凋亡基因是Bak和Bax。
15.一種制備分離的單體鉬(II)絡(luò)合物的方法，所述方法包括(i)將含過(guò)量焦磷酸鹽與如圖15所給出的式V和式VI鉬絡(luò)合物的含水反應(yīng)混合物 其中R1、R2和R3各自獨(dú)立地選自取代的或未取代的脂肪族胺和芳香族胺，而且 其中X獨(dú)立地選自鹵素；維持在約30至約60攝氏度的溫度，持續(xù)約12至約18小時(shí)的時(shí)間，pH為約7至約9 ；( )隨后濃縮所述含水反應(yīng)混合物，以使不形成焦磷酸鹽沉淀；(iii)通過(guò)加入酸來(lái)將反應(yīng)混合物的PH迅速降至pH小于2 ；其中，所述分離的單體鉬絡(luò)合物具有如圖1所給出的式I或III其中R\R2和R3各自獨(dú)立地選自取代的或未取代的脂肪族胺和芳香族胺；而且其中所述分離的單體鉬絡(luò)合物在PH約6至約9之間的水溶液中是穩(wěn)定的。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所制備的分離的單體鉬絡(luò)合物是(反式-1，2-環(huán) 己二胺)(二氫焦磷酸)鉬(II)。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述溫度是40攝氏度，且反應(yīng)時(shí)間是15小時(shí)，并 且PH是在7與8之間。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其還包括在濃縮反應(yīng)混合物之后將反應(yīng)混合物冷卻至 5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其還包括在降低反應(yīng)混合物的pH之后將反應(yīng)混合物冷 卻至5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。
20.一種制備分離的單體鉬(IV)絡(luò)合物的方法，所述方法包括(i)將含過(guò)量焦磷酸鹽與如圖15所給出的式V和式VI鉬絡(luò)合物的含水反應(yīng)混合物 其中R1、R2和R3各自獨(dú)立地選自取代的或未取代的脂肪族胺和芳香族胺，而且 其中X獨(dú)立地選自鹵素；維持在約30至約60攝氏度的溫度，持續(xù)約12至約18小時(shí)，pH為約7至約9 ； ( )向反應(yīng)混合物加入過(guò)氧化氫，以及選自由乙酸鹽、丁酸鹽和α-羥基酸的鹽及其 組合所組成的組的任選試劑；(iii)隨后濃縮含水反應(yīng)混合物，以使不形成焦磷酸鹽沉淀；(iv)通過(guò)加入硝酸來(lái)將反應(yīng)混合物的pH迅速降至pH小于2； 其中，所述分離的單體鉬絡(luò)合物具有如圖1所給出的式II或IV ；其中R1、R2和R3各自獨(dú)立地選自取代的或未取代的脂肪族胺和芳香族胺；其中S獨(dú)立地選自氫氧化物、乙酸、丁酸和α-羥基酸；而且其中所述分離的單體鉬絡(luò)合物在PH約6與約9之間的水溶液中是穩(wěn)定的。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述溫度是40攝氏度，且反應(yīng)時(shí)間是15小時(shí)，而 且pH在7與8之間。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其還包括在濃縮反應(yīng)混合物之后將反應(yīng)混合物冷卻至 5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其還包括在降低反應(yīng)混合物的pH之后將反應(yīng)混合物冷 卻至5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其中在濃縮反應(yīng)混合物前與過(guò)氧化氫一起加入的任選 試劑選自乙酸鈉、丁酸鈉和α-羥基酸鈉鹽。
25.如權(quán)利要求20所述的方法，其中在濃縮反應(yīng)混合物前與過(guò)氧化氫一起加入的任選 試劑選自乙酸鉀、丁酸鉀和α-羥基酸鉀鹽。
26.如權(quán)利要求20所述的方法，其中過(guò)氧化氫的初始體積比濃度為30%。
27.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所制備的分離的單體鉬絡(luò)合物是順式_二氨合-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
28.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所制備的分離的單體鉬絡(luò)合物是1，2-乙二胺-反 式_ 二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
29.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所制備的分離的單體鉬絡(luò)合物是反式-1，2-環(huán)己 二胺)-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
30.一種治療癌的方法，所述方法包括施用治療上有效量的至少一種選自權(quán)利要求1 所述絡(luò)合物的分離的單體鉬絡(luò)合物，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、佐劑或媒 介物。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述癌選自卵巢癌、睪丸癌、小細(xì)胞肺癌和頭頸癌。
32.—種治療對(duì)選自順鉬、卡鉬和奧沙利鉬的一種或更多種抗癌劑耐藥的癌的方法，所 述方法包括施用治療上有效量的至少一種選自二氨合(二氫焦磷酸)鉬(II)和權(quán)利要求 1所述絡(luò)合物的分離的單體鉬絡(luò)合物，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、佐劑或 媒介物。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述癌選自卵巢癌、睪丸癌、小細(xì)胞肺癌和頭頸癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了磷鉑，穩(wěn)定的、分離的單體鉑(II)和(IV)的磷酸絡(luò)合物，以及其用于治療癌的方法，所述癌包括對(duì)順鉑和卡鉑耐藥性癌。與順鉑不同，這些絡(luò)合物不易進(jìn)行水解并且頗溶于和穩(wěn)定于水溶液中。而且，與順鉑、卡鉑以及基于鉑的相關(guān)抗癌劑不同，這些絡(luò)合物不結(jié)合DNA。確切地，數(shù)據(jù)表明磷鉑引發(fā)fas及fas相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及某些促細(xì)胞凋亡基因如Bak和Bax的過(guò)度表達(dá)。不過(guò)，這些絡(luò)合物表現(xiàn)出對(duì)癌細(xì)胞極大的細(xì)胞毒性。因此，本發(fā)明提供了具有與本領(lǐng)域那些不同分子靶的新的鉑抗癌劑。
文檔編號(hào)A61K33/24GK101801369SQ200880101577
公開(kāi)日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2008年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月6日
發(fā)明者拉廷德拉·N·博斯 申請(qǐng)人:俄亥俄大學(xué)