專利名稱：：用于將生長(zhǎng)因子遞送至纖維結(jié)締組織的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的主旨涉及用于將生長(zhǎng)因子遞送至纖維結(jié)締組織的組合物。較具體的，本發(fā)明涉及對(duì)用于纖維結(jié)締組織再生非常重要的生長(zhǎng)因子具有親和性的肽家族，這些肽與用于一種或多種修復(fù)纖維結(jié)締組織缺損或誘導(dǎo)纖維結(jié)締組織形成的植入物相關(guān)的組合物和方法中非常有用。
背景技術(shù)：
：在美國(guó)，每年有近500萬人因?yàn)榧‰焯弁炊歪t(yī)，其中約20萬人需要進(jìn)行手術(shù)修復(fù)。肌腱和韌帶的損傷非常普遍，且預(yù)計(jì)這些損傷的頻率隨著人群老齡化而上升，且持續(xù)活躍。肌腱修復(fù)術(shù)在美國(guó)非常普遍，包括肌腱套腱(51，000/年)、跟腱(44，000/年)和臏腱(42，000/年)。由于纖維結(jié)締組織如肌腱和韌帶的愈合是一個(gè)耗時(shí)的過程，因此需要長(zhǎng)時(shí)間的固定和康復(fù)。固定受傷的纖維結(jié)締組織可使愈合過程啟動(dòng)，同時(shí)將可能干擾愈合過程和/或使正愈合的纖維結(jié)締組織再次損傷的動(dòng)作減到最少。然而，一旦愈合過程在愈合期的纖維結(jié)締組織中提供足夠的機(jī)械強(qiáng)度及其完整性，則通常鼓勵(lì)個(gè)體“康復(fù)”該組織。愈合期纖維結(jié)締組織的康復(fù)常常通過增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)的有效范圍而實(shí)現(xiàn)，據(jù)信其可促進(jìn)組織功能更好的恢復(fù)、加速組織愈合以及增強(qiáng)組織修復(fù)的質(zhì)量。此外，還需要減少肢體或關(guān)節(jié)的固定時(shí)間，因?yàn)榧词?-8周的固定時(shí)間也可引起肌肉萎縮、關(guān)節(jié)僵化、骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)以及其他并發(fā)癥。因此，任何可通過提高愈合速率而縮短該時(shí)間(以及因此所修復(fù)組織的強(qiáng)度)的治療還將通過使患者較快恢復(fù)活動(dòng)而提高護(hù)理。盡管目前用于受傷纖維結(jié)締組織修復(fù)的手術(shù)操作通常都相當(dāng)成功，但包括修復(fù)失敗在內(nèi)的并發(fā)癥并不少見。例如，慢性退行性肩袖撕裂就對(duì)骨科大夫提出了一種嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。由于組織缺損和回縮，肩袖撕裂可在最初修復(fù)后引起過強(qiáng)的張力，并引起初次修復(fù)的失敗。目前，由于肌腱退化和肌肉萎縮，較大慢性撕裂的初次修復(fù)失敗率可達(dá)38%。生長(zhǎng)分化因子(⑶F)是生長(zhǎng)因子家族的成員，屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族。⑶F-5、⑶F-6和⑶F-7(還分別稱為BMP-14、BMP-13和BMP-12)與纖維結(jié)締組織形成和愈合顯著相關(guān)，因?yàn)槠湓隗w外和體內(nèi)均刺激纖維結(jié)締組織的產(chǎn)生。例如，GDF-5敲除小鼠已證實(shí)該生長(zhǎng)因子對(duì)于正常肌腱發(fā)育非常必要。已證實(shí)⑶F-5缺乏可改變跟腱的超結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能和組分，并顯著減慢其在損傷模型中的愈合。這些GDF蛋白彼此之間密切相關(guān)，具有至少約80%-86%的氨基酸同源性。此外，嚙齒類和人類⑶F之間的氨基酸一致性為⑶F5是97%,GDF6是95%而GDF-7是97%。體內(nèi)肌腱修復(fù)實(shí)驗(yàn)已提出對(duì)GDF劑量的擔(dān)憂。GDF能夠驅(qū)動(dòng)除肌腱細(xì)胞之外的多種細(xì)胞類型分化，包括成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。因此，以恰當(dāng)劑量范圍之外的劑量將GDF應(yīng)用于肌腱修復(fù)部位，或在肌腱修復(fù)部位以外應(yīng)用GDF，則有誘導(dǎo)不必要的骨和/或軟骨形成的風(fēng)險(xiǎn)。已在研究GDF-7的臨床前動(dòng)物模型中觀察到軟骨島，特別是在采用較高劑量時(shí)。因此，盡管生長(zhǎng)因子常常對(duì)組織發(fā)揮有效的治療活性，其還可以觸發(fā)健康組織或非靶組織的異位或不需要的反應(yīng)。需要特別注意的是，生長(zhǎng)因子如GDF，特別是在較高或意外劑量時(shí)，能夠驅(qū)動(dòng)關(guān)節(jié)、肌腱、軟骨和骨的異位分化。因此，這些生長(zhǎng)因子的遞送必須采用最小有效劑量的生長(zhǎng)因子，將其嚴(yán)格限制于特定區(qū)域內(nèi)。盡管已有少數(shù)幾種技術(shù)開發(fā)用于遞送生長(zhǎng)因子(例如洗脫生長(zhǎng)因子的聚合物)并滿足這些遞送要求，但成功仍然較少。因此，目前仍然需要一種用于將生長(zhǎng)因子定向遞送并保留于待治療纖維結(jié)締組織部位的系統(tǒng)，用于促進(jìn)纖維結(jié)締組織愈合和/或生長(zhǎng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及用于將纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子遞送至植入物表面促進(jìn)纖維結(jié)締組織形成和修復(fù)的肽組合物。本發(fā)明還提供涂布該肽組合物的植入物以及用于將該纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子遞送至植入物表面的方法。該肽組合物包含一種對(duì)植入物表面材料具有親和性的表面結(jié)合肽，其已偶聯(lián)于對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。本發(fā)明還提供包含該肽組合物的試劑盒。圖1是一個(gè)示意圖，示出了本發(fā)明所披露的肽，其對(duì)植入物的表面材料具有親和性，而該植入物偶聯(lián)于對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。圖1中，示出了纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子⑶F-7結(jié)合于該肽。圖2是一個(gè)示意圖，比較本發(fā)明所述一系列肽在縫合線上捕獲⑶F-7的EC50值。所述肽包括對(duì)植入物表面材料具有親和性的肽，而該植入物偶聯(lián)于對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。圖2中，所采用對(duì)植入物表面材料具有親和性的肽是SEQIDNO67(白色框)或者SEQIDN0:71(淺灰色框)。類似的，所采用對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽是SEQIDN0:2(深灰色框)。此外，圖2中的肽包含脂肪酸末端修飾或脂肪酸連接物(淺色鋸齒狀陰影是十一烷酸，深色鋸齒狀陰影是肉豆蔻酸)、PEG連接物(MP表示mini-PEG，PlO表示PEG10)和氨基酸連接物(GSSG)中的一種或多種。具體實(shí)施例方式大多數(shù)軟組織的愈合，包括基底細(xì)胞增生和血管化，需要7-10天。然而，因?yàn)楸仨毢铣纱罅磕z原，并恰當(dāng)重建而形成具有足夠完整性的纖維結(jié)締組織，以承受肢體多種運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生的壓力，因此纖維結(jié)締組織的愈合可能需要幾周的時(shí)間。例如，肌腱愈合可通過腱鞘和鞘內(nèi)膜細(xì)胞增生而內(nèi)在發(fā)生；或者可通過周圍鞘和滑膜的細(xì)胞浸潤(rùn)而外在發(fā)生。內(nèi)在修復(fù)僅依賴于組織本身的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)愈合。外在修復(fù)則依賴于外部組織來源的細(xì)胞浸潤(rùn)。在纖維結(jié)締組織修復(fù)中，兩種模式均涉及到，其中外在修復(fù)在該過程的早期涉及，而內(nèi)在修復(fù)則在該過程的晚期涉及。由于周圍組織整合入疤痕組織，因此外在修復(fù)可能引起粘連。粘連可能導(dǎo)致新形成的纖維結(jié)締組織運(yùn)動(dòng)范圍障礙。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供用于將纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子遞送至植入物表面以及用于刺激纖維結(jié)締組織產(chǎn)生的組合物。由于利用處于正常位置的植入物表面的組合物進(jìn)行遞送，纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子可刺激體內(nèi)纖維結(jié)締組織的產(chǎn)生。因此，所述組合物在促進(jìn)纖維結(jié)締組織修復(fù)或植入物部位纖維結(jié)締組織形成中的一種或多種比較有用。根據(jù)本發(fā)明所述的組合物對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性，可包含結(jié)合于其上的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子。因此，例如，利用本發(fā)明所述的組合物來包被所采用縫合受損肌腱邊緣的材料以及在修復(fù)部位存留和直接遞送纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子，且可有助于通過從所包被的縫線材料持續(xù)釋放纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子而促進(jìn)纖維結(jié)締組織的修復(fù)。這些生長(zhǎng)因子從縫合材料釋放可在縫合部位的局部直接刺激肌腱細(xì)胞的遷移和增生(例如，在需要進(jìn)行纖維結(jié)締組織修復(fù)的區(qū)域)。相反，在無靶向分子的情況下直接在肌腱修復(fù)部位推注生長(zhǎng)因子，則更可能彌散入周圍組織并刺激外在修復(fù)和異位組織形成。因此，本發(fā)明涉及到的組合物包含對(duì)能夠誘導(dǎo)纖維結(jié)締組織形成的生長(zhǎng)因子(“纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子”)具有親和性的肽，例如生長(zhǎng)因子GDF-5、GDF-6和GDF-7(分別對(duì)應(yīng)于BMP-14、BMP-13和BMP-12)中的一種或多種。在一個(gè)實(shí)施方式中，相比于⑶F家族、BMP或TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)超家族中除⑶F-7之外的任何成員，該肽表現(xiàn)出對(duì)⑶F-7(BMP-12)的優(yōu)先結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物包含由本發(fā)明所述肽構(gòu)成的涂布組合物，特異性結(jié)合于纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子。在該實(shí)施方式的一個(gè)實(shí)例中，所述涂布組合物可與植入物相接觸，其中，該組合物的肽組分(例如對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽)在形成該植入物表面或其一部分的涂層時(shí)，偶聯(lián)于植入物的表面(如構(gòu)成該表面的材料)或其一部分。在該實(shí)施方式的另一個(gè)實(shí)例中，該涂布組合物包含至少一種對(duì)植入物表面(該表面優(yōu)先包含聚合物)具有親和性的肽，偶聯(lián)于至少一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽，且可進(jìn)一步包含纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子，其結(jié)合于所述至少一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。在該后一種實(shí)例中，將該涂布組合物應(yīng)用于(例如，與其相接觸)待涂布的植入物表面，使得在形成該植入物表面上的涂層時(shí)，與該表面的特異性結(jié)合是該包含對(duì)表面具有親和性的肽的組合物中的一個(gè)組分。在本發(fā)明的另一方面，提供了一個(gè)共有結(jié)構(gòu)和功能的肽家族，因?yàn)檫@些肽所包含的氨基酸序列具有共同的序列特征，且均對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性。還提供了本發(fā)明該方面相關(guān)的編碼這些肽的核苷酸序列和載體。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于從組合物持續(xù)釋放纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的肽組合物，該釋放主要涉及到纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子從其結(jié)合(借助于該肽的親和性)的肽解離。本發(fā)明所述肽組合物可以包含治療有效量的單一纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子成員(例如GDF-5)或者可以包含治療有效量的一種以上纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子(例如⑶F-5或⑶F-7;或者⑶F的任何組合)成員。作為一種以上⑶F蛋白家族成員的組合，每一個(gè)成員均可以單體或多聚體存在，還可以異聚體(例如，由一種GDF家族成員(例如GDF-5)單體和另一種GDF家族成員(例如GDF-6)的二聚體構(gòu)成)存在。如本文中將詳細(xì)闡述的，用于生成本發(fā)明所述組合物非常有用的多種肽在其特異結(jié)合能力以及與一種或多種GDF蛋白優(yōu)先結(jié)合能力方面有所不同(參見本文實(shí)施例1&2)。選擇本發(fā)明所述組合物中包含⑶F蛋白家族的單一成員還是包含該⑶F蛋白家族的一種以上成員，將依賴于預(yù)期療效以及待治療癥狀。本發(fā)明還提供一種將纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子遞送至植入物表面或其一部分的方法，其中需要將一種或多種纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子定位于該表面。該方法包括將本發(fā)明所述肽組合物施予該表面，所述組合物包含對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽以及纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子，其中所述肽和纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子非共價(jià)偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方式中，于植入前將纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子遞送至植入物表面(例如，在制備時(shí)或管理時(shí))。將組合物施予該植入物可以其中該組合物已經(jīng)完成的形式(例如，在形成該組合物時(shí)，該組合物的全部組分均為預(yù)裝配的，然后將該組合物施予植入物)；或者可在其中該組合物在植入物表面上形成的步驟中將組合物施予該植入物(例如，在形成本發(fā)明所述組合物時(shí)，首先將一個(gè)組分(其對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性)偶聯(lián)于植入物表面，然后在接下來的步驟中，將纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子施予植入物表面，其上已偶聯(lián)了一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述組合物可施予已植入患者體內(nèi)或體表的植入物(例如，“正常位置”施予植入物)。在該實(shí)施方式的一個(gè)實(shí)例中，所述組合物可原位施予植入物，例如通過注射給予已植入的植入物部位；或者，如果在開放部位，可通過例如噴霧或其他方式將組合物恰當(dāng)施予該植入物。優(yōu)選的，該組合物以對(duì)于該癥狀(損傷、缺損、病癥等)所需療效非常有效的量而給予包括植入物部位的纖維結(jié)締組織。例如，該組合物可以包含至少一種對(duì)植入物表面具有親和性的肽，而該表面偶聯(lián)于至少一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽，還可包含已結(jié)合于所述至少一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子。^X盡管可以認(rèn)為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員均可以很好的理解下列術(shù)語，但還是列出了下列定義以有助于闡述本發(fā)明。如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的，用于本文說明書和權(quán)利要求中的的術(shù)語“纖維結(jié)締組織”表示包含相當(dāng)部分膠原(用于彈性和抗張強(qiáng)度)的纖維膠原組織；其中代表性的纖維結(jié)締組織實(shí)例包括肌腱、韌帶、皮膚的真皮以及眼睛的鞏膜。如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的，用于本文說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語“纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子”表示能夠誘導(dǎo)纖維結(jié)締組織形成的生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子包括但不限于例如GDF-5、GDF-6、GDF-7(分別對(duì)應(yīng)于BMP_14、BMP_13和BMP-12；“GDF”是生長(zhǎng)和分化因子的首字母縮略詞)、BMP-2(“BMP”是骨形態(tài)發(fā)生蛋白的首字母縮略詞)和BMP-6(由于其可刺激參與組織修復(fù)的韌帶纖維母細(xì)胞而包括在內(nèi))。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，相比于⑶F家族、BMP家族或TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)超家族中除⑶F-7之外的任何成員，該肽表現(xiàn)出對(duì)⑶F-7(BMP-12)的優(yōu)先結(jié)合。用于本文說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語“第一”和“第二”是為了在區(qū)分兩種不同分子時(shí)便于闡述，而不是為了限制本發(fā)明的范圍，除非另有特別指明，否則也不表示空間、時(shí)間或等級(jí)順序。用于本文說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語“植入物”，在提到纖維結(jié)締組織時(shí)，指的是一種材料或結(jié)構(gòu)，(a)其可定位于患者體內(nèi)或體表以預(yù)防、治療、調(diào)整或緩解損傷或疾患或病癥或癥狀、修復(fù)或恢復(fù)受損纖維結(jié)締組織的功能，或者提供一種相對(duì)于纖維結(jié)締組織區(qū)域的新功能；且(b)包括至少一個(gè)表面而能夠施予本發(fā)明所述組合物。例如，植入物可用來促進(jìn)需要該治療的患者體內(nèi)纖維結(jié)締組織愈合和修復(fù)、治療纖維結(jié)締組織炎(例如肌腱炎)、治療纖維結(jié)締組織缺損和誘導(dǎo)纖維結(jié)締組織形成中的一種或多種。代表性的實(shí)例包括但不限于縫線(例如用于纖維結(jié)締組織損傷)、用來支持和/或提供用于纖維結(jié)締組織形成的表面的基質(zhì)(其可包括但不限于可生物降解的海綿、心臟修補(bǔ)網(wǎng)狀織物、肌腱包繞(tendonwrap，束套)(例如，“包繞”表示理想的纖維結(jié)締組織周圍包裹的基質(zhì)；本領(lǐng)域中有時(shí)也指“袖套”)、韌帶包繞、用于纖維結(jié)締組織的假體、膠原支架、膠原線、復(fù)合膠原氈圈(參見例如U.S.7，252，832)、韌帶增強(qiáng)裝置、合成的移植物(例如合成的韌帶移植物、肌腱置換等)和鞏膜扣帶。構(gòu)成植入物表面的材料可包含聚合物，且所述聚合物可包括合成的聚合物。例如，代表性的縫線、合成的韌帶移植物、韌帶假體和韌帶增強(qiáng)裝置通常由聚合物構(gòu)成(例如，聚乙烯對(duì)苯二甲酸酯、聚四氟乙烯、聚酯和聚乳酸聚乙醇酸交酯共聚體中的一種或多種)，且形式通常為編織物、纖維或網(wǎng)狀物。用于本文說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語“聚合物”表示由重復(fù)結(jié)構(gòu)單位通過共價(jià)化學(xué)鍵連接而構(gòu)成的分子或材料(一個(gè)結(jié)構(gòu)單位通常指單體)。根據(jù)其預(yù)期用途，聚合物可為可生物降解的(如，體內(nèi)自溶或可生物吸收或降解中的一種或多種)或非可生物降解的；或者合成的(制造的，自然界中不存在)或天然的(天然存在的，如植物和/或動(dòng)物活組織中生成的)。被描述為可生物降解的恰當(dāng)合成聚合物的非限制性實(shí)例包括多聚氨基酸；聚酐包括馬來酸酐聚合物；多聚羧酸；某些聚乙烯，包括但不限于聚乙二醇、聚氧化乙烯；聚丙烯，包括但不限于聚丙二醇、聚富馬酸二羥丙酯；聚乳酸或聚乙醇酸(及其共聚體和混合物，例如聚L-乳酸(PPLA)、聚D，L-乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、50/50(DL-乳酸-共-乙交酯))中的一種或多種；多正酯類；聚二氧六環(huán)酮；聚磷腈；聚縮酚酸酞；聚已酸內(nèi)酯(及其共聚體和混合物，例如聚(D，L-乳酸-共-己內(nèi)酯)或聚已酸內(nèi)酯共-丙烯酸丁酯；聚羥基丁酸戊酯和混合物)中的一種或多種；某些聚碳酸鹽(例如酪氨酸源性聚碳酸鹽和芳基化物)、聚亞胺基碳酸鹽、磷酸鈣；氰基丙烯酸酯；某些聚酰胺(包括尼龍)；聚氨基甲酸酯；聚二甲基三甲基碳酸鹽；合成的纖維質(zhì)聚合物(例如醋酸纖維素、丁酸纖維素、玻璃紙)；以及前述中任何一種材料的混合物、組合物和共聚體。被描述為可生物降解的代表性天然聚合物包括大分子(如多糖，例如藻酸鹽、淀粉、殼聚糖、纖維素或其衍生物(例如羥丙基甲基纖維素)；蛋白和多肽，例如明膠、膠原、白蛋白、纖維蛋白、纖維蛋白素原)；聚糖胺聚糖(例如透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素)；以及前述材料中任何一種的混合物、組合物、復(fù)合物(例如膠原_聚合物的復(fù)合底物)和共聚體。被描述為非可生物降解的恰當(dāng)合成聚合物的非限制性實(shí)例包括惰性聚芳醚酮，包括聚醚醚酮(“PEEK”)、聚醚酮、聚醚酮酮和聚醚酮醚酮酮；聚氨基甲酸酯；聚苯乙烯和苯乙烯_乙烯/丁烯-苯乙烯封閉共聚體；聚異丁烯共聚體和苯乙烯_異丁烯_苯乙烯封閉共聚體；聚乙烯吡咯酮；聚乙烯醇；乙烯基單體的共聚體；聚乙烯醚；聚乙烯芳香劑；聚氧化乙烯；聚酯，包括聚乙烯對(duì)苯二甲酸酯；某些聚酰胺；聚丙烯酰胺；聚醚，包括聚醚砜’聚烷撐，包括聚丙烯、聚乙烯；乙烯與聚丙烯的共聚體；某些聚碳酸鹽、硅酮和硅酮橡膠；硅氧烷聚合物；聚四氟乙烯；膨體聚四氟乙烯(e-PTFE)；尼龍及相關(guān)聚酰胺共聚體；尼龍；氟化乙烯丙烯；六氟丙稀、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)；2-甲基丙烯酸2-羥基乙酯(PHEMA)；聚酰亞胺；聚乙烯對(duì)苯二甲酸酯；聚砜和多硫化物；以及前述材料中任何一種的混合物、組合物和共聚體(包括交聯(lián)的共聚體)。用于本文說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語“親和性”指肽(如本文所述的)具有親和性的能力，其對(duì)一種靶分子或表面材料的親和性高于另一種；例如對(duì)異源性分子群中一種特定分子的親和性。例如，當(dāng)相比于與另一種生物學(xué)組分或生長(zhǎng)因子(例如，血小板源性生長(zhǎng)因子)的結(jié)合，一種肽對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子表現(xiàn)出優(yōu)先結(jié)合時(shí)，則該肽對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性。另一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)相比于與另一種表面分子如金屬的結(jié)合，肽對(duì)聚合物表現(xiàn)出優(yōu)先結(jié)合時(shí)，則該肽對(duì)包含聚合物的表面具有親和性。這種優(yōu)先結(jié)合可依賴于特殊構(gòu)象、結(jié)構(gòu)以及/或者該肽和/或?qū)ζ渚哂H和性材料表面或內(nèi)部的電荷。在某些實(shí)施方式中，對(duì)聚合表面或纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽以比該肽與例如另一種非聚合表面或非纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子高10%的親和性或者20%、30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%,200%,300%,400%^；500%的親和性或者較高的百分比進(jìn)行結(jié)合。例如，親和性可通過一種分析加以測(cè)定，在該分析中，對(duì)代表肽與纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子之間相對(duì)結(jié)合量的信號(hào)進(jìn)行量化(例如熒光或比色)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，肽具有親和性，其特征在于該相對(duì)親和性可以10μM或更低的EC50進(jìn)行測(cè)量，較優(yōu)選1μΜ,更優(yōu)選低于ΙΟΟηΜ。EC50可利用本領(lǐng)域中已知的任何形式的方法進(jìn)行測(cè)定，例如通過從親和分析而生成濃度反應(yīng)曲線，該分析中肽的濃度用已知量的底物(肽對(duì)其具有親和性)進(jìn)行滴定。在該情況中，EC50表示分析中所觀察到該肽最大結(jié)合50%的肽濃度。提到本發(fā)明所述的肽時(shí)，用于本文說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語“肽”，指包含至少一個(gè)結(jié)合區(qū)且長(zhǎng)度不少于約10個(gè)氨基酸而不多于約100個(gè)氨基酸殘基的氨基酸鏈，其中該氨基酸鏈可包括天然存在的氨基酸、合成的氨基酸、遺傳編碼的氨基酸、非遺傳編碼的氨基酸及其組合；然而，特別的，將抗體從具有本發(fā)明所述結(jié)合區(qū)的肽的范圍和定義中排除。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述包含至少一個(gè)結(jié)合區(qū)的肽可具有長(zhǎng)度不少于約11個(gè)氨基酸且不多于約60個(gè)氨基酸殘基，或者長(zhǎng)度不少于約12個(gè)氨基酸且不多于約40或50個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)本發(fā)明所述的肽結(jié)合區(qū)包含一個(gè)長(zhǎng)度不少于約10個(gè)氨基酸且不多于約30個(gè)氨基酸的相鄰序列，且較優(yōu)選包含長(zhǎng)度為11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25的氨基酸。本發(fā)明所述肽結(jié)合區(qū)包括表面結(jié)合區(qū)和纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的結(jié)合區(qū)。根據(jù)本發(fā)明所述的術(shù)語肽包括任何藥用鹽或其酯。根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的肽可利用化學(xué)合成、重組表達(dá)、較大分子的生化或酶解斷裂、較大分子的化學(xué)切割、前述方法的組合而生成，或者通常可通過本領(lǐng)域中的任何其他方法制備并優(yōu)選是分離的。術(shù)語“分離的”表示該肽基本上游離于未成為該肽本身完整結(jié)構(gòu)一部分的組分；例如，比如當(dāng)通過重組技術(shù)生成時(shí)基本游離于細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者當(dāng)通過化學(xué)方法合成或者利用生化或化學(xué)方法生成時(shí)基本游離于化學(xué)前體或其他化學(xué)材料。肽可包括L型氨基酸、D型氨基酸或其組合。代表性的非遺傳編碼氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；β-氨基丙酸、2-氨基丁酸；4-氨基丁酸(哌啶酸)；6_氨基酸；2-氨基庚酸；2-氨基異丁酸；3-氨基異丁酸；2-氨基庚二酸；2，4-二氨基丁酸；鎖鏈(賴氨)素；2.2’-二氨基庚二酸；2，3-二胺基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；輕(基)賴氨酸；別羥(基)賴氨酸；3-羥脯氨酸；4-羥脯氨酸；異鎖鏈(賴氨)素；別異亮氨酸；N-甲基甘氨酸(肌氨酸)；N-甲基異亮氨酸；N-甲基擷氨酸；正擷氨酸；正亮氨酸；鳥氨酸和3-(3，4-二羥苯基)-L-丙氨酸(“DOPA”)。代表性的衍生氨基酸包括例如那些其中游離氨基酸已衍生形成鹽酸銨、P-甲苯磺?；?、芐酯基、t-叔丁氧羥基、氯乙?；鶊F(tuán)或甲酸基的分子。游離的羧基可衍生形成鹽、甲基和乙基酯或其他類型的酯或酰胼。游離羥基可衍生形成O-?；騉-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可衍生形成N-對(duì)-苯甲組氨酸。此外，根據(jù)本發(fā)明所述的肽可通過例如化學(xué)基團(tuán)的添加、氨基酸的替代、插入和缺失而加以修飾，其中在應(yīng)用時(shí)，這些修飾可提供某些優(yōu)勢(shì)。因此，術(shù)語“肽”涵蓋多種類型肽衍生物中的任何一種，包括例如酰胺、含蛋白的軛合物、環(huán)肽、多聚化肽、保守替代的變異體、類似物、片段、化學(xué)修飾的肽以及肽模擬物。具有本發(fā)明所述肽家族的預(yù)期結(jié)合特征的任何肽均可用于實(shí)施本發(fā)明。例如，一個(gè)化學(xué)基團(tuán)當(dāng)添加至合成肽的N末端氨基酸以封閉該肽氨基末端的化學(xué)反應(yīng)性時(shí)，則構(gòu)成N末端基團(tuán)。這種用于保護(hù)肽氨基末端的N末端基團(tuán)在本領(lǐng)域中為人熟知，且包括但不限于低級(jí)鏈烷酰基團(tuán)、酰基、磺?；桶被姿狨バ纬苫鶊F(tuán)。優(yōu)選的N末端基團(tuán)可包括乙?；moc(芴甲基氯甲酸酯)和Boc(叔丁氧羰基)。一個(gè)化學(xué)基團(tuán)當(dāng)添加至合成肽的C末端氨基酸以封閉該肽羧基末端的化學(xué)反應(yīng)性時(shí)，則構(gòu)成C末端基團(tuán)。這種用于保護(hù)肽羧基末端的C末端基團(tuán)在本領(lǐng)域中為人熟知，且包括但不限于酯或酰胺基團(tuán)。肽的末端修飾常常對(duì)于通過蛋白酶消化而降低易感性并從而當(dāng)存在含蛋白酶的生物學(xué)液體時(shí)延長(zhǎng)肽的半衰期非常有用。肽末端修飾還可包括脂肪酸修飾。可選的，如本文所述，肽可包括一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)修飾而包含一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)(例如，反應(yīng)性官能團(tuán)如氟、溴或碘)以促進(jìn)將該肽連接于連接分子的氨基酸。如本文中使用的，術(shù)語“肽”還涵蓋其中肽鍵中的一個(gè)或多個(gè)被擬肽鍵置換的肽，擬肽鍵包括但不限于碳鍵(CH2-CH2)、depsi鍵(CO-O)、羥基亞乙基鍵(CHOH-CH2)、酮亞甲基鍵(CO-CH2)、亞甲基氧鍵(CH2-O)、還原鍵(CH2-NH)、硫甲基(thiomethylene)鍵(CH2-S)、N修飾的鍵(-NRC0-)和硫肽鍵(CS-NH)。對(duì)于本發(fā)明所述組合物非常有用的肽還可包括相對(duì)于本文中表1&3和SEQIDNOs1-71和73-76中披露的示例性肽序列而言，具有一個(gè)或多個(gè)殘基替代、添加和/或缺失的肽，只要原始示例性肽的結(jié)合屬性基本保留。因此，本發(fā)明包括其中約1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸(根據(jù)本文中披露的示例性肽的長(zhǎng)度)不同于示例性序列的肽，以及與本文中披露的示例性序列具有至少70%,75%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的肽。序列一致性可手工計(jì)算或者可利用計(jì)算機(jī)執(zhí)行數(shù)學(xué)算法例如GAP、BESTIFIT、BLAST和TFASTA進(jìn)行計(jì)算。利用這些程序進(jìn)行比對(duì)可利用默認(rèn)參數(shù)而實(shí)施。具有基本由本文所披露示例性肽序列組成的氨基酸序列的肽可由于用功能類似的氨基酸殘基取代示例性肽序列中的氨基酸殘基而具有一個(gè)或多個(gè)差異氨基酸殘基(“保守性取代”)，只要包含保守性取代的肽將基本保留不含該保守性取代的示例性肽的親和性。保守性取代的實(shí)例包括將一種非極性(疏水的)殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代為另一種非極性殘基；將一種芳香殘基如色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸取代為另一種芳香殘基；將一種極性(親水的)殘基取代為另一種極性殘基如精氨酸與賴氨酸之間、谷氨酰胺與門冬酰胺之間、蘇氨酸與絲氨酸之間；將一種堿性殘基如賴氨酸、精氨酸或組氨酸取代為另一種堿性殘基；或者將一種酸性殘基如門冬氨酸或谷氨酸取代為另一種酸性殘基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述肽包括表1&3和SEQIDNOs:1_71和73_76中披露的示例性肽序列，其羧基和/或氨基末端可包括其他氨基酸(例如在一個(gè)末端或兩個(gè)末端具有1個(gè)至約40個(gè)其他氨基酸)，只要原始示例性肽的結(jié)合特征基本保留。例如，在一個(gè)或兩個(gè)末端包含其他氨基酸的肽保留本文所述對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性或表面親和性中的一種或兩種。例如，如SEQIDNOs:1-71和73-76所示出的示例性氨基酸序列的一個(gè)或兩個(gè)末端包含其他氨基酸的肽將具有如本文所提供的對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性和/或親和性，且將不具有任何構(gòu)成對(duì)親和性顯著變化的特征(例如，包含親和性高于約10至約100至約1000倍或更多差異的顯著性變化)。用于本文說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語“藥物可受載體”表示一種攜帶介質(zhì)，其是一種用于給予和/或施予本發(fā)明所述組合物的恰當(dāng)支持介質(zhì)，且優(yōu)選不顯著改變本發(fā)明所述組合物(該載體將加入其中)的生物學(xué)活性。這種攜帶介質(zhì)的實(shí)例包括但不限于含水溶液、含水或非含水溶劑、懸液、乳液、凝膠、糊劑等。如本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員已知的，恰當(dāng)藥物可受載體可包含一種或多種材料包括但不限于水、緩沖水、醫(yī)用非胃腸媒劑、鹽水、0.3%甘氨酸、含水酒精、等張含水緩沖液；且可進(jìn)一步包括一種或多種材料如可溶于水的聚合物、甘油、聚乙二醇、甘油、油類、鹽類如鈉、鉀、鎂和銨、磷酸鹽、碳酸酯、脂肪酸、糖、多糖、糖蛋白(用于增強(qiáng)穩(wěn)定性)、賦形劑以及防腐劑和/或穩(wěn)定劑(以延長(zhǎng)保質(zhì)期或者如有必要，適用于該組合物的制備和分布)。用于本文說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語“連接物”指作為分子橋來共價(jià)偶聯(lián)至少兩種不同分子的化合物或部分(例如，參照本發(fā)明，將至少一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子偶聯(lián)于植入物表面或者偶聯(lián)于對(duì)植入物表面具有親和性的肽)。因此，例如，該連接物的一部分(例如，“第一”反應(yīng)官能團(tuán))結(jié)合于至少一種對(duì)聚合物具有親和性的肽，而該連接物的另一部分結(jié)合于至少一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。如本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員已知的，利用本領(lǐng)域中已知的方法，兩種分子可逐步偶聯(lián)于該連接物，或者可同時(shí)偶聯(lián)于該連接物。對(duì)于連接物沒有特殊的大小和含量限制，只要其可實(shí)現(xiàn)作為分子橋的目的，且本發(fā)明所述組合物中該肽的親和性基本保留。本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員已知，連接物包括但不限于化學(xué)鏈、化合物(例如，試齊U)等。所述連接物可包括但不限于同雙功能連接物和異雙功能連接物。異雙功能連接物已為本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員所熟知，包含一個(gè)具有可特異性連接第一分子的第一反應(yīng)官能團(tuán)(化學(xué)基團(tuán)或化學(xué)部分)的末端，以及具有可特異性連接第二分子的第二反應(yīng)官能團(tuán)的相對(duì)末端。對(duì)于本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員來說，很顯然，多種雙功能或多功能試劑、同-和異功能試劑(如那些在PoereceChemicalCo.，Rockford,III的目錄中闡述的)、氨基酸連接物(典型的，3-15個(gè)氨基酸之間的短肽，且常常包含諸如甘氨酸和/或絲氨酸等的氨基酸)以及聚合物(例如聚乙二醇)均可用作根據(jù)本發(fā)明所述的連接物。在一個(gè)實(shí)施方式中，代表性的肽連接物包含多個(gè)可偶聯(lián)于結(jié)合區(qū)的反應(yīng)部位(例如聚賴氨酸、聚鳥苷酸、聚半胱氨酸、聚谷氨酸和聚門冬氨酸)或包含基本為惰性的肽連接物(例如，聚甘氨酸、聚絲氨酸、聚脯氨酸、聚丙氨酸和其他包含內(nèi)氨酰、絲氨酰、脯氨酰和/或甘氨酰氨基酸殘基的寡核苷酸)。連接物還可利用銅催化的疊氮-炔烴環(huán)加成(例如“點(diǎn)擊化學(xué)”)或本領(lǐng)域中熟知的任何其他方法。連接物在本領(lǐng)域中已為人所知，且包括可切割的連接物(例如，通過加熱、通過患者身體內(nèi)部或體表存在的天然酶、通過PH敏感性)和可制備成對(duì)其他分子部分或其本身具有反應(yīng)性而用于交聯(lián)的連接物。有用于連接物的PH敏感性材料實(shí)例可包括但不限于醋酞纖維素、乙酸-1，2，4-苯三酸纖維素、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯和醋酸羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯。根據(jù)諸如代連接的分子、實(shí)施連接的條件等因素，可改變連接物的長(zhǎng)度和組成，用于優(yōu)化某些特征諸如保持生物學(xué)功能、穩(wěn)定性、對(duì)某些化學(xué)和/或溫度參數(shù)的抗性以及保持充分的立體選擇性或大小。例如，連接物不應(yīng)顯著干擾組合物充分結(jié)合表面(具有恰當(dāng)?shù)挠H合力)或結(jié)合纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的能力。恰當(dāng)?shù)木酆线B接物在本領(lǐng)域中已為人所知，可包括合成聚合物或天然聚合物。代表性的合成聚合物包括但不限于聚醚(例如，聚乙二醇(“PEG”)、10個(gè)單位的聚乙二醇(“卩10”)、1^1^^^6，其是？1110(3-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸(“MP”))、聚酯(例如聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA))、多胺、聚酰胺(例如，尼龍)、聚氨基甲酸酯、聚甲基丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸甲酯；PMMA)、聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚己酸、柔性螯合劑如EDTA、EGTA和其他合成的聚合物，其優(yōu)選具有約20道爾頓至約1，000千道爾頓的分子量。代表性的天然聚合物包括但不限于透明質(zhì)酸、藻酸鹽、硫酸軟骨素、纖維蛋白素原、纖維連接蛋白、白蛋白、膠原、鈣調(diào)蛋白，以及其他優(yōu)選具有約200道爾頓至約20，000千道爾頓(表示組分單體)的天然聚合物。聚合連接物可包括二嵌段聚合物、多嵌段共聚體、梳形聚合物、星形聚合物、數(shù)值形或分支聚合物、雜合線性_樹枝形聚合物、由賴氨酸組成的分支鏈或隨機(jī)共聚物。連接物還可包含巰基(氨基)羧酸、丙烯酰胺羧酸、丙烯酰胺-氨基三乙烯乙醇酸、7-氨基苯甲酸及其衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所述連接物可為脂肪酸。本發(fā)明所述脂肪酸包括飽和和不飽和脂肪酸，諸如但不限于丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十一烷酸(AUD)、十二烷酸、肉豆蔻酸、軟脂酸、硬脂酸、花生酸、崳樹酸、木蠟酸、二十(烷)酸、二十二(烷)酸、二十四烷酸、(肉)豆蔻腦酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α"亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。例如，在某些實(shí)施方式中，所述脂肪酸連接物用作表面結(jié)合肽與纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合肽之間的連接基團(tuán)。在其他實(shí)施方式中，除了用作連接物，本發(fā)明所述脂肪酸分子可用來修飾表面結(jié)合肽和纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合肽。例如，在某些實(shí)施方式中，脂肪酸用來修飾該肽組合物的氨基和/或羧基末端，該組合物包括表面結(jié)合肽和纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合肽。提到本發(fā)明所述組合物和底物(包括其結(jié)合或偶聯(lián)的植入物)時(shí)，用于本文說明書和權(quán)利要求的術(shù)語“有效量”表示足以介導(dǎo)該組合物與底物結(jié)合的組合物的量；促進(jìn)該組合物與底物的連接。本文中，提到本發(fā)明所述組合物用于修復(fù)纖維結(jié)締組織缺損或誘導(dǎo)纖維結(jié)締組織形成中的一種或多種時(shí)或者用于說明書和權(quán)利要求時(shí)，表示該組合物中纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子用于調(diào)節(jié)、預(yù)防、減緩或治療包含待治療纖維結(jié)締組織的疾患和/或病癥的量。按照本發(fā)明，用于本文說明書和權(quán)利要求時(shí)，術(shù)語“肽組合物”指一種肽組合物，其包含對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽，而該生長(zhǎng)因子已偶聯(lián)于對(duì)由植入物構(gòu)成的聚合物底物具有親和性的肽。對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽與對(duì)聚合物底物具有親和性的肽可發(fā)生于兩個(gè)方向。例如，對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽可發(fā)生于該肽組合物的氨基末端或羧基末端。類似的，對(duì)聚合物底物具有親和性的肽可發(fā)生于兩個(gè)末端。該肽組合物可進(jìn)一步包括已結(jié)合的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子和一種或多種偶聯(lián)于本發(fā)明所述肽的連接物、一種或多種本發(fā)明所述氨基和/或羧基末端修飾、一種藥物可受載體及其組合。因此，本發(fā)明所述肽組合物可由通式I表示SBP-L-GDFBP或GDFBP-L-SBP，其中SBP是一種10-100個(gè)氨基酸的肽，包含(i)10-30個(gè)氨基酸的表面結(jié)合區(qū)和(ii)對(duì)植入物的聚合表面材料的親和性；GDFBP是一種10-100個(gè)氨基酸的肽，包含(i)10-30個(gè)氨基酸的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)和(ii)對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性；以及L可存在或缺失，且包含SBP與⑶FBP之間的共價(jià)連接物，其中如果L缺失，則SBP與⑶FBP直接連接在一起。SBP和⑶FBP可以各自均保持其親和性的方式偶聯(lián)在一起。這種偶聯(lián)可包括形成多聚分子，其包含兩個(gè)或多個(gè)對(duì)植入物表面具有親和性的肽、兩個(gè)或多個(gè)對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽及其組合。例如，利用肽化學(xué)領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)試劑和方法，兩種肽通過側(cè)鏈-側(cè)鏈鍵合(例如，其中每一種肽均具有一個(gè)側(cè)鏈氨(例如，如賴氨酸的ε氨))、側(cè)鏈-N末端鍵合(例如，偶聯(lián)一種肽的N末端氨與另一種肽的側(cè)鏈)、側(cè)鏈-C末端鍵合(例如，偶聯(lián)一種肽的C末端化學(xué)部分(例如，羧基)與另一種肽的側(cè)鏈氨)、Ν末端-N末端鍵合、N末端-C末端鍵合、C末端-C末端鍵合及其組合。在合成或重組表達(dá)中，可通過將兩種肽均作為單一肽合成或表達(dá)，可將對(duì)植入物表面具有親和性的肽直接偶聯(lián)于對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。兩種或多種肽可通過連接物進(jìn)行偶聯(lián)。[正式定義部分結(jié)束]本發(fā)明提供對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽家族；包含本發(fā)明所述肽的肽組合物；通過將本發(fā)明所述肽組合物施予植入物而涂布該植入物的方法；以及已涂布的植入物，其中該涂層包含根據(jù)本發(fā)明所述的肽組合物；本發(fā)明所有這些與對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽相關(guān)的方面。對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的示例性肽包含由選自由SEQIDN0s:l-11、73、74或75、對(duì)SEQIDNOs:1_11、73、74或75中任何一種或多種具有95%—致性的肽、其保守取代的變異體、其修飾肽(即，該肽經(jīng)修飾包含一種或多種末端修飾以及促進(jìn)連接的修飾)及其組合組成組的氨基酸組成的組。提供下列實(shí)施例是為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明的某些方面而不是為而來限制本發(fā)明。實(shí)施例1本實(shí)施例中示出的是多種用于利用噬菌體展示技術(shù)生成對(duì)本發(fā)明所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽的方法。本發(fā)明所述涂布組合物中多種包含結(jié)合區(qū)的肽(即，對(duì)植入物表面具有親和性的肽和對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽)最初利用噬菌體展示技術(shù)開發(fā)，隨后通過肽設(shè)計(jì)和肽合成而改善結(jié)合特征。噬菌體篩杳和選擇噬菌體展示技術(shù)在本領(lǐng)域中已為人熟知，可用來嘗試鑒定對(duì)篩查中所用特定靶底物具有親和性的噬菌體展示肽。通常，利用噬菌體展示，可提供針對(duì)靶底物的多種肽文庫(kù)，且可選擇特異性結(jié)合該底物的肽，用作結(jié)合區(qū)?？刹捎枚噍喯盗羞x擇(稱為“篩選”)。如本領(lǐng)域中已知的，多種文庫(kù)和篩選(panning)方法中的任何一種均可用于實(shí)施噬菌體展示技術(shù)。篩選方法可包括例如液相篩選、固相篩選或基于細(xì)胞的篩選。一旦鑒定出候選結(jié)合區(qū)，則可采用序列的定向或隨機(jī)突變來優(yōu)化該結(jié)合區(qū)的結(jié)合特征(包括一種或多種親和性和親合力)。例如，可在多個(gè)不同噬菌體展示文庫(kù)中篩查結(jié)合已選定靶底物(例如，一種已選出來尋找本發(fā)明中非常有用的結(jié)合區(qū)的底物)的肽。根據(jù)所選出的底物，將該底物結(jié)合于容器或置于容器(96孔微滴定板的孔或微量離心管)中。容器表面上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)用包含牛血清白蛋白(“BSA”;例如的緩沖液進(jìn)行封閉。隨后用容納含TweenTM20的緩沖鹽水(“緩沖液-T”)的緩沖液洗滌該容器5次。每一個(gè)文庫(kù)均在緩沖液-T中稀釋，并以IOuiPfuAil的濃度共加入100μ1。室溫下以50rpm振蕩孵育(1_3小時(shí))后，通過用緩沖液T多次洗滌而除去未結(jié)合的噬菌體。隨后已結(jié)合的噬菌體可用來在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中感染大腸桿菌細(xì)胞。該細(xì)胞和含噬菌體培養(yǎng)基通過以200rpm在振蕩器中37°C過夜孵育。將培養(yǎng)物離心后，收集含噬菌體的上清液。利用前一輪中擴(kuò)增的噬菌體作為輸入物(input)，以類似于第一輪選擇的方式進(jìn)行第二輪和第三輪篩選。為了檢測(cè)特異性結(jié)合已選出底物的噬菌體，利用軛合于檢測(cè)分子的抗噬菌體抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附(ELISAS)試驗(yàn)，隨后對(duì)該試驗(yàn)中結(jié)合的檢測(cè)分子檢測(cè)并定量。然后測(cè)定該噬菌體中特異性結(jié)合已選出底物的肽的DNA序列；即編碼該肽的序列作為插入子定位于噬菌體基因組中，且可經(jīng)測(cè)序得到展示于噬菌體表面上的相應(yīng)氨基酸序列。作為一個(gè)特別的例證性實(shí)例，利用幾種不同的噬菌體文庫(kù)，將⑶F用作實(shí)施噬菌體選擇的底物。將GDF-7利用兩種不同的方法包被用于噬菌體選擇。在第一種方法中，采用溶于0.IMNaCO3中的⑶F-7(4pmol/孔，每孔100μ1)預(yù)涂布微滴定板的孔。在第二種方法中，采用抗GDF抗體(lug/ml，每孔100μ1)的緩沖液預(yù)包被微滴定板的孔，隨后將⑶F-7(4pmol/孔)加入抗體預(yù)包被的微滴定板孔中。預(yù)包被常常需在4°C過夜孵育，隨后用緩沖液T洗滌幾次。微滴定板孔表面內(nèi)的非特異性結(jié)合位點(diǎn)用牛血清白蛋白(BSA)/0.IMNaCO3進(jìn)行封閉。將該板在室溫下以50rpm振蕩孵育1小時(shí)。隨后將孔用300μ1緩沖液T洗滌5次。每一個(gè)文庫(kù)均用含1%BSA的高鹽(0.5ΜNaCl)緩沖液T進(jìn)行稀釋，并以101Qpfu/ml的濃度加入微滴定板的每一個(gè)孔內(nèi)，每孔100μ1。室溫下以50rpm振蕩孵育2小時(shí)后，用緩沖液T洗滌5次除去未結(jié)合的噬菌體。將該噬菌體加入2xYT培養(yǎng)基中對(duì)噬菌體感染敏感的大腸桿菌細(xì)胞中，將噬菌體感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含2χΥΤ培養(yǎng)基的新管中并在振蕩培養(yǎng)箱中37°C過夜孵育。以8500g離心10分鐘收集噬菌體上清液。利用前一輪中擴(kuò)增的噬菌體作為輸入物(input)，以類似于第一輪選擇的方式進(jìn)行第二輪和第三輪篩選。每一輪選擇均利用ELISA樣試驗(yàn)和噬菌體滴定監(jiān)測(cè)⑶F-7結(jié)合肽的富集程度。將表現(xiàn)出噬菌體(其展示結(jié)合于GDF-7的肽)富集的文庫(kù)鋪種于大腸桿菌細(xì)胞的菌苔上，挑取單個(gè)噬菌斑并通過ELISA試驗(yàn)測(cè)定對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的結(jié)合。對(duì)于ELISA，利用本文中描述的方法，將GDF直接包被或通過已吸附抗體包被于微滴定板的孔表面上。將噬菌體(25μ1噬菌體稀釋液)與75μ1含1%BSA的高鹽緩沖液T一起加入孔內(nèi)，隨后在室溫下孵育1小時(shí)。用緩沖液T洗滌幾次后，加入軛合于辣根過氧化物酶的抗Μ13噬菌體抗體，隨后加入生色劑ABT(2，2，-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸))，20分鐘后測(cè)定405nm處的讀數(shù)。每一孔得到的吸光度值與結(jié)合于GDF-7的噬菌體量相關(guān)。采用針對(duì)插入位點(diǎn)兩側(cè)噬菌體載體序列的引物來測(cè)定編碼每一組中用于噬菌體的肽的DNA序列。編碼肽插入子的序列翻譯后得到噬菌體表面上展示的相應(yīng)氨基酸序列。測(cè)定利用⑶F-7所分離肽的DNA序列并示于表1中。盡管通常這些與所展示肽相鄰的噬菌體氨基酸對(duì)該肽的親和性無顯著性貢獻(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明所述肽的氨基酸序列中，其N末端和C末端還可包括這些與該肽相鄰的噬菌體氨基酸(例如，表1中標(biāo)為ss和sr)。表1.通過利用⑶F-7的噬菌體選擇而分離的肽序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>根據(jù)通過噬菌體選擇在包被的⑶F-7上所鑒定肽的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建了一個(gè)共有氨基酸序列(SEQIDNO:9)，如下SEQIDNO:9=X1XaaXaaX2X3X4X5X6X7XaaX8，其中Xaa是任何氨基酸A1是W、R或L;X2是F或W;X3是E、D、N、M、Q或S;X4是S、T、G或A；X5是L或M;X6是R、Q或V;X7是G或V;X8是E、V、T或P。SEQIDNO10=X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11,其中X1是W、R或L;X2是A、E或R;X3是L、I或S;X4是F或W;X5是E、D、N、M、Q或S;X6是S、T、G或A;X7是L或M;X8是R、Q或V；X9是G或V；X10是K、R、V或G；X11是E、V、T或P。SEQIDNO11=X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11,其中X1是1、尺或L，優(yōu)選W;X2是A、E或R；X3是L、I或S;X4是F或W;X5是E或D;X6是S、T或G;X7是L或M;X8是R或V;X9是G或V；Xltl是K、V或G;X11是E或V。利用該共有序列，共有肽可包含基本由WXXFE(S/T)LXGXEX(SEQIDNO12)組成的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。因此，本文提供了一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的分離肽，該肽包含選自由SEQIDN0:9、SEQIDNO10、SEQIDNO:11組成的組的共有氨基酸序列、包含對(duì)SEQIDN0:9、SEQIDN0:10或SEQIDNO:11進(jìn)行多達(dá)2個(gè)氨基酸添加、缺失或置換(SEQIDN0:9、SEQIDN0:10或SEQIDNO:11的“取代的變異體”)的氨基酸序列、其包含一種或多種末端修飾以及一種促進(jìn)肽連接的修飾的修飾氨基酸序列。因此，這種肽具有的氨基酸序列可選自由SEQIDNOs:1-8、12、73、74和75組成的組。優(yōu)選的，本發(fā)明所述肽可具有對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性，對(duì)GDF-7的相對(duì)親和性由低于1μM較優(yōu)選低于IOOnM的EC50表示。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述取代的變異體與SEQIDNO:9、SEQIDNO10或SEQIDNO11中任何一種具有至少90%的一致性。實(shí)施例2在該實(shí)施例中，進(jìn)一步示出了對(duì)本發(fā)明所述肽的鑒定。本發(fā)明所述肽可利用本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員已知的任何方法合成，包括但不限于固相合成、液相合成、線性合成及其組合。在該實(shí)施例中，肽利用標(biāo)準(zhǔn)的固相肽合成技術(shù)在利用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)的肽合成儀上進(jìn)行合成。所有殘基均偶聯(lián)后，通過用復(fù)合三氟醋酸(TFA)進(jìn)行處理，同時(shí)進(jìn)行切割和側(cè)鏈去保護(hù)。粗制肽用冷乙醚進(jìn)行沉淀，并通過利用線性水/含0.TFA的乙腈梯度的高效液相色譜法(HPLC)加以純化。合成肽的均質(zhì)性利用分析性反相-HPLC進(jìn)行評(píng)價(jià)，肽的特性(identity)則用質(zhì)譜法進(jìn)行確認(rèn)。親和件鑒定本發(fā)明所述代表性肽對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的相對(duì)親和性通過測(cè)定肽的系列稀釋液對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的結(jié)合而測(cè)定。針對(duì)每一種肽序列的濃度范圍，對(duì)所觀察到的吸光度進(jìn)行繪圖，得到該肽對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的結(jié)合曲線，從中可確定EC50(S卩，該結(jié)合曲線中可產(chǎn)生最大信號(hào)50%的肽濃度)。優(yōu)選以EC50小于或等于約1μM較優(yōu)選納摩爾范圍(例如<IOOnM)的親和性結(jié)合纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的肽。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在本發(fā)明所述方法和組合物中，優(yōu)選的肽表現(xiàn)出對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性為EC50小于或等于約1μΜ，較優(yōu)選<ΙΟΟηΜ。對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的典型結(jié)合試驗(yàn)可按照下列步驟實(shí)施。簡(jiǎn)單而言，包含SEQIDNOs:1_3中每一種氨基酸序列的肽經(jīng)生物素化可促進(jìn)在抗生蛋白鏈菌素涂布的96孔板上進(jìn)行包被。微滴定板通過加入50μ110ug/ml的抗生蛋白鏈菌素/0.IMNaHCO3溶液而用抗生蛋白鏈菌素進(jìn)行涂布，并孵育至少3小時(shí)。該板的孔通過加入150μ1的BSA/0.IMNaHCO3溶液進(jìn)行封閉，并將板儲(chǔ)存于4°C直至使用。使用前，在緩沖液T中徹底洗滌，隨后每孔加入20pmol肽(溶于含500mM的100μ1高鹽緩沖液T中)，隨后在室溫下通過振蕩孵育1小時(shí)。加入150μ1的0.5mM生物素(溶于水)封閉殘余的抗生蛋白鏈菌素位點(diǎn)，并將板再孵育1小時(shí)。隨后用TBS-T洗滌板，以去除過量生物素和肽。向每一個(gè)孔中加入生長(zhǎng)因子(包括纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子⑶F-7、⑶F-5、BMP-2和BMP-6；以及除纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子之外的生長(zhǎng)因子，如BMP_5、TGF_β1、TGF-β3或PDGF-BB)的系列稀釋液(溶于高鹽緩沖液T)，濃度范圍在0.OlnM與IOOnM之間。板在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，然后用TBS-T洗滌幾次。生長(zhǎng)因子隨后利用IOOul恰當(dāng)稀釋的針對(duì)該生長(zhǎng)因子的特異性第一抗體進(jìn)行檢測(cè)。用緩沖液T洗滌后，每孔均加入100μ1堿性磷酸酶軛合的第二抗體，并在室溫下孵育45分鐘。過量第二抗體通過用緩沖液T反復(fù)洗滌而除去，孔中殘留的堿性磷酸酶的量利用PNPP(磷酸對(duì)硝基苯酯)酶顯色定量分析進(jìn)行檢測(cè)。該肽所捕獲生長(zhǎng)因子的量通過測(cè)定堿性磷酸酶反應(yīng)的有色產(chǎn)物在405nm處的吸光度而測(cè)定。測(cè)定每一種肽相對(duì)于多種生長(zhǎng)因子的親和性EC50，如表2中所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>ndb-無可檢測(cè)到的結(jié)合(例如，相對(duì)于陰性對(duì)照和試驗(yàn)背景)。因?yàn)檎J(rèn)為⑶F也是BMP蛋白家族的成員，因此共有顯著的氨基酸序列同源性，且注意到本發(fā)明所述肽與BMP-5具有某些結(jié)合方面的交叉反應(yīng)性。然而，表2中列出的所有生長(zhǎng)因子均屬于TGF-β超家族，因此共有序列同源性；然而，本發(fā)明所述肽主要表現(xiàn)為對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子而非TGF-β超家族中其他除BMP/GDF生長(zhǎng)因子家族成員的親和性。我們實(shí)施了進(jìn)一步的結(jié)合研究，從中測(cè)定了本發(fā)明所述肽對(duì)不同生長(zhǎng)因子的結(jié)合優(yōu)先性。對(duì)于具有氨基酸序列SEQIDNOs:1或3的肽，親和優(yōu)先性(相對(duì)親和性從最高到最低)如下GDF-7>GDF-5,BMP-2>BMP-6>BMP-5>TGF-βUTGF-β3或PDGF-BB(后3種未對(duì)該肽表現(xiàn)出可檢測(cè)性結(jié)合)。對(duì)于具有氨基酸序列SEQIDNO:2的肽，則親和優(yōu)先性如下GDF-7>GDF-5,BMP-2和BMP-6>BMP-5>TGF-βUTGF-β3或PDGF_BB(相比于SEQIDNO:1或SEQIDNO，3該肽對(duì)后3種生長(zhǎng)因子未表現(xiàn)出可檢測(cè)性結(jié)合，但對(duì)⑶F_7則表現(xiàn)出比BMP-2、BMP-6和⑶F-5中任何一種都顯著較高的結(jié)合)。因此，本發(fā)明所述肽表現(xiàn)出對(duì)⑶F-7的優(yōu)先結(jié)合，且表現(xiàn)出對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性。實(shí)施競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)來確定具有氨基酸序列SEQIDNOs:1、2和3的肽是否在相似或重疊位點(diǎn)結(jié)合⑶F-7。如上所述實(shí)施結(jié)合試驗(yàn)，其中所包被的肽為SEQIDNOs:1、2或3的其中一種；但除了加入⑶F-7，還以過量達(dá)所包被肽1000倍的摩爾濃度向反應(yīng)溶液中加入競(jìng)爭(zhēng)肽(SEQIDN0s:l、2或3的其中一種)。如果相比于所包被的肽，該競(jìng)爭(zhēng)肽以高親和性在GDF-7上的相似位點(diǎn)結(jié)合GDF-7，則將需要相對(duì)較低濃度的競(jìng)爭(zhēng)肽來抑制GDF-7與所包被肽的結(jié)合。根據(jù)這些研究，可顯示具有氨基酸序列SEQIDNOs:1、2和3的肽具有⑶F-7上的相似結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)施例3表3示出了對(duì)植入物表面材料具有親和性的示例性肽(“表面結(jié)合肽”)。例如，表面結(jié)合肽包括具有表面結(jié)合區(qū)且對(duì)包括但不限于例如聚苯乙烯、聚氨基甲酸酯、聚乙醇酸、聚碳酸鹽、尼龍、丁eflon、聚乙烯對(duì)苯二甲酸酯纖維和基于膠原的底物等材料具有親和性的肽。示例性的表面結(jié)合肽包括SEQIDNOs13-71.在某些實(shí)施方式中，在生成本發(fā)明所述組合物時(shí)，可將至少一種表面結(jié)合肽偶聯(lián)于至少一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例4該實(shí)施例示出了一種制備本發(fā)明所述組合物的方法，包括將至少一種對(duì)植入物表面材料具有親和性的肽與至少一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽偶聯(lián)在一起。形成本發(fā)明所述用于涂布植入物的組合物時(shí)，利用本文中描述的方法以及本領(lǐng)域中熟知的將兩種分子偶聯(lián)在一起(直接或通過使用連接物)的方法，例如，可將對(duì)植入物表面具有親和性的肽偶聯(lián)于對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。對(duì)于本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員來說很明顯的，用于偶聯(lián)或連接兩種分子的優(yōu)先方法將隨每一種分子上存在的反應(yīng)官能團(tuán)而有所不同。如本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員所知，可用于共價(jià)偶聯(lián)的反應(yīng)性官能團(tuán)所包含的化學(xué)基團(tuán)可選自由馬來酰亞胺、硫醇、羧基、氫、磷酰基、?；?、羥基、乙酰基、醛、疏水的、胺、氨基、丹酰、巰基、琥珀酰亞胺(包括但不限于琥珀酰亞胺酯或琥珀酰亞胺碳酸酯)、鹵素、硫醇_反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)、胺反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)、羧基反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)、羥基反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)及其組合組成的組。為了說明該實(shí)施方式，采用連接物來偶聯(lián)對(duì)植入物表面具有親和性的肽和對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。因?yàn)槎喾N市售縫線均由編織的聚乙烯對(duì)苯二甲酸酯纖維構(gòu)成，且包含氨基酸序列SEQIDNO:67的肽對(duì)該縫合材料(例如，植入物的表面材料)具有親和性，因此選擇該肽作為代表性表面結(jié)合肽，包含入內(nèi)作為本發(fā)明所述組合物中的一個(gè)組分。類似的，具有氨基酸序列SEQIDNOs1-3的肽也可單獨(dú)作為對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的代表性肽，且包含入內(nèi)作為本發(fā)明所述組合物中的一個(gè)組分。利用用于肽合成的標(biāo)準(zhǔn)方法，合成包含SEQIDNO:1_3和SEQIDNOs67的氨基酸序列，以在C末端包含一個(gè)氨基酸連接序列(例如，GSSGK，SEQIDNO:72)，其中生物素連接于C末端(借助于賴氨酸殘基)。參見例如SEQIDNOs73-760將抗生蛋白鏈菌素(具有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn))與生物素在生物素化肽上一起應(yīng)用，可形成該兩種不同肽組分之間的連接物。盡管多種摩爾比均可成功應(yīng)用，但在一個(gè)示例性實(shí)例中，表面結(jié)合肽與對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽之間以21的摩爾比用于該偶聯(lián)反應(yīng)中。因此，將1416pmol表面結(jié)合肽與708pmol對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽在30ylH20中混合，將30iaimg/ml的抗生蛋白鏈菌素儲(chǔ)存液加入該混合物中，并將其在室溫下孵育10分鐘。隨后該反應(yīng)混合物在冰上冷卻達(dá)45分鐘。為了封閉抗生蛋白鏈菌素上任何未占據(jù)的生物素結(jié)合位點(diǎn)，將0.5mM生物素/440iU高鹽緩沖液T加入反應(yīng)混合物中。這樣，可形成本發(fā)明所述組合物，包含至少一種表面結(jié)合肽，而其偶聯(lián)于至少一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。在該實(shí)施例中，通過使植入物與組合物(例如，將該植入物浸于包含該組合物的溶液中)接觸達(dá)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，而將本發(fā)明所述組合物施予該植入物，實(shí)現(xiàn)該組合物與該植入物的結(jié)合。將由聚乙烯對(duì)苯二甲酸酯纖維構(gòu)成的商品化縫線切成0.5cm的長(zhǎng)度，并置于96孔板的孔內(nèi)。隨后在高鹽緩沖液T中用1%BSA室溫封閉這些孔達(dá)30分鐘。用作實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照(“對(duì)照軛合物”)的肽軛合物通過將生物素化表面結(jié)合肽結(jié)合于抗生蛋白鏈菌素而制備(即，不包含對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽)。本發(fā)明所述三種代表性組合物中的每一種均以不同濃度(從該組合物的終濃度為lOOnM；0.5uM的軛合物開始)分別與高鹽緩沖液T一起加入各個(gè)包含縫線且包含⑶F-7的孔中，并在室溫下孵育1小時(shí)。該縫線隨后用高鹽溶液T洗滌幾次，利用抗GDF-7的抗體_第二抗體-AP軛合物通過利用pNPP酶顯色定量分析進(jìn)行檢測(cè)，而實(shí)施定位并存留于縫線上的GDF-7檢測(cè)。該肽軛合物，如陰性對(duì)照所預(yù)期的，對(duì)GDF-7未表現(xiàn)出可估計(jì)的結(jié)合(例如，相對(duì)于分析背景而言)。對(duì)所述三種代表性組合物中每一種均生成一條結(jié)合曲線，用于測(cè)定EC50值，作為每一種代表性組合物對(duì)GDF-7親和性的一個(gè)衡量標(biāo)準(zhǔn)，盡管所述反應(yīng)性組合物結(jié)合于植入物(例如，縫線)。從該結(jié)合曲線，該三種代表性組合物中的每一種(每一種均已固定于植入物表面上)均展示出對(duì)⑶F-7的親和性，EC50低于lOnM。用于結(jié)合試驗(yàn)的條件可以變化，包括足以使最大量GDF-7結(jié)合于本發(fā)明所述已固定于植入物表面上的組合物的時(shí)間?？梢源_定，在這些實(shí)驗(yàn)中，生長(zhǎng)因子與組合物的最大結(jié)合發(fā)生在最初幾分鐘內(nèi)(例如，在5-10分鐘的時(shí)間內(nèi))，且與植入物接觸達(dá)1小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，似乎不再有更多的⑶F-7存留于植入物表面上。這些以及其他數(shù)據(jù)表明，在將本發(fā)明所述組合物施予植入物表面時(shí)，足以將組合物結(jié)合于該植入物(以及將纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合于該組合物)的時(shí)間可包括使該植入物與組合物接觸(或者使組合物與纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子接觸)最少幾分鐘。為了測(cè)定本發(fā)明所述組合物在植入物表面上的存留，采用一種利用標(biāo)準(zhǔn)Western印跡技術(shù)的方法檢測(cè)⑶F-7。將⑶F-7結(jié)合于本發(fā)明所述組合物(包括一種含氨基酸序列SEQIDNO:67的表面結(jié)合肽，其偶聯(lián)于一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽，其包含氨基酸序列SEQIDN0:2)，隨后使該組合物在微量離心管中與縫線接觸并施予縫線，如本文之前所述。隨后在存在100%人血漿的情況下，孵育縫線達(dá)0、1、3或6天。22在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)，去除管中的血漿，簡(jiǎn)單洗滌縫線，加入凝膠電泳樣品緩沖液，并將縫線在樣品緩沖液中煮沸以洗脫任何借助該組合物結(jié)合于縫線的GDF。樣品利用標(biāo)準(zhǔn)凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，隨后通過電印跡轉(zhuǎn)移至膜上。采用抗⑶F-7抗體和第二抗體與堿性磷酸酶(AP)的軛合物以及隨后的顯色，利用標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡技術(shù)檢測(cè)⑶F-7。該試驗(yàn)中還包括已知的GDF量(例如，100ng、50ng、25ng、12.5ng)，這使得可利用Western印跡的密度分析構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。除了前述利用肽抗生蛋白鏈菌素軛合物測(cè)定縫線上GDF-7存留的實(shí)驗(yàn)之外，還可利用用于肽合成的標(biāo)準(zhǔn)方法合成表面結(jié)合肽(SEQIDN0:71)以及其共價(jià)結(jié)合的對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽(SEQIDN0:2)。⑶F-7存留實(shí)驗(yàn)(retentionexperiment)可類似于包含共價(jià)連接結(jié)合區(qū)的肽而實(shí)施，僅做了極小的修改。利用該試驗(yàn)，超過50ng/cm⑶F_7可通過肽與抗生蛋白鏈菌素的軛合物而存留，而利用共價(jià)連接的肽組合物則有超過80ng/cm的GDF-7存留，且最初固定于所孵育的縫線上。與第0天相比，到第3天時(shí)，抗生蛋白鏈菌素軛合物釋放出最初結(jié)合于縫線上GDF-7中的約一半，到第6天時(shí)，則釋放出最初結(jié)合于縫線上⑶F-7中的約三分之二。到第4天時(shí)，共價(jià)肽組合物即釋放出最初結(jié)合于縫線上⑶F-7中的約三分之二。因此，通過該實(shí)施例，可表明纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子借助于本發(fā)明所述組合物在植入物表面上的存留和定位，以及纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子從結(jié)合于該植入物(其定位于該植入物)的組合物緩慢釋放。此外，還表明生物學(xué)相關(guān)量的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子通過本發(fā)明所述組合物存留于植入物表面(據(jù)報(bào)道，對(duì)于縫線而言，估計(jì)用于誘導(dǎo)肌腱組織愈合的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的生物學(xué)有效濃度為約40ng/cm)。另外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表面相當(dāng)量的本發(fā)明所述組合物(包括已結(jié)合的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子)可持續(xù)偶聯(lián)于縫線表面，即使在縫線穿過肌腱組織幾次之后。實(shí)施例5在該實(shí)施例中，進(jìn)一步闡釋用于將本發(fā)明所述組合物施予植入物的方法。該方法包括使組合物與所述將該組合物施予其的至少一種植入物表面(例如，將用組合物涂布的表面)與一定量可有效促進(jìn)纖維結(jié)締組織形成的組合物相接觸(例如，通過在植入物部位釋放纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子)。該組合物的有效量可由醫(yī)師通過考慮如下因素而確定，包括但不限于待遞送纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的類型，待治療、修復(fù)、緩解的纖維結(jié)締組織病癥或指征，組織損傷區(qū)域的大小，植入物大小，植入物類型以及希望形成的纖維結(jié)締組織量。利用本領(lǐng)域中已知的方法，還可根據(jù)利用本發(fā)明所述組合物的臨床前研究和臨床研究結(jié)果確定有效劑量。由本發(fā)明組合物所誘導(dǎo)纖維結(jié)締組織形成的過程或評(píng)估可通過本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，例如多種成像技術(shù)(例如，X線、計(jì)算機(jī)輔助的斷層技術(shù)(CAT掃描)、磁共振成像(MRI)、關(guān)節(jié)鏡檢查)。該組合物可施予植入物，其中該組合物包含在施予所述植入物時(shí)已結(jié)合于該組合物的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)該組合物施予植入物時(shí)，對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽尚未結(jié)合于纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子。關(guān)于后一種情況，隨后在進(jìn)一步的涂布步驟中，在適于纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合于已結(jié)合于植入物表面的組合物的條件下使其上已施予組合物的表面材料與足夠量的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子相接觸(體外或體內(nèi))。在一個(gè)實(shí)例中，將本發(fā)明所述組合物施予植入物，隨后將該植入物定位于正常位置。在另一個(gè)實(shí)例中，將本發(fā)明所述組合物施予正常位置的植入物。例如，如果該植入物通過身體的開放部位暴露(例如，在手術(shù)過程中)，則醫(yī)師可通過噴霧或其他方式將該組合物施予正常位置的植入物。在另一個(gè)實(shí)例中，如果植入物不易于通過諸如噴霧涂層而施予，本發(fā)明所述組合物可通過在植入物部位注射而給予，從而使該組合物與植入物相接觸。為了便于組合物的注射，該組合物進(jìn)一步包含一種藥物可受載體?？刹捎帽绢I(lǐng)域中已知的方便過程將本發(fā)明所述涂布組合物施予一種或多種待涂布的表面(使涂布組合物與所述一種或多種表面相接觸時(shí))。根據(jù)待涂布植入物的性質(zhì)，已知這種過程包括但不限于浸透、混合、泡入、刷涂、噴霧和氣相淀積。例如，包含所述涂布組合物的溶液或懸液可通過噴霧裝置的噴管施予，從而得到可涂布將涂布植入物表面的液滴。將所涂布植入物干燥，隨后在使用前進(jìn)一步處理(例如，在溶液(如水或等張緩沖液)中洗滌除去過量涂布組合物；如果用于體內(nèi)用途，通過利用本領(lǐng)域中用于消毒聚合物的方法中任何一種進(jìn)行消毒；等等)?？商娲?，涂布過程之前，所述涂布組合物和植入物各自均進(jìn)行消毒，且施予過程在無菌條件下進(jìn)行。在另一種用于將涂布組合物施予待涂布植入物一個(gè)或多個(gè)表面的過程中，將植入物表面泡入包含涂布組合物(其量可有效涂布該植入物)的液體(例如，溶液或懸液，含水或溶劑)中。例如，將該表面泡入或浸入含所述組合物的水浴中。用于施予該涂布組合物的恰當(dāng)條件包括使待涂布表面與包含涂布組合物的液體在恰當(dāng)溫度(例如，從10°c至約50°C;較優(yōu)選的，從室溫至37°C)持續(xù)接觸恰當(dāng)時(shí)間(例如，從約5分鐘至約12小時(shí)；較優(yōu)選的，從約5分鐘至約60分鐘)。如應(yīng)用所必需的，隨后可對(duì)所涂布植入物進(jìn)一步處理(例如，洗滌、消毒等)。這些用于將涂布組合物施予植入物的示例性過程并非專有的，因?yàn)槠渌坎己拖痉椒ㄒ部刹捎?如本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員將能夠選擇可符合特定植入物和目標(biāo)需求的組合物和方法)。此外，在一種根據(jù)本發(fā)明所述的方法中，植入物表面上包含該涂布組合物的涂層可通過例如空氣干燥而消毒。然而，這些處理并非專有的，其他涂布和穩(wěn)定方法也可采用。恰當(dāng)?shù)耐坎己头€(wěn)定方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)為人所知。例如，將利用本發(fā)明所述涂布組合物進(jìn)行涂布的所述至少一個(gè)植入物表面可在涂布步驟前進(jìn)行預(yù)處理以增強(qiáng)以下一種或多種具有親和性的肽與待涂布表面材料的結(jié)合；以及涂層的連貫性和均一性。實(shí)施例6在該實(shí)施例中，合成本發(fā)明所述包含對(duì)植入物表面材料具有親和性的肽(偶聯(lián)于對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽)的肽組合物，包含一種或多種脂肪酸末端修飾、脂肪酸連接物、PEG連接物以及氨基酸連接物。本發(fā)明所述示例性肽以及根據(jù)本發(fā)明所述方法合成的肽均示于表4中。這些化合物均以線性序列列出，其中“AUD”表示氨基十一烷酸；“MYR”表示肉豆蔻酸；“Ahx”表示含氨基己酸的脂肪酸；“B”表示生物素；“NH2”表示已酰胺化的修飾C末端氨基酸。偶聯(lián)于對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽且對(duì)植入物表面材料具有親和性的肽C末端進(jìn)一步包含生物素化連接物，以利于功能研究中的檢測(cè)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>下列首字母縮略詞在本文中用來描述用于制備本發(fā)明所述化合物的方法中。Mtt是4-甲基三苯甲基；TATU是2-(7-Aza-lH-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲四氟硼酸鹽；DIEA是二異丙基乙胺；NMP是1-甲基-2-吡咯(烷)酮；DCM是二氯甲烷；DMF是二甲基酰胺；TFA是三氟醋酸；TIS是三異丙基硅烷；TBTU是0-(苯并三唑-1-基)-N,N,N，，N，-四甲基脲四氟硼酸鹽；HOBt是0-Pfp酯/I-羥基苯并三唑；NMM是N-甲基嗎啉；RP-HPLC是反相高效液相色譜；Fmoc是9-芴甲氧羰基；tBU是t_丁酰；mini-PEG是Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸；MALDI-T0F是基質(zhì)輔助的激解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜；試劑A是水/TFA(0.1%TFA)；試劑B是乙腈/TFA(0.1%TFA)；Fmoc-PAL-PEG樹脂是[5-(4-Fmoc-氨甲基-3，5-二甲氧基苯基)戊酸]-聚乙二醇-聚苯乙烯樹脂。利用AA/TBTU/HOBt/NMM(l112)作為偶聯(lián)劑的標(biāo)準(zhǔn)Fmoc/t_Bu化學(xué)可用來合成示例性肽740P。基礎(chǔ)樹脂，F(xiàn)moc-PAL-PEG-PS(0.20mmol/g)用于合成包含SEQIDNO:71的氨基酸序列，隨后是兩個(gè)mini-PEG連接物，隨后是包含SEQIDNO2的氨基酸序列。合成循環(huán)中采用5倍過量的氨基酸，且所有殘基均為雙重或三重偶聯(lián)。偶聯(lián)反應(yīng)通過凱澤茚三酮試驗(yàn)(Kaiserninhydrintest)或綠醌試驗(yàn)(chloraniltest)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。為了抑制肽聚集，采用假脯氨酸肽Fmoc-Ser-Ser(PsiMe,Mepro)-0H，并以5倍過量進(jìn)行雙重偶聯(lián)。Fmoc-Lys(生物素)-0H和FmOC-Mini-PEG-C02H利用上述偶聯(lián)條件進(jìn)行手工雙重偶聯(lián)。Fmoc去保護(hù)反應(yīng)利用20%哌啶在含0.1MHOBt的DMF中實(shí)施。將氨基己酸(Ahx)引入樹脂結(jié)合肽的N末端，隨后利用TBTU活化法進(jìn)行肉豆蔻酸的雙偶聯(lián)。室溫下，利用試劑K(TFAEDTH20酚苯甲硫醚=82.52.5555)將該化合物從樹脂切割達(dá)4小時(shí)。粗制產(chǎn)物在冷醚中沉淀。離心后得到的沉淀用冷醚洗滌兩次，并低壓凍干得到白色固體即粗制肽。粗制線性肽利用3%DMS0在10mMPBS(pH7.4)緩沖液環(huán)化48小時(shí)(肽濃度0.065-0.075mM)。將粗制環(huán)化肽在RP-HPLC柱(C18；250x21.2mm)上利用流動(dòng)洗脫劑(A=H0/TFA(0.1%TFA)，B=乙腈/TFA(0.1%TFA))采用15%B至55%B的梯度以10Ml/min@220nm進(jìn)行純化。收集包含所需產(chǎn)物的餾分，并低壓凍干得到一種松散的白色粉末，并用MALDI-T0F分析確認(rèn)所需產(chǎn)物。利用與本文中肽740P所述類似的方法和試劑，合成肽NOs:710P_830P。實(shí)施例7縫線上的⑶F-7捕獲實(shí)施下列步驟檢測(cè)本發(fā)明所述示例性肽組合物捕獲縫線上GDF-7的能力，所述肽組合物包含對(duì)植入物表面材料具有親和性的肽，而其偶聯(lián)于對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。實(shí)施例6中描述的肽組合物(SEQIDNOS:710P-830P)如下進(jìn)行檢測(cè)。用保險(xiǎn)刀片將ETHIB0NDEXCEL1縫線(ETHIC0N)切成0.5cm長(zhǎng)的段，并置于96孔聚丙烯板的孔內(nèi)。該板用BSA/TBS(高鹽)室溫振蕩1小時(shí)而封閉。在TBST高鹽中制備liiM肽組合物并按照100Pi/孔/縫線加入將該肽溶液，板在室溫下振蕩孵育30min。該板用250u1TBST高鹽手工洗滌4次。在TBST高鹽中將⑶F_7(R&DSYSTEMS)溶液制備成50nM的濃度，并以14系列稀釋加入96孔板中，濃度范圍為0.01nM-50nM。該板室溫振蕩孵育1小時(shí)并用250u1TBST高鹽手工洗滌4次。⑶F-7用抗⑶F-7的抗體-第二抗體-AP軛合物通過利用PNPP酶顯色定量分析進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定通過肽組合物捕獲GDF的相對(duì)EC50值。EC50值總結(jié)于圖2中。實(shí)施例8對(duì)于本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員來說，很顯然，可根據(jù)本發(fā)明所述肽(包含對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的氨基酸序列)的氨基酸序列來合成或構(gòu)建編碼該肽(或如本文所述的其變異體)的多核苷酸(核酸分子)，且可通過采用重組DNA技術(shù)作為一種制備方式(例如，在縫線中)和/或通過體內(nèi)引入這種多核苷酸進(jìn)行體內(nèi)生成而得到這種肽。例如，對(duì)于本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員來說，很顯然，一種以上多核苷酸序列可編碼本發(fā)明所述的肽，且這些多核苷酸可根據(jù)已知編碼該肽氨基酸的三聯(lián)密碼子、第三堿基簡(jiǎn)并性和選擇無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)或宿主細(xì)胞(通常為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞(例如，細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞；酵母菌細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞；禽類細(xì)胞；兩棲動(dòng)物細(xì)胞；植物細(xì)胞；魚類細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞；位于體外或體內(nèi)，希望在這些細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá))偏向的三聯(lián)密碼子選擇而合成。對(duì)于本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員來說，生成上述簡(jiǎn)并變異體，例如，以優(yōu)化用于特定宿主的密碼子表達(dá)(例如，將細(xì)菌mRNA中的密碼子更改為哺乳動(dòng)物、植物或其他細(xì)菌宿主如大腸桿菌偏向的密碼子)是常規(guī)的。出于說明而非限制的目的，本文提供了SEQIDN0s:77-79，其為編碼氨基酸序列SEQIDN0s:l、2和3的多核苷酸，對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說，很顯然，分別來自這些多核苷酸的密碼子選擇通常將適用于編碼本發(fā)明所述對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽的多核苷酸。因此，例如，利用SEQIDN0:77并結(jié)合(inrelationto)SEQIDNO:1，本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員可易于構(gòu)建編碼SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的變異體的多核苷酸，或推論編碼如SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，編碼對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性肽的氨基酸序列的多核苷酸包括的核酸分子所編碼的肽基本由對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽的氨基酸序列組成，或由與對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性肽的氨基酸序列具有至少95%—致性(較優(yōu)選的，至少90%—致性)的氨基酸序列組成，只要所編碼的肽對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性。在一種示例性實(shí)施方式中，提供了一種重組載體，其包含的多核苷酸編碼按照本發(fā)明所述而應(yīng)用且對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽；且提供了所述重組生成對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽的用途。在一個(gè)實(shí)例中，該多核苷酸可加入本領(lǐng)域中已知的無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)用于生成肽或多肽。在另一個(gè)實(shí)例中，該多核苷酸可定位于于表達(dá)載體內(nèi)，使得當(dāng)宿主細(xì)胞中生成該肽時(shí)，其作為一種與其他氨基酸序列(例如，其有助于該肽的純化；或重組性偶聯(lián)于表面結(jié)合區(qū))的融合蛋白或作為該肽的多拷貝或多聯(lián)體而得到。例如，已有一些序列為本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員所知，作為含需表達(dá)肽的融合蛋白的一部分，其促進(jìn)在用于表達(dá)的原核細(xì)胞胞漿內(nèi)生成包涵體和/或有助于純化包含該序列的融合蛋白。包涵體可通過本領(lǐng)域中已知的方法與其他原核細(xì)胞組分分離，包括變性劑以及分部分離(例如，離心、柱層析等)。在另一個(gè)實(shí)例中，存在一些商品化載體，其中可插入將表達(dá)為蛋白或肽的所需感興趣核酸序列，這樣一旦表達(dá)，即可利用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的純化。對(duì)于本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員來說，很顯然，可將編碼本發(fā)明所述對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽的核酸序列插入核酸分子中，包括質(zhì)?；虺|(zhì)粒之外的載體；并成為其一部分。還可采用其他表達(dá)系統(tǒng)，包括但不限于用噬菌體載體轉(zhuǎn)染的細(xì)菌或粘粒DNA；包含酵母的酵母載體；包含真菌的真菌載體；感染病毒(例如桿狀病毒)的昆蟲細(xì)胞系；以及已引入(例如轉(zhuǎn)染或電擊穿孔)質(zhì)粒或病毒表達(dá)系統(tǒng)或者已感染重組病毒(例如，痘苗病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。肽的成功表達(dá)需要包括該肽編碼序列的重組核酸分子或載體本身包含轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的控制元件，其與用于表達(dá)的特定宿主系統(tǒng)相容并被其識(shí)別。利用分子生物學(xué)領(lǐng)域中已知的方法，包括上述方法，可將多種啟動(dòng)子和增強(qiáng)子整合入載體內(nèi)或包含編碼序列的重組核酸分子內(nèi)，以增加肽的表達(dá)，只要該肽的表達(dá)增加與所采用的特定宿主系統(tǒng)相容(例如，對(duì)其無毒性)。對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說，很顯然，選擇啟動(dòng)子將依賴于所采用的表達(dá)系統(tǒng)。啟動(dòng)子的強(qiáng)度即促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力有所不同。通常，為了表達(dá)已克隆基因，需要采用較強(qiáng)啟動(dòng)子以獲得該基因的高水平轉(zhuǎn)錄及表達(dá)為基因產(chǎn)物。例如，本領(lǐng)域中已知的細(xì)菌、噬菌體或質(zhì)粒啟動(dòng)子(從其已觀察到宿主細(xì)胞系統(tǒng)包括大腸桿菌中的高水平轉(zhuǎn)錄)包括lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、recA啟動(dòng)子、核糖體RNA啟動(dòng)子、P.sub.R和P.sub.L啟動(dòng)子、lacUV5、ompF、bla、lpp等，可用來提供編碼合成肽的插入核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。用于哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體中通常采用的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子是來自哺乳動(dòng)物病毒基因的啟動(dòng)子。實(shí)例包括SV40早期啟動(dòng)子、小鼠乳腺瘤病毒LTR啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、單純皰疹病毒啟動(dòng)子以及CMV啟動(dòng)子。如果在某些情況下肽的表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞是致死性的或有害的，則可選擇該宿主細(xì)胞株/系和表達(dá)系統(tǒng)，使得該啟動(dòng)子的活化被抑制直至被特異性誘導(dǎo)。例如，在某些操縱子中，加入特殊誘導(dǎo)子對(duì)于高效轉(zhuǎn)錄所插入DNA是必需的(例如，lac操縱子可通過加入乳糖或異丙基-0-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)而誘導(dǎo)；當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中缺乏色氨酸時(shí)，trp操縱子被誘導(dǎo)；而四環(huán)素可用于具有tet敏感性啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中)。因此，通過在控制編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子不被誘導(dǎo)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞而延緩該肽表達(dá)，而當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞達(dá)到合適密度時(shí)，可誘導(dǎo)該啟動(dòng)子用于該編碼序列的表達(dá)。本領(lǐng)域中熟知的其他用于高效基因轉(zhuǎn)錄或信使翻譯的控制元件包括增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄或翻譯起始信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化序列，等等。實(shí)施例9在該實(shí)施例中，示出了一個(gè)包含本發(fā)明所述組合物的試劑盒。該試劑盒的組成部分可包括一個(gè)容納組合物的容器，而該組合物包含至少一種對(duì)植入物表面材料具有親和性的肽，其已偶聯(lián)于至少一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽?？蛇x的，該組合物可包括所述已結(jié)合于纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。優(yōu)選的容器類型是瓶，例如那些通常用于藥劑溶液或凍干粉末、藥用的、藥物、貼片等的容器?？商娲?，該試劑盒中的一個(gè)組成部分可以為容納纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的第一容器以及容納組合物的第二容器，該組合物包含至少一種對(duì)植入物表面材料具有親和性的肽，而該肽已偶聯(lián)于至少一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。因此，可在將該組合物施予植入物表面的步驟中將所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子加入本發(fā)明所述組合物中，而非作為包含纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的已完成組合物的一部分；或者可在將組合物施予植入物表面之前與本發(fā)明所述組合物混合。該試劑盒的其他組成部分可包括但不限于用于重溶(重建)的液體(一個(gè)或多個(gè)容納可用來重溶試劑盒組成部分的稀釋劑或液體，例如用于重溶本發(fā)明所述組合物和/或可包裝為凍干或粉末形式的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子)；用于將該組合物施予植入物的供給裝置(applicatordevice)(例如浸濕盤(soakingtray)、刷子、涂藥器襯墊(applicatorpad)、注射器、注射針頭或其組合)、試劑盒使用說明書、將施予本發(fā)明所述組合物的植入物以及其組合。試劑盒包含的這些組成部分可包裝在一起，例如在單個(gè)無菌容器中(例如，盒子、淺箱、小藥袋或其他形式的便利包裝)。該試劑盒還可包括多個(gè)獨(dú)立包裝的組成部分，而這些獨(dú)立包裝隨后可容納于單個(gè)較大容器中。為了用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域或牙科領(lǐng)域，優(yōu)選這些組成部分在包裝或容器中進(jìn)行消毒以使其可立即在無菌環(huán)境中應(yīng)用。為了說明，已對(duì)前文所述本發(fā)明的特殊實(shí)施方式進(jìn)行了詳細(xì)闡述。根據(jù)說明書和舉例，本領(lǐng)域中的其他熟練技術(shù)人員可通過應(yīng)用現(xiàn)有知識(shí)而方便的修改和/或改良本發(fā)明用于多種應(yīng)用而不背離本發(fā)明的基本概念；因此，認(rèn)為這些修改和/或改良也在附屬權(quán)利要求的含義和范圍內(nèi)。權(quán)利要求一種具有通式SBP-L-GDFBP或GDFBP-L-SBP的肽組合物，其中SBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30個(gè)氨基酸的表面結(jié)合區(qū)和(ii)對(duì)植入物的聚合表面材料的親和性；GDFBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，包含(i)10-30個(gè)氨基酸的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)和(ii)對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性；以及L可存在或缺失，且包含SBP與GDFBP之間的共價(jià)連接物，其中如果L缺失，SBP與GDFBP直接連接在一起。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:9ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述表面結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:71，纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:9。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述表面結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:71，纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:2。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含藥物可受載體。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽組合物，進(jìn)一步包含結(jié)合于⑶FBP的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子。7.根據(jù)權(quán)利要求6述的肽組合物，其中所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子是⑶F-7。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽組合物，其中L存在并選自由聚合物、合成的聚合物、聚醚、聚乙二醇(“PEG”)、10個(gè)單位的聚乙二醇(“P10”)、6個(gè)單位的聚乙二醇(“MP”)、脂肪酸、十一烷酸(AUD)、肉豆蔻酸和氨基酸組成的組。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽組合物，包含氨基末端的脂肪酸修飾。10.一種用肽組合物涂布植入物的方法，所述方法包括(a)通式為SBP-L-GDFBP或⑶FBP-L-SBP的肽組合物與植入物的表面接觸，其中SBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30個(gè)氨基酸的表面結(jié)合區(qū)和(ii)對(duì)植入物的聚合表面材料的親和性；⑶FBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30個(gè)氨基酸的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)和(ii)對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性；以及L可存在或缺失，且包含SBP與⑶FBP之間的共價(jià)連接物，其中如果L缺失，SBP與⑶FBP直接連接在一起，其中所述肽組合物的至少一部分借助于表面結(jié)合區(qū)對(duì)所述植入物的聚合表面材料的親和性而結(jié)合于所述植入物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，進(jìn)一步包括纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子接觸GDFBP012.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子是GDF-7。13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述植入物的聚合物表面材料選自由可生物降解性聚合物、合成聚合物、天然聚合物、膠原、聚對(duì)苯二甲酸乙酯、聚四氟乙烯、聚酯、聚乳酸聚乙醇酸交酯共聚物、其混合物、其復(fù)合物、其共聚物及其組合組成的組。14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述植入物選自由縫線、可生物降解性海綿、心臟修補(bǔ)網(wǎng)狀織物、肌腱包繞、韌帶包繞、纖維結(jié)締組織假體、膠原支架、膠原線、復(fù)合膠原氈圈、合成的移植物、韌帶移植物、韌帶假體、韌帶增強(qiáng)裝置和鞏膜扣帶組成的組。15.一種涂布通式為SBP-L-GDFBP或⑶FBP-L-SBP的肽組合物的植入物其中SBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30個(gè)氨基酸的表面結(jié)合區(qū)和()對(duì)植入物的聚合表面材料的親和性；⑶FBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，所述包含(i)10-30個(gè)氨基酸的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)和(ii)對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性；以及L可存在或缺失，且包含SBP與⑶FBP之間的共價(jià)連接物，其中如果L缺失，SBP與⑶FBP直接連接在一起。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的植入物，其中所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:9ο17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的植入物，所述表面結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:71，纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:9。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的植入物，所述表面結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:71，纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:2。19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的肽組合物，其中L存在并選自由聚合物、合成的聚合物、聚醚、聚乙二醇(“PEG”)、10個(gè)單位的聚乙二醇(“P10”)、6個(gè)單位的聚乙二醇(“MP”)、月旨肪酸、十一烷酸(AUD)、肉豆蔻酸和氨基酸組成的組。20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的肽組合物，其中所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合于GDFBP021.根據(jù)權(quán)利要求20所述的肽組合物，其中所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子是GDF-7022.根據(jù)權(quán)利要求15所述的植入物，其中所述肽組合物包含氨基末端的脂肪酸修飾。23.一種用于刺激患者纖維結(jié)締組織產(chǎn)生的方法，所述方法包括(a)將包含聚合物表面材料的植入物置于患者靶部位，所述聚合物表面材料的至少一部分已結(jié)合通式為SBP-L-GDFBP或⑶FBP-L-SBP的肽組合物其中SBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30個(gè)氨基酸的表面結(jié)合區(qū)和()對(duì)植入物的聚合表面材料的親和性；⑶FBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30個(gè)氨基酸的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)和(ii)對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性；L可存在或缺失，且包含SBP與⑶FBP之間的共價(jià)連接物，其中如果L缺失，SBP與⑶FBP直接連接在一起；以及其中通過結(jié)合于靶部位的⑶FBP限制所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子刺激了纖維結(jié)締組織的產(chǎn)生。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中置于靶部位的所述植入物包含結(jié)合于⑶FBP的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子是GDF-7。26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植入物，其中所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:9ο27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植入物，所述表面結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:71，纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:9。28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植入物，所述表面結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:71，纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:2。29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中L存在并選自由聚合物、合成的聚合物、聚醚、聚乙二醇(“PEG”)、10個(gè)單位的聚乙二醇(“P10”)、6個(gè)單位的聚乙二醇(“MP”)、脂肪酸、十一烷酸(AUD)、肉豆蔻酸和氨基酸組成的組。30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述肽組合物包含氨基末端的脂肪酸修飾。31.一種將纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子遞送至所述包含聚合物表面材料的植入物表面的方法，所述方法包括(a)將肽組合物與植入物的表面接觸充足的時(shí)間以使所述表面的至少一部分結(jié)合于所述肽組合物，其中，所述肽組合物的通式為SBP-L-GDFBP或⑶FBP-L-SBP，其中SBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30個(gè)氨基酸的表面結(jié)合區(qū)和()對(duì)植入物的聚合表面材料的親和性；⑶FBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30個(gè)氨基酸的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)和(ii)對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性；L可存在或缺失，且包含SBP與⑶FBP之間的共價(jià)連接物，其中如果L缺失，SBP與⑶FBP直接連接在一起，且其中纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合于⑶FBP。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子是⑶F-7，且以可有效促進(jìn)一種過程的量遞送GDF-7，所述過程選自由纖維結(jié)締組織修復(fù)、纖維結(jié)締組織形成及其組合組成的組。33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:9。34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，所述表面結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:71，纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:9。35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，所述表面結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:71，纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)是SEQIDNO:2。36.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中L存在并選自由聚合物、合成的聚合物、聚醚、聚乙二醇(“PEG”)、10個(gè)單位的聚乙二醇(“P10”)、6個(gè)單位的聚乙二醇(“MP”)、脂肪酸、十一烷酸(AUD)、肉豆蔻酸和氨基酸組成的組。37.根據(jù)權(quán)利要求31所述的植入物，其中所述肽組合物包含氨基末端的脂肪酸修飾。38.一種包含肽組合物組成部分的試劑盒，所述肽組合物組成部分具有對(duì)植入物表面材料的結(jié)合親和性和對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的結(jié)合親和性，其中所述肽組合物通式為SBP-L-GDFBP或⑶FBP-L-SBP，其中SBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30個(gè)氨基酸的表面結(jié)合區(qū)和()對(duì)植入物的聚合表面材料的親和性；⑶FBP是10-100個(gè)氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30個(gè)氨基酸的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)和(ii)對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的親和性；以及L可存在或缺失，且包含SBP與⑶FBP之間的共價(jià)連接物，其中如果L缺失，SBP與⑶FBP直接連接在一起。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述肽組合物進(jìn)一步包含結(jié)合于GDFBP的纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子。40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含獨(dú)立包裝的第二組成部分，所述第二組成部分含所述纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子。41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含其他組成部分，選自由用于重溶的液體、供給裝置、所述試劑盒的使用說明書、待施予所述肽組合物的植入物及其組合組成的組。42.一種分離的肽，包含的氨基酸序列選自由SEQIDNO:1、SEQIDN0:2、SEQIDNO3、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10、SEQIDN0:11、SEQIDNO:67和SEQIDNO:71組成的組。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于將纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子非共價(jià)性定位于植入物表面的肽組合物，該組合物包含一種對(duì)植入物表面材料具有親和性的肽，其偶聯(lián)于一種對(duì)纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子具有親和性的肽。本發(fā)明提供一種用于以可有效促進(jìn)纖維結(jié)締組織修復(fù)和纖維結(jié)締組織形成的量遞送纖維結(jié)締組織誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子GDF-7的方法。本發(fā)明還提供通過使該組合物與植入物表面相接觸而將該肽組合物施予植入物的方法以及包含該組合物的試劑盒。文檔編號(hào)A61F2/02GK101827564SQ200880105374公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2008年9月4日優(yōu)先權(quán)日2007年9月4日發(fā)明者保羅·西奧多·漢密爾頓,師庫(kù)瑪·阿布杰克森·奈爾,本杰明·馬庫(kù)斯·比勒,達(dá)莉亞·伊索爾德·祖米尼,陳玉琛申請(qǐng)人:阿費(fèi)內(nèi)基有限公司