專利名稱：采用gitr結(jié)合分子的聯(lián)合療法的制作方法
相關(guān)申請
本申請要求2007年7月12日提交的題目為“Combination TherapiesEmploying GITR Binding Molecules”的美國臨時申請USSN 60/959,246、2007年10月30日提交的題目為“Combination Therapies Employing GITR BindingMolecules”的USSN 61/001,021、和2008年5月5日提交的題目為“CombinationTherapies Employing GITR Binding Molecules”的USSN 61/126,431的優(yōu)先權(quán)，由此通過提及而收錄每篇的全部內(nèi)容。
背景技術(shù)：
癌癥是當今世界上最普遍的健康問題之一，在美國影響約1/5的人口。常規(guī)采用各種化療劑來抗擊癌癥。不幸的是，許多這些藥物在有效對抗腫瘤的劑量時具有一些毒性。另外，化學療法抗性是癌癥治療失敗的一個主要原因。在多年里已經(jīng)開發(fā)了用于改善癌癥治療的策略，但是仍需要有效的療法。增強化療劑的抗腫瘤效果的方法對于受試者(例如人)中瘤形成的治療或者進展、嚴重程度或影響的減輕會是有用的。
發(fā)明概述 本發(fā)明至少部分基于如下發(fā)現(xiàn)，即采用GITR結(jié)合分子(例如抗GITR抗體)和至少一種別的不是GITR結(jié)合分子的藥劑(例如化療劑)的聯(lián)合療法比沒有GITR結(jié)合分子的情況中施用一種或多種藥劑更有效地治療和/或預(yù)防癌癥和/或縮小某些腫瘤的大小。此外，在一個實施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合療法具有改善的安全性概況。例如，在一個實施方案中，由于本發(fā)明的聯(lián)合療法是更有效的，至少一種藥劑可以以比單獨使用時實現(xiàn)功效所要求的劑量低的劑量使用。
因而，一方面，本發(fā)明提供了一種用于在受試者中抑制腫瘤細胞生長的方法，包括對所述受試者施用GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪至少一種別的藥劑，使得在所述受試者中腫瘤細胞生長得到抑制。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在具有腫瘤的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪至少一種別的藥劑，使得所述腫瘤大小得到縮小。
在一個實施方案中，在施用所述GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段前對所述受試者施用所述至少一種別的藥劑。在另一個實施方案中，伴隨所述GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段對所述受試者施用所述至少一種別的藥劑。在又一個實施方案中，在施用所述GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段后對所述受試者施用所述至少一種別的藥劑。
在一個實施方案中，所述至少一種別的藥劑是化療劑。在一個實施方案中，所述化療劑是抗代謝物。在一個實施方案中，所述抗代謝物選自下組氨基蝶呤(Aminopterin)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、培美曲塞(Pemetrexed)、雷替曲塞(Raltitrexed)、克拉屈濱(Cladribine)、氯法拉濱(Clofarabine)、氟達拉濱(Fludarabine)、巰嘌呤(Mercaptopurine)、噴司他丁(Pentostatin)、硫鳥嘌呤(Thioguanine)、卡培他濱(Capecitabine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟尿苷(Floxuridine)、和吉西他濱(Gemcitabine)。在一個實施方案中，所述抗代謝物是核苷類似物。在一個實施方案中，所述核苷類似物是吉西他濱。在另一個實施方案中，所述核苷類似物是氟尿嘧啶。在一個實施方案中，所述化療劑是影響微管形成的藥劑。在一個實施方案中，所述影響微管形成的藥劑選自下組帕利他塞(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbin)、泰索帝(taxotere)、依托泊苷(etoposide)、和替尼泊苷(teniposide)。在另一個實施方案中，所述影響微管形成的藥劑是帕利他塞。在一個實施方案中，所述化療劑是烷化劑。在一個實施方案中，所述烷化劑是環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)。在一個實施方案中，所述化療劑是細胞毒性抗生素。在一個實施方案中，所述細胞毒性抗生素是拓撲異構(gòu)酶II抑制劑。在一個實施方案中，所述拓撲異構(gòu)酶II抑制劑是多柔比星(doxorubicin)。
在一個實施方案中，所述GITR結(jié)合分子是人源化抗體或其抗體片段。在一個實施方案中，所述GITR結(jié)合分子是人抗體或其抗體片段。在一個實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO.1、2或3、4、5、6、或7中所顯示的CDR。在另一個實施方案中，所述GITR結(jié)合分子是嵌合抗體或其抗體片段。
在一個實施方案中，所述腫瘤的類型選自下組胰腺癌(pancreaticcancer)、黑素瘤(melanoma)、乳腺癌(breast cancer)、肺癌(lung cancer)、支氣管癌(bronchial cancer)、結(jié)腸直腸癌(colorectal cancer)、前列腺癌(prostatecancer)、胃癌(stomach cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、膀胱癌(urinary bladdercancer)、腦癌或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌(brain or central nervous system cancer)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)癌(peripheral nervous system cancer)、食管癌(esophageal cancer)、宮頸癌(cervical cancer)、子宮癌或子宮內(nèi)膜癌(uterine or endometrial cancer)、口腔癌或咽癌(cancer of the oral cavity or pharynx)、肝癌(liver cancer)、腎癌(kidney cancer)、睪丸癌(testicular cancer)、膽管癌(biliary tract cancer)、小腸癌或闌尾癌(small bowel or appendix cancer)、唾液腺癌(salivary gland cancer)、甲狀腺癌(thyroid gland cancer)、腎上腺癌(adrenal gland cancer)、骨肉瘤(osteosarcoma)、軟骨肉瘤(chondrosarcoma)、和血液學組織的癌癥(cancer ofhematological tissue)。在一個實施方案中，所述腫瘤是結(jié)腸腫瘤。在一個實施方案中，所述結(jié)腸腫瘤是腺癌。在另一個實施方案中，所述腫瘤選自下組結(jié)腸腫瘤(colon tumor)、肺腫瘤(lung tumor)、乳腺腫瘤(breast tumor)、胃腫瘤(stomach tumor)、前列腺腫瘤(prostate tumor)、宮頸腫瘤(cervical tumor)、陰道腫瘤(vaginal tumor)、和胰腺腫瘤(pancreatic tumor)。在又一個實施方案中，所述腫瘤處于選自下組的時期I期、II期、III期、和IV期。
在一個實施方案中，所述腫瘤為至少約0.5mm×0.5mm。在另一個實施方案中，所述腫瘤為至少約1mm×1mm。在又一個實施方案中，所述腫瘤具有至少約100mm3的體積。
在一個實施方案中，所述腫瘤是轉(zhuǎn)移性的。
在一個實施方案中，所述施用GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段和至少一種化療劑導(dǎo)致腫瘤大小被抑制至少約42％至至少約90％。
另一方面，本發(fā)明提供一種用于在具有結(jié)腸腺癌的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR抗體或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪吉西他濱，使得所述腫瘤大小得到縮小。
在一個實施方案中，所述腫瘤是在啟動治療時已建立的腫瘤。
另一方面，本發(fā)明提供一種用于在具有黑素瘤的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR抗體或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪帕利他塞，使得所述腫瘤大小得到縮小。
在一個實施方案中，所述腫瘤是在啟動治療時已建立的腫瘤。在另一個實施方案中，所述腫瘤是在啟動治療時的繼發(fā)性腫瘤。
又一方面，本發(fā)明提供了一種用于在具有結(jié)腸腺癌的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR抗體或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪環(huán)磷酰胺，使得所述腫瘤大小得到縮小。
在一個實施方案中，所述腫瘤是在啟動治療時已建立的腫瘤。在另一個實施方案中，所述腫瘤是在啟動治療時的繼發(fā)性腫瘤。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在具有結(jié)腸腺癌的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR抗體或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪氟尿嘧啶，使得所述腫瘤大小得到縮小。
在一個實施方案中，所述腫瘤是在啟動治療時已建立的腫瘤。在另一個實施方案中，所述腫瘤是在啟動治療時的繼發(fā)性腫瘤。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在具有結(jié)腸腺癌的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR抗體或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪多柔比星，使得所述腫瘤大小得到縮小。
在一個實施方案中，所述腫瘤是在啟動治療時已建立的腫瘤。在另一個實施方案中，所述腫瘤是在啟動治療時的繼發(fā)性腫瘤。
在一個實施方案中，所述抗GITR抗體是人源化抗體或其抗體片段。在一個實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO.1、2或3、4、5、6、或7中所顯示的CDR。在另一個實施方案中，所述GITR結(jié)合分子是嵌合抗體或其抗體片段。
本方面的又一方面提供了一種試劑盒，其包含a)包裝材料；b)GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段；和c)所述包裝材料內(nèi)含有的標簽或包裝插頁，其指明所述GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段可以與至少一種別的藥劑一起施用。
在一個實施方案中，所述至少一種別的藥劑是化療劑。在一個實施方案中，所述化療劑是抗代謝物。在一個實施方案中，所述抗代謝物是核苷類似物。在一個實施方案中，所述核苷抑制劑是吉西他濱。在另一個實施方案中，所述核苷類似物是氟尿嘧啶。在一個實施方案中，所述化療劑是影響微管形成的藥劑。在一個實施方案中，所述影響微管形成的藥劑選自下組帕利他塞、多西他賽、長春新堿、長春堿、長春地辛、長春瑞濱、泰索帝、依托泊苷、和替尼泊苷。在另一個實施方案中，所述影響微管形成的藥劑是帕利他塞。在一個實施方案中，所述化療劑是烷化劑。在一個實施方案中，所述烷化劑是環(huán)磷酰胺。在一個實施方案中，所述化療劑是細胞毒性抗生素。在一個實施方案中，所述細胞毒性抗生素是拓撲異構(gòu)酶II抑制劑。在一個實施方案中，所述拓撲異構(gòu)酶II抑制劑是多柔比星。
在一個實施方案中，所述GITR結(jié)合分子是人源化抗體或其抗體片段。在一個實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO.1、2或3、4、5、6、或7中所顯示的CDR。在另一個實施方案中，所述GITR結(jié)合分子是嵌合抗體或其抗體片段。
附圖簡述

圖1描繪的圖形顯示了與單獨的吉西他濱、單獨的2F8、和媒介物對照的效果相比在處理過程里與抗GITR抗體，即2F8(0.4mg)組合的核苷類似物，即吉西他濱(Gemzar)(80mg/kg)對腫瘤體積的影響。
圖2描繪的圖形顯示了與單獨的吉西他濱、單獨的2F8、和媒介物對照的效果相比在處理過程里與抗GITR抗體，即2F8(0.4mg)組合的核苷類似物，即吉西他濱(Gemzar)(80mg/kg)對中值存活時間(Kaplan-Meier存活曲線)的影響。
圖3描繪的圖形顯示了與單獨的吉西他濱、單獨的2F8、和媒介物對照的效果相比在處理過程里與抗GITR抗體，即2F8(0.4mg)組合的核苷類似物，即吉西他濱(Gemzar)(80mg/kg)對轉(zhuǎn)移性腫瘤數(shù)目的影響。
圖4描繪的圖形顯示了與單獨的帕利他塞、單獨的2F8、和媒介物對照的效果相比在處理過程里與抗GITR抗體，即2F8(0.4mg)組合的影響微管形成的藥劑，即帕利他塞(Taxol

)(10mg/kg)對腫瘤體積的影響。
圖5描繪的圖形顯示了與單獨的環(huán)磷酰胺、和媒介物對照的效果相比在處理過程里與抗GITR抗體，即2F8(0.4mg)組合的烷化劑，即環(huán)磷酰胺(Cytoxan)(150mg/kg)對腫瘤體積的影響。
圖6描繪的圖形顯示了與單獨的氟尿嘧啶、和媒介物對照的效果相比在處理過程里與抗GITR抗體，即2F8(0.4mg)組合的核苷類似物，即氟尿嘧啶(5-FU)(75mg/kg)對腫瘤體積的影響。
圖7描繪的圖形顯示了與單獨的氟尿嘧啶、和媒介物對照的效果相比在處理過程里與抗GITR抗體，即2F8(0.4mg)組合的拓撲異構(gòu)酶II抑制劑，即多柔比星(阿霉素)(5mg/kg)對腫瘤體積的影響。
圖8描繪的圖形顯示了與單獨的環(huán)磷酰胺、和媒介物對照的效果相比在處理過程里與抗GITR抗體，即2F8(0.4mg)組合的烷化劑，即環(huán)磷酰胺(Cytoxan)(150mg/kg)對腫瘤體積的影響。
發(fā)明詳述 本發(fā)明部分提供了用于治療癌癥的方法和試劑盒。更具體地，已經(jīng)顯示了，采用GITR結(jié)合分子(例如抗GITR抗體)和至少一種別的不是GITR結(jié)合分子的藥劑(例如化療劑)的聯(lián)合療法比單獨的任一藥劑更有效地縮小某些腫瘤的大小。
糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子(TNF)受體家族相關(guān)基因(GITR)(也稱為TNF受體超家族成員18(TNFRSF 18))是與TNF受體家族成員具有同源性的I型跨膜蛋白(Nocentini G等(1997)Proc Natl Acad Sci USA 946216-21；Gurney AL等(1999)Curr Biol 9215-8)。GITR在靜息CD4+和CD8+T細胞上以低水平表達，并且在T細胞活化后上調(diào)。GITR的連接提供增強CD4+和CD8+T細胞增殖和效應(yīng)器功能的共刺激信號(Kohm AP等(2004)J Immunol1724686-90；Kanamaru F等(2004)J Immunol 1727306-14；Ronchetti S等(2004)Eur J Immunol 34613-22；Tone M等(2003)Proc Natl Acad Sci USA10015059-64；Stephens GL等(2004)J Immunol 2004；1735008-20)。另外，GITR在調(diào)節(jié)性T細胞上以高水平組成性表達。雖然先前已經(jīng)顯示了GITR增強對某些蛋白質(zhì)抗原的免疫應(yīng)答，但是先前沒有顯示其增強用于抗擊癌癥的藥劑的抗腫瘤效果。
為了可以更容易地理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。
I.定義 為方便起見，在進一步描述本發(fā)明前，這里定義了說明書、實施例和所附權(quán)利要求書中所采用的某些術(shù)語。
除非上下文另有清楚指明，單數(shù)形式“一個/一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)提及物。
術(shù)語“施用”包括將藥物組合物或治療劑投遞入受試者的系統(tǒng)中或者投遞至受試者中或受試者上的特定區(qū)域的任何方法。如本文中所使用的，短語“系統(tǒng)施用”(systemic administration，administered systemically)和“周圍施用”(peripheral administration，administered peripherally)指不同于直接進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的化合物、藥物或其它材料的施用，使得它進入受試者的系統(tǒng)，且如此進行新陳代謝和其它類似的過程，例如皮下施用?！拔改c外施用”指不同于腸和表面施用的施用模式，通常通過注射進行，并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)和胸骨內(nèi)注射和輸注。
如本文中所使用的，術(shù)語“糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受體”(在本文中縮寫為“GITR”)，又稱為TNF受體超家族18(TNFRSF18)、TEASR、和312C2，指腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子受體家族的一個成員。GITR是一種241個氨基酸的I型跨膜蛋白，其特征在于胞外域中有三個半胱氨酸假重復(fù)，而且特異性地保護T細胞受體誘導(dǎo)的凋亡，雖然它不保護細胞免于其它凋亡信號，包括Fas觸發(fā)、地塞米松處理、或UV照射(Nocentini，G等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 946216-622)。人GITR(hGITR)(有三種剪接變體)的核酸和氨基酸序列是已知的，而且可以在例如GenBank登錄號gi40354198、gi23238190、gi23238193、和gi23238196中找到。
如本文中所使用的，術(shù)語“結(jié)合分子”包括含有至少一個特異性結(jié)合其靶物的抗原結(jié)合位點的分子。例如，在一個實施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的結(jié)合分子包含免疫球蛋白抗原結(jié)合位點或配體分子中負責受體結(jié)合的部分。
在一個實施方案中，結(jié)合分子包含至少兩個結(jié)合位點。在一個實施方案中，結(jié)合分子包含兩個結(jié)合位點。在一個實施方案中，結(jié)合分子包含三個結(jié)合位點。在另一個實施方案中，結(jié)合分子包含四個結(jié)合位點。
術(shù)語“GITR結(jié)合分子”指包含至少一個GITR結(jié)合位點的分子。適合于在本發(fā)明的方法和試劑盒中使用的GITR結(jié)合分子的例子包括但不限于記載于例如US20070098719、US20050014224、或WO05007190(本文通過提及而完整收錄這些中的每篇)的結(jié)合分子，或包含US20070098719、US20050014224、或WO05007190之一中所列CDR的結(jié)合分子。在另一個實施方案中，GITR結(jié)合分子可以包含一種或多種在SEQ ID NO.1、2或3、4、5、6、或7中所列的CDR。[SEQ ID NO.1(GFSLSTSGMGVG(重鏈CDR1))，SEQ ID NO.2(HIWWDDDKYYNPSLKS(HC CDR2N))，SEQ ID NO.4(TRRYFPFAY(HC CDR3))，SEQ ID NO.5(KASQNVGTNVA(輕鏈CDR1))，SEQ ID NO.6(SASYRYS(LC CDR2))，SEQ ID NO.7(QQYNTDPLT(LCCDR3))，和SEQ ID NO3(HIWWDDDKYYQPSLKS(HC CDR2Q))]。在一個實施方案中，結(jié)合分子包含1個CDR。在另一個實施方案中，結(jié)合分子包含2個CDR。在另一個實施方案中，結(jié)合分子包含3個CDR。在另一個實施方案中，結(jié)合分子包含4個CDR。在另一個實施方案中，結(jié)合分子包含5個CDR。在又一個實施方案中，結(jié)合分子包含所有6個CDR。適合于在本發(fā)明的方法中使用的例示性GITR結(jié)合分子還包括商品化的GITR結(jié)合分子，諸如MAB689，其可購自R&D Systems。
“特異性結(jié)合”表示結(jié)合分子對非GITR分子基本上只展現(xiàn)出背景結(jié)合。然而，特異性結(jié)合GITR的分離的結(jié)合分子對來自其它物種的GITR分子可具有交叉反應(yīng)性。
如本文中所使用的，術(shù)語結(jié)合分子包括抗體(包括全長抗體)，單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)，多克隆抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，人的、人源化的或嵌合的抗體，抗體片段，例如Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表達文庫生成的片段、上文任何的表位結(jié)合片段，和抗體的工程化改造形式(即，包含自抗體分子衍生的結(jié)合位點的分子)，例如scFv分子或包含scFv分子的分子，只要它們展現(xiàn)出想要的活性，例如結(jié)合GITR。在一個實施方案中，在本發(fā)明的聯(lián)合療法中使用的GITR結(jié)合分子結(jié)合T細胞和樹突細胞上的GITR。在一個實施方案中，在本發(fā)明的聯(lián)合療法中使用的GITR結(jié)合分子的特征在于以下一項或多項以高親和力結(jié)合hGITR、激動GITR活性(例如在存在刺激劑(例如CD3)的情況中)、和提高體液和/或T細胞效應(yīng)器應(yīng)答。
在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是“抗體”或“免疫球蛋白”分子，例如天然存在的抗體或免疫球蛋白分子或經(jīng)過遺傳工程改造的抗體分子，其以與抗體分子類似的方式結(jié)合抗原。如本文中所使用的，術(shù)語“免疫球蛋白”包括具有兩條重鏈和兩條輕鏈的組合的多肽，無論其是否擁有任何有關(guān)的特異性免疫反應(yīng)性?！翱贵w”指對抗原具有重要的已知特異性免疫反應(yīng)性活性的此類裝配物?？贵w和免疫球蛋白包含輕鏈和重鏈，它們之間具有或沒有鏈間共價連接。脊椎動物系統(tǒng)中的基本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)是相對充分了解的。
通稱“免疫球蛋白”包含能在生化方面區(qū)別的5類不同抗體。所有5類抗體都明確在本發(fā)明的范圍內(nèi)。關(guān)于IgG，免疫球蛋白包含兩條約23,000道爾頓分子量的相同多肽輕鏈和兩條53,000-70,000分子量的相同重鏈。四條鏈在“Y”構(gòu)型中由二硫鍵連接，其中輕鏈包夾重鏈，在“Y”的口處開始，并經(jīng)過可變區(qū)延續(xù)。
輕鏈和重鏈兩者都被分成結(jié)構(gòu)和功能同源性的區(qū)域。術(shù)語“恒定的”和“可變的”在功能方面使用。在這點上，應(yīng)當領(lǐng)會的是，輕(VL)鏈和重(VH)鏈部分兩者的可變域都決定抗原識別和特異性。相反，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恒定域賦予重要的生物學特性，諸如分泌、經(jīng)胎盤的移動性、Fc受體結(jié)合、補體結(jié)合等。按照慣例，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編號隨著它們變得距離抗體的抗原結(jié)合位點或氨基端越來越遠而增加。N端是可變區(qū)，而恒定區(qū)在C端；CH3和CL域?qū)嶋H上分別構(gòu)成重鏈和輕鏈的羧基端。
輕鏈被歸入卡帕或拉姆達(κ，λ)。每個重鏈種類可以與κ或λ輕鏈結(jié)合在一起。一般而言，輕鏈和重鏈彼此共價鍵合，而兩條重鏈的“尾部”部分在雜交瘤、B細胞或經(jīng)過遺傳工程改造的宿主細胞生成免疫球蛋白時通過共價二硫化物連接或非共價連接而彼此鍵合。在重鏈中，氨基酸序列從Y構(gòu)型的叉狀末端處的N端行進至每條鏈底部處的C端。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當領(lǐng)會的是，重鏈被歸入伽馬、謬、阿爾法、德耳塔、或厄普西隆(γ，μ，α，δ，ε)，它們之中有一些亞類(例如，γ1-γ4)。決定抗體“類”分別為IgG、IgM、IgA、IgG、或IgE的正是該鏈的性質(zhì)。免疫球蛋白亞類(同種型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等)是充分表征的，而且已知賦予功能特化?？紤]到本公開內(nèi)容，熟練技術(shù)人員可容易辯別每個這些類和同種型的修飾型式，因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可變區(qū)容許抗體選擇性識別且特異性結(jié)合抗原上的表位。也就是說，抗體的VL域和VH域聯(lián)合以形成限定三維抗原結(jié)合位點的可變區(qū)。此四元抗體結(jié)構(gòu)形成存在于Y的每條臂末端的抗原結(jié)合位點。更具體地，抗原結(jié)合位點由VH和VL鏈中每條上的三個互補決定區(qū)(CDR)限定。
如本文中所使用的，術(shù)語“抗體”包括例如任何同種型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的完整抗體，而且包括其抗原結(jié)合片段。例示性的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、和多價抗體?？梢允褂贸Ｒ?guī)技術(shù)來使抗體片段化。如此，術(shù)語抗體包括抗體分子的蛋白水解方式切割的或重組方式制備的部分的能夠主動結(jié)合某種抗原的區(qū)段。蛋白水解和/或重組抗原結(jié)合片段的非限制性例子包括Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、和含有由肽接頭連接的VL和/或VH域的單鏈抗體(sFv)。
本發(fā)明的結(jié)合分子可以包含任何同種型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、和IgY)、類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類的免疫球蛋白分子的免疫球蛋白重鏈。結(jié)合分子可以具有重鏈和輕鏈兩者。
“抗原”指結(jié)合分子所特異結(jié)合的實體(例如蛋白質(zhì)性質(zhì)的實體或肽)。
術(shù)語“表位”或“抗原決定簇”指抗原上結(jié)合分子特異性結(jié)合的位點。表位可以由連續(xù)氨基酸形成，也可以是不連續(xù)的氨基酸通過蛋白質(zhì)的四級折疊而并列在一起的。由連續(xù)氨基酸形成的表位在暴露于變性溶劑后通常得到維持，而通過四級折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理后喪失。表位通常包括處于獨特空間構(gòu)象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸。確定表位的空間構(gòu)象的方法包括，例如X-射線結(jié)晶學和2-維核磁共振。參見例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology，第66卷，G.E.Morris編(1996)。
可以在顯示一種抗體阻斷另一種抗體結(jié)合靶抗原的能力的簡單免疫測定法，即競爭性結(jié)合測定法中鑒定識別相同表位的結(jié)合分子。在所測試的結(jié)合分子抑制參照結(jié)合分子對共同抗原(諸如GITR)的特異性結(jié)合的測定法中確定競爭性結(jié)合。許多類型的競爭性結(jié)合測定法是已知的，例如固相直接或間接放射免疫測定法(RIA)；固相直接或間接酶免疫測定法(EIA)三明治式/夾心競爭測定法(參見Stahli等，Methods in Enzymology 9242(1983))；固相直接生物素-親合素EIA(參見Kirkland等，J.Immunol.1373614(1986))；固相直接標記測定法、固相直接標記三明治式/夾心測定法(參見Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125標記物進行的固相直接標記RIA(參見Morel等，Mol.Immunol.25(1)7(1988))；固相直接生物素-親合素EIA(Cheung等，Virology 176546(1990))；和直接標記RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.3277(1990))。通常，此類測定法牽涉使用結(jié)合至固體表面的純化抗原或攜帶未標記的測試結(jié)合分子和標記的參照結(jié)合分子這些之任一的細胞。通過在存在測試結(jié)合分子的情況中測定結(jié)合至固體表面和細胞的標記物的量來測量競爭性抑制。通常，測試結(jié)合分子是過量存在的。通常，在競爭性結(jié)合分子過量存在時，它會抑制參照結(jié)合分子對共同抗原的特異性結(jié)合達至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。
表位還受到免疫細胞，例如B細胞和/或T細胞的識別?？梢酝ㄟ^測量抗原依賴性增殖的體外測定法來測定表位的細胞識別，如通過3H-胸苷摻入、細胞因子分泌、抗體分泌、或抗原依賴性殺傷(細胞毒性T淋巴細胞測定法)所測定的。
如本文中所使用的，術(shù)語“單克隆結(jié)合分子”指從一群基本上同質(zhì)的結(jié)合分子獲得的結(jié)合分子。單克隆結(jié)合分子是高度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同結(jié)合分子的多克隆結(jié)合分子制備物不同，每種單克隆結(jié)合分子針對抗原上的單一決定簇。修飾語“單克隆”指明所述結(jié)合分子的特征在于自基本同質(zhì)的結(jié)合分子群體獲得，并且不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成結(jié)合分子。例如，要依照本發(fā)明使用的單克隆結(jié)合分子可以通過最初由Kohler等，Nature 256495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利No.4,816,567)。“單克隆結(jié)合分子”還可以使用例如Clackson等，Nature352624-628(1991)和Marks等，J.Mol Biol.222581-597(1991)中記載的技術(shù)從噬菌體抗體文庫分離。
術(shù)語“嵌合結(jié)合分子”指包含自不同物種衍生的氨基酸序列的結(jié)合分子?？梢岳缱詫儆诓煌锓N的結(jié)合分子基因區(qū)段通過遺傳工程來構(gòu)建嵌合結(jié)合分子。
本文中的單克隆結(jié)合分子明確包括“嵌合”結(jié)合分子，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與自特定物種衍生的或者屬于具體抗體類或亞類的結(jié)合分子中的相應(yīng)序列是相同或同源的，而鏈的剩余部分與自另一物種衍生的或者屬于另一抗體類或亞類的結(jié)合分子中的相應(yīng)序列是相同或同源的，以及此類結(jié)合分子的片段，只要它們展現(xiàn)出想要的生物學活性(美國專利No.4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 816851-6855(1984))，例如結(jié)合GITR，例如人GITR(hGITR)和提高T效應(yīng)器和/或體液應(yīng)答。
非人(例如鼠)結(jié)合分子的“人源化”形式指最低限度含有自非人結(jié)合分子衍生的序列的抗體。在極大程度上，人源化結(jié)合分子指人結(jié)合分子(受體/接受結(jié)合分子)中來自高變區(qū)的CDR殘基用具有期望特異性、親和力、和能力的來自非人物種(供體結(jié)合分子)諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類的高變區(qū)的CDR殘基替換得到的免疫球蛋白。在有些情況中，改變?nèi)私Y(jié)合分子的Fv框架區(qū)(FR)殘基，例如用非供體殘基(例如種系殘基)替換或替代，或者回復(fù)突變成相應(yīng)的供體人殘基。此外，人源化結(jié)合分子可以包含在受體結(jié)合分子或供體結(jié)合分子中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。一般而言，進行這些修飾是為了進一步改進結(jié)合分子的性能。通常，人源化結(jié)合分子會包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人結(jié)合分子的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR區(qū)是人結(jié)合分子序列的。人源化結(jié)合分子任選還會包含至少部分結(jié)合分子恒定區(qū)(Fc)，通常是人結(jié)合分子的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見Jones等，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
術(shù)語“多特異性的”包括對超過一種靶抗原具有特異性的結(jié)合分子。此類分子具有超過一個結(jié)合位點，其中每個結(jié)合位點特異性結(jié)合不同靶分子或同一靶物上的不同抗原性位點(例如與其起免疫反應(yīng))。
在一個實施方案中，本發(fā)明的多特異性結(jié)合分子是雙特異性分子(例如抗體、微型抗體(minibody)、域刪除的抗體、或融合抗體)，其具有對至少兩種靶物(例如超過一種靶分子或同一靶分子上的超過一種表位)的結(jié)合特異性。
在一個實施方案中，可以使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)從完整的前體或親本抗體制備抗體的修飾形式。下文更詳細地記載了例示性的技術(shù)。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽的可變區(qū)和恒定區(qū)兩者都是人的。在一個實施方案中，可以使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來制備完全人抗體。例如，可以通過給如下轉(zhuǎn)基因動物施用抗原來制備針對特定抗原的完全人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物已經(jīng)進行過修飾以響應(yīng)抗原考驗而生成此類抗體，但是其內(nèi)源基因座已經(jīng)喪失能力。可以用于制備抗體的例示性技術(shù)記載于美國專利6,150,584；6,458,592；6,420,140。其它技術(shù)諸如文庫的使用是本領(lǐng)域中已知的。
在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含抗體分子，例如完整的抗體分子或抗體分子的片段。在另一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是經(jīng)過修飾的或合成的抗體分子。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、或重組生成的抗體的整個或部分(例如至少一個抗原結(jié)合位點、至少一個CDR)。
在結(jié)合分子是抗體或經(jīng)修飾抗體的實施方案中，抗原結(jié)合位點和重鏈部分不需要衍生自相同免疫球蛋白分子。在這點上，可變區(qū)可以衍生自能被誘導(dǎo)來啟動體液應(yīng)答并生成針對想要的抗原的免疫球蛋白的任何類型的動物。因此，多肽的可變區(qū)可以是例如哺乳動物起源的，例如可以是人的、(小)鼠的、大鼠的、非人靈長類(諸如獼猴(cynomolgus monkey)、短尾猴(macaque)等)的、狼的、camelid(例如來自駱駝(camel)、美洲駝(llamas)和相關(guān)物種)的。在另一個實施方案中，可變區(qū)在起源方面可以是condricthoid(例如來自鯊魚)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是經(jīng)修飾的抗體。如本文中所使用的，術(shù)語“工程化改造的”或“經(jīng)修飾的抗體”包括合成形式的抗體，其被進行改變，使得它們不是天然存在的，例如不包含完整重鏈的抗體(諸如域刪除的抗體或微型抗體)；進行過改變以結(jié)合兩種或更多種不同抗原或單一抗原上的不同表位的多特異性形式的抗體(例如雙特異性的、三特異性的等)；與scFv分子連接的重鏈分子等。scFv分子是本領(lǐng)域中已知的，并且記載于例如美國專利5,892,019。另外，術(shù)語“工程化改造的”或“經(jīng)修飾的抗體”包括多價形式的抗體(例如結(jié)合三個或更多個拷貝的相同抗原或不同抗原或同一抗原上的不同表位的三價、四價等抗體)。
在一個實施方案中，依照本發(fā)明的術(shù)語“經(jīng)修飾的抗體”包括如下的免疫球蛋白、抗體、或其免疫反應(yīng)性片段或重組形式，其中一個或多個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的至少一部分已經(jīng)被刪除或者在其它方面改變過(例如突變)，從而提供想要的生化特性，諸如非共價二聚化的能力、在腫瘤位置處定位的能力增強、或與具有近于相同的免疫原性的完整的、未改變的抗體相比時血清半衰期改變。
在一個實施方案中，可以使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)來修飾本發(fā)明的結(jié)合分子以降低其免疫原性。例如，可以使本發(fā)明的抗體或多肽人源化、脫免疫(deimmunize)，或者可以制備嵌合抗體。這些類型的抗體衍生自非人抗體，通常是鼠抗體，其保留或基本上保留親本抗體的抗原結(jié)合特性，但是其在人中具有較小的免疫原性。這可以通過多種方法來實現(xiàn)，包括(a)將整個非人可變域嫁接至人恒定區(qū)上以生成嵌合抗體；(b)將一個或多個非人互補決定區(qū)(CDR)的至少一部分嫁接入保留或未保留重要框架殘基的人框架和恒定區(qū)中；或(c)移植整個非人可變域，但是通過替換表面殘基來用人樣部分“掩蓋”它們。此類方法披露于Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-5(1984)；Morrison等，Adv.Immunol.4465-92(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31169-217(1994)，及美國專利No.5,585,089，5,693,761和5,693,762，在此通過提及而完整收錄所有這些。
術(shù)語“化療劑”與“化學治療劑”和“抗腫瘤劑”在本文中可互換使用，指抑制或阻止細胞的生存力和/或功能，和/或引起細胞破壞(細胞死亡)，和/或施加抗腫瘤/抗增殖效果，例如直接或間接阻止贅生性腫瘤細胞的形成、成熟或擴散的物質(zhì)。該術(shù)語還包括僅引起抑制細胞效果和不僅引起細胞毒性效果的此類藥劑。如本文中所使用的，術(shù)語化療劑包括抗血管發(fā)生劑、酪氨酸激酶抑制劑、蛋白質(zhì)激酶A抑制劑、細胞因子家族的成員、和放射性同位素。
優(yōu)選地，依照本發(fā)明的合適的化療劑是天然的或合成的化學化合物。在商業(yè)應(yīng)用、臨床評估和臨床前開發(fā)中有大量可用的抗腫瘤化學劑，其可以在本發(fā)明的聯(lián)合療法(下文所討論的)中使用。
術(shù)語“生物制劑”或“生物學藥劑”指從活生物體和/或其產(chǎn)物制備的任何藥學活性劑，其意圖作為治療劑(例如毒素諸如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素)使用。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以與GITR結(jié)合分子組合使用的生物學藥劑包括但不限于例如抗體、核酸分子(例如反義核酸分子)、多肽或蛋白質(zhì)。可以如下與GITR結(jié)合分子組合施用此類生物制劑，例如在施用GITR結(jié)合分子前、伴隨GITR結(jié)合分子一起、或者在施用GITR結(jié)合分子后施用所述生物學藥劑。
如本文中所使用的，術(shù)語“聯(lián)合療法”指包含例如GITR結(jié)合分子和至少一種別的非GITR結(jié)合分子(例如化療劑)的治療方案。GITR結(jié)合分子和至少一種別的藥劑可以為分開施用而配制，或者可以為一起施用而配制。在一個實施方案中，所述至少一種別的藥劑不是想要針對它的免疫應(yīng)答的分子，例如不是疫苗。
術(shù)語“癌癥”或“瘤形成”一般指惡性新生物或細胞的自發(fā)生長或增殖。癌細胞通常處于腫瘤形式，但是此類細胞可以單獨存在于受試者內(nèi)，或者可以是非致瘤性癌細胞，諸如白血病細胞。如本文中所使用的，術(shù)語“癌癥”包括惡變前的以及惡性的癌癥。
例如，患有“癌癥”的受試者可以患有白血病、淋巴瘤、或血細胞的其它惡性腫瘤。在一個實施方案中，癌癥選自下組胰腺癌、黑素瘤和其它形式的皮膚癌(例如鱗狀細胞癌)、乳腺癌、肺癌、支氣管癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、腦癌或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、周圍神經(jīng)系統(tǒng)癌、食管癌、宮頸癌、子宮癌或子宮內(nèi)膜癌、頭頸癌(包括口腔癌或鼻咽癌)、肝癌和膽管癌、腎癌和腎收集系統(tǒng)癌(包括膀胱癌)、睪丸癌、小腸癌或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、肉瘤(包括骨肉瘤和軟骨肉瘤)、和血液學組織的癌癥。
在某些實施方案中，使用主題方法來治療實體瘤。例示性的實體瘤包括但不限于小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)、睪丸癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌(CRC)、乳腺癌、以及前列腺、胃(gastric)、皮膚、胃(stomach)、食管、和膀胱癌。
在一個實施方案中，實體瘤是腺癌，例如結(jié)腸腺癌。在本發(fā)明的一個實施方案中，實體瘤是結(jié)腸腫瘤。在本發(fā)明的另一個實施方案中，實體瘤選自下組結(jié)腸腫瘤、肺腫瘤、乳腺腫瘤、胃腫瘤、前列腺腫瘤、宮頸腫瘤、陰道腫瘤、和胰腺腫瘤。
在本發(fā)明的一個實施方案中，要治療的癌癥是黑素瘤。
在本發(fā)明的某些實施方案中，使用主題方法來降低和/或阻止腫瘤細胞增殖。在本發(fā)明的某些實施方案中，使用主題方法來降低和/或阻止腫瘤轉(zhuǎn)移。在另一個實施方案中，使用主題方法來縮小腫瘤大小，例如已建立的腫瘤和/或繼發(fā)性腫瘤，例如轉(zhuǎn)移。如本文中所使用的，“已建立的腫瘤”指如下的實體瘤，其具有足夠的大小，使得營養(yǎng)物，即氧不再能通過滲透而從受試者的血管系統(tǒng)滲入腫瘤中央，因此腫瘤需要其自身的血管供應(yīng)來接受營養(yǎng)物。
在一個實施方案中，使用主題方法來治療血管化的腫瘤。術(shù)語“血管化的腫瘤”包括具有已建立的血管系統(tǒng)的特點的腫瘤。此類腫瘤根據(jù)其大小和/或根據(jù)與血管或血管發(fā)生有關(guān)的標志物的存在來鑒定。在一個實施方案中，腫瘤至少是約0.5mm×0.5mm。在另一個實施方案中，腫瘤至少是約1mm×1mm。在又一個實施方案中，腫瘤具有至少約100mm3的體積。在另一個實施方案中，腫瘤具有至少約200mm3的體積。在另一個實施方案中，腫瘤具有至少約300mm3的體積。在另一個實施方案中，腫瘤具有至少約400mm3的體積。在另一個實施方案中，腫瘤具有至少約500mm3的體積。在一個實施方案中，腫瘤大得足以通過觸診或通過使用本領(lǐng)域公認的成像技術(shù)來找到。
在另一個實施方案中，使用主題方法來治療如下實體瘤，其不是靜止的，而是活躍地經(jīng)歷指數(shù)式生長。在一個實施方案中，使用主題方法來治療小腫瘤，諸如微小轉(zhuǎn)移，例如僅可通過組織學檢查檢測到而通過其它技術(shù)檢測不到的腫瘤。
術(shù)語“有效量”指足以對癌性細胞或腫瘤產(chǎn)生想要的結(jié)果(包括但不限于例如在體外或在體內(nèi)縮小腫瘤大小和/或縮小實體瘤的腫瘤體積)的聯(lián)合療法量。在本發(fā)明的一個實施方案中，聯(lián)合療法的有效量是導(dǎo)致抑制腫瘤大小超過約10％、超過約20％、超過約30％、超過約35％、超過約42％、超過約43％、超過約44％、超過約45％、超過約46％、超過約47％、超過約48％、超過約49％、超過約50％、超過約51％、超過約52％、超過約53％、超過約54％、超過約55％、超過約56％、超過約57％、超過約58％、超過約59％、超過約60％、超過約65％、超過約70％、超過約75％、超過約80％、超過約85％、超過約90％、超過約95％、或超過約100％的量。
該術(shù)語還包括足以實現(xiàn)想要的臨床結(jié)果(包括但不限于例如阻止復(fù)發(fā)、改善疾病、使患者穩(wěn)定、預(yù)防或延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生、或預(yù)防或減緩患者中的癌癥行進)的聯(lián)合療法量。可以基于療法的每種藥劑的一次施用或至少一種藥劑的重復(fù)施用來確定聯(lián)合療法的有效量。檢測和測量上述指標的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。此類方法包括但不限于測量腫瘤負荷的降低、腫瘤大小的縮小、腫瘤體積的縮小、繼發(fā)性腫瘤增殖的減緩、降低的實體瘤血管形成、腫瘤組織或鄰近組織中的基因表達改變、生物標志的存在或缺失、淋巴結(jié)的參與、組織學等級、檢測腫瘤復(fù)發(fā)的缺乏、降低的腫瘤生長速率、降低的腫瘤細胞新陳代謝、和/或核等級。
在本發(fā)明的一個實施方案中，測定腫瘤負荷。“腫瘤負荷”也稱為“腫瘤負載”，指遍及整個身體分布的腫瘤物質(zhì)的總量。腫瘤負荷指遍及整個身體(包括淋巴結(jié)和骨髓)的癌細胞總數(shù)或腫瘤總體大小?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的多種方法來測定腫瘤負荷，諸如例如通過自受試者取出后測量腫瘤的尺寸，例如使用測徑器，或者在身體內(nèi)時使用成像技術(shù)，例如超聲、骨掃描、計算機斷層攝影術(shù)(CT)或磁共振成像(MRI)掃描來實現(xiàn)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，測定腫瘤大小。術(shù)語“腫瘤大小”指可以作為腫瘤的長度和寬度測量的腫瘤總體大小?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的多種方法來測定腫瘤大小，諸如例如通過自受試者取出后測量腫瘤的尺寸，例如使用測徑器，或者在身體內(nèi)時使用成像技術(shù)，例如骨掃描、超聲、CT或MRI掃描來實現(xiàn)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，通過測定腫瘤重量來測定腫瘤大小。在一個實施方案中，如下測定腫瘤重量，即測量腫瘤的長度、使其乘以腫瘤寬度的平方，并使該總數(shù)除以2。
在本發(fā)明的一個實施方案中，通過測定腫瘤體積來測定腫瘤大小。術(shù)語“腫瘤體積”指腫瘤的總體大小，包括腫瘤自身加上受累的淋巴結(jié)(若可適用的話)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的多種方法來測定腫瘤體積，諸如例如通過自受試者取出后測量腫瘤的尺寸，例如使用測徑器，或者在身體內(nèi)時使用成像技術(shù)，例如超聲、CT或MRI掃描，并使用基于例如z-軸直徑、或基于標準形狀諸如球體、橢圓體、或立方體的公式來計算體積。在一個實施方案中，自2維腫瘤測量為長橢球計算腫瘤體積(mm3)腫瘤體積(mm3)＝(長度×寬度2[L×W2])÷2。采用單位密度，腫瘤體積被轉(zhuǎn)換成腫瘤重量(即，1mm3＝1mg)。
術(shù)語“實體瘤的血管化”指實體瘤中形成血管?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的多種方法來測定腫瘤血管化，諸如例如通過對活檢標本的免疫組織化學分析，或者通過成像技術(shù)，諸如腫瘤的超聲波檢查術(shù)(sonography)、血管造影術(shù)(angiography)、CT或磁MRI掃描來實現(xiàn)。
術(shù)語“％T/C”指處理組(T)的腫瘤重量均值除以對照組(C)的腫瘤重量均值乘以100的百分比。美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute，USA)認為42％或更小的％T/C值指明有意義的活性。
與T/C對應(yīng)的術(shù)語“％抑制”通過用100減去％T/C來計算。
術(shù)語“統(tǒng)計學顯著的”或“統(tǒng)計學顯著性”指結(jié)果會偶然發(fā)生的概率，假定自變量沒有影響，或者假定的原假設(shè)(null hypothesis)是成立的?？梢酝ㄟ^獲得代表概率值的“P值”(P)來確定統(tǒng)計學顯著性。p值指明通過實驗獲得的結(jié)果由于單獨偶然性的概率如何。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以通過獲得雙尾單樣本T檢驗的p值來測定統(tǒng)計學顯著性。認為小于.05的p值是統(tǒng)計學顯著的，即不可能是由于單獨的偶然性?；蛘撸y(tǒng)計學顯著的p值可以在約0.05至約0.04之間；在約0.04至約0.03之間；在約0.03至約0.02之間；在約0.02至約0.01之間。例如，上文所述數(shù)值中間的范圍也意圖是本發(fā)明的一部分。在某些情況中，p值可以小于0.01?？梢允褂胮值來確定在使用聯(lián)合療法來治療患有腫瘤的受試者時腫瘤大小是否有任何統(tǒng)計學顯著性縮小和/或存活方面是否有任何統(tǒng)計學顯著性升高。
“治療癌癥”或“治療患有癌癥的受試者”包括抑制癌細胞的復(fù)制、抑制癌癥擴散、腫瘤大小的縮小、減少或降低身體中癌性細胞的數(shù)目、和/或改善或減輕癌癥的癥狀。若在死亡率和/或發(fā)病率方面有降低，則認為處理是治療性的，并且可以預(yù)防性或治療性實施。
“患者”或“受試者”或“宿主”指人類或非人動物。
在以下分部中更為詳細地描述了本發(fā)明的各方面。
II.GITR結(jié)合分子 本發(fā)明方法中使用的GITR結(jié)合分子包括特異性結(jié)合GITR并充當GITR激動劑(如通過例如增強的效應(yīng)T細胞應(yīng)答和/或增強的體液免疫所表明的)的結(jié)合分子，諸如例如那些記載于US20070098719、US20050014224、和WO05007190的結(jié)合分子。
在一個實施方案中，所述GITR結(jié)合分子是抗GITR抗體。可以使用標準的重組DNA技術(shù)來制備抗GITR抗體的各種形式(Winter和Milstein，Nature，349，第293-99頁(1991))。
在某些實施方案中，所述GITR結(jié)合分子可以是多克隆抗體。例如，可以通過相關(guān)抗原和佐劑的多次皮下或腹膜內(nèi)注射來在哺乳動物中制備抗體。此免疫接種通常引發(fā)免疫應(yīng)答，其包括從活化的脾細胞或淋巴細胞生成抗原反應(yīng)性抗體?？梢宰詣游锏难迨斋@所得的抗體以提供多克隆制備物。
對GITR特異性的嵌合和/或人源化結(jié)合分子(即，嵌合和/或人源化免疫球蛋白)也適合于在本發(fā)明的方法中使用。嵌合和/或人源化結(jié)合分子與提供用于構(gòu)建嵌合或人源化結(jié)合分子的起始材料的小鼠或其它非人結(jié)合分子具有相同或類似的結(jié)合特異性和親和力。
嵌合結(jié)合分子是如下的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子的輕鏈和重鏈基因是自屬于不同物種的免疫球蛋白基因區(qū)段構(gòu)建的，其通常通過遺傳工程來實現(xiàn)。例如，可以將來自小鼠單克隆結(jié)合分子的基因的可變(V)區(qū)段連接至人恒定(C)區(qū)段，諸如IgG1或IgG4。優(yōu)選人同種型IgG1。如此，例示性的嵌合結(jié)合分子是由來自小鼠結(jié)合分子的V或抗原結(jié)合域和來自人結(jié)合分子的C或效應(yīng)器域組成的雜合蛋白質(zhì)。
在一個實施方案中，適合于在本發(fā)明方法中使用的結(jié)合分子包含6C8結(jié)合分子的人源化可變區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少一種人源化6C8結(jié)合分子可變區(qū)，例如輕鏈或重鏈可變區(qū)。
如上文所列出的，術(shù)語“人源化結(jié)合分子”指包含至少一條如下的鏈的結(jié)合分子，該鏈包含自人結(jié)合分子鏈(稱為受體抗體或結(jié)合分子)衍生的可變區(qū)框架殘基和至少一種自小鼠結(jié)合分子(稱為供體抗體或結(jié)合分子)衍生的互補決定區(qū)?？梢允褂弥亟MDNA技術(shù)來生成人源化結(jié)合分子。參見例如，例如Hwang，W.Y.K.等(2005)Methods 3635；Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1989)，8610029-10033；Jones等，Nature，(1986)，321522-25；Riechmann等，Nature，(1988)，332323-27；Verhoeyen等，Science，(1988)，2391534-36；Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1989)，863833-37；美國專利號US 5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370，Selick等，WO 90/07861，及Winter，US 5,225,539(出于所有目的，通過提及而完整收錄)。優(yōu)選地，恒定區(qū)(若存在的話)也衍生自人免疫球蛋白。
在某些實施方案中，所述人源化抗體是人源化6C8或其抗體片段(包括其核苷酸和氨基酸序列)，如US20070098719中所記載的。在一個實施方案中，所述人源化抗體包含一種或多種在SEQ ID NO.1、2或3、4、5、6、或7中所顯示的CDR。在一個實施方案中，所述人源化抗體包含CDR 1、2或3、4、5、6、和7。
優(yōu)選地，人源化結(jié)合分子展現(xiàn)出至少107、108、109、1010、1011、或1012M-1的對抗原的特異性結(jié)合親和力。通常，人源化結(jié)合分子對抗原的結(jié)合親和力的上限在供體免疫球蛋白對抗原的結(jié)合親和力的上限的3倍、4倍或5倍內(nèi)。通常，結(jié)合親和力的下限也在供體免疫球蛋白結(jié)合親和力下限的3倍、4倍或5倍內(nèi)?；蛘撸梢詫⑺鼋Y(jié)合親和力與沒有替代的人源化結(jié)合分子(例如具有供體CDR和受體FR，但沒有FR替代的結(jié)合分子)的結(jié)合親和力比較。在此類情況中，優(yōu)化的結(jié)合分子(具有替代)的結(jié)合優(yōu)選比未替代的結(jié)合分子的結(jié)合大至少2倍至3倍，或3倍至4倍。為了進行比較，可以通過例如BIACORE(即，使用未標記的試劑進行的表面等離振子共振)或競爭性結(jié)合測定法來測定各種結(jié)合分子的活性。
在某些實施方案中，GITR結(jié)合分子是嵌合抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合抗體可以是嵌合的6C8抗體，其記載于美國專利公開文本號US20070098719，本文通過提及而明確收錄其內(nèi)容。
在某些實施方案中，GITR結(jié)合分子是單克隆抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體可以是人源化的6C8抗體，其也記載于美國專利公開文本號US20070098719。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含自鼠人GITR結(jié)合分子(例如6C8結(jié)合分子)衍生的至少一種CDR。在另一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含自大鼠GITR結(jié)合分子(例如2F8結(jié)合分子)衍生的至少一種CDR(例如1、2、3、4、5、或6種CDR)。如本文中所使用的，術(shù)語“衍生自”指定蛋白質(zhì)的指多肽的起源。在一個實施方案中，自特定起始多肽衍生的多肽或氨基酸序列是CDR序列或與其相關(guān)的序列。在另一個實施方案中，自特定起始多肽衍生的多肽或氨基酸序列是框架(FR)序列或與其相關(guān)的序列。在一個實施方案中，自特定起始多肽衍生的氨基酸序列不是連續(xù)的。
例如，在一個實施方案中，1、2、3、4、5、或6種CDR衍生自鼠6C8抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含鼠6C8抗體的至少一種重鏈或輕鏈CDR。在另一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含來自鼠6C8抗體的至少兩種CDR。在另一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含來自鼠6C8抗體的至少三種CDR。在另一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含來自鼠6C8抗體的至少四種CDR。在另一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含來自鼠6C8抗體的至少五種CDR。在另一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含來自鼠6C8抗體的至少六種CDR。
在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含如下的多肽或氨基酸序列，其基本上與6C8抗體或其部分(例如CDR)的多肽或氨基酸序列相同，其中所述部分由至少3-5個氨基酸、至少5-10個氨基酸、至少10-20個氨基酸、至少20-30個氨基酸、或至少30-50個氨基酸組成，或者其可以別的方式被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員鑒定為在起始序列中具有其起源。
在另一個實施方案中，自特定起始多肽或氨基酸序列衍生的多肽或氨基酸序列與6C8抗體或其部分(例如CDR)共享約80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列同一性，或者其可以別的方式被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員鑒定為在起始序列中具有其起源。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還應(yīng)當理解的是，可以修飾本發(fā)明方法中使用的抗GITR結(jié)合分子，使得其在氨基酸序列方面與衍生其的分子有所不同。例如，可以進行導(dǎo)致“非必需”氨基酸殘基處的保守替代或改變的核苷酸或氨基酸替代(例如在CDR和/或框架殘基中)，并且維持、提高、或降低結(jié)合GITR(例如人GITR)的能力。
可以如下創(chuàng)建編碼多肽的非天然變體的分離的核酸分子，即將一處或多處核苷酸替代、添加或刪除引入結(jié)合分子的核苷酸序列中，使得將一處或多處氨基酸替代、添加或刪除引入所編碼的蛋白質(zhì)中。可以通過標準技術(shù)來引入突變，諸如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。在一個實施方案中，在一個或多個非必需氨基酸殘基處進行保守的氨基酸替代?！氨Ｊ氐陌被崽娲笔菍被釟埢镁哂蓄愃苽?cè)鏈的氨基酸殘基替換。本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。如此，結(jié)合分子多肽中的非必需氨基酸殘基可以用來自相同側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基替換。在另一個實施方案中，一串氨基酸可以用結(jié)構(gòu)類似，但側(cè)鏈家族成員次序和/或組成有所不同的一串氨基酸替換。
或者，在另一個實施方案中，可以沿著整個或部分結(jié)合分子編碼序列隨機引入突變。
本發(fā)明方法中使用的優(yōu)選的結(jié)合分子包含自人氨基酸序列衍生的框架和恒定區(qū)氨基酸序列。然而，結(jié)合分子可以包含自另一哺乳動物物種衍生的框架和/或恒定區(qū)序列。例如，靈長類框架區(qū)(例如非人靈長類的)、重鏈部分、和/或鉸鏈部分可以包括在主題結(jié)合分子中。在一個實施方案中，一個或多個鼠氨基酸可以存在于結(jié)合多肽的框架區(qū)中，例如，人或非人靈長類框架氨基酸序列可以包含一處或多處氨基酸替代和/或回復(fù)突變，其中存在相應(yīng)的鼠氨基酸殘基。本發(fā)明優(yōu)選的結(jié)合分子比起始6C8鼠抗體具有更小的免疫原性。
單克隆抗體的制備是公知的方法(Kohler等，Nature，256495(1975))，其中融合來自已經(jīng)注射過抗原的哺乳動物的相對短命的或必死的淋巴細胞與永生的腫瘤細胞系(例如骨髓瘤細胞系)，如此產(chǎn)生雜交細胞或“雜交瘤”，它們都是永生的，而且能夠生成B細胞的遺傳編碼的抗體。通過選擇、稀釋、和再生長來將所得的雜合物分離成單一遺傳株，其中每個單獨的株包含用于形成單一抗體的特定基因。它們生成針對想要的抗原的同質(zhì)抗體，并且在提及它們的純的遺傳來源時，被稱為“單克隆的”。
在合適的培養(yǎng)基中接種并培養(yǎng)如此制備的雜交瘤細胞，所述合適的培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的、親本骨髓瘤細胞的生長或存活的物種。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當領(lǐng)會的是，供雜交瘤形成、選擇和生長用的試劑、細胞系和培養(yǎng)基可購自許多來源，并且標準化的方案是充分建立的。一般而言，對雜交瘤細胞正在其中生長的培養(yǎng)液測定針對想要的抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選地，通過免疫沉淀或通過體外測定法諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)來測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。鑒定出生成具有想要的特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，可以通過有限稀釋規(guī)程來亞克隆所述克隆，并通過標準方法來培養(yǎng)(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，第59頁-第103頁(Academic Press，1986))。應(yīng)當進一步領(lǐng)會的是，可以通過常規(guī)的純化規(guī)程諸如例如蛋白A、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和力來從培養(yǎng)液、腹水或血清分離由亞克隆分泌的單克隆抗體。
在另一個實施方案中，可以使用常規(guī)規(guī)程來容易地分離編碼想要的單克隆抗體的DNA，并進行測序(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。所分離和亞克隆的雜交瘤細胞充當此類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，可以將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉(zhuǎn)染入不另外生成免疫球蛋白的原核或真核宿主細胞中，諸如大腸桿菌(E.coli)細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞。更具體地，可以使用分離的DNA(其可以如本文所描述的那樣進行修飾)來克隆恒定區(qū)和可變區(qū)序列以制備抗體，如記載于1995年1月25日提交的Newman等，美國專利號5,658,570的，本文通過提及而將其收錄。實質(zhì)上，這需要自選定的細胞提取RNA，轉(zhuǎn)化成cDNA，并通過使用Ig特異性引物進行的PCR來擴增。適合于此目的的引物也記載于美國專利號5,658,570。如下文會更為詳細地討論的，可以相對大量地培養(yǎng)出表達想要的抗體的轉(zhuǎn)化細胞以提供免疫球蛋白的臨床和商業(yè)供應(yīng)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當領(lǐng)會的是，編碼抗體或抗體片段的DNA也可以衍生自抗體噬菌體文庫，例如使用pd噬菌體或Fd噬菌粒技術(shù)。例示性的方法記載于例如EP 368684B1；美國專利5,969,108，Hoogenboom，H.R.和Chames.2000.Immunol.Today 21371；Nagy等2002.Nat.Med.8801；Huie等2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 982682；Lui等2002.J.Mol.Biol.3151063，本文通過提及而將每篇收錄。數(shù)份出版物(例如Marks等Bio/Technology 10779-783(1992))已經(jīng)描述了通過鏈改組，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建大噬菌體文庫的策略來生成高親和力人抗體。在另一個實施方案中，可以使用核糖體展示來替換噬菌體作為展示平臺(參見例如Hanes等2000.Nat.Biotechnol.181287；Wilson等2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 983750；或Irving等2001J.Immunol.Methods 24831。在又一個實施方案中，可以對細胞表面文庫篩選抗體(Boder等2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9710701；Daugherty等2000J.Immunol.Methods 243211)。此類規(guī)程為用于分離和隨后克隆單克隆抗體的傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)提供了備選。
本發(fā)明的其它實施方案包括在非人動物(諸如含有一種或多種人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物)中生成人的或基本上人的抗體?？梢允褂么祟悇游镒鳛楣┥呻s交瘤用的脾細胞的來源，如記載于美國專利5,569,825，WO00076310，WO00058499和WO00037504的，本文通過提及而收錄。
用于生成重組抗體的又一種高度有效的手段披露于Newman，Biotechnology，101455-1460(1992)。具體地，此技術(shù)導(dǎo)致生成含有猴可變域和人恒定序列的靈長類化抗體。本文通過提及而完整收錄這篇參考文獻。此外，此項技術(shù)還記載共同轉(zhuǎn)讓的美國專利號5,658,570，5,693,780和5,756,096，本文通過提及而將每篇收錄。
在另一個實施方案中，可以通過顯微操作來選擇淋巴細胞，并分離可變基因。例如，可以自經(jīng)過免疫的哺乳動物分離外周血單個核細胞，并在體外培養(yǎng)約7天。可以對培養(yǎng)物篩選滿足篩選標準的特異性IgG。可以分離來自陽性孔的細胞。單個產(chǎn)生Ig的B細胞可以通過FACS或者通過在補體介導(dǎo)的溶血蝕斑測定法中鑒定它們來分離?？梢詫a(chǎn)生Ig的B細胞顯微操作入管中，并可以使用例如RT-PCR來擴增VH和VL基因?？梢詫H和VL基因克隆入抗體表達載體中，并轉(zhuǎn)染入細胞(例如真核或原核細胞)中進行表達。
或者，可以使用熟練技術(shù)人員公知的技術(shù)來選擇和培養(yǎng)抗體生成細胞系。此類技術(shù)記載于許多實驗手冊和原版出版物。在這方面，如下文所描述的適合于在本發(fā)明中使用的技術(shù)記載于Current Protocols in Immunology，Coligan等編，Green Publishing Associates and Wiley-Interscience，John Wileyand Sons，New York(1991)，本文通過提及而完整收錄(包括補充材料)。
可以自現(xiàn)有的來源(例如自本文所描述的一種或多種抗GITR抗體)獲得可變區(qū)和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，并摻入本發(fā)明的修飾過的結(jié)合分子中。例如，為了克隆抗體，可以自雜交瘤、脾、或淋巴細胞分離mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成DNA，并通過PCR擴增抗體基因?？梢酝ㄟ^共有恒定區(qū)引物或通過基于發(fā)表的重鏈和輕鏈DNA和氨基酸序列的更為特異的引物來啟動PCR。還可以使用PCR來分離編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA克隆。在此情況中，通過共有引物或更大的同源性探針，諸如小鼠恒定區(qū)探針來篩選文庫。許多適合于擴增抗體基因的引物組是本領(lǐng)域中已知的(例如基于純化的抗體的N端序列(Benhar和Pastan.1994.Protein Engineering 71509)；cDNA末端的快速擴增(Ruberti，F(xiàn).等1994.J.Immunol.Methods 17333)；抗體前導(dǎo)序列(Larrick等1989Biochem.Biophys.Res.Commun.1601250)；或者基于來自Kabat的已知可變區(qū)框架氨基酸序列(Kabat等1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.Bethesda，MDJS Dep.Health Hum.Serv.第5版)或V堿基數(shù)據(jù)庫(例如Orlandi等1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833；Sblattero等1998.Immunotechnology 3271；或Krebber等1997.J.Immunol.Methods 20135)的5’引物)。可以選擇如下的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，其具有特定的效應(yīng)器功能(或缺乏特定的效應(yīng)器功能)或者具有特定的修飾來降低免疫原性?？梢岳缡褂镁酆厦告準椒磻?yīng)和選擇用來擴增感興趣的域的引物來克隆可變域和恒定域。PCR擴增方法詳細記載于美國專利號4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188；及例如“PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications”Innis等編，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Ho等1989.Gene 7751；Horton等1993.Methods Enzymol.217270)。
或者，可以自選定動物的V基因序列文庫獲得V域。可以用想要的抗原篩選表達域的隨機組合(例如VH域和VL域)的文庫以鑒定具有想要的結(jié)合特性的元件。此類篩選的方法是本領(lǐng)域中公知的。例如，可以將抗體基因全集克隆入λ噬菌體表達載體中(Huse，WD等1989.Science 24761275)。另外，可以篩選在其表面上表達抗體的細胞(Boder和Wittrup.1997.Nat.Biotechnol.15553；Daugtherty，P.等2000.J.Immunol.Methods.243211；Francisco等1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010444；Georgiou等1997.NatureBiotechnology 1529)或病毒(例如Hoogenboom，HR.1998Immunoechnology41Winter等1994.Annu.Rev.Immunol.12433；Griffiths，AD.1998.Curr.Opin.Biotechnol.9102)。還可以使用核糖體展示來篩選抗體文庫(Hanes J.等1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9514130；Hanes，J.和Pluckthun.1999.Curr.Top.Microbiol.Immunol.243107；He，M.和Taussig.1997.Nucleic AcidsResearch 255132)。
用于篩選的優(yōu)選文庫是人V基因文庫。也可以使用來自非人來源的VL域和VH域。在一個實施方案中，可以使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)來改變此類非人V域以降低其免疫原性。
文庫可以是未接觸抗原的、來自經(jīng)免疫的受試者的，或者半合成的(Hoogenboom，H.R.和Winter.1992.J.Mol.Biol.227381；Griffiths，AD等EMBO J.133245；de Kruif，J.等1995.J.Mol.Biol.24897；Barbas，C.F.等1992.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894457)。
另外，許多抗體V域和C域的序列是已知的，并且可以使用本領(lǐng)域中公知的方法來合成此類域。在一個實施方案中，可以對免疫球蛋白域進行突變以創(chuàng)建具有更大異質(zhì)性的核酸分子的文庫(Thompson，J.等1996.J.Mol.Biol.25677；Lamminmaki，U.等1999.J.Mol.Biol.291589；Caldwell，R.C.和JoyceGF.1992.PCR Methods Appl.228；Caldwell RC和Joyce GF.1994.PCRMethods Appl.3S136?？梢允褂脴藴实暮Y選規(guī)程來選擇高親和力變體。在另一個實施方案中，可以對VH序列和VL序列進行改變以提高或降低抗體親合力，例如使用自晶體結(jié)構(gòu)獲得的信息使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來實現(xiàn)。
可以自一種或多種親本抗體衍生抗原識別位點或整個可變區(qū)。親本抗體可以包括天然存在的抗體或抗體片段、自天然存在的抗體改編的抗體或抗體片段、使用已知對GITR特異性的抗體或抗體片段的序列從頭構(gòu)建的抗體?？梢宰杂H本抗體衍生的序列包括重鏈和/或輕鏈可變區(qū)和/或其CDR、框架區(qū)或其它部分。
在一個實施方案中，所述GITR結(jié)合分子是人源化抗體。為了制備人源化抗體，用想要的抗原免疫動物，分離相應(yīng)的抗體，并取出可變區(qū)序列中負責特異性抗原結(jié)合的部分。然后將動物衍生的抗原結(jié)合區(qū)克隆入已經(jīng)刪除抗原結(jié)合區(qū)的人抗體基因的合適位置中。參見例如Jones，P.等(1986)，Nature321，522-525或Tempest等(1991)Biotechnology 9，266-273。還有，可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠或其它哺乳動物來表達人源化抗體。此類人源化可以是部分的或完全的。人源化抗體使人抗體中的異源(物種間)序列的使用最小化，并且在所處理的受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的概率較小。
在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含抗體的抗原結(jié)合片段或由其組成。術(shù)語“抗原結(jié)合片段”指免疫球蛋白或抗體中結(jié)合抗原或與完整抗體(即與衍生它們的完整抗體)競爭抗原結(jié)合(即，特異性結(jié)合)的多肽片段。如本文中所使用的，抗體分子的術(shù)語“片段”包括抗體的抗原結(jié)合片段，例如抗體輕鏈(VL)、抗體重鏈(VH)、單鏈抗體(scFv)、F(ab’)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、和單域抗體片段(DAb)?？梢岳缃?jīng)由化學或酶促處理完整的或完全的抗體或抗體鏈或者通過重組手段來獲得片段。
在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是經(jīng)過工程化改造的或經(jīng)過修飾的抗體。經(jīng)過工程化改造形式的抗體包括例如微型抗體、雙抗體、與CH3分子融合的雙抗體、四價抗體、胞內(nèi)雙抗體(intradiabody)(例如Jendreyko等2003.J.Biol.Chem.27847813)、雙特異性抗體、融合蛋白(例如抗體細胞因子融合蛋白)、或雙特異性抗體。其它免疫球蛋白(Ig)及其某些變體記載于例如美國專利號4,745,055；EP 256,654；Faulkner等，Nature 298286(1982)；EP120,694；EP 125,023；Morrison，J.Immun.123793(1979)；Kohler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197(1980)；Raso等，Cancer Res.412073(1981)；Morrison等，Ann.Rev.Immunol.2239(1984)；Morrison，Science 2291202(1985)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851(1984)；EP 255,694；EP266,663；及WO 88/03559。重配的(reassorted)免疫球蛋白鏈也是已知的。參見例如美國專利號4,444,878；WO 88/03565；和EP 68,763及其中所引用的參考文獻。
在一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗體是微型抗體。微型抗體是由兩條多肽鏈構(gòu)成的二聚體分子，每條多肽鏈包含一個ScFv分子(包含一個或多個抗原結(jié)合位點的單個多肽，例如VL域通過柔性接頭與VH域連接，而VH域經(jīng)由連接肽與CH3域融合。
可以以VH-接頭-VL取向或VL-接頭-VH取向構(gòu)建ScFv分子。
將構(gòu)成抗原結(jié)合位點的VL和VH域連接在一起的柔性鉸鏈優(yōu)選包含約10至約50個氨基酸殘基。用于此目的的例示性連接肽是(Gly4Ser)3(Huston等1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879)。其它連接肽是本領(lǐng)域中已知的。
制備單鏈抗體的方法是本領(lǐng)域公知的，例如Ho等1989.Gene 7751；Bird等1988Science 242423；Pantoliano等1991.Biochemistry 3010117；Milenic等1991.Cancer Research 516363；Takkinen等1991.Protein Engineering4837。
可以使用本領(lǐng)域記載的方法(參見例如美國專利5,837,821或WO94/09817A1)通過構(gòu)建ScFv構(gòu)件和連接肽-CH3構(gòu)件來制備微型抗體。可以作為限制性片段自分開的質(zhì)粒分離這些構(gòu)件，然后連接，并再克隆入合適的載體中?？梢酝ㄟ^限制性消化和DNA序列分析來證實合適的裝配。
雙抗體類似于scFv分子，但是通常具有連接兩個V域的一個短的(小于10個，且優(yōu)選1-5個)氨基酸殘基接頭，使得同一條多肽鏈上的VL和VH域不能相互作用。取而代之，一條多肽鏈的VL和VH域與第二條多肽鏈上的VH和VL域(分別)相互作用(WO 02/02781)。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是與至少一個重鏈部分融合的雙抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是與CH3域融合的雙抗體。
其它形式的修飾抗體也在本發(fā)明范圍內(nèi)(例如WO 02/02781A1；5,959,083；6,476,198B1；US 2002/0103345A1；WO 00/06605；Byrn等1990.Nature.344667-70；Chamow和Ashkenazi.1996.Trends Biotechnol.1452)。
在一個實施方案中，將本發(fā)明的GITR結(jié)合分子進行修飾以改變一個或多個糖基化位點或者通過不改變一個或多個糖基化位點的一處或多處其它氨基酸替代來修飾。例如，因為氨基酸序列Asn-X-(Ser/Thr)是糖基化位點的假定共有序列，其可能影響結(jié)合分子生成，可以進行用谷氨酰胺(Gln)替換天冬酰胺(Asn)的保守替代。
在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含免疫球蛋白恒定區(qū)。本領(lǐng)域中已知的是，恒定區(qū)介導(dǎo)數(shù)種效應(yīng)器功能。例如，補體的C1組分與結(jié)合分子的結(jié)合激活補體系統(tǒng)。補體的活化在細胞病原體的調(diào)理作用和溶胞中是重要的。補體的活化還刺激炎性應(yīng)答，也可能參與自身免疫超敏感性。此外，結(jié)合分子經(jīng)由Fc區(qū)結(jié)合細胞，其中結(jié)合分子Fc區(qū)上的Fc受體位點結(jié)合細胞上的Fc受體(FcR)。有許多對不同種類的結(jié)合分子特異性的Fc受體，包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)和IgM(μ受體)。分子結(jié)合對細胞表面上的Fc受體的結(jié)合觸發(fā)許多重要的且多種多樣的生物學應(yīng)答，包括對經(jīng)結(jié)合分子包被的顆粒的內(nèi)吞和破壞、對免疫復(fù)合物的清除、經(jīng)結(jié)合分子包被的靶細胞被殺傷細胞溶胞(稱為抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性，或者ADCC)、釋放炎癥介質(zhì)、胎盤轉(zhuǎn)運和控制免疫球蛋白生成。
在一個實施方案中，可以如下消除或降低效應(yīng)器功能，即例如使用IgG4結(jié)合分子的恒定區(qū)(其被認為沒有能力消減靶細胞)，或者制備Fc變體，其中使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(例如美國專利No.5,585,097)將Fc區(qū)中對效應(yīng)器功能關(guān)鍵的殘基突變。例如，刪除或滅活(經(jīng)由點突變或其它手段)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可降低Fc受體與循環(huán)中的經(jīng)修飾的結(jié)合分子的結(jié)合，由此提高腫瘤定位。另外，用于除去Fc上的潛在糖基化位點的氨基酸替代可降低Fc受體結(jié)合(參見例如，Shields等(2001)J Biol Chem 2766591)。在一個實施方案中，進行N297A替代。在另一個實施方案中，進行L235A替代和L237A。在又一個實施方案中，進行L234A替代和L235A替代。在另一個實施方案中，進行E233P替代。在另一個實施方案中，進行L234V替代。在另一個實施方案中，進行L235A替代。在另一個實施方案中，刪除C236。在另一個實施方案中，進行P238A替代。在另一個實施方案中，進行D265A替代。在另一個實施方案中，進行N297A替代。在另一個實施方案中，進行A327Q替代。在另一個實施方案中，進行P329A替代。上文所述氨基酸位置基于EU編號系統(tǒng)(參見例如Kabat等(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest，第5版，United States Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda)。
在其它情況中，可能的是，與本發(fā)明一致的恒定區(qū)修飾調(diào)節(jié)(moderate)補體結(jié)合和/或降低血清半衰期。還可以使用對恒定區(qū)的其它修飾來修飾二硫化物連接或寡糖模塊，其由于抗原特異性或結(jié)合分子柔性升高而使得定位增強。更為一般地，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到如本文中所描述的那樣修飾的結(jié)合分子可發(fā)揮多種微妙的效果，其可能很容易或者不容易理解。然而，可以在不需要過多實驗的情況中使用公知的免疫學技術(shù)容易地測量和定量修飾的所得生理學概況、生物利用度和其它生化效果，諸如腫瘤定位、生物分布和血清半袁期。
在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子可以被衍生化或被連接至另一功能性分子(例如另一肽或蛋白質(zhì))。因而，本發(fā)明的結(jié)合分子包括本文中所描述的GITR結(jié)合分子的衍生化和其它修飾形式，包括免疫粘附分子。例如，可以將本發(fā)明的結(jié)合分子功能性地連接(通過化學偶聯(lián)、遺傳融合、非共價聯(lián)合或別的方式)至一種或多種其它分子實體，諸如另一種結(jié)合分子(例如scFv抗體、雙特異性抗體或雙抗體)、可檢測試劑、化療劑(例如如本文中所描述的)、藥劑、和/或能介導(dǎo)該結(jié)合分子與另一種分子的聯(lián)合的蛋白質(zhì)或肽(諸如鏈霉親合素核心區(qū)或多組氨酸標簽)。
在一個實施方案中，用聚乙二醇修飾本發(fā)明的結(jié)合分子?！癙EG化”在體內(nèi)延長停留時間并降低免疫原性。例如Knauf等，J.Biol.Chem.，2631506415070(1988)報告了白介素-2的多種聚羥化甘油(polyoxylated glycerol)甘油和聚乙二醇修飾的種類在大鼠中的藥效學行為。Delgado等，Br.J.Cancer，73175182(1996)，Kitamura等，Cancer Res.，5143104315(1991)，Kitamura等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，17113871394(1990)和Pedley等，Br.J.Cancer，701126 1130(1994)報告了表征用低分子量(5kD)PEG衍生化的某些抗腫瘤抗原抗體或抗體片段的血液清除和組織攝取的研究。Zapata等，F(xiàn)ASEBJ.9A1479(1995)報告了與親本Fab’分子相比，低分子量(5或10kD)PEG附著至Fab’片段鉸鏈區(qū)中的巰基減少清除。
一種類型的衍生化結(jié)合分子是通過交聯(lián)兩個或更多個結(jié)合分子(相同類型或不同類型，例如為了創(chuàng)建雙特異性抗體)而生成的。合適的交聯(lián)劑包括異雙功能的，即具有兩個由適當?shù)拈g隔物分開的不同反應(yīng)性的基團(例如，間-馬來酰亞氨苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester))，或者是同雙功能的(例如，辛二酸二琥珀酰亞氨基酯(disuccinimidyl suberate))。此類接頭可購自Pierce Chemical Company，Rockford，IL。
可以通過在宿主細胞中重組表達免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因來制備本發(fā)明的結(jié)合分子。為了重組表達結(jié)合分子，用一種或多種攜帶編碼結(jié)合分子的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的重組表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，使得所述輕鏈和重鏈在宿主細胞中得到表達，且優(yōu)選地，分泌入培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中，可以自該培養(yǎng)液回收結(jié)合分子。使用標準的重組DNA方法來獲得抗體重鏈和輕鏈基因，將這些基因摻入重組表達載體中，并將該載體導(dǎo)入宿主細胞中，諸如那些記載于Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis(編)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F(xiàn).M.等(編)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)和Boss等的美國專利號4,816,397的。
為了表達本發(fā)明的結(jié)合分子，可以使用本領(lǐng)域公知的方法將編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入表達載體中，使得所述基因可操作連接至轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。在此語境中，術(shù)語“可操作連接的”指結(jié)合分子基因被連接入載體中，使得載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)結(jié)合分子基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。在一個實施方案中，選擇的表達載體和表達控制序列與所使用的表達宿主細胞相容。可以將結(jié)合分子輕鏈基因和結(jié)合分子重鏈基因插入分開的載體中，或者更典型地，將兩種基因都插入同一個表達載體中。可以通過標準方法(例如將結(jié)合分子基因片段和載體上的互補限制性位點連接，或者若不存在限制性位點，進行平末端連接)將結(jié)合分子基因插入表達載體中。在插入結(jié)合分子輕鏈或重鏈序列前，表達載體可能已經(jīng)攜帶結(jié)合分子恒定區(qū)序列。例如，將VH和VL序列轉(zhuǎn)換成全長結(jié)合分子基因的一個辦法是將它們插入已經(jīng)分別編碼重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達載體中，使得VH區(qū)段可操作連接至載體內(nèi)的CH區(qū)段，而VL區(qū)段可操作連接至載體內(nèi)的CL區(qū)段。另外/或者，重組表達載體可以編碼促進結(jié)合分子鏈自宿主細胞分泌的信號肽?？梢詫⒔Y(jié)合分子鏈基因克隆入載體中，使得信號肽以符合讀碼框的方式連接至結(jié)合分子鏈基因的氨基末端。所述信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號肽)。
在結(jié)合分子鏈基因外，本發(fā)明的重組表達載體還攜帶控制結(jié)合分子鏈基因在宿主細胞中的表達的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子、增強子和其它控制結(jié)合分子鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的表達控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。此類調(diào)節(jié)序列記載于例如Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當領(lǐng)會的是，表達載體的設(shè)計(包括調(diào)節(jié)序列的選擇)可取決于如下的因素，諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇，想要的蛋白質(zhì)的表達水平等。優(yōu)選的用于哺乳動物宿主細胞表達的調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)在哺乳動物細胞中高水平表達的病毒元件，諸如自巨細胞病毒(CMV)(諸如CMV啟動子/增強子)、猿病毒40(SV40)(諸如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)和多瘤病毒衍生的啟動子和/或增強子。關(guān)于病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進一步描述，參見例如Stinski的美國專利No.5,168,062、Bell等的美國專利No.4,510,245及Schaffner等的美國專利No.4,968,615。
在結(jié)合分子鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達載體還可以攜帶別的序列，諸如調(diào)節(jié)載體在宿主細胞中的復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點)和選擇標志基因。選擇標志基因便于選擇其中已經(jīng)導(dǎo)入有載體的宿主細胞(參見例如美國專利號4,399,216、4,634,665和5,179,017，都是Axel等的)。例如，通常選擇標志基因?qū)ζ渲幸呀?jīng)導(dǎo)入有載體的宿主細胞賦予對藥物(諸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。優(yōu)選的選擇標志基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主細胞，用甲氨蝶呤進行選擇/擴增)和neo基因(進行G418選擇)。
為了表達輕鏈和重鏈，通過標準技術(shù)將編碼結(jié)合分子重鏈和輕鏈的表達載體轉(zhuǎn)染入宿主細胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式意圖涵蓋極其多種常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細胞中的技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。有可能在原核或真核宿主細胞中表達本發(fā)明的結(jié)合分子，最優(yōu)選在真核細胞(且最優(yōu)選哺乳動物宿主細胞)中表達結(jié)合分子，因為此類真核細胞，特別是哺乳動物細胞，比原核細胞更可能裝配和分泌正確折疊的且具有免疫學活性的結(jié)合分子。
通常，表達載體含有選擇標志(例如氨芐青霉素抗性、潮霉素抗性、四環(huán)素抗性或新霉素抗性)以容許檢測用想要的DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細胞(參見，例如Itakura等，美國專利4,704,362)。
大腸桿菌是一種對于克隆本發(fā)明的多核苷酸(例如DNA序列)特別有用的原核宿主。其它適合使用的微生物宿主包括芽孢桿菌屬(bacilli)(諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus))，和其它腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以制備表達載體，它們通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如復(fù)制起點)。另外，會存在任何數(shù)目的多種公知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動子系統(tǒng)、或來自噬菌體λ的啟動子系統(tǒng)。啟動子通常會控制表達，任選與操縱子序列一起，并且具有核糖體結(jié)合位點序列等，用于啟始和結(jié)束轉(zhuǎn)錄和翻譯。
其它微生物諸如酵母也可用于表達。酵母屬(Saccharomyces)是優(yōu)選的酵母宿主，其具有根據(jù)需要具有表達控制序列(例如啟動子)、復(fù)制起點、終止序列等的合適載體。典型的啟動子包括3-磷酸甘油激酶和其它糖酵解酶。誘導(dǎo)型酵母啟動子包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子等。
在微生物外，還可以使用哺乳動物組織細胞培養(yǎng)物來表達和生成本發(fā)明的多肽(例如編碼結(jié)合分子的多核苷酸)。參見Winnacker，F(xiàn)rom Genes toClones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987)。實際上優(yōu)選真核細胞，因為本領(lǐng)域中已經(jīng)開發(fā)了許多能夠分泌異源蛋白質(zhì)(例如完整的結(jié)合分子)的合適宿主細胞系，并且包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、或經(jīng)轉(zhuǎn)化的B細胞或雜交瘤。優(yōu)選地，所述細胞是非人的。用于這些細胞的表達載體可以包括表達控制序列，諸如復(fù)制起點、啟動子和增強子(Queen等，Immunol.Rev.8949(1986))，和必要的加工信息位點，諸如核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點、多聚腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的表達控制序列是自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等，J.Immunol.1481149(1992)。
或者，可以在轉(zhuǎn)基因中摻入編碼結(jié)合分子的序列以導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動物的基因組中，隨后在轉(zhuǎn)基因動物的乳中表達(參見，例如Deboer等，US 5,741,957，Rosen，US 5,304,489和Meade等，US 5,849,992)。合適的轉(zhuǎn)基因包括與來自乳腺特異性基因(諸如酪蛋白或β-乳球蛋白)的啟動子和增強子可操作連接的輕鏈和/或重鏈編碼序列。
用于表達本發(fā)明的重組結(jié)合分子的優(yōu)選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA774216-4220所記載的dhfr-CHO細胞，其與DHFR選擇標志一起使用，例如如記載于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621的)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。在將編碼結(jié)合分子基因的重組表達載體導(dǎo)入哺乳動物宿主細胞中時，如下生成結(jié)合分子，即將宿主細胞培養(yǎng)一段時間，所述時間足以容許在宿主細胞中表達所述結(jié)合分子，或更優(yōu)選地，將結(jié)合分子分泌入培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中?？梢允褂脴藴实牡鞍踪|(zhì)純化方法自培養(yǎng)液回收結(jié)合分子。
可以通過公知的方法(其根據(jù)細胞宿主的類型而有所變化)將含有感興趣的多核苷酸序列(例如，結(jié)合分子重鏈和輕鏈編碼序列和表達控制序列)的載體轉(zhuǎn)移入宿主細胞中。例如，通常對原核細胞利用氯化鈣轉(zhuǎn)染，而對其它細胞宿主可以使用磷酸鈣處理、電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、生物射彈或基于病毒的轉(zhuǎn)染(一般參見Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Press，第2版，1989)(出于所有目的，通過提及而完整收錄)。其它用于轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞的方法包括Polybrene的使用、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、電穿孔和顯微注射(一般參見Sambrook等，見上文)。為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，可以將轉(zhuǎn)基因顯微注射入受精的卵母細胞中，或者可以摻入胚胎干細胞基因組中，并將此類細胞的細胞核轉(zhuǎn)移入去核的卵母細胞中。
在分開的表達載體上克隆重鏈和輕鏈時，共轉(zhuǎn)染載體以便獲得完整免疫球蛋白的表達和裝配。一旦表達，可以依照本領(lǐng)域的標準規(guī)程來純化本發(fā)明的整個結(jié)合分子、其二聚體、單個的輕鏈和重鏈、或其它免疫球蛋白形式，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、HPLC純化、凝膠電泳等(一般參見Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。為了藥學應(yīng)用，優(yōu)選至少約90至95％同質(zhì)的，且最優(yōu)選98至99％或更多同質(zhì)的基本上純的結(jié)合分子。
還可以使用宿主細胞來生成完整結(jié)合分子的部分，諸如Fab片段或scFv分子。應(yīng)當理解的是，對上文規(guī)程的各種變化在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可能希望用編碼本發(fā)明結(jié)合分子的輕鏈或重鏈(但是非兩者同時)的DNA轉(zhuǎn)染宿主細胞。還可以使用重組DNA技術(shù)來除去編碼對于結(jié)合GITR不是必需的輕鏈和重鏈之任一或兩者的DNA的一些或全部。本發(fā)明的結(jié)合分子也涵蓋自此類截短的DNA分子表達的分子。另外，可以通過標準的化學交聯(lián)方法通過交聯(lián)本發(fā)明的結(jié)合分子與第二結(jié)合分子來生成雙功能結(jié)合分子，其中一條重鏈和一條輕鏈是本發(fā)明的結(jié)合分子，而另一條重鏈和輕鏈對于不同于GITR的抗原是特異性的。
III.別的藥劑 在一個實施方案中，在本發(fā)明的聯(lián)合療法中使用的別的藥劑是化療劑。
化療劑一般屬于多種種類，包括例如 1.拓撲異構(gòu)酶II抑制劑(細胞毒性抗生素)，諸如蒽環(huán)類(antracyclines，anthracyclines)/蒽二酮類(anthracenediones)，例如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)和奈莫柔比星(nemorubicin)，蒽醌類(anthraquinones)，例如米托蒽醌(mitoxantrone)和洛索蒽醌(losoxantrone)，和鬼臼毒素(podophillotoxines，podophyllotoxin)，例如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)； 2.影響微管形成的藥劑(有絲分裂抑制劑)，諸如植物生物堿(例如屬于自有生物學活性和細胞毒性的植物衍生的堿性含氮分子的家族的化合物)，例如紫杉烷類(taxanes)，例如帕利他塞(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel)，和長春花生物堿(vinka alkaloids)，例如長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)、和長春瑞濱(vinorelbine)、和鬼臼毒素的衍生物； 3.烷化劑，諸如氮芥類(nitrogen mustards)、乙撐亞胺化合物、磺酸烴基酯類(alkyl sulphonates)和其它具有烷化作用的化合物諸如亞硝脲類(nitrosoureas)、達卡巴嗪(dacarbazine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)和美法侖(melphalan)； 4.抗代謝物(核苷抑制劑)，例如葉酸類(folates)，例如葉酸，氟嘧啶類(fluoropyrimidines)、嘌呤或嘧啶類似物諸如5-氟尿嘧啶、卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、甲氨蝶呤和依達曲沙(edatrexate)； 5.拓撲異構(gòu)酶I抑制劑，諸如托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、和9-硝基喜樹堿(nitrocamptothecin)、和喜樹堿衍生物；和 6.鉑化合物/復(fù)合物，諸如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、和卡鉑(carbopaltin，carboplatin)； 本發(fā)明方法中使用的例示性化療劑包括但不限于氨磷汀(amifostine)(Ethyol)、順鉑、達卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)、放線菌素D(dactinomycin)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)(氮芥)、鏈佐星(streptozocin)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、多柔比星脂質(zhì)體(Doxil)、吉西他濱(Gemzar)、柔紅霉素(daunorubicin)、柔紅霉素脂質(zhì)體(Daunoxome)、丙卡巴肼(procarbazine)、絲裂霉素(mitomycin)、阿糖胞苷(cytarabine)、依托泊苷(etoposide)、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、長春堿、長春新堿、博來霉素(bleomycin)、帕利他塞(Taxol)、多西他賽(docetaxel)(Taxotere)、阿地白介素(aldesleukin)、天冬酰胺酶(asparaginase)、白消安(busulfan)、卡鉑、克拉屈濱(cladribine)、喜樹堿、CPT-11、10-羥基-7-乙基-喜樹堿(SN38)、達卡巴嗪(dacarbazine)、S-I卡培他濱、替加氟(ftorafur)、5’-脫氧氟尿苷(deoxyflurouridine，deoxyfluorouridine)、UFT、恩尿嘧啶(eniluracil)、脫氧胞苷(deoxycytidine)、5-氮雜胞嘧啶(azacytosine)、5-氮雜脫氧胞嘧啶(azadeoxycytosine)、別嘌呤醇(allopurinol)、2-氯腺苷、三甲曲沙(trimetrexate)、氨基蝶呤(aminopterin)、亞甲基-10-脫氮氨基蝶呤(deazaaminopterin)(MDAM)、奧沙利鉑、皮卡鉑(picoplatin)、四鉑(tetraplatin)、沙鉑(satraplatin)、鉑-DACH、奧馬鉑(ormaplatin)、CI-973、JM-216、及其類似物、表柔比星、磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)、9-氨基喜樹堿(aminocamptothecin)、10，11-亞甲基二氧喜樹堿(methylenedioxycamptothecin)、karenitecin、9-硝基喜樹堿、TAS 103、長春地辛、L-苯丙氨酸芥、ifosphamidemefosphamide、培磷酰胺(perfosfamide)、曲磷胺(trophosphamide)、卡莫司汀(carmustine)、司莫司汀(semustine)、埃博霉素(epothilone)A-E、拓優(yōu)得(tomudex)、6-巰嘌呤(mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(thioguanine)、安吖啶(amsacrine)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、karenitecin、阿昔洛維(acyclovir)、伐昔洛韋(valacyclovir)、更昔洛韋(ganciclovir)、金剛烷胺(amantadine)、金剛乙胺(rimantadine)、拉米夫定(lamivudine)、齊多夫定(zidovudine)、貝伐單抗(bevacizumab)、曲妥單抗(trastuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、5-氟尿嘧啶、卡培他濱(Capecitabine)、噴司他丁(Pentostatin)、三甲曲沙、克拉屈濱、氟尿苷、氟達拉濱、羥脲(hydroxyurea)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、伊達比星(idarubicin)、美司鈉(mesna)、伊立替康(irinotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、托泊替康(topotecan)、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、普卡霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素、鏈佐星(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷、睪內(nèi)酯(testolactone)、硫鳥嘌呤、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、長春瑞濱、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑、多柔比星、帕利他塞(taxol)和博來霉素(bleomycin)、及其組合，它們對于本領(lǐng)域技術(shù)人員基于特定腫瘤或癌癥的合適標準護理是容易顯而易見的。
在一個實施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合療法中使用的化療劑選自下組Gemzar、5-FU、長春新堿、長春堿、阿霉素、順鉑、Taxol、沙利度胺(Thalidomide)、Velcade、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、氟達拉濱(fludarabine)、羥脲、柔紅霉素(danorubracin，daunorubicin)、依托泊苷(etopside)、米托蒽醌、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、美法侖(melphelan)、塞替派、博來霉素、達卡巴嗪、L-天冬酰胺酶、和丙卡巴肼。
在一個實施方案中，化療劑是拓撲異構(gòu)酶II抑制劑。在另一個實施方案中，化療劑是影響微管形成的藥劑。在另一個實施方案中，化療劑是烷化劑。在另一個實施方案中，化療劑是拓撲異構(gòu)酶I抑制劑。在另一個實施方案中，化療劑是鉑化合物/復(fù)合物。在另一個實施方案中，化療劑是激素、激素類似物、和/或激素復(fù)合物。在另一個實施方案中，化療劑是酶、蛋白質(zhì)、肽、多克隆和/或單克隆抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的化療劑是抗代謝物。
術(shù)語“抗代謝物”指在結(jié)構(gòu)方面類似于導(dǎo)致DNA或RNA合成的生化途徑中的關(guān)鍵天然中間體(代謝物)的物質(zhì)，其被宿主在所述途徑中利用，但是起到抑制所述途徑(即DNA或RNA的合成)完成的作用。更具體地，抗代謝物通常如下發(fā)揮功能(1)與代謝物競爭DNA或RNA合成中的關(guān)鍵酶的催化或調(diào)節(jié)位點，或(2)替換通常摻入DNA或RNA中的代謝物，并且由此生成不能支持復(fù)制的DNA或RNA?？勾x物的主要種類包括(1)葉酸類似物，其是二氫葉酸還原酶(DHFR)的抑制劑；(2)嘌呤類似物，其模擬天然嘌呤(腺嘌呤或鳥嘌呤)，但是結(jié)構(gòu)不同，因此它們競爭性或不可逆地抑制對DNA或RNA的核加工；和(3)嘧啶類似物，其模擬天然嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶、和尿嘧啶)，但是結(jié)構(gòu)不同，因此它們競爭性或不可逆地抑制對DNA或RNA的核加工。本發(fā)明的抗代謝物的非限制性例子是5-氟尿嘧啶、氟尿苷(Floxuradine，F(xiàn)loxuridine)、硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉濱、6-巰嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他濱、卡培他濱、噴司他丁、三甲曲沙、和克拉屈濱。
在一個實施方案中，所述抗代謝物是核苷類似物吉西他濱。在另一個實施方案中，所述抗代謝物是核苷類似物氟尿嘧啶。
如本文中所使用的，“影響微管形成的藥劑”或“有絲分裂抑制劑”指破壞微管聚合的藥劑。有絲分裂抑制劑通過干擾和停止有絲分裂(通常在細胞周期的M期期間)，使得細胞不再會分裂來起作用。在一個實施方案中，影響微管形成的藥劑是帕利他塞(Taxol

)。
如本文中所使用的，“烷化劑”指交聯(lián)DNA中的鳥嘌呤核堿基，使那些鏈不能解螺旋和分開的藥劑。由于這是DNA復(fù)制必需的，所以細胞不再能分裂。在一個實施方案中，烷化劑是環(huán)磷酰胺，也稱為cytophosphane。環(huán)磷酰胺是前藥。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合療法中使用的別的藥劑是生物學藥劑。
生物學藥劑(也稱作生物制劑)是生物學系統(tǒng)(例如生物體、細胞、或重組系統(tǒng))的產(chǎn)物。此類生物學藥劑的例子包括核酸分子(例如反義核酸分子)、干擾素、白介素、集落刺激因子、抗體(例如單克隆抗體)、抗血管發(fā)生劑、和細胞因子。下文更為詳細地討論了例示性的生物學藥劑，并且一般屬于多種種類，包括例如 1.激素、激素類似物、和激素復(fù)合物，例如雌激素和雌激素類似物、孕酮、孕酮類似物和黃體酮、雄激素、腎上腺皮質(zhì)類固醇、抗雌激素、抗雄激素、抗睪酮、腎上腺類固醇抑制劑、和抗促黃體生成激素；和 2.酶、蛋白質(zhì)、肽、多克隆和/或單克隆抗體，諸如白介素、干擾素、集落刺激因子等。
在一個實施方案中，所述生物制劑是干擾素。干擾素(IFN)是身體中天然存在的一類生物學藥劑。干擾素還在實驗室中生成，并在生物學療法中給予癌癥患者。已經(jīng)顯示了，它們改善癌癥患者的免疫系統(tǒng)針對癌細胞起作用的方式。干擾素可直接對癌細胞起作用以減緩它們的生長，或者它們可以引起癌細胞改變成具有更加正常行為的細胞。一些干擾素還可以刺激天然殺傷細胞(NK)、T細胞、和巨噬細胞一血流中幫助抗擊癌細胞的白細胞類型。
在一個實施方案中，所述生物制劑是白介素。白介素(IL)刺激許多免疫細胞的生長和活性。它們是身體中天然存在的蛋白質(zhì)(細胞因子和趨化因子)，但是也可以在實驗室中制備。一些白介素刺激起破壞癌細胞作用的免疫細胞(諸如淋巴細胞)的生長和活性。
在另一個實施方案中，所述生物制劑是集落刺激因子。集落刺激因子(CSF)是給予患者以促進骨髓內(nèi)的干細胞生成更多血細胞的蛋白質(zhì)。身體持續(xù)需要新的白細胞、紅細胞、和血小板，尤其在存在癌癥時。給予CSF以及化學療法，以幫助加強免疫系統(tǒng)。在癌癥患者接受化學療法時，骨髓生成新的血細胞的能力受到抑制，使患者更傾向于發(fā)生感染。免疫系統(tǒng)的各部分在沒有血細胞的情況中不能發(fā)揮功能，如此集落刺激因子促進骨髓干細胞生成白細胞、血小板、和紅細胞。在適當?shù)募毎傻那闆r中，其它癌癥治療可以繼續(xù)使患者能夠安全地接受更高劑量的化學療法。
在另一個實施方案中，所述生物制劑是抗體?？贵w(例如單克隆抗體)是在實驗室中生成的結(jié)合癌細胞的藥劑。在將癌癥破壞劑(cancer-destroyingagent)導(dǎo)入身體中時，它們找出抗體，并殺死癌細胞。單克隆抗體藥劑不破壞健康的細胞。單克隆抗體經(jīng)由多種機制來實現(xiàn)其治療效果。它們在產(chǎn)生凋亡或程序性細胞死亡中可以具有直接效果。它們能阻斷生長因子受體，這有效阻滯腫瘤細胞的增殖。在表達單克隆抗體的細胞中，它們能引起抗獨特型抗體形成。
可以在本發(fā)明的聯(lián)合治療中使用的抗體的例子包括抗CD20抗體，諸如但不限于西妥昔單抗(Cetuximab)、托西莫單抗(Tositumomab)、利妥昔單抗(Rituximab)、和替伊莫單抗(Ibritumomab)。也可以與抗GITR抗體組合使用抗HER2抗體以治療癌癥。在一個實施方案中，所述抗HER2抗體是曲妥單抗(Herceptin)?？梢耘c抗GITR抗體組合使用以治療癌癥的抗體的其它例子包括抗CD52抗體(例如阿侖單抗(Alemtuzumab))、抗CD-22抗體(例如依帕珠單抗(Epratuzumab))、和抗CD33抗體(例如吉姆單抗(Gemtuzumab)、奧佐米星(ozogamicin))。也可以與抗GITR抗體組合使用抗VEGF抗體以治療癌癥。在一個實施方案中，所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。在其它實施方案中，所述生物學藥劑是抗體，所述抗體是抗EGFR抗體，例如西妥昔單抗。另一個例子是抗糖蛋白17-1A抗體依決洛單抗(edrecolomab)。
在另一個實施方案中，所述生物制劑是細胞因子。細胞因子療法使用蛋白質(zhì)(細胞因子)來幫助受試者的免疫系統(tǒng)識別和破壞那些癌性細胞。細胞因子在身體中由免疫系統(tǒng)天然生成，但是也可以在實驗室中生成。與晚期黑素瘤及與輔助療法(在主要的癌癥治療后或之外給予的治療)一起使用此療法。細胞因子療法到達身體的所有部分以殺死癌細胞，并阻止腫瘤生長。
在一個實施方案中，所述生物制劑是融合蛋白。也可以使用融合蛋白。例如，可以在聯(lián)合療法中使用重組人Apo2L/TRAIL(Genentech)。Apo2/TRAIL是第一種設(shè)計用于活化促凋亡受體DR4和DR5兩者(它們牽涉對凋亡(程序性細胞死亡)的調(diào)節(jié))的雙重促凋亡受體激動劑。
在一個實施方案中，所述生物制劑是反義核酸分子。也可以在本發(fā)明的方法中使用反義核酸分子。如本文中所使用的，“反義”核酸包含與編碼蛋白質(zhì)的“有義”核酸互補(例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補、與mRNA序列互補或與基因的編碼鏈互補)的核苷酸序列。因而，反義核酸能與有義核酸形成氫鍵。
在一個實施方案中，生物學藥劑是siRNA分子，例如增強血管發(fā)生的分子(例如bFGF、VEGF和EGFR)的。在一個實施方案中，抑制血管發(fā)生的生物學藥劑介導(dǎo)RNAi。RNA干擾(RNAi)是轉(zhuǎn)錄后的、靶向基因沉默技術(shù)，其使用雙鏈RNA(dsRNA)來降解含有與dsRNA相同序列的信使RNA(mRNA)(Sharp，P.A.和Zamore，P.D.287，2431-2432(2000)；Zamore，R.D.等Cell 101，25-33(2000).Tuschl，T.等Genes Dev.13，3191-3197(1999)；Cottrell TR和Doering TL.2003.Trends Microbiol.1137-43；Bushman F.2003.Mol Therapy.79-10；McManus MT和Sharp PA.2002.Nat Rev Genet.3737-47)。該過程在內(nèi)源核糖核酸酶將較長的dsRNA切割成較短的(例如長度為21或22個核苷酸的)RNA(稱作小干擾RNA或siRNA)時發(fā)生。然后較小的RNA區(qū)段介導(dǎo)對靶mRNA的降解。用于合成RNAi的試劑盒可購自例如New England Biolabs或Ambion。在一個實施方案中，可以在介導(dǎo)RNAi的分子中采用反義RNA中使用的本文中所描述的一種或多種化學品。
反義核酸下調(diào)特定蛋白質(zhì)在細胞中的表達的應(yīng)用是本領(lǐng)域中公知的(參見例如Weintraub，H.等，Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis，Reviews-Trends in Genetics，卷1(1)1986；Askari，F(xiàn).K.和McDonnell，W.M.(1996)N.Eng.J.Med.334316-318；Bennett，M.R.和Schwartz，S.M.(1995)Circulation 921981-1993；Mercola，D.和Cohen，J.S.(1995)Cancer Gene Ther.247-59；Rossi，JJ.(1995)Br.Med.Bull.51217-225；Wagner，R.W.(1994)Nature 372333-335)。反義核酸分子包含與另一種核酸分子的編碼鏈(例如mRNA序列)互補的核苷酸序列，因而能夠與另一種核酸分子的編碼鏈形成氫鍵。與mRNA序列互補的反義序列可以與mRNA編碼區(qū)、mRNA的5’或3’非翻譯區(qū)或橋接(bridge)編碼區(qū)和非翻譯區(qū)的區(qū)域(例如在5’非翻譯區(qū)和編碼區(qū)的接合處)中找到的序列互補。此外，反義核酸可以在序列上與編碼mRNA的基因的調(diào)節(jié)區(qū)(例如轉(zhuǎn)錄起始序列或調(diào)節(jié)元件)互補。優(yōu)選地，設(shè)計反義核酸，使得與編碼鏈上的起始密碼子前或跨越該起始密碼子的區(qū)域或者mRNA的3’非翻譯區(qū)中的區(qū)域互補。
給予增強血管發(fā)生的分子的編碼鏈序列，可以依照Watson和Crick堿基配對規(guī)則來設(shè)計本發(fā)明的反義核酸。反義核酸分子可以與mRNA的整個編碼區(qū)互補，但是更優(yōu)選的是，僅對mRNA的編碼區(qū)或非編碼區(qū)的部分反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可以與mRNA的翻譯起始位點周圍的區(qū)域互補。反義寡核苷酸的長度可以為例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸。可以使用本領(lǐng)域中已知的規(guī)程使用化學合成和酶促連接反應(yīng)來構(gòu)建本發(fā)明的反義核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或以各種方式修飾的核苷酸來化學合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)，所述以各種方式修飾的核苷酸設(shè)計用于提高該分子的生物學穩(wěn)定性或者用于提高反義和有義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代核苷酸?？梢杂糜谏煞戳x核酸的修飾核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤(xantine，xanthine)、4-乙?；奏ぁ?-(羧羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲氨甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辮苷(galactosylqueosine，galactosylqueuosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤(isopentenyladenine)、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氨甲基尿嘧啶、5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷(mannosylqueosine)、5’-甲氧羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-含氧乙酸(oxyacetic acid)(v)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辮苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-含氧乙酸甲酯(oxyacetic acid methylester)、尿嘧啶-5-含氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、和2，6-二氨基嘌呤。為了抑制細胞中的表達，可以使用一種或多種反義寡核苷酸。或者，可以使用已經(jīng)將核酸以反義取向(即，自所插入核酸轉(zhuǎn)錄的RNA會是對感興趣靶核酸反義取向的，以下分部中進一步描述的)亞克隆入其中的表達載體來以生物學方式生成反義核酸。
在又一個實施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子是α-異頭(anomeric)核酸分子。α-異頭核酸分子與互補RNA形成特異性雙鏈雜合物(其中與通常的β單元相反，所述鏈彼此平行)(Gaultier等(1987)Nucleic Acids.Res.156625-6641)。反義核酸分子還可以包含2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215327-330)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的反義核酸是介導(dǎo)RNAi的化合物。RNA干擾劑包括但不限于核酸分子，包括與靶基因或基因組序列同源的RNA分子，“短干擾RNA”(siRNA)、“短發(fā)夾”或“小發(fā)夾RNA”(shRNA)、和小分子，它們通過RNA干擾(RNAi)來干擾或抑制靶基因表達。RNA干擾是轉(zhuǎn)錄后的、靶向基因沉默技術(shù)，其使用雙鏈RNA(dsRNA)來降解含有與dsRNA相同序列的信使RNA(mRNA)(Sharp，P.A.和Zamore，P.D.287，2431-2432(2000)；Zamore，P.D.等Cell 101，25-33(2000).Tuschl，T.等Genes Dev.13，3191-3197(1999))。該過程在內(nèi)源核糖核酸酶將較長的dsRNA切割成較短的、長度為21或22個核苷酸的RNA(稱作小干擾RNA或siRNA)時發(fā)生。然后較小的RNA區(qū)段介導(dǎo)對靶mRNA的降解。用于合成RNAi的試劑盒可購自例如New England Biolabs和Ambion。在一個實施方案中，可以采用反義RNA中使用的上文所描述的一種或多種化學品。
可以以如下形式將編碼例如抑制血管發(fā)生的分子的核酸分子導(dǎo)入受試者中，所述形式適合于在受試者的細胞中表達所編碼的蛋白質(zhì)，其也可以在本發(fā)明的方法中使用。抑制血管發(fā)生的例示性分子包括但不限于TSP-1、TSP-2、IFN-α、IFN-γ、血管他丁(angiostatin)、內(nèi)皮他丁(endostsin，endostatin)、腫瘤他丁(tumastatin，tumstatin)、canstatin、VEGI、PEDF、vasohibin、和促乳素2-甲氧雌二醇的16kD片段(關(guān)于綜述，參見Kerbel(2004)J.Clin Invest114884)。
例如，使用標準的分子生物學技術(shù)來將全長或部分cDNA序列克隆入重組表達載體中，并將所述載體轉(zhuǎn)染入細胞中?？梢酝ㄟ^例如使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行的擴增或者篩選合適的cDNA文庫來獲得cDNA?？梢允褂胏DNA的核苷酸序列來設(shè)計容許通過標準的PCR方法擴增cDNA的PCR引物或設(shè)計可以用于使用標準的雜交方法篩選cDNA文庫的雜交探針。分離或擴增cDNA后，將DNA片段導(dǎo)入合適的表達載體中。
在本發(fā)明的方法中使用的例示性生物學藥劑包括但不限于吉非替尼(gefitinib)(Iressa)、阿那曲唑(anastrazole)、二乙基己烯雌酚(diethylstilbesterol)、雌二醇、普雷馬林(premarin)、雷洛昔芬(raloxifene)、孕酮、異炔諾酮(norethynodrel)、炔孕酮(esthisterone，ethisterone)、地美炔酮(dimesthisterone，dimethisterone)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)、己酸羥孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、炔諾酮(norethisterone)、甲睪酮(methyltestosterone)、睪酮、地塞米松(dexamthasone，dexamethasone)、潑尼松(prednisone)、考的松(Cortisol)、solumedrol、他莫昔芬(tamoxifen)、氟維司群(fulvestrant)、托瑞米芬(toremifene)、氨魯米特(aminoglutethimide)、睪內(nèi)酯、屈洛昔芬(droloxifene)、阿那曲唑(anastrozole)、比卡魯胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、戈舍瑞林(goserelin)、氟他胺、亮丙瑞林、曲普瑞林(triptorelin)、氨魯米特、米托坦(mitotane)、戈舍瑞林、西妥昔單抗、埃羅替尼(erlotinib)、伊馬替尼(imatinib)、托西莫單抗(Tositumomab)、阿侖單抗、曲妥單抗、吉姆單抗、利妥昔單抗、替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan)、貝伐單抗、地尼白介素-毒素連接物(Denileukin diftitox)、達克珠單抗(Daclizumab)、干擾素-α、干擾素-β、抗4-1BB、抗4-1BBL、抗CD40、抗CD154、抗OX40、抗OX40L、抗CD28、抗CD80、抗CD86、抗CD70、抗CD27、抗HVEM、抗LIGHT、抗GITRL、抗CTLA-4、可溶性O(shè)X40L、可溶性4-1BBL、可溶性CD154、可溶性GITRL、可溶性LIGHT、可溶性CD70、可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CTLA4-Ig、GVAX

、及其組合，它們對于本領(lǐng)域技術(shù)人員基于特定腫瘤或癌癥的合適標準護理是容易顯而易見的?？梢酝ㄟ^可操作連接所述藥劑與例如Ig-Fc區(qū)來以例如融合蛋白制備可溶性形式的藥劑。
應(yīng)當注意到，可以與GITR結(jié)合分子組合施用超過一種別的藥劑，例如1種、2種、3種、4種、5種。例如，在一個實施方案中，可以與GITR結(jié)合分子組合施用兩種化療劑。在另一個實施方案中，可以施用化療劑、生物學藥劑、和GITR結(jié)合分子。
可以使用多種形式的生物學藥劑。這些包括但不限于如下形式，諸如原型(proform)分子、不帶電荷的分子、分子復(fù)合物、鹽、醚、酯、酰胺等，它們在植入、注射入或以別的方式插入腫瘤中后被生物學活化。
IV.治療性方法 本發(fā)明進一步提供了給受試者施用本發(fā)明的聯(lián)合療法的方法。
如上文所提出的，可以使用本發(fā)明的方法(即與在治療癌癥中有用的第二藥劑組合使用GITR結(jié)合分子)來治療受試者中的惡性腫瘤或癌癥。例示性的癌癥包括胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支氣管癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦癌或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、周圍神經(jīng)系統(tǒng)癌、食管癌、宮頸癌、子宮癌或子宮內(nèi)膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽管癌、小腸癌或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、和血液學組織的癌癥。
在一個實施方案中，可以使用本發(fā)明的方法來治療黑素瘤。在另一個實施方案中，可以使用本發(fā)明的方法來治療實體瘤，例如癌瘤。可以由本發(fā)明的化合物治療的實體瘤的例子包括但不限于乳腺癌、睪丸癌、肺癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、胰腺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結(jié)腸癌、以及前列腺癌、胃癌、皮膚癌、胃癌、食道癌和膀胱癌。在一個實施方案中，實體瘤是腺癌，例如結(jié)腸腺癌。在本發(fā)明的一個實施方案中，實體瘤是結(jié)腸腫瘤。在本發(fā)明的另一個實施方案中，實體瘤選自下組結(jié)腸腫瘤、肺腫瘤、乳腺腫瘤、胃腫瘤、前列腺腫瘤、宮頸腫瘤、陰道腫瘤、和胰腺腫瘤。
在另一個實施方案中，所述腫瘤選自下組I期、II期、III期、和IV期腫瘤。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域公認的分期方法容易確定腫瘤期，諸如腫瘤大小、腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移至的淋巴結(jié)或其它組織的數(shù)目、顯微分析、組織學分析等。
在本發(fā)明的一個實施方案中，使用主題聯(lián)合療法來治療已建立的腫瘤，例如如下腫瘤，其具有足夠的大小，使得營養(yǎng)物不再能通過滲透而從受試者的血管系統(tǒng)滲入腫瘤中央，因此該腫瘤需要其自身的血管供應(yīng)來接受營養(yǎng)物，即血管化的腫瘤。在另一個實施方案中，使用主題聯(lián)合療法來治療，例如抑制繼發(fā)性腫瘤(例如轉(zhuǎn)移)的建立，和/或降低腫瘤(例如已建立的腫瘤和/或繼發(fā)性腫瘤，例如轉(zhuǎn)移)的大小。在又一個實施方案中，使用主題聯(lián)合療法來預(yù)防繼發(fā)性腫瘤(例如轉(zhuǎn)移)的建立。
在一個實施方案中，使用聯(lián)合療法來治療具有至少約1mm×1mm的尺寸的腫瘤。在本發(fā)明的另一個實施方案中，使用聯(lián)合療法來治療至少約0.5mm×0.5mm的腫瘤。在本發(fā)明的其它實施方案中，所述腫瘤具有至少約100mm3的體積。在一個實施方案中，使用本發(fā)明的聯(lián)合療法來治療如下的腫瘤，所述腫瘤大得足以通過觸診或通過使用本領(lǐng)域中公知的成像技術(shù)來找到，諸如MRI、超聲、或CAT掃描。
在本發(fā)明的某些實施方案中，所述主題方法導(dǎo)致抑制腫瘤大小超過約10％、超過約20％、超過約30％、超過約35％、超過約42％、超過約43％、超過約44％、超過約45％、超過約46％、超過約47％、超過約48％、超過約49％、超過約50％、超過約51％、超過約52％、超過約53％、超過約54％、超過約55％、超過約56％、超過約57％、超過約58％、超過約59％、超過約60％、超過約65％、超過約70％、超過約75％、超過約80％、超過約85％、超過約90％、超過約95％、或超過約100％。在一個實施方案中，GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段和至少一種化療劑的施用導(dǎo)致約42％或更大的％T/C。
在一個實施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合療法具有協(xié)同效應(yīng)。兩種化合物的“協(xié)同效應(yīng)”指兩種藥劑的組合的效果大于它們單個效果的總和，而且在統(tǒng)計學上不同于對照和單種藥物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合療法具有加性效應(yīng)。兩種化合物的“加性效應(yīng)”指兩種藥劑的組合的效果是它們單個效果的總和，而且在統(tǒng)計學上不同于對照和/或單種藥物。
可以以方便的方式諸如通過注射(皮下、靜脈內(nèi)等)、口服施用、吸入、經(jīng)皮應(yīng)用、或直腸施用來施用GITR結(jié)合分子。根據(jù)施用路徑，可以在某種材料中包被活性化合物以保護所述化合物免于可能滅活該化合物的酶、酸和其它天然條件的作用。例如，為了通過不同于胃腸外施用來施用所述藥劑，可能想要用某種材料包被所述藥劑或者與所述材料共施用所述藥劑以阻止其失活。
一般而言，會經(jīng)由單獨使用時常規(guī)施用的路徑來施用要與GITR結(jié)合分子組合施用的至少一種別的藥劑。應(yīng)當理解的是，所述GITR結(jié)合分子和所述至少一種別的藥劑不需要經(jīng)由相同路徑施用。
可以通過本領(lǐng)域中已知的多種方法來施用本發(fā)明的聯(lián)合療法，雖然對于許多治療性應(yīng)用，優(yōu)選的施用路徑/方式是靜脈內(nèi)注射或輸注。如熟練技術(shù)人員應(yīng)當領(lǐng)會的，施用路徑和/或方式會根據(jù)想要的結(jié)果而有所變化。在某些實施方案中，與載體一起制備所述活性化合物，所述載體會保護所述化合物免于快速釋放，諸如受控釋放的配制劑，包括植入物、經(jīng)皮貼劑、和微囊化投遞系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備此類配制劑的許多方法是受專利保護的或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson編，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在某些實施方案中，可以與例如惰性稀釋劑或可同化的、可食用的載體一起口服施用本發(fā)明的結(jié)合分子。還可以將化合物(和其它成分，若想要的話)裝入硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓制成片劑，或者直接摻入受試者的飲食中。對于口服治療性施用，可以將所述化合物與賦形劑一起摻入，并且以可攝食的片劑、口含片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、速溶片(wafer)等形式使用。為了通過不同于胃腸外施用來施用本發(fā)明的化合物，可能有必要用某種材料包被所述化合物或者與所述材料共施用所述化合物以阻止其失活。
在某些實施方案中，所述方法包括對受試者胃腸外施用有效量的GITR結(jié)合分子和第二藥劑。在一個實施方案中，所述方法包括對受試者動脈內(nèi)施用GITR結(jié)合分子和至少一種化療劑。在其它實施方案中，所述方法包括直接向受試者中腫瘤的動脈血供施用有效量的GITR結(jié)合分子和至少一種化療劑。在一個實施方案中，所述方法包括使用導(dǎo)管直接向癌性腫瘤的動脈血供施用有效量的GITR結(jié)合分子和至少一種化療劑。在使用導(dǎo)管來施用GITR結(jié)合分子和至少一種化療劑的實施方案中，可以通過熒光鏡檢術(shù)或者本領(lǐng)域中已知的可以觀察和/或引導(dǎo)導(dǎo)管插入的其它方法來引導(dǎo)或觀察導(dǎo)管的插入。在另一個實施方案中，所述方法包括化療栓塞(chemoembolization)。例如，化療栓塞方法可以包括用如下組合物阻塞供給癌性腫瘤的血管，所述組合物由與油基混合的樹脂樣材料(例如Ethiodol中的聚乙烯醇)和一種或多種化療劑構(gòu)成。在其它實施方案中，所述方法包括對受試者系統(tǒng)施用GITR結(jié)合分子和至少一種化療劑。
一般而言，不管位置，通常以類似的方式實施利用本發(fā)明的藥學組合物的化療栓塞或直接動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)注射療法。簡言之，首先可以如下實施要栓塞區(qū)域的血管造影術(shù)(血管道路圖)，或者更具體地在某些實施方案中，實施動脈造影術(shù)，即在采用X射線時經(jīng)由插入動脈或靜脈(取決于要栓塞或注射的位置)中的導(dǎo)管注射不透射線的造影劑。可以以經(jīng)皮方式或通過手術(shù)來插入導(dǎo)管。然后可以如下栓塞血管，即經(jīng)由導(dǎo)管使本發(fā)明的藥學組合物回流，直至觀察到流動停止?？梢酝ㄟ^重復(fù)血管造影片來證實阻塞。在使用直接注射的實施方案中，然后用想要劑量的本發(fā)明的藥學組合物輸注血管。
栓塞療法一般導(dǎo)致含有抑制劑的組合物遍及要治療的腫瘤或血管塊間隙的分布。阻塞動脈內(nèi)腔的栓塞性顆粒的物理體積導(dǎo)致血供的阻塞。在此效果外，抗血管發(fā)生因子的存在阻止新血管形成來供給腫瘤或血管塊，這增強切斷血供的早衰效應(yīng)。直接的動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)或注射施用一般也導(dǎo)致含有抑制劑的組合物遍及要治療的腫瘤或血管塊間隙的分布。然而，預(yù)期用本方法一般不會使血供變得阻塞。
在本發(fā)明的一方面，可以利用栓塞或直接動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)注射療法來治療原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤。簡言之，經(jīng)由股動脈或肱動脈插入導(dǎo)管，并通過在熒光鏡檢指導(dǎo)下操縱其通過動脈系統(tǒng)來行進入例如肝動脈中。使導(dǎo)管行進入肝動脈樹中，其遠到必須容許完全阻斷供給腫瘤的血管，而盡可能多得不傷害供給正常結(jié)構(gòu)的動脈分枝。理想地，這會是肝動脈的區(qū)段分枝，但可以的是，胃十二指腸動脈起源遠側(cè)的整個肝動脈，或者甚至多條不同的動脈會需要進行阻斷，這取決于腫瘤的程度及其個體血供。一旦達到想要的導(dǎo)管位置，便如下栓塞動脈，即經(jīng)由動脈導(dǎo)管注射組合物(如上文所描述的)，直至要阻斷的動脈中的流動停止，優(yōu)選甚至在觀察5分鐘后?？梢匀缦伦C實動脈的阻塞，即經(jīng)由導(dǎo)管注射不透射線的造影劑，并通過熒光鏡檢術(shù)或X射線膠片來證明先前用造影劑注滿的血管不再如此。在使用直接注射的實施方案中，通過經(jīng)由動脈導(dǎo)管以想要的劑量注射組合物(如上文所描述的)來輸注動脈?？梢杂靡枞拿織l供給動脈重復(fù)相同的規(guī)程。
關(guān)于劑量給藥，應(yīng)當注意到，劑量數(shù)量、施用周期的數(shù)目、和施用次序可以隨要減輕的狀況的嚴重程度而變化。應(yīng)當進一步理解的是，對于任何具體的受試者，可以依照個體需要和施用或監(jiān)督所述組合物施用的個人的專業(yè)判斷來隨時間調(diào)整特定的劑量方案。通常，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來確定劑量給藥。選定的劑量水平會取決于多種因素，包括藥劑或其酯、鹽或酰胺的活性、施用路徑、施用時間、所采用的特定化合物的排泄或代謝速率、治療的持續(xù)時間、與所采用的特定化合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料、年齡、性別、重量、狀況、一般健康、疾病狀態(tài)、結(jié)合分子在個體中引發(fā)想要的響應(yīng)的能力、和所治療的患者的在先醫(yī)學史、和醫(yī)學領(lǐng)域中公知的類似因素。
可以調(diào)整劑量方案以提供最佳的想要響應(yīng)。例如，可以施用單次推注，可以隨時間施用數(shù)個分劑，或者可以根據(jù)治療狀況的緊急事件所指明的按比例降低或提高劑量。在一個實施方案中，為了容易施用和劑量的一致性，可以將要施用的一種或多種藥劑配制為劑量單位形式的胃腸外組合物。如本文中所使用的，劑量單位形式指物理上離散的單元，適用作為要治療的哺乳動物受試者的單一劑量；每個單元含有與所需要的藥學載體聯(lián)合的，預(yù)先確定數(shù)量的活性化合物，其根據(jù)計算，產(chǎn)生想要的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由下述各項規(guī)定，并直接依賴于下述各項(a)所述活性化合物的獨特特性和要達到的具體治療或預(yù)防效果，和(b)本領(lǐng)域配合此類活性化合物以治療個體中敏感性所固有的局限性。
具有本領(lǐng)域普通技能的醫(yī)師或獸醫(yī)能容易地確定和規(guī)定有效量的主題聯(lián)合療法的每種藥劑。例如，醫(yī)師或獸醫(yī)能以如下劑量施用至少一種別的藥劑，所述劑量就是所述藥劑單獨施用時或者作為不采用GITR結(jié)合分子的聯(lián)合療法的部分施用時會向受試者施用的。熟練技術(shù)人員無需過度實驗便能確定此類本領(lǐng)域公認的劑量給藥方案。
如本文中所描述的GITR結(jié)合分子和至少一種化療劑的組合使用可以降低任何單種藥劑所需要的劑量。因而，在一個實施方案中，至少一種別的藥劑的劑量可以低于單獨施用所述藥劑時為了實現(xiàn)想要的治療效果所需要的劑量。
關(guān)于GITR結(jié)合分子，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還會能夠容易地確定最佳劑量。例如，可以以約50mg/kg和約0.05mg/kg之間的劑量施用抗GITR抗體。在一個實施方案中，可以以約40mg/kg和約0.1mg/kg之間的劑量施用抗GITR抗體。在另一個實施方案中，可以以約30mg/kg和約0.5mg/kg之間的劑量施用抗GITR抗體。在又一個實施方案中，可以以約20mg/kg和約1mg/kg之間的劑量施用抗GITR抗體。上文所述數(shù)值中間的范圍也意圖是本發(fā)明的一部分。在又一個實施方案中，可以以約10mg/kg和約5mg/kg之間的劑量施用抗GITR抗體。例如，例示性的劑量包括約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約10、約20、約30、或約40mg/kg。注意到，本文中所列出的劑量和劑量范圍僅是例示性的，并不意圖限制要求保護的組合物的范圍或?qū)嵤?br> 可以如下在配制人用劑量范圍中使用自細胞培養(yǎng)物測定法和動物研究獲得的數(shù)據(jù)，即，例如測定在例如小鼠中不發(fā)生不利效果的劑量，并確定人等同劑量(參見例如www.fda.gov/cber/gdlns/dose.htm，本文通過提及而收錄其內(nèi)容)。優(yōu)選地，任何補充物的劑量，或者其中任何成分的劑量位于包括具有少許或沒有毒性的ED50(中值有效劑量)的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。劑量在此范圍內(nèi)可以有所變化，這取決于所采用的劑量形式和所利用的施用路徑。對于本發(fā)明的藥劑，最初可以從細胞培養(yǎng)物測定法評估治療有效劑量。可以在動物模型中配制劑量以達到循環(huán)血漿濃度范圍，其包括IC50(即，對癥狀實現(xiàn)半數(shù)最大抑制的測試化合物濃度)，如在細胞培養(yǎng)物中所測定的。可以使用此信息來更準確地確定在人中有用的劑量。可以通過例如高效液相層析來測量血漿中的水平。
或者，可以通過參考組合物的血漿濃度來確定主題發(fā)明的劑量。例如，可以使用最大血漿濃度(Cmax)和在血漿濃度-時間曲線下從時間0至無窮大的面積(AUC(0-4))。本發(fā)明的劑量包括那些產(chǎn)生Cmax和AUC(0-4)的上述數(shù)值的劑量及產(chǎn)生那些參數(shù)的或大或小數(shù)值的其它劑量。
任何特定化合物會在給定患者中產(chǎn)生最有效治療的精確施用時間和量會取決于特定化合物的活性、藥動學、和生物利用度、所述患者的生理學狀況(包括年齡、性別、疾病類型和階段、一般身體狀況、對給定劑量的響應(yīng)性和藥療類型)、施用路徑等?？梢允褂帽疚闹兴尸F(xiàn)的準則來優(yōu)化治療，例如確定最佳的施用時間和/或量，其僅僅會需要如下的常規(guī)實驗，包括監(jiān)測受試者，并調(diào)整劑量和/或時機。
在一個實施方案中，向受試者施用聯(lián)合療法的至少一種非GITR結(jié)合劑，之后施用GITR結(jié)合分子?？梢韵蚧颊呤┯梅荊ITR結(jié)合分子一次或超過一次。在重復(fù)施用的情況中，可以每天、隔天、每周、每月或者依照另一日程表來施用非GITR結(jié)合分子。例示性的治療需要在延長的一段時間(例如至少六個月)里以多劑量施用。
類似地，可以向受試者施用本發(fā)明的GITR結(jié)合分子一次或超過一次。在重復(fù)施用的情況中，可以每天、隔天、每周、每月或者依照另一日程表來施用GITR結(jié)合分子。例示性的治療需要在延長的一段時間(例如至少六個月)里以多劑量施用。
在施用GITR結(jié)合分子之前或之后施用非GITR結(jié)合分子的情況中，施用藥劑之間的時間間隔可以是例如數(shù)分鐘、數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周、或數(shù)月。
任選地，包含GITR結(jié)合分子和至少一種別的藥劑的本發(fā)明的聯(lián)合療法可包括施用別的有效治療癌癥的藥劑或治療方案，例如手術(shù)、放射療法。優(yōu)選的別的藥劑是那些本領(lǐng)域公認的，且常規(guī)施用以治療特定病癥的藥劑。
在治療受試者時，可以通過在預(yù)先確定的時間(例如24小時期間)測量一項或多項相關(guān)指數(shù)來監(jiān)測患者的健康?？梢砸勒沾吮O(jiān)測的結(jié)果來優(yōu)化治療，包括補充物、量、施用次數(shù)和配方?？梢酝ㄟ^測量相同的參數(shù)來周期性地再評估患者以確定改善程度，第一次此類再評估通常在距治療開始4周末時發(fā)生，而隨后的再評估在治療過程中每4-8周發(fā)生，然后其后的每3個月發(fā)生。治療可以持續(xù)數(shù)月或者甚至數(shù)年，其中人治療的典型長度最少是一個月?？梢曰谶@些再評估來調(diào)整所施用的藥劑量，并有可能調(diào)整施用次數(shù)。
在一個實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的方法來偶聯(lián)GITR結(jié)合分子與第二藥劑。
V.本發(fā)明的試劑盒 本發(fā)明提供了供本發(fā)明方法使用的試劑盒和制品。本發(fā)明還涉及包裝好的藥物組合物或試劑盒，其用于施用GITR結(jié)合分子和本發(fā)明中使用的第二藥劑以治療癌癥。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述試劑盒或制品包含GITR結(jié)合分子，和關(guān)于與至少一種別的藥劑(例如化療劑)組合施用以治療癌癥的說明書。在另一個實施方案中，所述試劑盒包含第二容器，其裝有在與GITR結(jié)合分子的聯(lián)合療法中使用的至少一種別的藥劑。所述說明書可以描述應(yīng)當如何(例如靜脈內(nèi))及何時(例如在第0周和第2周)向受試者施用不同劑量的GITR結(jié)合分子和至少一種化療劑以進行治療。
或者，所述包裝或試劑盒可以含有GITR結(jié)合分子，并且它可以在包裝內(nèi)或經(jīng)由附隨的信息宣傳用途，宣傳本文中所描述的各種用途或?qū)Σ“Y的治療。包裝好的藥物或試劑盒可以進一步包含化療劑(如本文中所描述的)，其與關(guān)于與第一藥劑(例如GITR結(jié)合分子)一起使用第二藥劑(例如化療劑)的說明書一起包裝或者用所述說明書共同宣傳。
例如，試劑盒可以包含包裝材料、一種或多種GITR結(jié)合分子和至少一種如上文所描述的化療劑和任選地，標簽或包裝插頁。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含一種或多種GITR結(jié)合分子和至少一種化療劑和一種或多種用于實現(xiàn)此類組合物施用的裝置。例如，試劑盒可以包含包含GITR結(jié)合分子的藥物組合物和用于實現(xiàn)向?qū)嶓w瘤中直接動脈內(nèi)注射組合物的導(dǎo)管。任選地，所述試劑盒包含輔助成分諸如裝有藥學可接受緩沖劑的第二容器和關(guān)于使用所述組合物的說明書。
通過以下實施例進一步例示本發(fā)明，這些實施例不應(yīng)被理解為限制性的。本文通過提及而收錄遍及本申請所引用的所有參考文獻、專利和已公開的專利申請的內(nèi)容，以及附圖。
實施例 實施例1在結(jié)腸癌瘤的動物模型中GITR結(jié)合分子和核苷類似物的組合降低腫瘤負荷并延長存活時間。
在體側(cè)給小鼠注射1×105個CT26細胞，并分成組。一組對照小鼠是未處理的。在第15天時用80mg/kg Gemzar處理接受Gemzar的一組小鼠。在第15天、第16天和第17天時一組小鼠以0.4mg劑量(I.P.)接受單獨的抗GITR抗體(2F8)。在第15天時向接受Gemzar+2F8的一組小鼠給予80mg/kg Gemzar，并在第16天時給予0.4mg 2F8(I.P.)。
監(jiān)測腫瘤的大小和小鼠的存活。使用GraphPadPrism 4軟件來標繪Kaplan-Meir存活曲線，并確認各組的中值存活時間。使用測徑器來測量腫瘤，并使用公式(L×W2)/2來計算腫瘤大小。
與用媒介物、單獨的Gemzar、或單獨的2F8處理的小鼠的腫瘤負荷相比，用Gemzar和2F8的組合處理的小鼠的腫瘤負荷是降低的(圖1)。
另外，如圖2中所顯示的，IgG2a對照小鼠和用單獨的GITR結(jié)合分子處理的小鼠的中值存活是24天。對于用單獨的Gemzar處理的小鼠，中值存活是31天。所有經(jīng)Gemzar加上2F8處理的小鼠在第31天時仍然活著，并且腫瘤在大小方面是適度的。
在第二項研究中，在尾靜脈中給小鼠注射1×105個CT26細胞，并容許腫瘤在肺中建立10天。然后將動物分成組。一組對照小鼠是未處理的。在第15天時用80mg/kg Gemzar處理接受Gemzar的一組小鼠。一組小鼠在第15天、第16天和第17天時以0.4mg劑量(I.P.)接受單獨的抗GITR抗體(2F8)。在第15天時向接受Gemzar+2F8的一組小鼠給予80mg/kg Gemzar，并在第16天時給予0.4mg 2F8(I.P.)。在第22天時評估腫瘤數(shù)目。
如圖3中所顯示的，與用媒介物、單獨的Gemzar、或單獨的2F8處理的小鼠中的腫瘤數(shù)目相比，用Gemzar和2F8的組合處理的小鼠中的腫瘤數(shù)目是減少的。
實施例2在黑素瘤的動物模型中GITR結(jié)合分子和影響微管形成的藥劑的組合降低腫瘤負荷。
在體側(cè)給小鼠注射12×103個B16黑素瘤細胞，并分成組。一組對照小鼠是未處理的。在第20天時用10mg/kgTaxol

處理接受Taxol

的一組小鼠，此時腫瘤約為100mm3。在第21天時一組小鼠以0.4mg的劑量(I.P.)接受單獨的抗GITR抗體(2F8)。在第20天時向接受Taxol

+2F8的一組小鼠給予10mg/kgTaxol

，并在第21天時給予0.4mg 2F8(I.P.)。
監(jiān)測腫瘤的大小和小鼠的存活。使用測徑器來測量腫瘤，并使用公式(L×W2)/2來計算腫瘤大小。
如圖4中所顯示的，與用媒介物、單獨的Taxol

、或單獨的2F8處理的小鼠的腫瘤負荷相比，用Taxol

和2F8的組合處理的小鼠中的腫瘤負荷是降低的。
實施例3在結(jié)腸癌瘤的動物模型中GITR結(jié)合分子和烷化劑的組合降低腫瘤負荷。
給小鼠皮下注射1×105個CT26細胞，并分成組。一組對照小鼠是未處理的。在第13天時用150mg/kg Cytoxan處理接受Cytoxan的一組小鼠。在第14天時一組小鼠以0.4mg的劑量(I.P.)接受單獨的抗GITR抗體(2F8)。在第13天時向接受Cytoxan+2F8的一組小鼠給予150mg/kg Cytoxan

，并在第14天時給予0.4mg 2F8(I.P.)。
監(jiān)測腫瘤的大小和小鼠的存活。使用測徑器來測量腫瘤，并使用公式(L×W2)/2來計算腫瘤大小。
如圖5中所顯示的，與用媒介物或單獨的Cytoxan處理的小鼠的腫瘤負荷相比，用Cytoxan和2F8的組合處理的小鼠中的腫瘤負荷是降低的。
實施例4用GITR結(jié)合分子和烷化劑或核苷類似物的組合處理的結(jié)腸癌瘤的動物模型對CT26細胞形成強烈的記憶應(yīng)答。
在研究中使用如上文在實施例1和實施例4那樣處理且其腫瘤完全消退的小鼠，其中給它們在其左體側(cè)注射3×105個CT26細胞IV(4只小鼠)或106個CT26細胞，及在其右體側(cè)注射106個RENCA細胞(4只小鼠)。使用未接觸CT26的小鼠作為對照。所有4只經(jīng)組合處理的小鼠排斥CT26細胞考驗，而2/4完全排斥RENCA細胞。在IV研究中，注射細胞后14天切除肺，用墨汁染色，用Fekete氏溶液固定，并分析腫瘤的存在；對所有4只動物的肺的分析沒有顯示可見的腫瘤癥候。
實施例5在結(jié)腸癌瘤的動物模型中GITR結(jié)合分子和抗代謝物的組合降低腫瘤負荷。
給小鼠皮下注射1×105個CT26細胞，并分成組。一組對照小鼠是未處理的。在第10天時用75mg/kg5-FU處理接受氟尿嘧啶(5-FU)的一組小鼠。在第10天時向接受5-FU+2F8的一組小鼠給予75mg/kg 5-FU，并在第11天時給予0.4mg 2F8(I.P.)。
監(jiān)測腫瘤的大小和小鼠的存活。使用測徑器來測量腫瘤，并使用公式(L×W2)/2來計算腫瘤大小。
如圖6中所顯示的，與用媒介物或單獨的5-FU處理的小鼠的腫瘤負荷相比，用5-FU和2F8的組合處理的小鼠中的腫瘤負荷是降低的。
實施例6在結(jié)腸癌瘤的動物模型中GITR結(jié)合分子和細胞毒性抗生素的組合降低腫瘤負荷。
給小鼠皮下注射1×105個CT26細胞，并分成組。一組對照小鼠是未處理的。在第10天時用5mg/kg多柔比星處理接受多柔比星(阿霉素)的一組小鼠。在第10天時向接受多柔比星+2F8的一組小鼠給予5mg/kg多柔比星，并在第11天時給予0.4mg 2F8(I.P.)。
監(jiān)測腫瘤的大小和小鼠的存活。使用測徑器來測量腫瘤，并使用公式(L×W2)/2來計算腫瘤大小。
如圖7中所顯示的，與用媒介物或單獨的多柔比星處理的小鼠的腫瘤負荷相比，用多柔比星和2F8的組合處理的小鼠中的腫瘤負荷是降低的。
實施例7在黑素瘤的動物模型中GITR結(jié)合分子和烷化劑的組合降低腫瘤負荷。
給小鼠皮下注射1×104個B16黑素瘤細胞，并分成組。一組對照小鼠是未處理的。在第13天時用150mg/kg Cytoxan處理接受Cytoxan的一組小鼠。在第14天時一組小鼠以0.4mg的劑量(I.P.)接受單獨的抗GITR抗體(2F8)。在第13天時向接受Cytoxan+2F8的一組小鼠給予150mg/kg Cytoxan

，并在第14天時給予0.4mg 2F8(I.P.)。
監(jiān)測腫瘤的大小和小鼠的存活。使用測徑器來測量腫瘤，并使用公式(L×W2)/2來計算腫瘤大小。
如圖8中所顯示的，與用媒介物或單獨的Cytoxan處理的小鼠的腫瘤負荷相比，用Cytoxan和2F8的組合處理的小鼠中的腫瘤負荷是降低的。
等同方案 本領(lǐng)域技術(shù)人員只要使用常規(guī)的實驗就會認識到，或者能夠確定本文中所描述的發(fā)明的具體實施方案的許多等同方案。所附權(quán)利要求書意圖涵蓋此類等同方案。
由此通過提及而完整收錄本文所提及的所有出版物和專利，包括那些下文所列的各項，就像明確且單獨指明通過提及而收錄每篇單獨的出版物或?qū)＠粯印?br> 序列表
<110>托勒克斯股份有限公司(TOLERX，INC.)
PONATH，PAUL
ROSENZWEIG，MICHAEL
PONTE，F(xiàn).JOSE
<120>采用GITR結(jié)合分子的聯(lián)合療法
<130>TLN-040
<140>隨本文
<141>隨本文
<150>60/959,246
<151>2007-07-12
<150>61/001,021
<151>2007-10-30
<150>61/126,431
<151>2008-05-05
<160>7
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>1
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly
1 5 10
<210>2
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<223>人工序列的描述合成肽
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His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>3
<211>16
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<213>人工序列
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<223>人工序列的描述合成肽
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<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人工序列的描述合成肽
<400>4
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<210>5
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<213>人工序列
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<223>人工序列的描述合成肽
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>7
Gln Gln Tyr Asn Thr Asp Pro Leu Thr
1 權(quán)利要求
1.一種用于在受試者中抑制腫瘤細胞生長的方法，包括對所述受試者施用GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪至少一種別的藥劑，使得在所述受試者中腫瘤細胞生長得到抑制。
2.一種用于在具有腫瘤的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪至少一種別的藥劑，使得所述腫瘤大小得到縮小。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中在施用所述GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段前對所述受試者施用所述至少一種別的藥劑。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中伴隨所述GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段對所述受試者施用所述至少一種別的藥劑。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中在施用所述GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段后對所述受試者施用所述至少一種別的藥劑。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述至少一種別的藥劑是化療劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述化療劑是抗代謝物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗代謝物選自下組氨基蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、克拉屈濱、氯法拉濱、氟達拉濱、巰嘌呤、噴司他丁、硫鳥嘌呤、卡培他濱、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟尿苷、和吉西他濱。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗代謝物是核苷類似物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述核苷類似物是吉西他濱。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述核苷類似物是氟尿嘧啶。
12.權(quán)利要求6的方法，其中所述化療劑是影響微管形成的藥劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述影響微管形成的藥劑選自下組帕利他塞、多西他賽、長春新堿、長春堿、長春地辛、長春瑞濱、泰索帝、依托泊苷、和替尼泊苷。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述影響微管形成的藥劑是帕利他塞。
15.權(quán)利要求6的方法，其中所述化療劑是烷化劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述烷化劑是環(huán)磷酰胺。
17.權(quán)利要求6的方法，其中所述化療劑是細胞毒性抗生素。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述細胞毒性抗生素是拓撲異構(gòu)酶II抑制劑。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述拓撲異構(gòu)酶II抑制劑是多柔比星。
20.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述GITR結(jié)合分子是人源化抗體或其抗體片段。
21.權(quán)利要求16的方法，其中所述人源化抗體包含SEQ ID NO.1、2或3、4、5、6、或7中所顯示的CDR。
22.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述GITR結(jié)合分子是嵌合抗體或其抗體片段。
23.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述腫瘤的類型選自下組胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支氣管癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦癌或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、周圍神經(jīng)系統(tǒng)癌、食管癌、宮頸癌、子宮癌或子宮內(nèi)膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽管癌、小腸癌或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、和血液學組織的癌癥。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述腫瘤是結(jié)腸腫瘤。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述結(jié)腸腫瘤是腺癌。
26.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述腫瘤是黑素瘤。
27.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述腫瘤選自下組結(jié)腸腫瘤、肺腫瘤、乳腺腫瘤、胃腫瘤、前列腺腫瘤、宮頸腫瘤、陰道腫瘤、和胰腺腫瘤。
28.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述腫瘤處于選自下組的時期I期、II期、III期、和IV期。
29.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述腫瘤為至少約0.5mmX0.5mm。
30.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述腫瘤為至少約1mmX1mm。
31.權(quán)利要求2的方法，其中所述腫瘤具有至少約100mm3的體積。
32.權(quán)利要求2的方法，其中所述腫瘤是轉(zhuǎn)移性的。
33.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述施用GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段和至少一種化療劑導(dǎo)致腫瘤大小被抑制超過約42％。
34.一種用于在具有結(jié)腸腺癌的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR抗體或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪吉西他濱，使得所述腫瘤大小得到縮小。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述腫瘤是在啟動治療時已建立的腫瘤。
36.一種用于在具有黑素瘤的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR抗體或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪帕利他塞，使得所述腫瘤大小得到縮小。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述腫瘤是在啟動治療時已建立的腫瘤。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述腫瘤是在啟動治療時的繼發(fā)性腫瘤。
39.一種用于在具有結(jié)腸腺癌的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR抗體或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪環(huán)磷酰胺，使得所述腫瘤大小得到縮小。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述腫瘤是在啟動治療時已建立的腫瘤。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述腫瘤是在啟動治療時的繼發(fā)性腫瘤。
42.一種用于在具有結(jié)腸腺癌的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR抗體或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪氟尿嘧啶，使得所述腫瘤大小得到縮小。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述腫瘤是在啟動治療時已建立的腫瘤。
44.一種用于在具有結(jié)腸腺癌的受試者中縮小腫瘤大小的方法，包括對所述受試者施用GITR抗體或其抗原結(jié)合片段和一輪或多輪多柔比星，使得所述腫瘤大小得到縮小。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述腫瘤是在啟動治療時已建立的腫瘤。
46.權(quán)利要求34、36、39、42、和44任一項的方法，其中所述GITR結(jié)合分子是人源化抗體或其抗體片段。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述人源化抗體包含SEQ ID NO.1、2或3、4、5、6、或7中所顯示的CDR。
48.權(quán)利要求34、36、39、42、和44任一項的方法，其中所述GITR結(jié)合分子是嵌合抗體或其抗體片段。
49.一種試劑盒，其包含
a)包裝材料；
b)GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段；和
c)所述包裝材料內(nèi)含有的標簽或包裝插頁，其指明所述GITR結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段可以與至少一種別的藥劑一起施用。
50.權(quán)利要求49的試劑盒，其中所述至少一種別的藥劑是化療劑。
51.權(quán)利要求50的試劑盒，其中所述化療劑是抗代謝物。
52.權(quán)利要求51的試劑盒，其中所述抗代謝物是核苷類似物。
53.權(quán)利要求52的試劑盒，其中所述核苷類似物是吉西他濱。
54.權(quán)利要求52的試劑盒，其中所述核苷類似物是氟尿嘧啶。
55.權(quán)利要求50的試劑盒，其中所述化療劑是影響微管形成的藥劑。
56.權(quán)利要求55的試劑盒，其中所述影響微管形成的藥劑是帕利他塞。
57.權(quán)利要求50的試劑盒，其中所述化療劑是烷化劑。
58.權(quán)利要求57的試劑盒，其中所述烷化劑是環(huán)磷酰胺。
59.權(quán)利要求50的方法，其中所述化療劑是細胞毒性抗生素。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述細胞毒性抗生素是拓撲異構(gòu)酶II抑制劑。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述拓撲異構(gòu)酶II抑制劑是多柔比星。
62.權(quán)利要求49的試劑盒，其中所述GITR結(jié)合分子是人源化抗體或其抗體片段。
63.權(quán)利要求62的試劑盒，其中所述人源化抗體包含SEQ ID NO.1、2或3、4、5、6、或7中所顯示的CDR。
64.權(quán)利要求49的試劑盒，其中所述GITR結(jié)合分子是嵌合抗體或其抗體片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了采用與一種或多種別的藥劑組合的GITR結(jié)合分子的聯(lián)合療法。
文檔編號A61K39/395GK101801413SQ200880106968
公開日2010年8月11日 申請日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日
發(fā)明者邁克爾·羅森茨韋格, 保羅·波內(nèi)思, 喬斯·F·龐特 申請人:托勒克斯股份有限公司