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      新型抗體的制作方法

      文檔序號:1145999閱讀:575來源:國知局
      專利名稱:新型抗體的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及新型α 5β 1抗體、包含該抗體的組合物和試劑盒及使用該抗體的方法。
      背景技術(shù)
      α 5 β 1整聯(lián)蛋白是經(jīng)由其主要配體纖連蛋白介導(dǎo)細(xì)胞_細(xì)胞和細(xì)胞-ECM相互作 用的細(xì)胞膜糖蛋白。α 5β1整聯(lián)蛋白在細(xì)胞遷移、分化和存活中發(fā)揮作用。在腫瘤血管 內(nèi)皮(例如胃癌、結(jié)腸直腸癌、肝細(xì)胞癌、子宮宮頸癌和乳腺癌)和其它血管發(fā)生性血管中 αδβ 整聯(lián)蛋白的水平升高。α 5β 1整聯(lián)蛋白調(diào)控血管發(fā)生期間壁細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié) 合和內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)的裝配。因此,α 5β1整聯(lián)蛋白是抑制血管發(fā)生及使細(xì)胞對VEGF拮 抗劑的效果敏感的有用靶物。如此,本領(lǐng)域需要用于靶向α 5β 1整聯(lián)蛋白的組合物和方法。本發(fā)明滿足了此需 要和其它需要。發(fā)明概述本發(fā)明涉及自7Η5雜交瘤生成的抗體衍生的新型抗α 5β1抗體,包含該新型抗 αδβ 抗體的試劑盒和組合物,及制備和使用它們的方法。本發(fā)明的抗α 5β 1抗體具有 與7Η5雜交瘤生成的抗體相比改進(jìn)的對α 5β1的結(jié)合。此類抗體包括人源化抗體。依照 另一個實施方案,所述新抗α 5β 1抗體可偶聯(lián)至另一實體,諸如但不限于治療劑或熒光染 料或其它標(biāo)志物,用以在患者中或在患者樣品中檢測α 5β 1。此類新α 5β 1抗體可在各種 治療和診斷方法中使用。例如,此類抗α5β1抗體可在治療異常血管發(fā)生、瘤形成、眼病和 自身免疫性疾病中使用。此類抗體可用于在患者或患者樣品中檢測α 5β 1蛋白質(zhì),其通過 使此類抗體接觸患者中或患者樣品中的α 5β 1蛋白質(zhì)并定性或定量測定結(jié)合至α 5β 1蛋 白質(zhì)的抗α5β1抗體來進(jìn)行。依照一個實施方案,本發(fā)明的抗α 5β 1抗體包含輕鏈可變域序列,該輕鏈可變域 序列包含(1)包含氨基酸序列KASQ-N/S-VGSDVA(SEQ ID NO 10)的LHVRl、(2)包含氨基 酸序列 STSYRYS (SEQ ID NO: 11)的 LHVR2 禾口(3)包含氨基酸序列 QQY-N/S-SYPFT (SEQ ID NO 12)的LHVR3。依照另一個實施方案,本發(fā)明的抗α 5 β 1抗體包含重鏈可變域序列,該 重鏈可變域序列包含⑴包含氨基酸序列GYTF-T/S-DYYLY(SEQ ID NO 13)的HHVR1、(2) 包含氨基酸序列 GISPS-N/S-GGTTF-N/A-D-N/A-FE-N/G(SEQ ID NO: 14)的 HHVR2 和(3)包 含氨基酸序列 DAY ⑶ WYFDV (SEQ ID NO: 15)的 HHVR3。依照另一個實施方案,本發(fā)明的抗α 5β 1抗體包含輕鏈可變域和重鏈可變域,該 輕鏈可變域具有序列SEQ ID NO 1或其變體,該重鏈可變域具有序列SEQ ID NO 6或其變 體。依照一個實施方案,所述重鏈可變域變體序列在選自下組的殘基處包含氨基酸替代30、48、49、54、60、62、65、66、67和69(Kabat編號系統(tǒng))。依照另一個實施方案,所述輕鏈可 變域變體序列在選自下組的殘基處包含氨基酸替代28、46和92(1(油站編號系統(tǒng))。依照 一個實施方案,所述重鏈可變域包含選自下組的氨基酸替代T30S、I48V、G49S、N54S、N60A、 N62A、N62S、N65G、K66R、A67F和L69I (Kabat編號系統(tǒng))。依照一個實施方案,所述輕鏈可 變域包含選自下組的氨基酸替代N28S、T46L和N92S (Kabat編號系統(tǒng))。本發(fā)明還涉及一種組合物,其包含多肽,該多肽包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、和9。依照另一個實施方案,所述組合物包含抗體,該抗體包含輕 鏈可變域序列SEQ ID NO :1和重鏈可變域序列SEQ ID NO :5。依照另一個實施方案,所述組 合物包含抗體,該抗體包含輕鏈可變域序列SEQ ID NO :2和重鏈可變域序列SEQ ID NO :6。 依照另一個實施方案,所述組合物包含抗體,該抗體包含輕鏈可變域序列SEQ ID N0:2和重 鏈可變域序列SEQ ID NO :7。依照另一個實施方案,所述組合物包含抗體,該抗體包含輕鏈 可變域序列SEQ ID NO: 3和重鏈可變域序列SEQ ID NO :8。依照另一個實施方案,所述組 合物包含抗體,該抗體包含輕鏈可變域序列SEQ ID NO :4和重鏈可變域序列SEQ ID NO :9。依照又一個實施方案,本發(fā)明提供了一種在受試者中治療癌癥的方法,其包括施 用VEGF拮抗劑和本發(fā)明的抗α5β1抗體的步驟。依照一個優(yōu)選的實施方案,所述癌癥響 應(yīng)VEGF拮抗劑療法。在另一個實施方案中,一種在患有AMD的受試者中治療年齡相關(guān)黃斑 變性(AMD)(包括濕性年齡相關(guān)黃斑變性)的方法,包括施用治療有效量的VEGF拮抗劑和 本發(fā)明的抗α5β1抗體的步驟。在又一個實施方案中,一種在受試者中治療自身免疫性疾 病的方法,包括施用治療有效量的VEGF拮抗劑和抗α 5 β 1抗體的步驟。在一個實施方案中,要治療的受試者可以首先施用VEGF拮抗劑,隨后用本發(fā)明的 抗α5β1抗體治療。在另一個實施方案中,在用任一藥物的多輪治療中,用VEGF拮抗劑和 本發(fā)明的抗α 5β1抗體治療受試者。依照另一個實施方案,用VEGF拮抗劑治療受試者,直 至受試者對VEGF拮抗劑治療沒有響應(yīng),然后用本發(fā)明的抗α 5β 1抗體治療受試者。在一個 具體的實施方案中,在所述癌癥是非侵入性的或早期的時候用VEGF拮抗劑治療受試者,而 在所述癌癥是侵入性的時候用本發(fā)明的抗α 5β1抗體治療受試者。在另一個實施方案中, 用本發(fā)明的抗α 5β 1抗體治療的受試者在患病組織中有與來自未患病受試者的組織相比 升高的α5β1水平。在這種情況中,所述方法可進(jìn)一步包括檢測受試者中的α5β1的步 驟,例如在用VEGF拮抗劑治療后在患病組織中。依照一個實施方案,所述侵入性癌癥是轉(zhuǎn) 移性癌癥。依照另一個實施方案,所述早期癌癥是通過輔助療法(例如化療或手術(shù)切除) 治療的癌癥。在一個優(yōu)選的實施方案中,所述受試者患有具有異常血管發(fā)生的疾病。依照另一 個實施方案,所述疾病選自下組癌癥、自身免疫性疾病或眼病。依照一個優(yōu)選的實施方 案,所述疾病選自下組實體瘤、轉(zhuǎn)移瘤、軟組織腫瘤、具有眼新血管形成的疾病、具有異常 血管發(fā)生的炎性疾病、移植入受試者后發(fā)生的疾病和具有纖維血管(fibrovascular)組織 異常增殖的疾病。依照另一個優(yōu)選的實施方案,所述癌癥選自下組乳腺癌(包括轉(zhuǎn)移性 乳腺癌)、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌(包括轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌)、肺癌(包括非小細(xì)胞肺癌)、非 何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病、腎細(xì)胞癌、前列腺癌(包括激素 不應(yīng)性前列腺癌(homone refractory prostate cancer))、肝癌、頭頸癌、黑素瘤、卵巢癌、 間皮瘤、軟組織癌、胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinalstromal tumor)、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme)和多發(fā)性骨髓瘤。依照另一個優(yōu)選的實施方案,所述疾病 選自下組視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)黃斑變性(例如濕性AMD)、糖尿病黃斑水腫、視網(wǎng)膜靜脈閉 塞(RVO)、和干性AMD/地理性萎縮(geographic atrophy)(為了阻止發(fā)展成濕性AMD)、 發(fā)紅;銀屑病、炎性腎病、溶血性尿毒綜合征(haemolytic uremic syndrome)、糖尿病腎病 (例如增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病)、關(guān)節(jié)炎(例如銀屑病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、 炎性腸病、慢性炎癥、慢性視網(wǎng)膜剝離、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃體炎、角膜移植片排斥、角 膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、克羅恩(Crohn)氏病、近視、眼新血管病、佩吉特 (Paget)氏病、類天皰瘡、多動脈炎、激光放射狀角膜切開術(shù)后、視網(wǎng)膜新血管形成、斯耶格 倫(Sogren)氏綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、移植物排斥、肺部炎癥、腎病綜合征、水腫、與惡性腫 瘤有關(guān)的腹水、中風(fēng)、血管纖維瘤和新生血管性青光眼。在一個實施方案中,對所述受試者 進(jìn)一步施用選自下組的治療劑抗腫瘤劑、化療劑和細(xì)胞毒劑。依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案,要用抗α 5β 1抗體治療的受試者患有VEGF拮 抗劑治療后的復(fù)發(fā)或變成對VEGF拮抗劑治療不應(yīng)。依照另一個實施方案,要用本發(fā)明抗 α 5 β 1抗體和VEGF拮抗劑治療的受試者患有轉(zhuǎn)移性癌癥或先前用輔助療法治療過。在一 個實施方案中,候選患者是對化療劑(諸如伊立替康(irinotecan)復(fù)發(fā)的、不應(yīng)的或有抗 性的。此類疾病的例子包括但不限于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌、復(fù)發(fā)性結(jié)腸直腸癌、轉(zhuǎn)移性乳腺 癌、復(fù)發(fā)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性HER2+乳腺癌、乳腺癌、HER2+乳腺癌、轉(zhuǎn)移性胰腺癌、結(jié)腸 癌、非小細(xì)胞肺癌、腎癌、非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性卵巢癌、轉(zhuǎn)移性腎細(xì) 胞癌和腎細(xì)胞癌。依照一個實施方案,在用VEGF拮抗劑治療疾病后對患有本文所述疾病的受試者 施用維持療法,其中所述維持療法是單獨地施用抗α 5β 1抗體,或者抗α 5β 1抗體與VEGF 拮抗劑序貫地施用或同時施用。依照一個優(yōu)選的實施方案,所述VEGF拮抗劑可選自下組抗體、免疫粘附素、肽 抗體(ρ印tibody)、小分子和在嚴(yán)格條件下與編碼VEGF的核酸分子雜交的核酸(例如核 酶(ribozyme)、siRNA和適體(aptamer))。依照一個優(yōu)選的實施方案,所述VEGF拮抗劑是 抗體。依照另一個實施方案,所述抗體是單克隆抗體。依照一個優(yōu)選的實施方案,所述抗 VEGF抗體對人VEGF的結(jié)合能夠被Avastin 抗體競爭性抑制。依照另一個實施方案,所述 抗VEGF抗體是人的、人源化的或嵌合的。依照一個具體的實施方案,所述抗VEGF抗體是 Avastin 抗體。依照另一個實施方案,所述抗VEGF抗體選自下組Fab、Fab,、F(ab),2、單 鏈Fv(SCFV)、Fv片段、雙抗體和線性抗體。依照另一個實施方案,所述VEGF拮抗劑是結(jié)合 VEGF的雙特異性抗體且包含本發(fā)明抗α 5β 1抗體的重鏈和輕鏈可變域。依照一個優(yōu)選的實施方案,本發(fā)明的抗α5β1抗體是包含人IgG Fc部分的抗體。 依照另一個實施方案,本發(fā)明的抗α 5 β 1抗體包含人IgGl或hIgG4的CHI、CH2和CH3結(jié) 構(gòu)域。依照一個優(yōu)選的實施方案,所述抗α 5β1抗體是人源化抗體。依照一個具體的實施 方案,所述抗α5β1抗體是7Η5抗體或其嵌合或人源化抗體。依照另一個實施方案,所述 抗α5β 1抗體選自下組Fab、Fab,、a F (ab),2、單鏈Fv (scFv)、Fv片段、雙抗體和線性抗 體。依照另一個實施方案,本發(fā)明的抗α 5β 1抗體是結(jié)合VEGF和α 5β 1的雙特異性抗體 且是VEGF拮抗劑。依照又一個實施方案,本發(fā)明的抗α 5β1抗體具有改變的效應(yīng)器功能。 依照一個實施方案,抗α 5β1抗體被改變以降低或阻止抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)或補
      6體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性(例如通過改變編碼抗體Fc部分的核酸序列)。依照又一個 實施方案,所述抗α 5β1抗體被改變以延長或縮短在人類中的半衰期(例如通過改變編碼 抗體Fc部分的核酸序列)。依照一個實施方案,所述α 5β 1抗體偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑或化療劑。依照另一個實施 方案,所述細(xì)胞毒劑是放射性同位素或毒素。本發(fā)明提供了組合物,其包含VEGF拮抗劑、本發(fā)明的α 5β 1抗體和藥學(xué)可接受載 體。本發(fā)明還提供了制品,其包含關(guān)于在已經(jīng)用VEGF拮抗劑治療過的受試者中檢測α 5β 1 的說明。附圖簡述

      圖1描繪了下述人源化抗體相對于抗整聯(lián)蛋白α 5 β 1克隆7Η5的輕鏈可變域序 列比對基于嫁接鼠7Η5 CDR的人源化7Η5抗體(h7H5. vl,SEQ ID NO 1)、基于替換h7H5. vlCDR-Ll、-L3 和-H2 中殘基的人源化 7H5 抗體(h7H5. v2, SEQ ID NO 2)和基于在 h7H5. v2 上修飾框架的人源化 7H5 抗體(h7H5. v4, SEQ ID NO 3 和 h7H5. v5, SEQ ID NO 4)。h7H5. v3輕鏈可變域在序列上與SEQ ID N0:2相同。圖2描繪了下述人源化抗體相對于抗整聯(lián)蛋白α 5 β 1克隆7H5的重鏈可變域序 列比對基于嫁接鼠7Η5 CDR的人源化7Η5抗體(h7H5. vl,SEQ ID NO 5)、基于替換h7H5. vl CDR-L1、-L3 和-H2 中殘基的人源化 7H5 抗體(h7H5. v2,SEQ ID NO 6)和基于在h7H5. v2 上框架修飾的人源化 7H5 抗體(h7H5. v4, SEQ ID NO 8 和 h7H5. v5, SEQ ID NO 9)。h7H5. v3重鏈可變域在序列上與h7H5. v2相同,只是它具有N62S氨基酸突變(h7H5. v3VH序列稱 作 SEQ IDNO 7)。圖3描繪了嵌合7H5_IgG和人源化7H5. vl-IgG對人整聯(lián)蛋白α5β1的 BIACORE 分析的結(jié)果。(A)在CM5傳感器芯片的兩個不同流動室上固定化450RU(響 應(yīng)單位)的嵌合7H5-IgG和人源化7H5.vl-IgG并注射2倍連續(xù)稀釋的人整聯(lián)蛋白 α 5β 1(300ηΜ至0. 29nM)通過傳感器芯片以測定結(jié)合親和力和動力學(xué),于25°C進(jìn)行。(B)在 CM5傳感器芯片上固定化800RU的人整聯(lián)蛋白α 5 β 1并注射2倍連續(xù)稀釋的嵌合7H5_IgG 和人源化7H5. vl-IgG(200nM至0. 2nM)通過傳感器芯片以測定結(jié)合親和力和動力學(xué),于 25°C進(jìn)行。圖4描繪了噬菌體競爭ELISA,用于測定在噬菌體上作為單價Fab形式展示的人源 化7H5. vl單一點突變克隆對人整聯(lián)蛋白α 5 β 1的噬菌體IC50。圖5描繪了每一處對親本克隆h7H5. vl的單一點突變的結(jié)合親和力(IC50)的相 對變化倍數(shù)的匯總。圖6描繪了噬菌體競爭ELISA,用于測定在噬菌體上作為單價Fab形式展示的人源 化7H5. vl多處替代克隆對人整聯(lián)蛋白α 5 β 1的噬菌體IC50。前兩種變體是基于來自圖5 的選集(突出顯示的)生成的??傊辛N變體保留并顯示略微改進(jìn)的結(jié)合親和力;因 此,選擇所示兩種變體h7H5. v2和h7H5. v3來包括⑶R-H2第65位甘氨酸替代。圖7描繪了人源化7H5. vl、v2和v3_IgG對人整聯(lián)蛋白α 5 β 1的BIACORE 分析的結(jié)果。在CM5傳感器芯片的三個不同流動室上固定化450RU(響應(yīng)單位)的人源化 7H5. vl、v2和v3-IgG并注射2倍連續(xù)稀釋的人整聯(lián)蛋白α 5 β 1 (300ηΜ至0. 29ηΜ)通過傳 感器芯片以測定結(jié)合親和力和動力學(xué),于25°C進(jìn)行。人源化7H5. v2指示解離速率的最大結(jié)合親和力改善。圖8描繪了噬菌體競爭ELISA,用于測定在噬菌體上作為單價Fab形式展示的人 源化7H5.V2框架修飾克隆對人整聯(lián)蛋白α5β1的噬菌體IC50。大多數(shù)框架替代顯示出 與h7H5. v2相比相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和力,除了分別將甘氨酸變成絲氨酸和將丙氨酸變成亮氨酸 的重鏈第49位和第78位。圖9描繪了人源化7H5. v2、v4和v5_IgG對人整聯(lián)蛋白α 5 β 1的BIACORE 分析的結(jié)果。(A)在CM5傳感器芯片的三個不同流動室上固定化450RU(響應(yīng)單位)的人 源化7H5. v2、v4和v5-IgG并注射2倍連續(xù)稀釋的人整聯(lián)蛋白α 5 β 1 (300ηΜ至0. 29ηΜ)通 過傳感器芯片以測定結(jié)合親和力和動力學(xué),于25°C進(jìn)行。(B)在CM5傳感器芯片上固定化 800RU的人整聯(lián)蛋白α 5 β 1并注射2倍連續(xù)稀釋的人源化7Η5. v2、v4和v5_IgG(200nM至 0. 2nM)通過傳感器芯片以測定結(jié)合親和力和動力學(xué),于25°C進(jìn)行。在兩種形式中,人源化 7H5. v4顯示與人源化7H5. v2相比相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和力。圖10描繪了皮膚傷口愈合實驗的結(jié)果,證明了組合施用h7H5.v2和抗VEGF增強 單獨的抗VEGF的抗血管發(fā)生效果。圖11描繪了皮膚傷口愈合實驗的結(jié)果,證明了組合施用h7H5. v4和抗VEGF增強 單獨的抗VEGF的抗血管發(fā)生效果。發(fā)明詳述I.引言本發(fā)明基于結(jié)合Cij1整聯(lián)蛋白的新型抗體的鑒定。所述Ci5^抗體衍生自單克 隆抗體7H5且能在各種治療和診斷方法中使用。例如,所述α 5β工抗體能單獨地或與其它藥 劑組合地在治療異常血管發(fā)生、瘤形成、眼病和自身免疫性疾病中使用。所述抗體還能用于 在患者或患者樣品中檢測α5β1蛋白質(zhì),其通過施用針對患者中Cij1蛋白質(zhì)的抗體并檢 測結(jié)合至來自患者的樣品(例如體內(nèi)的或離體的)中Ci5^1蛋白質(zhì)的抗α5β1抗體或者 通過使所述抗體接觸來自患者的樣品并定性或定量檢測結(jié)合至α J1蛋白質(zhì)的抗α5β1 抗體來進(jìn)行。II.定義“阿爾法5貝塔1 ”或“ α 5 β 1 ”或“a5b 1 ”或“ α 5 β i,,或指包含兩個不同蛋白質(zhì) (即亞基α 5和β 1)的整聯(lián)蛋白。α5β1已顯示出結(jié)合纖連蛋白、Ll-CAM和纖維蛋白原。 α 5β 1 整聯(lián)蛋白還稱為 VLA_5(極晚激活蛋白(very late activation) _5)、alpha5betal、 ⑶49e/⑶29、纖連蛋白受體、FNR和GPIc-IIa。依照一個優(yōu)選的實施方案,所述α 5 β 1是人 α 5β 1?!?α 5”在本文中與 CD49e、alpha5、整聯(lián)蛋白 a5MS、VLA_5a 亞基、GPIc-IIa 的 IC亞基和FNR α鏈可互換使用,指α J1整聯(lián)蛋白的一個亞基。α5具有四種通過可變剪 接生成的同工型(isoform) (A-D),它們在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)有所不同。α 5人同工型的氨基 酸序列可分別見于例如Genbank編號X07979、U33879、U33882和U33880?!?β 1” 也稱為 CD29、betal、血小板 GPIIa ;VLA-β 鏈;β _1 整聯(lián)蛋白鏈、CD29 ; FNRB ;MDF2 ;VLAB ;GPIIA ;MSK12和VLA5B。人β 1的氨基酸序列可見于例如Genbank編號 Χ06256。術(shù)語“VEGF”在用于本文時指165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子及相關(guān)的121個、189個和206個氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子,如Leung等Science 246 1306(1989)和Houck等Mol.Endocrin,5 :1806(1991)所述,及其天然存在等位基因形式和 加工形式。術(shù)語“VEGF”還指來自非人物種諸如小鼠、大鼠或靈長類動物的VEGF。有時,來 自特定物種的VEGF表示如下,hVEGF表示人VEGF,mVEGF表示鼠VEGF,等等。術(shù)語“VEGF” 還用于指包含165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的氨基酸第8-109位或第1-109位 的截短形式多肽。本申請中可能通過例如“VEGF(8-109) ”、“VEGF(1-109)”或"VEGF165”來 鑒別任何此類形式VEGF?!敖囟痰摹碧烊籚EGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示編號。 例如,截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲 硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當(dāng)?shù)膶DR和Flt-I受體的結(jié)合親和力。 依照一個優(yōu)選的實施方案,所述VEGF是人VEGF。"VEGF拮抗劑”指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性(包括其與 VEGF或一種或多種VEGF受體或編碼它們的核酸結(jié)合)的分子。優(yōu)選的是,所述VEGF拮抗 劑能結(jié)合VEGF或VEGF受體。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段、能結(jié)合VEGF 和VEGF受體并阻斷配體-受體相互作用的多肽(例如免疫粘附素、肽體(ρ印tibody))、抗 VEGF受體抗體和VEGF受體拮抗劑諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑、能結(jié)合VEGF的 適體和能在嚴(yán)格條件下與編碼VEGF或VEGF受體核酸序列雜交的核酸(例如RNAi)。依照 一個優(yōu)選的實施方案,所述VEGF拮抗劑能結(jié)合VEGF并抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖(在 體外)。依照一個優(yōu)選的實施方案,所述VEGF拮抗劑以大于非VEGF或非VEGF受體的親和 力結(jié)合VEGF或VEGF受體。依照一個優(yōu)選的實施方案,所述VEGF拮抗劑以介于1 μ M和IpM 之間的Kd結(jié)合VEGF或VEGF受體。依照另一個優(yōu)選的實施方案,所述VEGF拮抗劑以介于 500ηΜ和IpM之間的Kd結(jié)合VEGF或VEGF受體。依照一個優(yōu)選的實施方案,所述VEGF拮抗劑選自下組多肽諸如抗體、肽 體、免疫粘附素、小分子或適體。在一個優(yōu)選的實施方案中,所述抗體是抗VEGF抗體 (諸如AVASTIN 抗體)或抗VEGF受體抗體(諸如抗VEGFR2或抗VEGFR3抗體)。 VEGF 拮抗劑的其它例子包括VEGF-Trap、Mucagen, PTK787、SUl 1248、AG-013736、Bay 439006(sorafenib)、ZD-6474、CP632、CP-547632、AZD-2171、CDP-171、SU_14813、CHIR-258、 AEE-788、SB786034、BAY579352、CDP-791、EG-3306、Gff-786034, RWJ-417975/CT6758 和 KRN-633?!翱筕EGF抗體”指以足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF的抗體。優(yōu)選的是,本發(fā)明的 抗VEGF抗體可在靶向和干預(yù)其中牽涉VEGF活性的疾病或疾患中用作治療劑??筕EGF抗 體通常不會結(jié)合其它VEGF同系物,諸如VEGF-B或VEGF-C,也不會結(jié)合其它生長因子,諸如 P1GF、PDGF或bFGF。一種優(yōu)選的抗VEGF抗體是與雜交瘤ATCC HB 10709所生成的單克隆抗 VEGF抗體A4. 6. 1結(jié)合相同表位的單克隆抗體。更優(yōu)選的是,抗VEGF抗體是依照Presta等 (1997) Cancer Res. 57 =4593-4599生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體,包括但不限于稱 為貝伐單抗(bevacizumab) (BV ;Avastin )的抗體。依照另一個實施方案,可以使用的抗 VEGF抗體包括但不限于WO 2005/012359中披露的抗體。依照一個實施方案,所述抗VEGF 抗體包含WO 2005/012359的圖24、25、26、27和29中披露的任一抗體(例如G6、G6-23、 G6-3UG6-23. 1、G6-23. 2、B20、B20-4和B20. 4. 1)的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。在另一個 優(yōu)選的實施方案中,稱為ranibizumab的抗VEGF抗體是為了眼病諸如糖尿病視網(wǎng)膜病和濕
      9性AMD而施用的VEGF拮抗劑??筕EGF 抗體“貝伐單抗” (bevacizumab, BV),也稱為 “rhuMAb VEGF” 或 "Avastin ”,是依照 Presta et al. (1997) Cancer Res. 57 :4593_4599 生成的重組人源化 抗VEGF單克隆抗體。它包含突變的人IgGl框架區(qū)和來自能阻斷人VEGF結(jié)合其受體的鼠抗 hVEGF單克隆抗體A4. 6. 1的抗原結(jié)合互補決定區(qū)。貝伐單抗大約93%的氨基酸序列(包括 大部分框架區(qū))衍生自人IgGl,而大約7%的序列衍生自鼠抗體A4. 6.1。貝伐單抗具有約 149,000道爾頓的分子量,而且是糖基化的。其它抗VEGF抗體包括美國專利No. 6,884,879 和W02005/044853中記載的抗體??筕EGF抗體Ranibizumab或LUCENTIS 抗體或rhuFab V2是人源化的、親和 力成熟的抗人VEGF Fab片段。Ranibizumab是通過標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)方法在大腸桿菌表達(dá)載 體和細(xì)菌發(fā)酵中生成的。Ranibizumab是未糖基化的且分子量為約48,000道爾頓。參見 W098/45331和 US 2003/0190317。稱作7H5的α 5 β 1單克隆抗體于2006年3月7日作為7Η5. 4. 2. 8 (ATCC No. ΡΤΑ-7421)保藏于 ATCC。以結(jié)合至靶物上交疊的或相似的區(qū)域為特征的分子(諸如抗體)可以通過競爭性 抑制/結(jié)合測定法來鑒定。在一個實施方案中,在競爭性抑制測定法中使用表達(dá)α 5β工的HUVEC或其它細(xì)胞, 而且使用FACS來評估兩種抗Cij1抗體相對于彼此的結(jié)合位置。例如,可以將HUVEC細(xì) 胞在錐形管中清洗,并以IOOOrpm離心5分鐘。通常將沉淀物清洗兩次。然后,可以將細(xì) 胞重懸,計數(shù),并放置在冰上直至使用??梢韵蚩字刑砑?00 μ 1第一抗α J1抗體(例如 從1 μ g/ml濃度或更低濃度開始)。接著,可以向每個孔中添加100 μ 1細(xì)胞(例如20χ105 個細(xì)胞),并在冰上溫育30分鐘。接著,可以向每個孔中添加ΙΟΟμΙ生物素化抗Cij1抗 體(5 μ g/ml儲液),并在冰上溫育30分鐘。然后將細(xì)胞清洗,并以IOOOrpm離心5分鐘。 吸去上清液。向孔中添加第二試劑R-藻紅蛋白偶聯(lián)鏈霉親合素(Jackson 016-110-084) (ΙΟΟμΙ,Ι 1000)。接著,可以將板包裹在金屬箔中,并在冰上溫育30分鐘。溫育后,可 以將沉淀物清洗,并以IOOOrpm離心5分鐘??梢詫⒊恋砦镏貞?,并轉(zhuǎn)移至微量滴定管,供 FACS分析?!把馨l(fā)生因子”或“血管發(fā)生劑”指刺激血管發(fā)育,例如促進(jìn)血管發(fā)生 (angiogenesis)、內(nèi)皮細(xì)胞生長、血管穩(wěn)定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長 因子。例如,血管發(fā)生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成員、P1GF、PDGF家族、成 纖維細(xì)胞生長因子家族(FGF)、TIE配體(血管生成素(angiopoietin)、印hrin、Del-l、酸 性(aFGF)和堿性(bFGF)成纖維細(xì)胞生長因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒細(xì)胞集落刺激 因子(G-CSF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)/散射因子(scatter factor,SF)、白介素-8 (IL-8)、 L印tin、Midkine、胎盤生長因子、血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PD-ECGF)、血小板衍生生 長因子尤其是 PDGF-BB 或 PDGFR-β、Pleiotrophin(PTN)、Progranulin, Proliferin、轉(zhuǎn)化 生長因子-α (TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β )、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、血管內(nèi)皮 生長因子(VEGF)/血管通透性因子(VPF)等。血管發(fā)生因子還包括加速傷口愈合的因子, 諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、CTGF及其家族 的成員、及 TGF-α 禾口 TGF-β。參見例如 Klagsbrun and D' Amore,Annu. Rev. Physiol. 53 217-39(1991) ;Streitand Detmar, Oncogene 22:3172—3179(2003) ;Ferrara & Alitalo, Nature Medicine5(12) 1359-1364(1999) ;Tonini等,Oncogene 22 :6549_6556(2003)(例 如列舉已知血管發(fā)生因子的表 1) ;Sato, Int. J. Clin. Oncol. 8 =200-206 (2003)。在一個優(yōu)選的實施方案中,依照本發(fā)明的抗VEGF抗體的“Kd”或“Kd值”是通 過如下測定法所述使用Fab型式的抗體和VEGF分子進(jìn)行的放射性標(biāo)記VEGF結(jié)合測定法 (RIA)來測量的通過在存在未標(biāo)記VEGF的滴定系列的條件下,用最小濃度的(125I)標(biāo)記 VEGF (109)平衡Fab,然后用抗Fab抗體包被的平板捕捉所結(jié)合的VEGF來測量Fab對VEGF 的溶液結(jié)合親和力(Chen,et al.,(1999) J Mol Biol 293 =865-881) 為了確定測定條件, 用50mM碳酸鈉(pH 9. 6)中的5μ g/ml捕捉用抗Fab抗體(Cappel Labs)包被微量滴定板 (Dynex)過夜,隨后用PBS中的2% (w/v)牛血清清蛋白于室溫(約23°C )封閉2_5小時。 在非吸附平板(Nunc #269620)中,將IOOpM或26pM[125I]-VEGF (109)與連續(xù)稀釋的感興趣 Fab,例如 Fab-12 (Presta et al.,(1997) Cancer Res. 57 :4593_4599)混合。然后將感興 趣Fab保溫過夜;不過,保溫可持續(xù)65個小時以保證達(dá)到平衡。此后,將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉 板以進(jìn)行室溫保溫1小時。然后除去溶液,并用含0. l%Tween-20的PBS洗板8次。平板 干燥后,加入150 μ 1/孔閃爍液(MicroScint-20 ;Packard),然后在Topcount伽馬計數(shù)器 (Packard)上對平板計數(shù)10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結(jié)合之20%的濃度用 于競爭性結(jié)合測定法。依照另一實施方案,Kd或Kd值是通過表面等離振子共振測定法使 用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore,Inc.,Piscataway, NJ)于 25°C使用固定化 hVEGF(8-109)CM5芯片在約10個響應(yīng)單位(RU)測量的。簡而言之,依照供應(yīng)商的說明書用 鹽酸N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸鈉pH 4. 8將人 VEGF稀釋至5 μ g/ml (約0. 2 μ Μ),然后以5 μ 1/分鐘的流速注入至獲得約10個響應(yīng)單位 (RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入人VEGF后,注入IM乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團。為了進(jìn)行動力學(xué) 測量,于25°C以約25 μ 1/分鐘的流速注入在含0. 05% Tween-20的PBS (PBST)中兩倍連續(xù) 稀釋的Fab (0. 78nM至500nM)。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖計算結(jié)合速率(k。n) 和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率k。ff/k。n計算。參見例如Chen,Y.,et al., J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根據(jù)上文表面等離振子共振測定法,結(jié)合速率超過 IO6M-1S-1,那么結(jié)合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來測定,即根據(jù)分光計諸如配備了斷流裝置的 分光光度計(astop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量,在存在濃度漸增的 人VEGF短型(8-109)或小鼠VEGF的條件下,測量PBS,pH 7. 2中的20nM抗VEGF抗體(Fab 形式)于25°C的熒光發(fā)射強度(激發(fā)=295nm;發(fā)射=340nm,16nm帶通)的升高或降低。 可以使用α 5 β 1作為靶物實施相似的結(jié)合測定法來測定抗α 5 β IFab或抗體的Kd。在用于本文時,待治療的受試者指哺乳動物(例如人、非人靈長類、大鼠、小鼠、 牛、馬、豬、綿羊、山羊、犬、貓等)。受試者可以是臨床患者、臨床試驗志愿者、實驗動物等。 受試者可以是懷疑患有或有風(fēng)險患上癌癥、免疫病、或具有異常血管發(fā)生的任何其它疾病, 診斷有癌癥、免疫病、或具有異常血管發(fā)生的任何其它疾病。癌癥、免疫病或展現(xiàn)出異常血 管發(fā)生的任何其它疾病的許多診斷方法及那些疾病的臨床描述是本領(lǐng)域已知的。依照一個優(yōu)選的實施方案,有待依照本發(fā)明治療的受試者指人。術(shù)語“異常血管發(fā)生”發(fā)生于疾病狀態(tài)中的或引起疾病狀態(tài)的新血管生長過度或 其它方面不當(dāng)(例如從醫(yī)學(xué)觀點看不良的血管發(fā)生位置、時間、程度、或啟動)時。在有些 情況中,過度的、失控的、或其它方面不當(dāng)?shù)难馨l(fā)生發(fā)生于有促成疾病狀態(tài)惡化或引起疾 病狀態(tài)的新血管生長時,諸如癌癥尤其是血管化實體瘤和轉(zhuǎn)移瘤(包括結(jié)腸癌、肺癌(尤其 是小細(xì)胞肺癌)、或前列腺癌),由眼新血管形成引起的疾病尤其是糖尿病性失明、視網(wǎng)膜 病變、原發(fā)性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(primarily diabetic retinopathy)或年齡誘發(fā)的黃斑 變性(AMD),脈絡(luò)膜新血管形成(CNV),糖尿病黃斑水腫,病理性近視,von Hippel-Lindau 病,眼組織胞漿菌病,視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO),角膜新血管形成,視網(wǎng)膜新血管形成和 發(fā)紅;銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、成血管細(xì)胞瘤諸如血管瘤;炎性腎病,諸如腎小球腎炎,尤其 是膜增生性腎小球腎炎、溶血性尿毒綜合征(haemolytic uremic syndrome)、糖尿病腎病 或高血壓腎硬化;各種炎性疾病,諸如關(guān)節(jié)炎,尤其是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、銀屑病、 結(jié)節(jié)病、動脈硬化和移植后發(fā)生的疾病、子宮內(nèi)膜異位癥或慢性哮喘,及超過70種其它疾 患。新血管可供應(yīng)患病組織,破壞正常組織,而且,在癌癥的情況中,新血管可容許腫瘤細(xì)胞 逃入循環(huán)并停留在其它器官中(腫瘤轉(zhuǎn)移)。本發(fā)明涵蓋治療那些有風(fēng)險發(fā)生上述疾病的
      ^^ ο“異常血管通透性”發(fā)生于疾病狀態(tài)中的或引起疾病狀態(tài)的血管與血管外區(qū)室之 間的流體、分子(例如離子和營養(yǎng)物)和細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞)的流動過度或其它方面不 當(dāng)(例如從醫(yī)學(xué)觀點看不良的血管通透性位置、時間、程度、或啟動)時。異常血管通透性可 導(dǎo)致過度的或其它方面不當(dāng)?shù)碾x子、水、營養(yǎng)物、或細(xì)胞經(jīng)由血管系統(tǒng)“滲漏”。在有些情況 中,過度的、失控的、或其它方面不當(dāng)?shù)难芡ㄍ感曰蜓軡B漏加劇或誘發(fā)疾病狀態(tài),包括 例如與腫瘤(包括腦瘤)有關(guān)的水腫;與惡性腫瘤有關(guān)的腹水;梅格斯氏(Meigs)綜合征; 肺部炎癥;腎病綜合癥征;心包積液;胸腔積液;與心血管疾病(諸如心肌梗死和中風(fēng)后的 疾患)有關(guān)的通透性等等。本發(fā)明涵蓋治療那些形成或有風(fēng)險形成與異常血管通透性或滲 漏有關(guān)的疾病和病癥的患者。作為接受本發(fā)明抗體或多肽的候選者的其他患者具有或者有風(fēng)險發(fā)生纖維血管 組織異常增殖、酒渣鼻(紅斑痤瘡)、獲得性免疫缺陷綜合征、動脈阻塞、特應(yīng)性角膜炎、細(xì) 菌性潰瘍、貝切特氏病(Bechets disease)、血液傳播的腫瘤(blood borne tumor)、頸動 脈阻塞性疾病、脈絡(luò)膜新血管形成、慢性炎癥、慢性視網(wǎng)膜剝離、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃體 炎、接觸鏡佩戴過度、角膜移植片排斥、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、克羅恩氏 病(Crohn' s disease)、伊爾斯病(Eales disease)、流行性角膜結(jié)膜炎、真菌性潰瘍、單純 皰疹感染、帶狀皰疹感染、高粘滯綜合征、卡波西氏肉瘤(Kaposi' ssarcoma)、白血病、脂 質(zhì)變性、萊姆氏病(Lyme' s disease)、邊緣角質(zhì)層分離(marginal keratolysis)、莫倫潰 瘍(Mooren ulcer)、除麻風(fēng)以外的分枝桿菌感染、近視、眼新血管疾病、視窩(optic pits)、 奧 _ 韋二氏綜合征(Osier-Weber syndrome)(奧斯勒-韋伯-朗迪(Osler-Weber-Rendu) 病)、骨關(guān)節(jié)炎、佩吉特氏病(Pagetsdisease)、扁平部睫狀體炎(pars planitis)、類天皰
      > phylectenulosis^sjjEi^^^Tfeip(post-laser complication) > J^^sjjiItl
      感染、彈性假黃色瘤、翼狀胬肉(Pterygium)、干燥性角膜炎、放射狀角膜切開術(shù)、視網(wǎng)膜新 血管形成、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生、類肉瘤/結(jié)節(jié)病(sarcoid)、鞏膜炎、鐮狀細(xì)胞貧血、斯耶格倫氏綜合征(Sogrens syndrome)、實體瘤、斯塔加特病(Stargarts disease)、約-斯病(Steven ‘ s Johnson disease)、上緣角膜炎(superior limbic keratitis)、梅毒、全身性狼瘡、特里昂氏邊緣變性(Terrien' smarginal degeneration)、 弓形蟲病、外傷、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)的腫瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤的腫瘤、骨肉瘤的腫瘤、 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的腫瘤、橫紋肌肉瘤的腫瘤、潰瘍性結(jié)腸炎、靜脈阻塞、維生素A缺乏和韋 格納結(jié)節(jié)病(Wegenerssarcoidosis)、與糖尿病有關(guān)的不良血管發(fā)生、寄生蟲病、異常傷口 愈合、外傷、損傷或手術(shù)后肥大、毛發(fā)生長抑制、排卵和黃體形成抑制、子宮中胚胎發(fā)育抑制 和植入抑制。抗血管發(fā)生療法可用于以下各項的一般治療移植物排斥、肺部炎癥、腎病綜合 征、先兆子癇、心包積液(諸如與心包炎有關(guān)的)和胸腔積液、特征為不良血管通透性或血 管滲漏的疾病和病癥,例如與腦瘤有關(guān)的水腫、與惡性腫瘤有關(guān)的腹水、梅格斯氏(Meigs) 綜合征、肺部炎癥、腎病綜合征、心包積液、胸腔積液、與心血管疾病有關(guān)的通透性,諸如心 肌梗死和中風(fēng)后的疾患,諸如此類。依照本發(fā)明的其它血管發(fā)生依賴性疾病包括血管纖維瘤(傾向于出血的異常血 管)、新生血管性青光眼(眼中的血管生長)、動靜脈畸形(動脈與靜脈之間的異常聯(lián)絡(luò))、 不連接的骨折(不會愈合的骨折)、動脈粥樣硬化斑塊(動脈的硬化)、膿性肉芽腫(由血 管構(gòu)成的常見皮膚損傷)、硬皮病(結(jié)締組織疾病的一種形式)、血管瘤(由血管構(gòu)成的腫 瘤)、沙眼(第三世界失明的第一位原因)、血友病性關(guān)節(jié)、血管粘連和肥厚性瘢痕(異常瘢 痕形成)?!爸委煛敝钢委熜蕴幚砗皖A(yù)防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括早就患 有病癥的受試者以及要預(yù)防病癥的受試者。術(shù)語“反復(fù)”、“復(fù)發(fā)”指癌癥或疾病在疾病消失的臨床評估后回復(fù)。遠(yuǎn)距轉(zhuǎn)移或局 部復(fù)發(fā)的診斷可以視為復(fù)發(fā)。術(shù)語“耐受性”、“抗性”或“不應(yīng)性”指癌癥或疾病對治療沒有響應(yīng)。術(shù)語“輔助療法”指在主要療法(通常是手術(shù))之后給予的治療。癌癥或疾病的 輔助療法可以包括免疫療法、化療、放療或激素療法。術(shù)語“維持療法”指為了幫助維持先前的治療效果而給予的有計劃的復(fù)治 (retreatment) 0常常為了幫助將癌癥保持在消退或延長對特定療法的響應(yīng)(不管疾病是 否進(jìn)展)而給予維持療法。術(shù)語“侵入性癌”指超過其起始的組織層而傳播進(jìn)入正常周圍組織的癌。侵入性 癌可以是或不是轉(zhuǎn)移性的。術(shù)語“非侵入性癌”指非常早期的癌或沒有向起源組織以外的組織傳播的癌。術(shù)語“無進(jìn)展存活(progression-free survival) ”在腫瘤學(xué)中指治療期間和之后 癌癥沒有生長的時間長度。無進(jìn)展存活包括患者經(jīng)歷完全響應(yīng)或部分響應(yīng)的時間量,以及 患者病情穩(wěn)定的時間量。術(shù)語“進(jìn)行性疾病(progressive disease) ”在腫瘤學(xué)中可以指自治療開始超過 20%的腫瘤生長-或是由于質(zhì)量的增加或是由于腫瘤的擴散。“病癥”指任何會受益于抗體治療的疾患。例如,患有或需要預(yù)防異常血管發(fā)生(過 度的、不當(dāng)?shù)幕蚴Э氐难馨l(fā)生)或異常血管通透性或滲漏的哺乳動物。這包括慢性和急
      13性病癥或疾病,包括那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥 的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤;非白血病和淋巴樣惡性腫瘤;神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星 細(xì)胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞、上皮、基質(zhì)和囊胚腔病癥;及炎性、血管發(fā)生性和免疫 學(xué)病癥。術(shù)語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動物中特征典型的為細(xì)胞生長不受調(diào)節(jié)的 生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌(癌瘤)、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病。此類 癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer, hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝肉瘤(h印atoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi) 膜癌、唾液腺癌、腎癌(kidney cancer, renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、頭 頸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗 癌)、鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)、前列腺癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞 瘤、泡膜細(xì)胞瘤(thecomas)、男性細(xì)胞瘤、肝瘤(h印atoma)、血液學(xué)惡性腫瘤(包括非何 杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)、多發(fā)性骨髓瘤和急性血液學(xué)惡性腫瘤)、子宮內(nèi)膜癌或 子宮癌、子宮內(nèi)膜異位癥、纖維肉瘤、絨毛膜癌、唾液腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、食管癌、肝癌 (h印aticcarcinoma)、肛門癌、陰莖癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、黑素瘤、皮 膚癌、許旺氏細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨源性肉瘤、平滑肌肉 瘤、尿道癌、甲狀腺癌、維爾姆斯(Wilm)氏腫瘤、以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非何 杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細(xì)胞性(SL) NHL、中級/濾泡性NHL、中級彌漫性NHL、高級成免 疫細(xì)胞性NHL、高級成淋巴細(xì)胞性NHL、高級小無核裂細(xì)胞性NHL、貯積病(bulky disease) NHL、套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、 慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、毛細(xì)胞性白血病、慢性成 髓細(xì)胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及梅格斯氏(Meigs)綜合征、和瘢痣 病(phakomatoses)有關(guān)的異常血管增殖?!澳[瘤”在用于本文時指所有贅生性細(xì)胞生長和增殖,無論是惡性的或者是良性 的,及所有癌前的和癌性的細(xì)胞和組織。術(shù)語“抗腫瘤組合物”或“抗腫瘤劑”指可用于治療癌癥的組合物,其包含至少一 種活性治療劑,例如“抗癌劑”。治療劑(抗癌劑)的例子包括但不限于例如化療劑、生長 抑制劑、細(xì)胞毒劑、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發(fā)生劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑、和其 它用于治療癌癥的藥劑諸如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗 劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑(例如erlotinib (Tarceva )、血小板衍 生生長因子抑制劑(例如Gleevec (Imatinib Mesylate) )、C0X-2抑制劑(例如塞來考昔 (celecoxib))、干擾素、細(xì)胞因子、能與 ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR- β、BAFF、BR3、APRIL、 BCMA或VEGF受體中的一種或多種靶物結(jié)合的拮抗劑(例如中和性抗體)、TRAIL/Apo2、及 其它生物活性和有機化學(xué)劑等。本發(fā)明還涵蓋它們的組合?!吧L抑制劑”在用于本文時指在體外和/或在體內(nèi)抑制細(xì)胞生長或增殖的 化合物或組合物。如此,生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的細(xì)胞百分比的藥劑。 生長抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑,諸如誘 導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春藥類(Vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、TAXOL 、和拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑諸如多 柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霄素(daunorubicin)、依托泊昔 (etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯,例如 DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、 雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿 啼唆(5-fluorouracil)禾口 ara_C。更多信息可參見 The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel 編,第 1 章,題 ^J "Ge 11 cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", Murakamiet al.,WB Saunders, Philadelphia(1995) ,jtMMM 13頁。術(shù)語“細(xì)胞毒劑”在用于本文時指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物 質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化療劑、和毒素諸如細(xì)菌、 真菌、植物或動物起源的酶活毒素或其片段?!盎焺敝缚捎糜谥委煱┌Y的化學(xué)化合物?;焺┑睦影捎糜谥委煱┌Y的 化學(xué)化合物。化療劑的例子包括烷化劑類(alkylating agents),諸如塞替派(thiotepa) 和CYTOXAN 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates), 諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶類 (aziridines),i者如苯佐替派(benzodepa)、卡波酉昆(carboquone)、美妥替派(meturedepa) 和烏瑞替派(ured印a);乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines), 包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝內(nèi)酯類(acetogenins)(尤其是布拉他 Φ (bullatacin)禾口 ^fJ ii (bullatacinone)) ; ^ W M (camptothecin) ( ^ ^ 成類似物托泊替康(topotecan));苔蘚抑素(bryostatin) ;callystatin ;CC_1065 (包 括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合 成類似物);隱藻素類(cryptophycinsM特別是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他 汀(dolastatin) ;duocarmycin (包括合成類似物,KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素 (eleutherobin) ;pancratistatin ;sarcodictyin ;海綿 ^^ 素(spongistatin);氣芥類 (nitrogen mustards),諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽 磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯 乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride) > 美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫 司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard);亞 硝脲類(nitrosoureas),諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、 福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)禾口雷莫司 汀(ranimustine);抗生素類,諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素 (calicheamicin),尤其是加利車霉素Y II和加利車霉素ω Il (參見例如Agnew,Chem. Intl. Ed. Engl. 33 183-186 (1994));蒽環(huán)類抗生素(dynemicin),包括 dynemicin A ;二膦 酸鹽類(bisphosphonates),諸如氯膦酸鹽(clodronate);埃斯波霉素(esperamicin); 以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、方文線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮 絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 C (cactinomycin)、carabicin、 洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、方文線 菌素 D (dactinomycin)、柔紅霄素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二 氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比 星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、 依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素 類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、 橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(ρ印lomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、 三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(str印tonigrin)、鏈 佐星(Sti^ptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁 (zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類,諸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5_氟 尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物,諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶羅 呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物,諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、 6_ 巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine);嘧啶 類似物,諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷(azauridine)、 卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿 苷(doxif luridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(f loxuridine);雄激素類,諸 如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇 (印itiostanol)、美雄烷(m印itiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺類,諸如氨魯 米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑,諸 如亞葉酸(folinic acid);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid);恩尿啼唆(eniluracil);安口丫 唆(amsacrine) ;bestrabucil ;比生群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);地磷酉先 月安(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone) ;elfornithine ; Hc 利醋銨(elliptinium acetate);埃坡霉素(印othilone);依托格魯(etoglucid);硝 酸鎵;羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(Ientinan);氯尼達(dá)明(Ionidamine);美登木素 生物喊類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)禾口安絲菌素(ansamitocin); 米it月瓜月宗(mitoguazone);米托惠酉昆(mitoxantrone);莫喊達(dá)酉享(mopidamol) ; 二月安 硝吖啶(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星 (pirarubicin);洛索惠酉昆(Iosoxantrone);鬼白酸(podophyllinic acid) ;2-乙基 酰胼(ethylhydrazide);丙卡巴胼(procarbazine) ;PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐口南(sizofiran);螺 方 錯(spirogermanium);細(xì)交鏈 包菌麗酸(tenuazonic acid);三亞月安酉昆(triaziquone); 2,2',2〃 -三氯三乙胺;單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素 (verrucarin)A、桿抱菌素(roridin)A 禾口蛇 亍菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長 春地辛(vindesine);達(dá)卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine) ;二溴甘露 酉享(mitobronitol) ;二漠衛(wèi)矛酉享(mitolactol);喊泊漠燒(pipobroman) ;gacytosine ;阿 糖胞苷(arabinoside) ( “Ara-C");環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);類紫杉醇類(taxoids),例如TAXOL 帕利他塞(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)、ABRAXANE 帕利他塞的不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋 白改造納米顆粒劑型(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) 禾口 TAXOTERE 多西他塞(doxetaxel) ( Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France); 苯丁 酸氮芥(chlorambucil) ; GEMZAR 吉西他濱(gemcitabine) ;6-硫鳥嘌呤 (thioguanine);巰基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);鉬類似物,諸如 順怕(cisplatin)禾口卡怕(carboplatin);長春喊(vinblastine);怕(platinum);依托 泊苷(etoposide) (VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長春 新堿(vincristine) ;NAVELBINE 長春瑞濱(vinorelbine);能滅瘤(novantrone); 替尼泊苷(teniposide);依達(dá)曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氨基蝶呤 (aminopterin);希羅達(dá)(xeloda);伊本膦酸鹽(ibandronate);伊立替康(irinotecan) (Camptosar, CPT-11)(包括伊立替康及5-FU和亞葉酸的治療方案);拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制 劑RFS 2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);類視黃酸類(retinoids),諸如視黃酸(retinoic acid);卡培他濱(capecitabine);考布他汀(combretastatin);亞葉酸(Ieucovorin) (LV);奧沙利鉬(oxaliplatin),包括奧沙利鉬治療方案(FOLFOX) ;PKC- α、Raf、H-Ras^P EGFR(例如erlotinibCTarceva ))的、降低細(xì)胞增殖的抑制劑;及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可 接受的鹽、酸或衍生物?;焺┻€包括作用為調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤作用的抗激素劑諸如抗雌激 素類和選擇性雌激素受體調(diào)控劑類(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括 NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、 4_羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LYl 17018、奧 那司酮(onapristone)和FARESTON 托瑞米芬(toremifene);抑制在腎上 腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑,諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特 (aminoglutethimide)、MEGASE 醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RJVISOR 伏羅唑(vorozole)、FEMARA 來曲唑(letrozole)和 ARIMIDEX 阿那曲唑 (anastrozole);抗雄激素類,諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡 米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他濱 (troxacitabine) (1,3_ 二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物);反義寡核苷酸,特別是抑制牽涉 異常(abherant)細(xì)胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸,諸如例如PKC-α、 Raf和H-Ras ;核酶,諸如VEGF表達(dá)抑制劑(例如ANGIOZΥΜΕ 核酸)和HER2表達(dá) 抑制劑;疫苗,諸如基因療法疫苗,例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗 和VAXID 疫苗;PROLEUKIN rlL-2 ; LURTOTECAN 拓?fù)洚悩?gòu)酶 1 抑制劑; ABARELIX rmRH;長春瑞濱(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(見美國專 利No. 4,675,187);及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。術(shù)語“前體藥物”在用于本申請時指與母藥(parent drug)相比對患病細(xì)胞 的細(xì)胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降乃幱没钚晕镔|(zhì)(例如小 分子)的前體或衍生物形式。參見例如WiIman,“Prodrugs in CancerChemotherapy”, Biochemical Society Transactions,14, pp. 375—382,615thMeeting Belfast (1986)禾口
      17Stella等,"Prodrugs :A Chemical Approach to TargetedDrug DeIivery",Directed Drug Delivery, Borchardt 等,編,pp. 247-267,HumanaPress (1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但 不限于含磷酸鹽/酯前體藥物、含硫代磷酸鹽/酯前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽 前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含內(nèi)酰胺前體藥物、含任選取代 苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉(zhuǎn)化為更具活性而無細(xì)胞 毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物??裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形 式的細(xì)胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑?!胺蛛x的”,在用于描述本文中所公開的各種多肽時,意指已經(jīng)鑒定且與/自表達(dá)它 的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物分開和/或回收的多肽。多肽的天然環(huán)境的污染性成分指通常會干擾 其診斷或治療用途的物質(zhì),可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在 優(yōu)選的實施方案中,將多肽純化至(1)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的 N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度,或(2)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色的非還原性或還 原性條件下的SDS-PAGE,達(dá)到同質(zhì)。既然多肽的天然環(huán)境的至少一種成分不會存在,那么分 離的多肽包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽。然而,分離的多肽通常通過至少一個純化步驟來制 備?!胺蛛x的”多肽編碼核酸或其它多肽編碼核酸指已經(jīng)鑒定且與多肽編碼核酸的天 然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的多肽編碼核酸 分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背景。分離的多肽編碼核酸分子因此與存在于天 然細(xì)胞中時的特定多肽編碼核酸分子有區(qū)別。然而,分離的多肽編碼核酸分子包括通常表 達(dá)該多肽的細(xì)胞中所包含的多肽編碼核酸分子,例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色 體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時。術(shù)語“控制序列”指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA 序列。例如,適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位 點。已知真核細(xì)胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中,則它是“可操作連接的”。 例如,若前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)(secretory leader)的DNA表達(dá)成參與多肽分 泌的前蛋白質(zhì)(preprotein),則它與該多肽的DNA可操作連接;若啟動子或增強子影響編 碼序列的轉(zhuǎn)錄,則它與該序列可操作連接;或者,若核糖體結(jié)合位點的位置促進(jìn)翻譯,則它 與編碼序列可操作連接。一般而言,“可操作連接的”意味著相連的DNA序列是相鄰的,而且 在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而,增強子不必相鄰。連接可以通過 在方便的限制性位點處的連接來實現(xiàn)。若沒有此類位點,則依照常規(guī)實踐使用合成的寡核 苷酸銜接頭或接頭。如本文中所定義的,“嚴(yán)格條件”或“高嚴(yán)格條件”可以定義如下(1)對于洗滌使用 低離子強度和高溫,例如0. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 1 %十二烷基硫酸鈉,50°C ; (2)在雜交期間使用變性劑,諸如甲酰胺,例如,50% (ν/ν)甲酰胺及0.1%牛血清清蛋白 /0. Ficol 1/0. 聚乙烯吡咯烷酮/具有750mM氯化鈉,75mM檸檬酸鈉的50mM磷酸鈉 緩沖液PH 6. 5,42°C,或(3)在使用50%甲酰胺,5x SSC(0. 75M NaCl,0. 075M檸檬酸鈉), 50mM磷酸鈉(pH6. 8),0. 焦磷酸鈉,5x Denhardt氏溶液,超聲處理的鮭精DNA (50 μ g/ ml),0. 1% SDS和10%硫酸右旋糖苷的溶液中于42°C雜交過夜,于42°C在0. 2x SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中洗滌10分鐘,接著是于55°C由含有EDTAWO. Ix SSC組成的10分鐘高 嚴(yán)格洗滌。本文所述氨基酸序列是連續(xù)的氨基酸序列,除非另有說明。在用于本文時,術(shù)語“免疫粘附素”指將異源蛋白質(zhì)(“粘附素”)的結(jié)合特異性 與免疫球蛋白恒定域的效應(yīng)器功能聯(lián)合起來的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上,免疫粘附素包括具 有不同于抗體抗原識別和結(jié)合位點(即是“異源”的)的期望結(jié)合特異性的氨基酸序列和 免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受體或 配體(諸如VEGFR或纖連蛋白配體)的結(jié)合位點的連續(xù)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫 球蛋白恒定域序列可以從任何免疫球蛋白獲得,諸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG_4亞型、 IgA(包括IgA-I和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。常常包含衍生自特異性結(jié)合靶物的序列的噬 菌體展示選擇的序列且其融合至免疫球蛋白Fc部分的肽體(ρ印tibody)可以視為本文中 的免疫粘附素。術(shù)語“抗體”以最廣義使用,明確覆蓋例如單克隆抗體(包括激動性、拮抗性和中 和性抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物、多克隆抗體、單鏈抗體、及抗體片段(見下 文),只要它們特異性結(jié)合天然多肽和/或展現(xiàn)出本發(fā)明的生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性。依照 一個實施方案,抗體結(jié)合寡聚體形式的靶蛋白,例如三聚體形式。依照另一個實施方案,抗 體特異性結(jié)合蛋白質(zhì),該結(jié)合可受到本發(fā)明單克隆抗體(例如本發(fā)明保藏的抗體等)的抑 制。短語抗體的“功能性片段或類似物”指與所指抗體具有共同的定性生物學(xué)活性的化合 物。例如,本發(fā)明抗體的功能性片段或類似物可以是能特異性結(jié)合VEGF或α5β1的功能 性片段或類似物。在一個實施方案中,所述抗體能阻止或?qū)嵸|(zhì)性降低VEGF誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的 能力?!胺蛛x的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其 天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì),可包括酶、激素、和其 它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中,將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry 法的測定,抗體重量超過95%,最優(yōu)選重量超過99%,(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得 至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度,或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下 的SDS-PAGE及使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染色,達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成 分不會存在,那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而,分離的抗體通常將通過至 少一個純化步驟來制備。基本的4鏈抗體單元是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的異四 聚體糖蛋白(IgM抗體由5個基本的異四聚體單元及稱作J鏈的另外多肽組成,因此包含 10個抗原結(jié)合位點;而分泌型IgA抗體可聚合而形成包含2-5個基本的4鏈單元及J鏈的 多價裝配物)。在IgG的情況中,4鏈單元通常是約150,000道爾頓。每條輕鏈通過一個共 價二硫鍵與重鏈相連,而兩條重鏈通過一個或多個二硫鍵彼此相連,二硫鍵的數(shù)目取決于 重鏈的同種型。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在N-末端具有 一個可變域(Vh),接著是三個(對于α和Y鏈)或四個(對于μ和ε同種型)恒定域 (Ch)。每條輕鏈在N-末端具有一個可變域(VJ,接著是其另一端的一個恒定域(CJ。\與 Vh排列在一起,而Q與重鏈第一恒定域(ChI)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈 和重鏈可變區(qū)之間形成界面。一個Vh和一個\ 一起配對而形成一個抗原結(jié)合位點。關(guān)于不同類別抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),參見例如《Basicand Clinical Immunology》,第8版,Daniel P. Stites, Abba I. Terr 禾口 Tristram G. Parslow(編),Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994,第71頁和第6章。根據(jù)其恒定域氨基酸序列,來自任何脊椎動物物種的L鏈可歸入兩種截然不同類 型中的一種,稱作卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)。根據(jù)其重鏈恒定域(Ch)氨基酸序列,免疫球蛋 白可歸入不同的類別或同種型。有五類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,分別具有稱 作α、δ、ε、Υ和μ的重鏈。根據(jù)Ch序列和功能的較小差異,、和α類可進(jìn)一步分為 亞類,例如人類表達(dá)下列亞類=IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。術(shù)語“可變的”指可變域中的某些區(qū)段在抗體間序列差異廣泛的實情。V結(jié)構(gòu)域介 導(dǎo)抗原結(jié)合并限定特定抗體對其特定抗原的特異性。然而,變異性并非均勻分布于可變域 跨越的Iio個氨基酸。事實上,V區(qū)由15-30個氨基酸、稱作框架區(qū)(FR)的相對不變異的 區(qū)段及將框架區(qū)分開的每個長度為9-12個氨基酸、稱作“高變區(qū)”的極度變異的較短區(qū)域 組成。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR,它們大多采取β-折疊片構(gòu)象,通過形 成環(huán)狀連接且在有些情況中形成β-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個高變區(qū)連接。每條鏈中的高 變區(qū)通過FR非常接近的保持在一起,并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位 點的形成(參見 Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunologicallnterest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD (1991))。 ’g 定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合,但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能,諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì) 胞毒性(ADCC)中抗體的參與。術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)一般包 含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如\中的殘基24-34 (Li)、50-56 (L2)和 89-97 (L3)附近及%中的殘基31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102 (H3)附近(在一個實施方 案中,Hl在殘基31-35附近);Kabat etal.,見上文)和/或那些來自“高變環(huán)”的殘基(例 如 Vl 中的殘基 26-32 (Li)、50-52 (L2)和 91-96 (L3)及 Vh 中的殘基 26-32 (Hl) ,53-55 (H2) 和 96-101 (H3) ;Chothia and Lesk,J. Mol. Biol. 196 :901_917 (1987))。本發(fā)明中的 HVR 區(qū) 包括下述位置輕鏈可變域的24-36 (LHVRl)、46_56 (LHVR2)、和89-97 (LHVR3)及重鏈可變 域的 26-35 (HHVRl)、47-65(HHVR2)和 93-102 (HHVR3) (Kabat 編號系統(tǒng),Kabat et al.,見上 文 1991)。貫穿本說明書和權(quán)利要求書,Kabat編號系統(tǒng)一般在提及可變域中的殘基(大約 是輕鏈殘基1-107和重鏈殘基1-113)時使用(例如Kabat等,見上文(1991))?!癊U編號 系統(tǒng)”或“EU指數(shù)”一般在提及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時使用(例如Kabat等,見 上文(1991)中報道的EU指數(shù),明確收入本文作為參考)。除非本文中另有說明,提及抗體 可變域中的殘基編號指根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的殘基編號方式。除非本文中另有說明,提及 抗體恒定域中的殘基編號指根據(jù)EU編號系統(tǒng)的殘基編號方式。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體,即構(gòu)成 群體的各抗體個體是相同的,除了可以以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。單克 隆抗體是高度特異性的,針對單一抗原性位點。此外,與包含針對不同決定簇(表位)的不 同抗體的多克隆抗體制備物不同,每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特 異性之外,單克隆抗體的優(yōu)勢在于它們可以在未受到其它抗體污染的情況中合成。修飾語
      20“單克隆”不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如,可用于本發(fā)明的單克隆抗 體可通過最初由Kohler等Nature 256 =495(1975)記載的雜交瘤方法來制備,或者可通過 重組DNA方法在細(xì)菌、真核動物或植物細(xì)胞中制備(參見例如美國專利No. 4,816,567)?!皢?克隆抗體”還可使用 Clackson 等 Nature352 :624_628 (1991) ;Marks 等 J. Mol. Biol. 222 581-597(1991)中記載的技術(shù)或使用下文實施例中列出的方法從噬菌體抗體庫分離。單克隆抗體在本文中包括“嵌合”抗體,其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特 定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源,而鏈的剩余部分與衍 生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源,以及此類抗體 的片段,只要它們展現(xiàn)出本發(fā)明的生物學(xué)活性(參見美國專利No. 4,816,567 ;Morrison et al.,PNAS USA 81 :6851_6855 (1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長 類動物(例如舊大陸猴類(Old World Monkey)、猿等)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū) 序列的“靈長類化”抗體?!巴暾贵w”指包含抗原結(jié)合位點以及Q和至少重鏈恒定域CH1、Ch2和Ch3的抗 體。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選 的是,完整抗體具有一項或多項效應(yīng)器功能?!翱贵w片段”包含完整抗體的一部分,優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)???體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段;雙抗體;線性抗體(參見美國專利 No. 5,641,870,實施例 2 ;Zapata et al. , Protein Eng. 8(10) 1057-1062 (1995));單鏈抗 體分子;及由抗體片段形成的多特異性抗體。表述“線性抗體”一般指 Zapata et al.,Protein Eng, 8 (10) 1057-1062 (1995) 中所描述的抗體。簡言之,這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1),該區(qū)段與互 補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的,或者是單特異性的。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段,稱作“Fab”片段,和一個殘 余“Fe”片段,其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。Fab片段由一條完整輕鏈及一條重鏈的可 變域(Vh)和第一恒定域(ChI)組成。每個Fab片段對于抗原結(jié)合是單價的,即它具有一個 抗原結(jié)合位點。胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生一個較大F(ab' )2片段,它粗略相當(dāng)于兩個通過二 硫鍵相連的Fab片段,具有二價抗原結(jié)合活性且仍能夠交聯(lián)抗原。Fab’片段因在ChI結(jié)構(gòu) 域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與Fab片段有所不同,包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個 半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab’的稱謂。 F(ab' )2抗體片段最初是作為成對Fab’片段生成的,在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。 還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)形式。Fc片段包含通過二硫鍵保持在一起的兩條重鏈的羧基末端部分??贵w的效應(yīng)器功 能是由Fc區(qū)中的序列決定的,該區(qū)還是受到在某些類型細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體(FcR)識別 的部分。變異Fc區(qū)”包含由于至少一處本文所定義的“氨基酸修飾”而與天然序列Fc區(qū)有 所不同的氨基酸序列。優(yōu)選的是,變異Fc區(qū)具有與天然序列Fc區(qū)或與親本多肽的Fc區(qū)相 比至少一處氨基酸替代,例如在天然序列Fc區(qū)中或在親本多肽的Fc區(qū)中具有約1處至約 10處氨基酸替代,優(yōu)選約1處至約5處氨基酸替代。在一個實施方案中,變異Fc區(qū)在本文 中將與天然序列Fc區(qū)擁有至少約80 %的同源性,至少約85 %的同源性,至少約90 %的同源性,至少約95%的同源性或至少約99%的同源性。根據(jù)另一個實施方案,變異Fc區(qū)在本文 中將與親本多肽的Fc區(qū)擁有至少約80 %的同源性,至少約85 %的同源性,至少約90 %的同 源性,至少約95%的同源性或至少約99%的同源性。術(shù)語“含F(xiàn)c區(qū)多肽”指包含F(xiàn)c區(qū)的多肽,諸如抗體或免疫粘附素(見下文定義)。 Fc區(qū)的C-末端賴氨酸(依照EU編號系統(tǒng)的殘基447)可以消除,例如在純化多肽的過程中 或者通過重組改造編碼多肽的核酸。因此,依照本發(fā)明包含具有Fc區(qū)的多肽(包括抗體) 的組合物可包含所有K447殘基都被消除的多肽群體、無一 K447殘基被消除的多肽群體、或 具有K447殘基的多肽與沒有K447殘基的多肽的混合物?!癋v”是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。此片段由緊密、非共價結(jié) 合的一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。從這兩個結(jié)構(gòu)域的折疊中散發(fā)出六 個高變環(huán)(重鏈和輕鏈各3個環(huán)),貢獻(xiàn)出抗原結(jié)合的氨基酸殘基并賦予抗體以抗原結(jié)合特 異性。然而,即使是單個可變域(或只包含對抗原特異的三個CDR的半個Fv)也具有識別 和結(jié)合抗原的能力,盡管親和力低于完整結(jié)合位點。“單鏈Fv”,也可縮寫為“sFv”或“scFv”,是包含連接成一條多肽鏈的抗體Vh和\ 結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選的是,sFv多肽在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭,使得sFv 形成抗原結(jié)合期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述參見Pluckthun,于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》,vol. 113, Rosenburg 禾口 Moore 編,Springer-Verlag, New York, pp. 269-315,1994 ;Borrebaeck 1995,見下文。術(shù)語“雙抗體”指通過在Vh和八結(jié)構(gòu)域之間使用短接頭(約5-10個殘基)構(gòu)建sFv 片段(見上一段)而制備的小型抗體片段,由于接頭短,使得V結(jié)構(gòu)域?qū)嵭墟滈g而非鏈內(nèi)配 對,導(dǎo)致二價片段,即具有兩個抗原結(jié)合位點的片段。雙特異性雙抗體是兩個“交叉”sFv片 段的異二聚體,其中兩種抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域存在于不同多肽鏈上。雙抗體更完整的描述 于例如 EP 404,097 ;W093/11161 ;Hollinger et al.,PNAS USA, 90 :6444_6448 (1993)。非人(例如嚙齒類)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗體的序 列的嵌合抗體。在極大程度上,人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基 用具有期望抗體特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人 靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中,將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘 基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外,人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的 殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常,人源化抗體包含至少一個、通 常兩個基本上整個如下可變域,其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高 變環(huán),且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還包含至少部 分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe),通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jones et al., Nature 321:522-525(1986) ;Riechmann etal. , Nature 332:323-329(1988) ;Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)?!拔锓N依賴性抗體”指對來自第一哺乳動物物種的抗原具有強于該抗原來自第二 哺乳動物物種的同系物的結(jié)合親和力的抗體。通常,物種依賴性抗體“特異性結(jié)合”人類抗 原(即具有不超過約1χ10_7Μ,不超過約1χ10_8Μ,或不超過約1x10_9M的結(jié)合親和力(Kd)), 但是對該抗原來自第二非人哺乳動物物種的同系物具有比其對人類抗原的結(jié)合親和力弱 至少約50倍,或至少約500倍,或至少約1000倍的結(jié)合親和力。物種依賴性抗體可以是上文定義的各種類型抗體,但是優(yōu)選人源化抗體或人抗體。在此類實施方案中,根據(jù)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)的 測定,多肽、抗體、拮抗劑或組合物結(jié)合“非靶物”蛋白質(zhì)的程度將小于該多肽、抗體、拮抗劑 或組合物對其特定靶物蛋白質(zhì)的結(jié)合的約10%。對于多肽、抗體、拮抗劑或組合物對靶分 子的結(jié)合,術(shù)語“特異結(jié)合”或“特異性結(jié)合”特定多肽或特定多肽靶物上的表位或?qū)ζ洹疤?異”意味著可測量的不同于非特異相互作用的結(jié)合。特異結(jié)合可通過例如測定分子的結(jié)合 并與對照分子的結(jié)合比較來測量,所述對照分子通常是結(jié)構(gòu)相似但沒有結(jié)合活性的分子。 例如,特異結(jié)合可通過與對照分子的競爭來測定,所述對照分子與靶物相似,例如過量的未 標(biāo)記靶物。在這種情況中,若經(jīng)標(biāo)記靶物與探針的結(jié)合受到過量未標(biāo)記靶物的競爭性抑制, 則指示特異結(jié)合。術(shù)語“特異結(jié)合”或“特異性結(jié)合”特定多肽或特定多肽靶物上的表位或 對其“特異”在用于本文時可由例如對靶物的Kd為至少約10_4M,至少約10_5M,至少約10_6M, 至少約10_7M,至少約10_8M,至少約10_9M,至少約ΙΟ,Μ,至少約10_"Μ,至少約10_12Μ,或更大 的分子展現(xiàn)。在一個實施方案中,術(shù)語“特異結(jié)合”指這樣的結(jié)合,其中分子結(jié)合特定多肽 或特定多肽上的表位,而基本上不結(jié)合任何其它多肽或多肽表位。抗體“效應(yīng)器功能”指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體 Fc區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合和補 體依賴性細(xì)胞毒性;Fc受體結(jié)合;抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用;細(xì) 胞表面受體下調(diào);和B細(xì)胞活化。“天然序列Fc區(qū)”包含與自然界中找到的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。 Fc序列的例子記載于例如但不限于Kabat等,見上文(1991)。關(guān)于本文中所鑒定的多肽和抗體序列的“百分比(% )氨基酸序列同一性”或“同 源性”定義為對比序列且將任何保守替代視為序列同一性的一部分時,候選序列中與所比 較多肽中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的 的對比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行,例如使用公眾可得到的計算機軟件,諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于測量對比 的適宜參數(shù),包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而,為了本發(fā)明的目 的,%氨基酸序列同一性值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比 較計算機程序由Genentech公司編寫,而且源代碼已經(jīng)連同用戶文檔一起提交給美國版權(quán) 局(US Copyright Office, Washington D. C.,20559),并以美國版權(quán)注冊號 TXU510087 注 冊。公眾可通過 Genentech 公司(South San Francisco, California)得到 ALIGN-2 程序。 ALIGN2程序應(yīng)當(dāng)編譯成在UNIX操作系統(tǒng),優(yōu)選數(shù)碼UNIX V4. OD上使用。所有序列比較參 數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變。術(shù)語“Fe受體”或“FcR”用于描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。在一個實施方案中, 本發(fā)明的FcR指結(jié)合IgG抗體的FcR(y受體),包括FcyRI、FcyRII和Fc γ RIII亞類 的受體,包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FCY RIIA( “活 化受體”)和FcyRIIB( “抑制受體”),它們具有相似的氨基酸序列,區(qū)別主要在于其胞 質(zhì)結(jié)構(gòu)域?;罨荏wFc γ RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基 序(ITAM)。抑制受體Fc γ RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基 序(ITIM)(參見綜述DaSron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203_234(1997))。該術(shù)語包括同種異型(allotype),諸如 Fc y RIIIa 同種異型:Fc γ RIIIA_Phel58、Fc y RIIIA-Vall58, Fc YRIIA-R131 和 / 或 Fc YRIIA-H131。FcR 的綜述參見 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 457-492(1991) ;Capel et al. , Immunomethods 4:25-34(1994) ;de Haas et al.,J. Lab. Clin. Med. 126 :330_41 (1995)。術(shù)語“FcR”在本文中涵蓋其它FcR,包括那些未 來將會鑒定的。該術(shù)語還包括新生兒受體,F(xiàn)cRn,它負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer et al.,J. Immunol. 117 587(1976) ;Kim et al.,J. Immunol. 24 :249(1994))。術(shù)語“FcRn”指新生兒Fc受體(FcRn)。FcRn在結(jié)構(gòu)上與主要組織相容性復(fù)合物 (MHC)相似,由非共價結(jié)合的α-鏈和β 2-微球蛋白組成。新生兒Fc受體FcRn的多種功 能的綜述見 Ghetie and Ward(2000) Annu. Rev. Immunol. 18,739-766。FcRn 在免疫球蛋白 IgG自母體被動投遞至幼仔和調(diào)節(jié)血清IgG水平中發(fā)揮作用。FcRn可起到補救受體的作 用,即在細(xì)胞中和穿越細(xì)胞結(jié)合和轉(zhuǎn)運完整形式的被胞飲IgG,并挽救它們免于默認(rèn)的降解 途徑。WO 00/42072 (Presta)和 Shields et al. , J. Biol. Chem. 9 (2) :6591_6604 (2001) 記載了對FcR的結(jié)合得到改良或消除的抗體變體。將這些出版物的內(nèi)容明確收入本文作為參考。人IgG Fc區(qū)的“CH1結(jié)構(gòu)域”(也稱為“Cl”或“HI”結(jié)構(gòu)域)通常自大約氨基酸 118延伸至大約氨基酸215 (EU編號系統(tǒng))?!般q鏈區(qū)”通常定義為自人IgGl的Glu216至Pro230的區(qū)段(Burton,Molec. Immunol. 22 161-206 (1985))。其它IgG同種型的鉸鏈區(qū)可以通過將第一個和最后一個形 成重鏈間S-S鍵的半胱氨酸殘基置于相同位置而與IgGl序列對比。Fc區(qū)的“較低位置處鉸鏈區(qū)(lower hinge region) ”通常定義為緊挨著鉸鏈區(qū) C-末端的一段殘基,即Fc區(qū)的殘基233-239。在先前的報告中,F(xiàn)cR結(jié)合一般歸功于IgG Fc區(qū)的較低位置處鉸鏈區(qū)中氨基酸殘基。人IgG Fc區(qū)的“CH2結(jié)構(gòu)域”(也稱為“C2”或“H2”結(jié)構(gòu)域)通常自大約氨基酸 231延伸至大約氨基酸340。CH2結(jié)構(gòu)域的獨特之處在于它沒有與另一結(jié)構(gòu)域緊密配對。而 是,有兩個N-連接的分支的碳水化合物鏈介于完整天然IgG分子的兩個CH2結(jié)構(gòu)域之間。 推測碳水化合物可能提供結(jié)構(gòu)域_結(jié)構(gòu)域配對的替代且有助于穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域。Burton, Molec. Immunol. 22 161-206(1985)。"CH3結(jié)構(gòu)域”(也稱為“C3”或“H3”結(jié)構(gòu)域)包含F(xiàn)c區(qū)中CH2結(jié)構(gòu)域C-末端的 一段殘基(即自抗體序列的大約氨基酸殘基341至C末端,通常是IgG的氨基酸殘基446 或 447)?!肮δ苄訤c區(qū)”擁有天然序列Fc區(qū)的“效應(yīng)器功能”。例示性的“效應(yīng)器功能”包 括Clq結(jié)合、補體依賴性細(xì)胞毒性、Fc受體結(jié)合、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、 吞噬作用、細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體;BCR)下調(diào)等。此類效應(yīng)器功能一般要求Fc區(qū) 與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變域)聯(lián)合,而且可使用多種測定法來評估,例如本文中所公開 的?!癈lq”指包含供免疫球蛋白Fc區(qū)結(jié)合的位點的多肽。Clq與兩種絲氨酸蛋白酶即 Clr和Cls —起形成復(fù)合物Cl,即補體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)途徑的第一組分。人Clq可 購自例如 Quidel,San Diego, CA。
      術(shù)語“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指多肽中能結(jié)合另一分子的區(qū)域。在FcR的情況中,結(jié)合結(jié)構(gòu) 域可以包含其多肽鏈(例如其α鏈)中負(fù)責(zé)Fc區(qū)結(jié)合的部分。一種有用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是 FcRa鏈的胞外結(jié)構(gòu)域。具有FcR結(jié)合親和力或ADCC活性“改變”了的變異IgG Fc的抗體或肽體指與親 本多肽或者與包含天然序列Fc區(qū)的多肽相比FcR結(jié)合活性(例如Fc γ R或FcRn)和/或 ADCC活性得到增強或減弱的抗體或肽體。“展現(xiàn)出對FcR的結(jié)合增加”的變異Fc以高于親 本多肽或天然序列IgG Fc的親和力(例如更低的表觀Kd或IC50值)結(jié)合至少一種FcR。 依照一些實施方案,與親本多肽相比結(jié)合的增強是約3倍,優(yōu)選約5倍、10倍、25倍、50倍、 60倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、或500倍,或結(jié)合改進(jìn) 約25%到1000%?!罢宫F(xiàn)出對FcR的結(jié)合減少”的多肽變體以低于親本多肽的親和力(例 如更高的表觀Kd或更高的IC50值)結(jié)合至少一種FcR。與親本多肽相比結(jié)合減弱約5%、 10%、20%、30%、40%、50%、或 60%、或更多?!翱贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或“ADCC”指其中結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞 (例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌 型Ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞,隨后用細(xì)胞毒素殺 死靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性形式。該抗體“武裝”(arm)細(xì)胞毒性細(xì)胞,而且是此類殺傷作用絕 對要求的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞,即NK細(xì)胞,只表達(dá)Fc γ RIII,而單核細(xì)胞表達(dá)Fc γ RI、 Fc YRII 禾口 Fc yRIII。 Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 457-92 (1991)第 464 頁 表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評估感興趣分子的ADCC活性,可進(jìn)行體外ADCC測 定法,諸如美國專利No. 5,500, 362或5,821,337或下文實施例中所記載的??捎糜诖祟悳y 定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?;蛘?另外,可在 體內(nèi)評估感興趣分子的ADCC活性,例如在動物模型中,諸如Clynes et al.,PNAS (USA) 95 652-656(1998)中所披露的。包含“展現(xiàn)出增強的ADCC”或在存在人效應(yīng)細(xì)胞時比具有野生型IgG Fc的多肽或 親本多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的變異Fc區(qū)的多肽指在具 有變異Fc區(qū)的多肽和具有野生型Fc區(qū)的多肽(或親本多肽)在測定中的量基本上相同時 在體外或在體內(nèi)顯著更有效地介導(dǎo)ADCC的多肽。一般而言,此類變體使用本文中所披露的 體外ADCC測定法來鑒定,但是涵蓋用于測定ADCC活性的其它測定法或方法,例如在動物模 型中。在一個實施方案中,優(yōu)選的變體在介導(dǎo)ADCC方面比野生型Fc (或親本多肽)更加有 效,約5倍到約100倍,例如約25倍到約50倍。“補體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”指存在補體時對靶細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補體途徑 的激活是由補體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原所結(jié)合的抗體(適宜亞類的)起始 的。為了評估補體激活,可進(jìn)行CDC測定法,例如如Gazzano-Santoro et al.,J. Immunol. Methods 202 =163(1996)中所記載的。具有改變的Fc區(qū)氨基酸序列和增強的或減弱的Clq結(jié)合能力的多肽記載于美國 專利No. 6,194,551和WO 99/51642。將這些專利出版物的內(nèi)容明確收入本文作為參考。還 可參見 Idusogie et al.,J. Immunol. 164 :4178_4184 (2000)。“人效應(yīng)細(xì)胞”指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。依照一個實施 方案,該細(xì)胞至少表達(dá)Fc γ RIII并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì) 胞,優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來源分離,例如如本文所述從血液或PBMC 分離。用于測量FcRn結(jié)合的方法是已知的(參見例如Ghetie 1997,Hinton 2004), M 且記載于下文實施例。人FcRn高親和力結(jié)合多肽對人FcRn的體內(nèi)結(jié)合和血清半衰期可以 在例如表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)染人細(xì)胞系中,或者在施用了 Fc變異多肽的靈長類 動物中測定。在一個實施方案中,具體而言,具有變異IgG Fc的本發(fā)明抗α5β1抗體展現(xiàn) 出比具有野生型IgG Fc的多肽升高的結(jié)合親和力,升高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至 少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少100倍、至少125倍、至少150倍。在一個 具體的實施方案中,對人FcRn的結(jié)合親和力提高了約170倍。關(guān)于對FcRn的結(jié)合親和力,在一個實施方案中,所述多肽的EC50或表觀Kd(在 ΡΗ6.0)小于luM,更優(yōu)選小于或等于ΙΟΟηΜ,更優(yōu)選小于或等于ΙΟηΜ。在一個實施方案中, 關(guān)于升高的對Fc γ RIII (F158 ;即低親和力同種型)的結(jié)合親和力,EC50或表觀Kd小于或 等于ΙΟηΜ,而對Fc y RIII (V158 ;高親和力同種型),EC50或表觀Kd小于或等于3nM。依 照另一個實施方案,若測試抗體和對照抗體結(jié)合曲線在中點處的吸光度數(shù)值的比例(例如 Α45ο (α#)/Α45ο ( #))小于或等于40%,則抗體對Fc受體的結(jié)合相對于對照抗體(例如 Herceptin 抗體)的降低可以認(rèn)為是相對于對照抗體是顯著的。依照另一個實施方案, 若測試抗體和對照抗體結(jié)合曲線在中點處的吸光度數(shù)值的比例(例如A45(lmi(a#)/A45(lnmWMtt 體))大于或等于125%,則抗體對Fc受體的結(jié)合相對于對照抗體(例如Herceptin 抗體) 的升高可以認(rèn)為是相對于對照抗體顯著的?!坝H本多肽”或“親本抗體”指包含產(chǎn)生變異多肽或抗體的氨基酸序列且所述變 異多肽或抗體與之進(jìn)行比較的多肽或抗體。典型的是,親本多肽或親本抗體缺少一處或多 處本文中所公開的Fc區(qū)修飾且與本文中所公開的多肽變體相比在效應(yīng)器功能方面有所不 同。親本多肽可以包含天然序列Fc區(qū)或具有預(yù)先存在氨基酸序列修飾(諸如添加、刪除和 /或替代)的Fc區(qū)。本發(fā)明的抗體可以衍生自噬菌體展示。在用于本文時,“文庫”或“庫”指眾多抗體 或抗體片段序列,或者編碼這些序列的核酸,這些序列在根據(jù)本發(fā)明方法導(dǎo)入這些序列的 變異氨基酸組合方面是不同的?!笆删w展示”是一種將變異多肽作為與外殼蛋白至少一部分的融合蛋白展示在 噬菌體(例如絲狀噬菌體)顆粒表面上的技術(shù)。噬菌體展示的效用在于能夠?qū)﹄S機化蛋 白質(zhì)變體的大型文庫快速且高效分選那些能以高親和力與靶抗原結(jié)合的序列的實情。肽 和蛋白質(zhì)文庫在噬菌體上的展示已經(jīng)用于對數(shù)以百萬計的多肽篩選那些具有特異性結(jié)合 特性的多肽。多價噬菌體展示法已經(jīng)用于展示小隨機肽和小蛋白,其通過與絲狀噬菌體 的基因 III 或基因 VIII 融合來實現(xiàn)。Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 355-362(1992),及其中引用的參考文獻(xiàn)。在單價噬菌體展示中,將蛋白質(zhì)或肽文庫與基因 III或其一部分融合,并在存在野生型基因III蛋白時以低水平表達(dá),使得噬菌體顆粒展示 一個拷貝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。親合效應(yīng)(avidity effect)相對于多價噬菌體 得到了降低,使得分選基于內(nèi)在的配體親和力,而且使用噬菌粒載體,這簡化了 DNA操作。 Lowman and WellsiMethods :A companion toMethods in Enzymology 3:205-0216(1991)。
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      “噬菌粒”是具有細(xì)菌復(fù)制起點(例如ColEl)和噬菌體基因區(qū)間拷貝的質(zhì)粒載體。 噬菌??衫萌魏我阎删w,包括絲狀噬菌體和λ類噬菌體。質(zhì)粒一般也包含抗生素抗 性的可選擇標(biāo)志物??寺∪脒@些載體的DNA區(qū)段可以像質(zhì)粒一樣擴增。在給容納這些載體 的細(xì)胞提供生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時,質(zhì)粒的復(fù)制模式變成滾環(huán)復(fù)制,以生成 質(zhì)粒DNA的一條鏈的拷貝,并包裝噬菌體顆粒。噬菌??尚纬筛腥拘曰蚍歉腥拘允删w顆 粒。此術(shù)語包括這樣的噬菌粒,它們包含與異源多肽基因連接成基因融合物的噬菌體外殼 蛋白基因或其片段,使得異源多肽展示在噬菌體顆粒的表面上。術(shù)語“噬菌體載體”指包含異源基因且能夠復(fù)制的雙鏈復(fù)制型噬菌體。噬菌體載 體具有容許噬菌體復(fù)制和噬菌體顆粒形成的噬菌體復(fù)制起點。噬菌體優(yōu)選是絲狀噬菌體, 諸如M13、fl、fd、Pf3噬菌體或其衍生物,或者是λ類噬菌體,諸如λ、21、φ80、φ81、82、 424、434等或其衍生物。對多肽諸如肽體、免疫粘附素、抗體和短肽的共價修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一 種類型的共價修飾包括使多肽的靶氨基酸殘基與有機衍生化試劑反應(yīng),該有機衍生化試劑 能夠與多肽的選定側(cè)鏈或者N-或C-末端殘基起反應(yīng)。用雙功能劑進(jìn)行的衍生化可用于例 如使多肽與不溶于水的支持基質(zhì)或表面交聯(lián),以用于純化抗體的方法,反之亦然。常用的 交聯(lián)劑包括例如1,1-雙(重氮乙?;?-2_苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯例如與 4_疊氮水楊酸形成的酯、同雙功能亞氨酸酯包括二琥珀酰亞氨基酯諸如3,3' -二硫代雙 (琥珀酰亞氨基_丙酸酯)、雙功能馬來酰亞胺諸如雙-N-馬來酰亞胺-1,8-辛烷和諸如甲 基-3-[(對_疊氮苯基)二硫代]丙酰亞胺酸酯等試劑。其它修飾包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基分別脫酰胺為谷氨酰和天冬氨酰殘 基,脯氨酸和賴氨酸的羥基化,絲氨酰或蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化,賴氨酸、精氨酸和組 氛酸側(cè)鏈的 α -氛基的甲基化(Τ. Ε. Creighton,Proteins :Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co. ,San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-$立溝月安的乙酉jHt, 及任何C-末端羧基的酰胺化。其它修飾包括將毒素偶聯(lián)至拮抗劑諸如美登素和美登木素生物堿類、加利車霉素 和其它細(xì)胞毒劑。對多肽的另一類共價修飾包括,以美國專利Nos. 4,640, 835 ;4, 496,689 ; 4,301,144 ;4, 670,417 ;4, 791,192或4,179,337所述方式,將多肽與多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)的 聚合物之一連接,例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化亞烷基(polyoxyalkylene)。如果有利的話,還可以以形成嵌合分子的方式修飾本發(fā)明的多肽,所述嵌合分子 包含與另一種異源多肽或氨基酸序列融合的多肽(例如免疫粘附素或肽體)。在一個實施方案中,此類嵌合分子包括多肽與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的融合物,所述 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?qū)⒍嚯陌邢蛲哆f至多種組織,更具體的說就是穿過血腦屏障,其中使用 例如人免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Schwarze et al.,1999,Science 285 1569-72)。在另一個實施方案中,此類嵌合分子包括帶有標(biāo)簽多肽的多肽的融合物,所述標(biāo) 簽多肽提供了抗標(biāo)簽抗體可選擇性結(jié)合的表位。表位標(biāo)簽通常位于多肽的氨基或羧基末 端。此類帶表位標(biāo)簽形式的多肽的存在可使用針對所述標(biāo)簽多肽的抗體來檢測。而且,表位 標(biāo)簽的提供使多肽易于使用抗標(biāo)簽抗體或另一類結(jié)合所述表位標(biāo)簽的親和基質(zhì)通過親和
      27純化來純化。多種標(biāo)簽多肽及其各自抗體是本領(lǐng)域已知的。例子包括多組氨酸(poly-his) 或多-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標(biāo)簽;流感HA標(biāo)簽多肽及其抗體12CA5 (Field et al.,Mol. Cell. Biol. 8 :2159_2165 (1988)) ;c-myc 標(biāo)簽及其抗體 8F9、3C7、6E10、G4、 B7 ^P 9E10 (Evan et al. , Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616(1985));及單 純皰疹病毒糖蛋白 D(gD)標(biāo)簽及其抗體(Paborsky et al.,Protein Engineerings (6) 547-553(1990))。其它標(biāo)簽多肽包括 Flag 肽(Hopp et al.,BioTechnology 6 1204-1210(1988)) ;KT3 表位肽(Martin et al.,Science 255:192-194(1992)) ; α -微管 蛋白表位肽(Skinner et al. ,J. Biol. Chem. 266 15163-15166 (1991));及 T7 基因 10 蛋白 月太標(biāo)簽(Lutz-Freyermuth et al.,PNAS USA 87 :6393_6397 (1990))。在一個備選實施方案中,嵌合分子可包括多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區(qū) 域的融合物。對于二價形式的嵌合分子(例如“免疫粘附素”),此類融合物可以是與IgG分 子Fc區(qū)的融合。本發(fā)明的Ig融合物包括大致包含或只包含人的殘基94-243、殘基33-53 或殘基33-52以置換Ig分子內(nèi)的至少一個可變區(qū)的多肽。在一個特別優(yōu)選的實施方案中, 免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的鉸鏈、CH2和CH3,或者鉸鏈、CHl、CH2和CH3區(qū)。關(guān)于 免疫球蛋白融合物的制備還可參見美國專利No. 5,428,130。本發(fā)明提供了用于抑制或預(yù)防復(fù)發(fā)的腫瘤生長或復(fù)發(fā)的癌細(xì)胞生長的方法和組 合物。在各種實施方案中,癌指復(fù)發(fā)的腫瘤生長或復(fù)發(fā)的癌細(xì)胞生長,其中癌細(xì)胞的數(shù)目沒 有顯著減少,或者增多了,或者腫瘤體積沒有顯著縮小,或者增大了,或者癌細(xì)胞體積或數(shù) 目未能有進(jìn)一步縮小/減少。確定癌細(xì)胞是否是復(fù)發(fā)的腫瘤生長或復(fù)發(fā)的癌細(xì)胞生長可以 通過本領(lǐng)域關(guān)于測定治療對癌細(xì)胞有效性知道的任何方法在體內(nèi)或在體外進(jìn)行。對抗VEGF 治療有抗性的腫瘤是復(fù)發(fā)的腫瘤生長的一個例子。本文中所公開的多肽、抗體、拮抗劑、或組合物的“有效量”指足以實現(xiàn)明確規(guī)定的 目的的量。“有效量”可憑經(jīng)驗且以已知方法,聯(lián)系規(guī)定的目的來確定。術(shù)語“治療有效量”指在哺乳動物(aka患者)中有效“治療”疾病或病癥的本發(fā)明 抗體、多肽、或拮抗劑的量。在癌癥的情況中,藥物的治療有效量可減少癌細(xì)胞數(shù)目;縮小腫 瘤體積或重量;抑制(即一定程度的減緩,優(yōu)選停止)癌細(xì)胞浸潤到周圍器官中;抑制(即 一定程度的減緩,優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移;一定程度的抑制腫瘤生長;和/或一定程度的減輕 與癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀。就藥物可預(yù)防現(xiàn)有癌細(xì)胞生長和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程 度而言,它可以是細(xì)胞抑制性的和/或細(xì)胞毒性的。在一個實施方案中,治療有效量是生長 抑制量。在另一個實施方案中,治療有效量是延長患者存活的量。在另一個實施方案中,治 療有效量是改進(jìn)患者無進(jìn)展存活的量。在傷口愈合的情況中,術(shù)語“有效量”或“治療有效量”指藥物有效加速或改進(jìn)受 試者中的傷口愈合的量。治療劑量指對患者展現(xiàn)出治療效果的劑量,而亞治療劑量指對所 治療的患者不展現(xiàn)出治療效果的劑量?!奥詡?”指不愈合的傷口。參見例如Lazarus et al.,Definitions andguidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130 =489-93 (1994) 0慢性傷口包括但不限于例如動脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、壓 迫性潰瘍、靜脈潰瘍等。急性傷口可以發(fā)展成慢性傷口。急性傷口包括但不限于由例如熱 傷、外傷、手術(shù)、大面積皮膚癌切除、深部真菌和細(xì)菌感染、血管炎、硬皮病、天皰瘡、中毒性表皮壞死松解癥等引起的傷口。參見例如Buford,Wound Healing and Pressure Sores, Healingffell. com, 2001年10月24日出版?!罢凇敝附?jīng)歷正常傷口愈合修復(fù)的傷口。本發(fā)明多肽、抗體、拮抗劑或組合物的“生長抑制量”指能夠在體外或在體內(nèi)抑制 細(xì)胞,尤其是腫瘤,例如癌細(xì)胞生長的量。本發(fā)明多肽、抗體、拮抗劑或組合物為了抑制贅生 性細(xì)胞生長的“生長抑制量”可以憑經(jīng)驗和通過已知方法或本文中提供的例子來確定。本發(fā)明多肽、抗體、拮抗劑或組合物的“細(xì)胞毒性量”指能夠在體外或在體內(nèi)引起 細(xì)胞,尤其是腫瘤,例如癌細(xì)胞破壞的量。本發(fā)明多肽、抗體、拮抗劑或組合物為了抑制贅生 性細(xì)胞生長的“細(xì)胞毒性量”可以憑經(jīng)驗和通過本領(lǐng)域已知方法來確定。“自身免疫病”在本文中指因個體自身組織引起的和針對個體自身組織的疾病 或病癥或其共分離(co-segregate)或表現(xiàn)或者由此產(chǎn)生的疾患。自身免疫性疾病或病 癥的例子包括但不限于關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎諸如急性關(guān)節(jié)炎、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆 (Lyme)關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)炎和幼發(fā)型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎, 骨關(guān)節(jié)炎,慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎(arthritis chronica progrediente),變形性關(guān)節(jié)炎,慢 性原發(fā)性多關(guān)節(jié)炎,反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎,和強直性脊柱炎),炎性過度增殖性皮膚病,銀屑病諸 如斑塊狀銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰性銀屑病和指甲銀屑病,皮炎包括接觸性皮炎、慢性接 觸性皮炎、變應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎和特應(yīng)性皮炎,χ連鎖的高IgM綜 合征,蕁麻疹諸如慢性特發(fā)性蕁麻疹包括慢性自身免疫性蕁麻疹,多肌炎/皮肌炎,青少 年型皮肌炎,中毒性表皮壞死松解癥,硬皮病(包括系統(tǒng)性硬皮病),硬化諸如系統(tǒng)性硬 化、多發(fā)性硬化(MS)諸如脊髓-眼(spino-opticaDMS、原發(fā)性進(jìn)行性MS和復(fù)發(fā)性消退 性(relapsingremittir^MS、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化、動脈粥樣硬化、動脈硬化、播散性硬化 (sclerosis disseminata)和共濟失調(diào)性(ataxic)硬化,炎性腸病(IBD)(例如克羅恩 氏(Crohn)病,結(jié)腸炎諸如潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, colitis ulcerosa)、微 觀(microscopic)結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和透壁性結(jié)腸 炎,和自身免疫性炎性腸病),壞疽性膿皮癥,結(jié)節(jié)性紅斑,原發(fā)性硬化性膽管炎,鞏膜外層 炎),呼吸窘迫綜合征包括成人型或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),腦膜炎,整個或部分葡萄 膜的炎癥,虹膜炎,脈絡(luò)膜炎,自身免疫性血液學(xué)病癥,類風(fēng)濕性脊椎炎,突發(fā)性聽覺喪失, IgE介導(dǎo)的疾病諸如過敏反應(yīng)和變應(yīng)性和特應(yīng)性鼻炎,腦炎諸如拉斯默森氏(Rasmussen) 腦炎和邊緣系和/或腦干腦炎,葡萄膜炎諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄 膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎, 具有和沒有腎病綜合征的腎小球腎炎(GN)諸如慢性或急性腎小球腎炎諸如原發(fā)性GN、免 疫介導(dǎo)的GN、膜性GN(膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN、膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II 型、和急進(jìn)性GN,變應(yīng)性疾患,變應(yīng)性反應(yīng),濕疹包括變應(yīng)性或特應(yīng)性濕疹,哮喘諸如支氣 管哮喘(asthma bronchiale, bronchial asthma)和自身免疫性哮喘,涉及T細(xì)胞浸潤和 慢性炎性應(yīng)答的疾患,慢性肺部炎性疾病,自身免疫性心肌炎,白細(xì)胞粘附缺陷,系統(tǒng)性紅 斑狼疫(SLE) (systemic Iupuserythematosus, systemic lupus erythematodes)諸如皮 膚SLE、亞急性皮膚紅斑狼瘡、新生兒狼瘡綜合征(NLE)、播散性紅斑狼瘡、狼瘡(包括狼瘡 腎炎、狼瘡腦炎、兒科狼瘡、非腎狼瘡、盤狀狼瘡、狼瘡脫發(fā)),幼發(fā)型(I型)糖尿病包括兒 科胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、成人期發(fā)作的糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特發(fā)性尿崩癥,與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答, 結(jié)核病,結(jié)節(jié)病,肉芽腫病包括淋巴瘤樣肉芽腫病、韋格納氏(Wegener)肉芽腫病,粒細(xì)胞 缺乏,血管炎病包括血管炎(包括大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(高安氏 (Takayasu))動脈炎),中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和結(jié)節(jié)性多動脈炎),微 觀(microscopic)多動脈炎,CNS血管炎,壞死性、皮膚性或超敏感性血管炎,系統(tǒng)性壞死性 血管炎,和ANCA相關(guān)血管炎諸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或綜合征(CSS)),顳 動脈炎,再生障礙性貧血,自身免疫性再生障礙性貧血,庫姆斯(Coombs)陽性貧血,戴-布 二氏(Diamond Blackfan)貧血,溶血性貧血或免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性 貧血(AIHA),惡性貧血(pernicious anemia, anemia perniciosa),阿狄森氏(Addison) 病,單純紅細(xì)胞性貧血或再生障礙(PRCA),因子VIII缺乏,血友病A,自身免疫性嗜中性粒 細(xì)胞減少癥,全血細(xì)胞減少癥,白細(xì)胞減少癥,涉及白細(xì)胞滲出的疾病,CNS炎性病癥,多器 官損傷綜合征諸如那些敗血癥、外傷或出血繼發(fā)的,抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病,抗腎小 球基底膜病,抗磷脂抗體綜合征,變應(yīng)性神經(jīng)炎,貝切特氏(Bechet或Behcet)病,卡斯?fàn)?曼氏(Castleman)綜合征,古德帕斯丘氏(Goodpasture)綜合征,雷諾氏(Reynaud)綜合 征,斯耶格倫氏(Sjogren)綜合征,史-約二氏(Stevens-Johnson)綜合征,類天皰瘡諸如 大皰性類天皰瘡和皮膚類天皰瘡,天皰瘡(包括尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、粘膜類天皰 瘡型天皰瘡和紅斑性天皰瘡),自身免疫性多內(nèi)分泌病,萊特氏(Reiter)病或綜合征,免 疫復(fù)合物腎炎,抗體介導(dǎo)的腎炎,慢性神經(jīng)病諸如IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病,血 小板減少癥(例如心肌梗死患者發(fā)生的)包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)和自身免 疫或免疫介導(dǎo)的血小板減少癥諸如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP, 睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎,原發(fā)性甲狀腺功能減退癥,甲 狀旁腺功能減退,自身免疫性內(nèi)分泌病包括甲狀腺炎諸如自身免疫性甲狀腺炎、橋本氏 (Hashimoto)病、慢性甲狀腺炎(橋本氏(Hashimoto)甲狀腺炎)或亞急性甲狀腺炎,自身 免疫性甲狀腺病,特發(fā)性甲狀腺功能減退癥,格雷夫斯氏(Graves)病,多腺性綜合征諸如 自身免疫性多腺體綜合征(或多腺性內(nèi)分泌病綜合征),瘤外綜合征包括神經(jīng)學(xué)瘤外綜合 征諸如蘭伯特-伊頓(Lambert-Eaton)肌無力綜合征或伊頓-蘭伯特(Lambert-Eaton)綜 合征,僵體或僵人綜合征,腦脊髓炎諸如變應(yīng)性腦脊髓炎(allergic encephalomyelitis, encephalomyelitisallergica)和實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE),重癥肌無力,小腦變 性,神經(jīng)性肌強直,視性眼陣攣或視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS),和感覺神經(jīng)病,席漢氏 (Sheehan)綜合征,自身免疫性肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細(xì)胞性肝炎、慢性活動性 肝炎或自身免疫性慢性活動性肝炎,淋巴樣間質(zhì)性肺炎,梗阻性細(xì)支氣管炎(非移植)對 NSIP,格-巴二氏(Guillain-Barre)綜合征,貝格爾氏(Berger)病(IgA腎病),特發(fā)性 IgA腎病,線性IgA皮膚病,原發(fā)性膽汁性肝硬化,肺硬變,自身免疫性腸病綜合征,乳糜瀉, 腹部疾病,口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病),頑固性口炎性腹瀉,特發(fā)性口炎性腹瀉,冷球蛋白血 癥、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)(盧格里克氏(Lou Gehrig)病),冠狀動脈病,自身免疫性內(nèi)耳 病(AIED)或自身免疫性聽覺喪失,視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS),多軟骨炎諸如頑固性 或復(fù)發(fā)性多軟骨炎,肺泡蛋白沉著癥,淀粉樣變,鞏膜炎,非癌性淋巴細(xì)胞增多,原發(fā)性淋巴 細(xì)胞增多包括單克隆B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多(例如良性單克隆丙種球蛋白病和性質(zhì)未確定的 單克隆丙種球蛋白病(MGUS)),周圍神經(jīng)病,瘤外綜合征,通道病諸如癲癇、偏頭痛、心率失常、肌肉病癥、失聰、失明、周期性癱瘓和CNS的通道病,孤獨癥,炎性肌病,局灶性節(jié)段性腎 小球硬化(FSGS),內(nèi)分泌性眼病,葡萄膜視網(wǎng)膜炎,脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎,自身免疫性肝臟病學(xué) 病癥,纖維肌痛,多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭,施密特氏(Schmidt)綜合征,腎上腺炎,胃萎縮,早老 性癡呆,脫髓鞘病諸如自身免疫性脫髓鞘病,糖尿病腎病,德雷斯勒氏(Dressier)綜合征, 斑禿,CREST綜合征(鈣質(zhì)沉著癥、雷諾氏(Raynaud)現(xiàn)象、食道運動功能障礙、指端硬化 和毛細(xì)管擴張),男性和女性自身免疫性不孕不育,混合性結(jié)締組織病,恰加斯氏(Chagas) 病,風(fēng)濕熱,習(xí)慣性流產(chǎn),農(nóng)民肺,多形紅斑,心臟切開術(shù)后綜合征,柯興氏(Cushing)綜合 征,養(yǎng)鳥者肺,變應(yīng)性肉芽腫性血管炎,良性淋巴細(xì)胞性血管炎,阿爾波特氏(Alport)綜 合征,肺泡炎諸如變應(yīng)性肺泡炎和纖維化肺泡炎,間質(zhì)性肺病,輸血反應(yīng),麻風(fēng),瘧疾,利什 曼病,錐蟲病(kypanosomiasis),血吸蟲病,蛔蟲病,曲霉病,Sampter氏綜合征,卡普蘭 氏(Caplan)綜合征,登革,心內(nèi)膜炎,心內(nèi)膜心肌纖維化,彌漫性肺間質(zhì)纖維化,間質(zhì)性肺 纖維化,特發(fā)性肺纖維化,囊性纖維化,眼內(nèi)炎,持久隆起性紅斑(erythema elevatum et diutinum),胎兒成紅細(xì)胞增多癥,嗜曙紅細(xì)胞性筋膜炎(faciitis)、舒爾曼氏(Shulman) 綜合征,費爾提氏(Felty)綜合征,flariasis,睫狀體炎諸如慢性睫狀體炎、異時性睫狀 體炎、虹膜睫狀體炎或Fuch氏睫狀體炎,亨諾-許蘭二氏(Henoch-Schonlein)紫癜,人 免疫缺陷病毒(HIV)感染,艾柯病毒感染,心肌病,阿爾茨海默氏(Alzheimer)病,細(xì)小病 毒感染,風(fēng)疹病毒感染,種痘后綜合征,先天性風(fēng)疹感染,愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Ban·) 病毒感染、腮腺炎,埃文斯(Evans)綜合征,自身免疫性性腺衰竭,西登哈姆氏(Sydenham) 舞蹈病,鏈球菌后腎炎,閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans),甲狀腺毒癥, 脊髓癆,脈絡(luò)膜炎,巨細(xì)胞性多肌痛,內(nèi)分泌性眼病,慢性超敏感性肺炎,干燥性角膜結(jié)膜 炎,流行性角膜結(jié)膜炎,特發(fā)性腎炎綜合征,微小病變腎病,良性家族性和缺血-再灌注損 傷,視網(wǎng)膜自身免疫,關(guān)節(jié)炎癥,支氣管炎,慢性阻塞性氣道疾病,硅沉著病,口疫,口瘡性 口炎,動脈硬化性病癥,無精子發(fā)生(aspermiogenese),自身免疫性溶血,伯克氏(Boeck) 病,冷球蛋白血癥,杜普伊特倫氏(Dupuytren)攣縮,晶體過敏性眼內(nèi)炎(endophthalmia phacoanaphylactica),變應(yīng)性小腸炎(enteritis allergica),麻風(fēng)節(jié)結(jié)性紅斑,特發(fā)性 面癱,慢性疲乏綜合征,風(fēng)濕熱(febris rheumatica),哈-里二氏(Hamman-Rich)病,感 覺神經(jīng)性聽覺喪失,陣發(fā)性血紅蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica),性腺功能減 退,局限性回腸炎(ileitisregionalis),白細(xì)胞減少癥,傳染性單核細(xì)胞增多癥,橫貫性 (traverse)脊髓炎,原發(fā)性特發(fā)性粘液水腫,腎病,交感性眼炎(ophthalmia symphatica), 肉芽腫性睪丸炎(orchitis granulomatosa),胰腺炎,急性多神經(jīng)根炎,壞疽性膿皮癥,奎 爾萬氏(Quervain)甲狀腺炎,獲得性脾萎縮,由于抗精蟲抗體的不育癥,非惡性胸腺瘤, 白癜風(fēng),SCID和愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Ban·)病毒相關(guān)疾病,獲得性免疫缺陷綜合征 (AIDS),寄生蟲病諸如利什曼蟲,中毒性休克綜合征,食物中毒,涉及T細(xì)胞浸潤的疾患, 白細(xì)胞粘附缺陷,與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng) 答,涉及白細(xì)胞滲出的疾病,多器官損傷綜合征,抗原_抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病,抗腎小球 基底膜病,變應(yīng)性神經(jīng)炎,自身免疫性多內(nèi)分泌病,卵巢炎,原發(fā)性粘液水腫,自身免疫性萎 縮性胃炎,交感性眼炎,風(fēng)濕病,混合性結(jié)締組織病,腎病綜合征,胰島炎,多內(nèi)分泌衰竭,周 圍神經(jīng)病,自身免疫性多腺性綜合征I型,成人期發(fā)作的特發(fā)性甲狀旁腺功能減退(AOIH), 全禿,擴張型心肌病,獲得性大皰性表皮松解(印idermolisis bullosa acquisita,EBA),血色素沉著,心肌炎,腎病綜合征,原發(fā)性硬化性膽管炎,化膿性或非化膿性鼻竇炎,急性或 慢性鼻竇炎,篩竇炎,額竇炎,上頌竇炎或蝶竇炎,嗜曙紅細(xì)胞相關(guān)病癥諸如嗜曙紅細(xì)胞增 多癥、肺嗜曙紅細(xì)胞增多性浸潤、嗜曙紅細(xì)胞增多-肌痛綜合征、呂弗勒氏(Loffler)綜合 征、慢性嗜曙紅細(xì)胞性肺炎、熱帶肺嗜曙紅細(xì)胞增多、支氣管肺曲霉病、曲霉腫、或含有嗜 曙紅細(xì)胞的肉芽腫,過敏反應(yīng),血清陰性脊椎關(guān)節(jié)炎病,多內(nèi)分泌自身免疫病,硬化性膽管 炎,鞏膜、鞏膜外層、慢性粘膜皮膚假絲酵母病,布魯頓氏(Bruton)綜合征,嬰兒期一過性 低丙種球蛋白血癥,威斯科特-奧爾德里齊(Wiskott-Aldrich)綜合征,共濟失調(diào)性毛細(xì) 管擴張,與以下各項有關(guān)的自身免疫性病癥膠原病、風(fēng)濕病、神經(jīng)病學(xué)疾病、缺血再灌注紊 亂、血壓應(yīng)答降低(reduction in blood pressure response)、血管功能障礙、毛細(xì)管擴張 (antgiectasis)、組織損傷、心血管缺血、痛覺過敏、腦缺血和伴隨血管化的疾病,變應(yīng)性超 敏感性病癥,腎小球腎炎病,再灌注損傷,心肌或其它組織的再灌注損傷,具有急性炎性成 分的皮膚病,急性化膿性腦膜炎或其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性病癥,粒細(xì)胞輸血相關(guān)綜合征,細(xì) 胞因子誘發(fā)的中毒,急性重度炎癥,慢性頑固性炎癥,腎盂炎,肺硬變,糖尿病性視網(wǎng)膜病, 糖尿病性大動脈病癥,動脈內(nèi)增生,消化性潰瘍,心瓣炎,和子宮內(nèi)膜異位癥。術(shù)語“檢測”意圖包括測定物質(zhì)的存在與否或?qū)ξ镔|(zhì)的量定量。該術(shù)語如此指將 本發(fā)明的材料、組合物、和方法用于定量和定性測定。一般而言,用于檢測的具體技術(shù)對于 本發(fā)明的實施不是至關(guān)重要的。例如,依照本發(fā)明的“檢測”可以包括觀察α5基因產(chǎn)物、β 基因產(chǎn)物(例如 mRNA分子)、或者α 5或α 5 β 1多肽的存在與否;α 5或α 5 β 1多肽水平或結(jié)合至靶物的 量的變化;α5或α 5β1多肽的生物學(xué)功能/活性的變化。在一些實施方案中,“檢測”可 以包括檢測野生型α 5或α 5 β 1水平(例如mRNA或多肽水平)。檢測可以包括對與對照 相比介于10%和90%之間任何數(shù)值、或介于30%和60%之間任何數(shù)值、或超過100%的變 化(升高或降低)的定量。檢測可以包括對介于2倍和10倍之間(含兩端值)任何數(shù)值 或更大(例如100倍)的變化的定量?!皹?biāo)記物”在用于本文時指與抗體直接或間接偶聯(lián)的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記 物自身可以是通過自身就可檢測的(例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物),或者在酶 標(biāo)記物的情況中,可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。III.抗 α5β1 抗體本文中提供了能結(jié)合人α5β1且競爭性抑制抗α5β1抗體結(jié)合人α 5 β 1的抗 體。因而,本發(fā)明的一個實施方案提供了包含SEQ ID N0:l、2、3、或4任一所列輕鏈可變域 (VL)序列和SEQ ID NO :5、6、7、8、或9任一所列重鏈可變域(VH)序列的抗體。還涵蓋所保 藏雜交瘤的抗體的人形式抗體或嵌合形式抗體。依照一個實施方案,所述抗體能以介于500ηΜ和IpM之間的Kd結(jié)合人α 5β 1。依 照另一個實施方案,所述抗體不結(jié)合ανβ3或ανβ5或ανβ 。依照另一個實施方案,所 述抗體包含人IgG,例如人IgGl或人IgG4的Fc序列。在另一個實施方案中,F(xiàn)c序列已經(jīng) 改變或者有其它方式變化,使得它缺乏抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)效應(yīng)器功能,這 常常與它們對Fc受體(FcR)的結(jié)合有關(guān)??筛淖冃?yīng)器功能的Fc序列變化或突變有許多 例子。例如,W000/42072 和 Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2) :6591_6604 (2001)記載了 具有提高的或降低的FcR結(jié)合的抗體變體。將這些出版物的內(nèi)容明確收入本文作為參考。所述抗體可以是Fab、Fab,、F(ab),2、單鏈FV(SCFV)、FV片段;雙抗體(diabody)和線性抗 體的形式。同樣,所述抗體可以是能結(jié)合α 5β1的多特異性抗體,而且是α5β1拮抗劑, 但是還能結(jié)合一種或多種其它靶物并抑制其功能(例如VEGF)。所述抗體可以偶聯(lián)至治療 劑(例如細(xì)胞毒劑、放射性同位素和化療劑)或標(biāo)記物,后者用于檢測患者樣品中的α 5β 1 或者通過成像(例如放射性同位素、熒光染料和酶)用于檢測體內(nèi)α5β1。還涵蓋編碼抗α 5β 1抗體的核酸分子、包含編碼兩種可變域之一或二者的核酸 分子的表達(dá)載體、及包含所述核酸分子的細(xì)胞。這些抗體可用于本文所述療法和用于檢測 (例如通過FACS、免疫組化(IHC)、ELISA測定法)患者樣品中的或患者中的α5β1蛋白。Α.單克隆抗體單克隆抗體可使用例如雜交瘤方法來制備,諸如那些由Kohler andMilstein, Nature, 256 =495(1975)記載的,或者可以通過重組DNA方法(美國專利No. 4,816, 567)來 制備,或者可以通過下文實施例所述的方法來生成。在雜交瘤方法中,通常用免疫劑免疫倉 鼠、小鼠、或其它適宜的宿主動物以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞,所述抗體將 特異性結(jié)合所述免疫劑?;蛘?,可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。免疫劑通常包括感興趣蛋白質(zhì)的多肽或融合蛋白或者包含該蛋白質(zhì)的組合物。一 般而言,若想要人起源的細(xì)胞,則使用外周血淋巴細(xì)胞(PBL);或者,若想要非人哺乳動物 來源,則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后,使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與 永生化細(xì)胞系融合,以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding,Monoclonal Antibodies principles and Practice, New Yourk,Academic Press,1986,pp. 59-103)。永生化細(xì)胞系通常是經(jīng)轉(zhuǎn)化的 哺乳動物細(xì)胞,特別是嚙齒類、牛、和人起源的骨髓瘤細(xì)胞。通常,采用大鼠或小鼠骨髓瘤 細(xì)胞系。雜交瘤細(xì)胞可以在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的永生 化細(xì)胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如,若親本細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖 轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷 (HAT培養(yǎng)基),這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是那些高效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平表 達(dá)抗體、并對諸如HAT培養(yǎng)基的培養(yǎng)基敏感的。更優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系,其 可以從例如索爾克研究所細(xì)胞分配中心(Salk InstituteCell Distribution Center, San Diego, California, USA)和美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA)獲得。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也 已記載用于生成人單克隆抗體(Kozbor,J. Immunol. 133 =3001(1984) ;Brodeur et al., Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987,pp.51-63)。然后可以對雜交瘤細(xì)胞正在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)液測定針對多肽的單克隆抗體的存 在。可以通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法,諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫 吸附測定法(ELISA),測定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。此類技術(shù)和測 定法是本領(lǐng)域已知的。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107 220(1980)的 Scatchard 分析來測定。在鑒定出想要的雜交瘤細(xì)胞后,該克隆可通過有限稀釋規(guī)程進(jìn)行亞克隆并通過標(biāo) 準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding,見上文)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如Dulbecco氏改良
      33Eagle氏培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基?;蛘撸s交瘤細(xì)胞可以在哺乳動物中作為腹水進(jìn)行體 內(nèi)培養(yǎng)。可通過常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程,諸如例如蛋白A-S印harose、羥磷灰石層析、凝 膠電泳、透析或親和層析,自培養(yǎng)液或腹水分離或純化亞克隆分泌的單克隆抗體。單克隆抗體還可以通過重組DNA方法來制備,諸如美國專利No. 4,816,567中所記 載的。編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA可以容易的使用常規(guī)規(guī)程分離和測序(例如通過使 用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以本發(fā)明的雜交瘤細(xì) 胞作為此類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離,可將DNA置于表達(dá)載體中,然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn) 染到原本不生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中,諸如猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO) 細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞,以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。還可以修飾DNA,例如通 過替代即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列代替同源鼠序列(美國專利No. 4,816,567 ; Morrison et al.,見上文),或通過將非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列與免疫球 蛋白編碼序列共價連接。可以用此類非免疫球蛋白多肽替代本發(fā)明抗體的恒定域,或者可 以用它們替代本發(fā)明抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變域,以創(chuàng)建嵌合二價抗體。所述抗體可以是單價抗體。用于制備單價抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如,一 種方法牽涉重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈和經(jīng)修飾的重鏈。所述重鏈一般在Fc區(qū)中任何位點 處截短以防止重鏈交聯(lián)?;蛘?,將相關(guān)半胱氨酸殘基用另一種氨基酸殘基替代或者刪除以 防止交聯(lián)。體外方法也適用于制備單價抗體。消化抗體以生成其片段,特別是Fab片段,可以 使用但不限于本領(lǐng)域已知技術(shù)來實現(xiàn)。B.人抗體和人源化抗體抗體可以是人源化抗體或人抗體。非人(例如鼠)抗體的人源化形式指通常最低 限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如 Fv.Fab.Fab'、F(ab' )2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)。人源化抗體包括人免疫球蛋白 (受體抗體)中的CDR殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如 小鼠、大鼠或家兔的CDR殘基替換的抗體。在有些情況中,將人免疫球蛋白的Fv框架殘基 用相應(yīng)的非人殘基替換。人源化抗體還可包含在受體抗體和輸入CDR或框架序列中都沒有 發(fā)現(xiàn)的殘基。通常,人源化抗體可以包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域,其 中所有或基本上所有CDR對應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR,且所有或基本上所有FR是人免疫 球蛋白共有序列的FR。人源化抗體優(yōu)選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe),通常是 人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Jones et al.,Nature 321 :522_525 (1986) ;Riechmann et al., Nature 332 :323_329(1988) ;Presta, Curr. Op.Struct. Biol. 2 :593_596(1992))。用于人源化非人抗體的一些方法在本領(lǐng)域和下文實施例中有描述。通常,人源化 抗體中引入了一個或多個來自非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸 入”殘基,它們通常取自“輸入”可變域。依照一個實施方案,人源化可基本上遵循Winter 及其同事的方法進(jìn)行(Jones et al. , Nature 321:522-525(1986) ;Riechmann et al., Nature 332:323-327(1988) ;Verhoeyen et al. ,Science 239 1534-1536 (1988)),即用嚙 齒類CDR或CDR序列替代人抗體的相應(yīng)序列。因此,此類“人源化”抗體是這樣的抗體(美 國專利No. 4,816,567),其中基本上少于整個人可變域用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實踐中,人源化抗體通常是其中一些⑶R殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類 似位點的殘基替代的人抗體。作為人源化的替代方法,可生成人抗體。例如,現(xiàn)在有可能生成這樣的轉(zhuǎn)基因動 物(例如小鼠),它們在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體 完整全集。例如,已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪 除導(dǎo)致內(nèi)源性抗體生成的完全抑制。將大量人種系免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)移到此類種系突變 小鼠中將導(dǎo)致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如Jakobovits et al.,PNAS USA 90: 2551 (1993) Jakobovits etal.,Nature 362 255-258 (1993) ;Bruggemann et al.,Year in Immunol. 7 33 (1993);美國專利 No. 5,545,806,5,569,825,5,591,669 ;5,545,807 ; WO 97/17852。或者,可以如下生成人抗體,即將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動物,例 如內(nèi)源免疫球蛋白基因已經(jīng)部分或完全滅活的小鼠。在攻擊時,觀察到人抗體的生成在所 有方面與在人中看到的密切相似,包括基因重排、裝配、和抗體全集。這種方法記載于例如 美國專禾Ij No. 5,545,807 ;5,545,806 ;5,569,825 ;5,625,126 ;5,633,425 ;和 5,661,016, 及 Marks et al.,Bio/Technology, 10 :779_783(1992) ;Lonberg et al.,Nature,368 856-859(1994) ;Morrison, Nature, 368 812-813 (1994) ;Fishwild et al. , Nature Biotechnology,14 845-851 (1996) ;Neuberger, Nature Biotechnology,14 826(1996); Lonberg and Huszar, Intern, Rev.Immunol. , 13 65-93(1995)?;蛘?,噬菌體展示技術(shù)(McCaffertyet al.,Nature 348 :552_553 (1990))可用 于在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變域(V)基因全集生成人抗體和抗體片段。 依照這種技術(shù)的一個實施方案,將抗體可變域序列以符合讀碼框的方式克隆到絲狀噬菌 體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因中,并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗 體片段。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行,例如下文實施例部分所述,或者綜述參見例如 Johnson, Kevin S. andChiswell, David J. , Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571(1993)。V基因區(qū)段的數(shù)種來源可用于噬菌體展示。Clackson et al. ,Nature 352 624-628(1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫中分離出大量不同的抗 噁唑酮抗體。可基本上遵循Marks et al.,J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1991)或Griffith et al.,EMBO J. 12 :725_734 (1993)所記載的技術(shù),由未免疫人供體構(gòu)建V基因全集和分離針 對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利No. 5,565,332和5,573,905。如上所述,還可通過體外激活B細(xì)胞來生成人抗體(參見美國專利No. 5,567,610 和 5,229,275)。人抗體還可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來生產(chǎn),包括噬菌體展示庫 (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. ,227 381(1991) ;Marks et al. , J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。Cole等人和Boerner等人的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985)和 Boerner et al.,J. Immunol.,147 (1) :86_95 (1991))。C.多特異性抗體多特異性抗體指對兩種或更多種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體,優(yōu)選人 抗體或人源化抗體(例如,雙特異性抗體對至少兩種抗原具有結(jié)合特異性)。例如,結(jié)合特 異性之一可以是針對α 5β 1蛋白質(zhì),結(jié)合特異性之另一可以是針對任何其它抗原。依照一個優(yōu)選的實施方案,另一抗原是細(xì)胞表面蛋白或受體或受體亞基。例如,所述細(xì)胞表面蛋白 可以是天然殺傷(NK)細(xì)胞受體。如此,依照一個實施方案,本發(fā)明的雙特異性抗體可結(jié)合 α 5β 1 禾口 VEGF 二者。用于構(gòu)建雙特異性抗體的合適方法是本領(lǐng)域公知的。例如,雙特異性抗體的 重組生產(chǎn)基于兩對免疫球蛋白重鏈/輕鏈的共表達(dá),其中兩種重鏈具有不同的特異性 (Millstein and Cuello, Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨 機分配,這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物,其 中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟來進(jìn)行正確分子的純化。類 似的規(guī)程披露于 WO 93/08829 及 Traunecker et al. , EMBO 10:3655-3659(1991)??梢詫⒕哂衅谕Y(jié)合特異性(抗體_抗原結(jié)合位點)的抗體可變域與免疫球蛋白 恒定域序列融合。優(yōu)選的是,與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域 進(jìn)行融合。優(yōu)選的是,在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點的第一重鏈恒 定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和,在需要時,免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開 的表達(dá)載體,并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見 例如 Suresh et al. , Methods in Enzymology 121 :210(1986)。還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。 例如,已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny et al. , J. Immunol. 148(5) 1547-1553(1992)。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗 體的Fab'部分連接??贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體,然后重新氧化以形成抗 體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger et al.,PNAS USA 90: 6444-6448(1993)記載的“雙抗體”技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機制。該片段 包含通過接頭相連的VH和VL,所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。 因此,迫使一個片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的互補VL和VH結(jié)構(gòu)域配對,由此 形成兩個抗原結(jié)合位點。還報道了通過使用單鏈Fv (sFv) 二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的 另一種策略。參見 Gruber et al.,J. Immunol. 152 :5368 (1994)。設(shè)想了具有超過兩個效價的抗體。例如,可制備三特異性抗體。Tutt et al., J. Immunol. 147 60(1991)。D.異源偶聯(lián)抗體異源偶聯(lián)抗體由兩種共價連接的抗體構(gòu)成。此類抗體建議用于例如將免疫系統(tǒng) 細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利No. 4,676,980)及用于治療HIV感染(W0 91/00360 ;WO 92/200373 ;EP 03089)。設(shè)想了可在體外使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)的已知方法制備抗體,包括那 些涉及交聯(lián)劑的方法。例如,可使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。 適于此目的的試劑的例子包括亞氨基硫醇酯/鹽(iminothiolate)和4-巰基丁酰亞氨酸 甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美國專利 No. 4,676,980 中所公開的。E.效應(yīng)器功能工程改造可能希望在效應(yīng)器功能方面修飾本發(fā)明的抗體,從而增強例如抗體在治療癌癥中 的效力。例如,可向Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基,從而使得在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此 生成的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或提高的補體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體 依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)。參見 Caron etal.,J. Exp. Med. 176 :1191_1195 (1992)和Shopes, J. Immunol. 148 :2918_2922 (1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使 用如 Wolff et al.,Cancer Research 53:2560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯(lián)劑來 制備。或者,抗體可改造成具有雙重Fc區(qū),由此可具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見 Stevenson et al. , Anti-Cancer Drug Design 3 :219_230(1989)??梢赃M(jìn)行Fc區(qū)序列中的突變或改變以改進(jìn)FcR結(jié)合(例如Fc y R、FcRn)。依照 一個實施方案,本發(fā)明的抗體具有至少一項改變的選自下組的效應(yīng)器功能:ADCC、⑶C、和改 進(jìn)的FcRn結(jié)合,所述改進(jìn)與天然IgG或親本抗體相比。數(shù)種有用的特定突變的例子記載于 例如 Shields,RL et al. (2001) JBC276 (6) 6591-6604 ;Presta, L. G. , (2002) Biochemical Society Transactions 30(4) 487-490 ;WO 00/42072。依照一個實施方案,F(xiàn)c受體突變是選自下組的至少一個位置的替代Fc區(qū)的238、 239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、 285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、 324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、 389、398、414、416、419、430、434、435、437、438 或 439,其中 Fc 區(qū)的殘基編號方式依照 EU 編 號系統(tǒng)。在一些實施方案中,F(xiàn)c受體突變是D265A替代。在一些實施方案中,F(xiàn)c受體突變 是N297A替代。美國專利No. 7,332,581列出了別的合適的突變。F.免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還關(guān)于包含偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑的抗體的免疫偶聯(lián)物,所述細(xì)胞毒劑諸如化療 劑、毒素(如細(xì)菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放 射偶聯(lián)物)。上文已經(jīng)描述了可用于生成此類免疫偶聯(lián)物的化療劑??墒褂玫拿富钚远舅丶?其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根 毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石 竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂 草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogel 1 in)、 局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素 (trichothecenes)。多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。例子包括212Bi、mI、mIn、 90Y 和 186Re。抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備,諸如N-琥珀 酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己 二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙 疊氮化合物(諸如雙(對_疊氮苯甲?;?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮 苯甲酰基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如,可如Vitetta et al.,Science 238 1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基 二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO 94/11026。在另一個實施方案中,可將抗體與“受體”(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)從而用于腫瘤 預(yù)先靶向,其中對患者施用抗體-受體偶聯(lián)物,接著使用清除劑由循環(huán)中清除未結(jié)合的偶 聯(lián)物,然后施用與細(xì)胞毒劑(如放射性核苷酸)偶聯(lián)的“配體”(如親合素)。G.免疫脂質(zhì)體本文中所公開的抗體還可配制成免疫脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域已 知方法來制備,諸如 Epstein et al.,PNAS USA 82 3688(1985) ;Hwang et al.,PNAS USA 77 =4030(1980);美國專利No. 4,485,045和4,544,545。循環(huán)時間延長的脂質(zhì)體披露于美 國專利 No. 5,013,556。可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物 通過反相蒸發(fā)法生成特別有用的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體擠過具有設(shè)定孔徑的濾器,產(chǎn)生具有期 望直徑的脂質(zhì)體。可如Martin et al. , J. Biol. Chem. 257 286-288 (1982)中所述,將本發(fā) 明抗體的Fab’片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。還任選在脂質(zhì)體中包含抗腫瘤劑、 生長抑制劑、或化療劑(諸如多柔比星(Doxorubicin))。參見Gabizon et al.,J. National Cancer Inst. 81(19) 1484(1989)。IV.使用抗α 5 β 1抗體的治療方法可以對受試者(例如哺乳動物,諸如人)施用本發(fā)明的抗α5β1抗體來治療涉 及異常血管發(fā)生和/或血管通透性或滲漏的疾病和病癥,包括例如癌癥、眼病、和免疫病癥 (例如自身免疫性病癥)。施用可以通過任何合適路徑,包括例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、或皮下。在一些實施方案中,與第二、第三、或第四藥劑(包括例如抗腫瘤劑、生長抑制劑、 細(xì)胞毒劑、或化療劑)組合地施用本發(fā)明的抗α 5 β 1抗體來治療涉及異常血管發(fā)生和/或 血管通透性或滲漏的疾病或病癥。在一些實施方案中,抗α 5β1抗體偶聯(lián)有別的藥劑。在一些實施方案中,與VEGF拮抗劑組合地施用抗α 5 β 1抗體??功?5 β 1抗體和 別的藥劑(例如VEGF拮抗劑)可以伴隨或序貫施用?;蛘撸茉囌呖梢杂盟鯲EGF拮抗 劑治療,隨后施用所述α 5 β 1拮抗劑,例如用VEGF拮抗劑治療,直至受試者對VEGF拮抗 劑治療沒有響應(yīng),然后受試者用α5β1拮抗劑治療。依照一個實施方案,受試者在癌是非 侵入性的時候用VEGF拮抗劑治療,而在癌是侵入性的時候用α5β1拮抗劑治療。有些與 無病患者或?qū)φ障啾忍烊唤?jīng)歷升高的α 5 β 1水平或者響應(yīng)VEGF拮抗劑療法而經(jīng)歷升高的 α 5β 1水平的患者可以是尤其對此聯(lián)合療法有響應(yīng)的。本發(fā)明涵蓋還包括治療劑(例如抗 腫瘤劑、化療劑、生長抑制劑和細(xì)胞毒劑)的組合(combination)。例如,有待用化療(例 如伊立替康)和α 5β1拮抗劑治療的患者或已經(jīng)用化療和α 5β1拮抗劑治療過的患者可 受益于VEGF拮抗劑療法?;蛘?,已經(jīng)用化療和VEGF拮抗劑治療過的患者可受益于α5β1 拮抗劑療法。在一個優(yōu)選的實施方案中,所述抗VEGF抗體是Avastin 抗體。在另一個優(yōu) 選的實施方案中,所述抗α5β1抗體是本文所述抗α5β1抗體。涵蓋包含VEGF拮抗劑、 α 5 β 1拮抗劑、任選和化療劑的試劑盒。癌癥治療可以通過例如但不限于腫瘤消退、腫瘤體積或大小收縮、距進(jìn)展的時間、 存活持續(xù)時間、無進(jìn)展存活、整體響應(yīng)率、響應(yīng)持續(xù)時間、生活質(zhì)量、蛋白質(zhì)表達(dá)和/或活性 來評估。因為本文所述抗血管發(fā)生劑靶向腫瘤血管結(jié)構(gòu)而不必是贅生性細(xì)胞本身,所以它 們代表了一類獨特的抗癌藥,并因此可以要求獨特的對藥物的臨床應(yīng)答的測量和定義。例
      38如,二維分析中大于50%的腫瘤收縮是宣告響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)截留(cut-off)。然而,本發(fā)明的 α5β1拮抗劑和VEGF拮抗劑可以引起對轉(zhuǎn)移性擴散的抑制而沒有原發(fā)腫瘤的收縮,或者 可以僅僅發(fā)揮抑制腫瘤效果。因而,可采用測定治療功效的方法,包括例如測量血管發(fā)生的 血漿或尿液標(biāo)志物和通過放射學(xué)成像測量響應(yīng)。取決于待治療的適應(yīng)癥和本領(lǐng)域熟練醫(yī)師所熟悉的與劑量給藥有關(guān)的因素,以有 效治療該適應(yīng)癥同時最小化毒性和副作用的劑量施用本發(fā)明的抗體。為了治療癌癥、自身 免疫病或免疫缺陷病,治療有效量可以在例如50mg/劑到2. 5g/m2的范圍內(nèi)。在一個實施 方案中,所施用的劑量是大約250mg/m2到大約400mg/m2或500mg/m2。在另一個實施方案 中,劑量是大約250-375mg/m2。在又一個實施方案中,劑量范圍是275_375mg/m2。對年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)治療的評估包括但不限于進(jìn)一步視力喪失速率的降 低或進(jìn)一步視力喪失的阻止。對于AMD療法,體內(nèi)功效可以通過例如下述一項或多項來測 量評估最好矯正視力(BCVA)自基線到期望時間的均值變化;評估在期望時間與基線相比 視力損失小于15個字母的受試者比例;評估在期望時間與基線相比視力獲得超過或等于 15個字母的受試者比例;評估在預(yù)期時間Snellen視力相當(dāng)于20/2000或更差的受試者比 例;評估NEI視覺功能問卷(Visual Functioning Questionnaire);評估預(yù)期時間CNV的 大小和CNV滲漏的量,通過熒光素血管造影術(shù)評估;等等。V.藥物配制劑抗α 5β 1抗體可以與合適的載體或賦形劑一起配制,使得它們適合于施用。合 適的抗體配制劑通過將具有期望純度的抗體與任選的藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑 (Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 16 版,0sol,A.編(1980))混合來獲得,處 于凍干配制劑或水溶液的形式。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對 接受者是無毒的,包括緩沖劑,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血 酸和甲硫氨酸;防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨;氯化己烷雙胺;苯扎氯銨、苯索 氯銨;酚、丁醇或苯甲醇;對羥基苯甲酸烷基酯,諸如對羥基苯甲酸的甲酯或丙酯;鄰苯二 酚;間苯二酚;環(huán)己醇;3-戊醇;和間甲酚);低分子量(少于約10個殘基)多肽;蛋白質(zhì), 諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,諸如 甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸;單糖、二糖和其它碳水化合物,包括 葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA ;糖類,諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成鹽 反荷離子,諸如鈉;金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物);和/或非離子表面活性劑,諸如 TWEEN 、PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。例示性的抗體配制劑記載于WO 98/56418,在此 明確收入作為參考。適于皮下施用的凍干配制劑記載于WO 97/04801。此類凍干配制劑可 用合適的稀釋劑重建至高蛋白質(zhì)濃度,重建的配制劑可皮下施用于本文中待治療的哺乳動 物。本文中的配制劑還可含有超過一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物,優(yōu)選 那些活性互補且彼此沒有不利影響的化合物。例如,可能希望進(jìn)一步提供抗腫瘤劑、生長抑 制劑、細(xì)胞毒劑、或化療劑。合適的是,此類分子以對于預(yù)定目的有效的量組合存在。此類 其它藥劑的有效量取決于配制劑中存在的抗體的量、疾病或病癥或治療的類型、及上文討 論的其它因素。這些通常是以與本文所述相同的劑量,以本文所述施用路徑而使用的,或是 迄今所采用的劑量的大約1_99%。
      活性成分還可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如 分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊),在膠狀藥物投遞系統(tǒng) 中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊),或在粗滴乳狀液中。此類 技術(shù)披露于例如 Remington' sPharmaceutical Sciences,第 16 版,Osol,A.編(1980)??芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有拮抗劑的固體疏水性聚 合物半透性基質(zhì),該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式,例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括 聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利 No. 3,773,919)、L_谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解 的乳酸_乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成 的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。脂轉(zhuǎn)染劑(Iipofectin)或脂質(zhì)體也可用于將本發(fā)明的多肽和抗體或組合物投遞 到細(xì)胞中。在使用抗體片段時,優(yōu)選特異性結(jié)合靶蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的最小抑制性片 段。例如,基于抗體的可變區(qū)序列,可設(shè)計保留結(jié)合靶蛋白質(zhì)序列的能力的肽分子。此類 肽可以化學(xué)合成和/或通過重組DNA技術(shù)生成(參見例如Marasco et al.,PNAS USA 90 7889-7893(1993))?;钚猿煞诌€可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如 分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、在膠狀藥物投遞系統(tǒng) 中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或在粗滴乳狀液中。此類 技術(shù)公幵于例如 Remington' sPharmaceutical Sciences,見上文??芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合 物半透性基質(zhì),該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式,例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括 聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利 3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸、-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降 解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPR0NDEP0T (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成 的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等 聚合物能夠釋放分子達(dá)100天以上,但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時間較短。當(dāng)膠囊化抗 體在體內(nèi)長時間維持時,它們可能由于暴露于37°C的潮濕環(huán)境而變性或聚集,導(dǎo)致生物學(xué) 活性損失和免疫原性可能改變??梢愿鶕?jù)相關(guān)機制來設(shè)計合理的穩(wěn)定化策略。例如,如果 發(fā)現(xiàn)聚集機制是經(jīng)由硫醇_ 二硫化物互換的分子間S-S鍵形成,那么可通過修飾巰基殘基、 由酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發(fā)特定聚合物基質(zhì)組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實 現(xiàn)。VI.使用抗α 5 β 1抗體的診斷和成像方法經(jīng)標(biāo)記的、特異性結(jié)合α 5β 1多肽的抗α 5β 1抗體及其衍生物和類似物可用 于診斷目的,以檢測、診斷、或監(jiān)測與α 5β1的表達(dá)、異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病和/ 或病癥。例如,本發(fā)明的抗α5β1抗體可用于原位(in situ)、體內(nèi)(invivo)、離體(ex vivo)、和體外(in vitro)診斷測定法或成像測定法。用于檢測α 5β 1多肽的表達(dá)的方法,包括(a)使用一種或多種本發(fā)明抗體測定個 體的細(xì)胞(例如組織)或體液中多肽的表達(dá),并(b)將基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)水平進(jìn)行比較,由此所測定基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平相比的升高或降低指示異常表達(dá)。本發(fā)明別的實施方案包括診斷動物(優(yōu)選哺乳動物,諸如人)中與α5β1表達(dá) 或異常表達(dá)有關(guān)的疾病或病癥的方法。所述方法包括檢測哺乳動物中的α5β1分子。在 一個實施方案中,在施用VEGF拮抗劑后,診斷包括(a)對哺乳動物施用有效量的經(jīng)標(biāo)記抗 α5β 1抗體,(b)在施用后等待一段時間,容許經(jīng)標(biāo)記α 5 β 1抗體優(yōu)先在受試者中α 5 β 1 分子表達(dá)的部位集中(及未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記分子清除至背景水平);(c)測定背景水平;并 (d)檢測受試者中的經(jīng)標(biāo)記分子,其中檢測到經(jīng)標(biāo)記分子高于背景水平指示受試者患有與 α 5β 1表達(dá)或異常表達(dá)有關(guān)的特定疾病或病癥。背景水平可以通過多種方法來測定,包括 將檢測到的經(jīng)標(biāo)記分子的量與事先為特定系統(tǒng)測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。本發(fā)明的抗α 5β1抗體還用于測定生物學(xué)樣品中的蛋白質(zhì)水平,其中使用本領(lǐng) 域技術(shù)人員知道的經(jīng)典免疫組織學(xué)方法(參見例如Jalkanen, et al.,J. Cell. Biol. 101 976-985(1985) Jalkanen, et al.,J. Cell. Biol. 105 :3087_3096 (1987))??捎糜跈z測蛋 白質(zhì)基因表達(dá)的其它基于抗體的方法包括免疫測定法,諸如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA) 和放射免疫測定法(RIA)。合適的抗體測定法標(biāo)記物是本領(lǐng)域知道的,包括酶標(biāo)記物,諸 如葡萄糖氧化酶;放射性同位素,諸如碘(1311、1251、1231、1211)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦 (ι )、锝(99Tc、9,c)、鉈(201Ti)、鎵(6W7Ga)、鈀(103Pd)、銷(99Mo), 氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177LU、159Gd、149Pm、14°La、175Yb、166H0、9°Y、47SC、186Re、188Re、142Pr、1(l5Rh、 97Ru ;魯米諾;熒光標(biāo)記物,諸如熒光素和羅丹明;及生物素。本領(lǐng)域已知的技術(shù)可應(yīng)用于本發(fā)明的經(jīng)標(biāo)記抗體。此類技術(shù)包括但不限于使用 雙功能偶聯(lián)劑(參見例如美國專利 No. 5,756,065 ;5, 714, 631 ;5,696,239 ;5,652,361 ; 5,505,931 ;5,489,425 ;5,435,990 ;5,428,139 ;5,342,604 ;5,274,119 ;4,994,560 ; 5,808,003)。依照一個具體的實施方案,α 5 β 1多肽表達(dá)或過表達(dá)是在施用VEGF拮抗劑治療 劑后的診斷或預(yù)后測定法中測定的,即評估在細(xì)胞表面上存在的α 5 β 1水平(例如經(jīng)免疫 組化測定法,使用抗α5β1抗體)。或者/另外,可以測量細(xì)胞中編碼α5β1多肽的核酸 或mRNA的水平,例如經(jīng)熒光原位雜交,使用基于核酸的探針,其對應(yīng)于編碼α 5β 1的核酸 或其互補序列(FISH ;參見W098/45479,公布于1998年10月)、Southern印跡、Northern 印跡、或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù),諸如實時定量PCR(RT-PCR)。還可以通過測量生物學(xué) 流體諸如血清中的脫落抗原來研究α 5β1過表達(dá),例如使用基于抗體的測定法(還可參 見例如美國專利No. 4,933,294,公告于1990年6月12日;W091/05264,公布于1991年4 月 18 日;美國專利 No. 5,401,638,公告于 1995 年 3 月 28 日;及 Sias et al.,J. Immunol. Methods 132 :73_80 (1990))。在上述測定法以外,多種體內(nèi)和離體測定法可供熟練從業(yè)人 員使用。例如,可以將哺乳動物身體內(nèi)的細(xì)胞暴露于抗體,其任選用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記,例 如放射性同位素,并可以評估抗體的結(jié)合,例如通過外部掃描放射性或通過分析取自先前 暴露于抗體的哺乳動物的樣品(例如活檢或其它生物學(xué)樣品)。VII.制品和試劑盒本發(fā)明的另一個實施方案是包含可用于治療癌癥(例如腫瘤)、眼病(例如濕性 AMD)或自身免疫病和相關(guān)疾患的物質(zhì)的制品。所述制品可以包括容器及容器上或與容器相 聯(lián)系的標(biāo)簽或包裝插頁。合適的容器包括例如藥瓶、藥管、注射器等。所述容器可以用多種
      41材料制成,諸如玻璃或塑料。一般而言,所述容器裝有有效治療所述疾患的組合物,可以具 有無菌存取口(例如所述容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或帶有皮下注射針可刺穿的塞子的藥 瓶)。所述組合物中的至少一種活性藥劑是本發(fā)明的VEGF拮抗劑或α 5β 1拮抗劑或VEGFR 激動劑或α5β1激動劑。所述標(biāo)簽或包裝插頁指明該組合物用于治療所述具體疾患。所 述標(biāo)簽或包裝插頁進(jìn)一步包含關(guān)于對患者施用所述抗體組合物的說明書。還涵蓋包含本文 所述聯(lián)合療法的制品和試劑盒。包裝插頁指通常包括在治療用產(chǎn)品商品化包裝中的說明書,它包含有關(guān)此類治療 用產(chǎn)品使用的適應(yīng)癥、用法、劑量、施用、禁忌和/或警告的信息。在一個實施方案中,包裝 插頁指明該組合物用于治療非何杰金氏淋巴瘤。另外,所述制品可進(jìn)一步包括第二容器,其中裝有藥學(xué)可接受緩沖液,諸如注射用 抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可進(jìn)一步包括從 商業(yè)和用戶立場出發(fā)需要的其它物質(zhì),包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針和注射器。還提供了可用于各種目的的試劑盒,例如用于分離或檢測患者中的α 5β 1和/ 或VEGF,任選聯(lián)合所述制品。為了分離和純化α 5β 1,所述試劑盒可包含與珠子(例如 sepharose珠子)偶聯(lián)的抗α 5 β 1抗體??商峁┌糜讦?5 β 1和/或VEGF體外檢測 和定量的抗體,例如在ELISA或Western印跡中進(jìn)行的。與制品一樣,所述試劑盒包括容器 及容器上或與容器相聯(lián)系的標(biāo)簽或包裝插頁。例如,所述容器裝有包含至少一種本發(fā)明抗 α5β1抗體的組合物。可包括裝有例如稀釋劑和緩沖液、對照抗體的別的容器。所述標(biāo)簽 或包裝插頁可提供該組合物的描述以及意圖體外或診斷使用的說明書。除非另有說明,實施例中提及的商品化試劑依照制造商的說明書使用。下文實 施例和整篇說明書中以ATCC編號所鑒別的那些細(xì)胞的來源是美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection,Manassas,VA)。除非另有說明,本發(fā)明使用重 組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)流程,諸如上文及以下教科書中所記載的那些Sambrook et al.,見 上文;Ausubel et al. , Current Protocols inMolecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N. Y. , 1989 ;Innis et al. ,PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N. Y. ,1990 ;Harlow et al., Antibodies :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988 ;Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984 ;Freshney, Animal CellCulture, 1987 ;Coligan et al. , Current Protocols in Immunology,1991。將本文中所引用的所有出版物(包括專利和專利申請)完整收入本文作為參考, 具體包括2006年3月21日提交的美國臨時申請No. 60/784,704 ;2006年3月22日提交的 美國臨時申請No. 60/785,330 ;和2006年12月22日提交的美國臨時申請No. 60/871,743。以下DNA序列根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection (ATCC),10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209,USA),如下所述材料保藏號 保藏日α 5/ β 1 7Η5. 4. 2. 8 ΡΤΑ—7421 2006 年 3 月 7 日本文保藏是依據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)及其(布達(dá)佩斯條約)實施細(xì)則的規(guī)定進(jìn)行的。這保證了自保藏之日起保存保藏的存活培養(yǎng)物30年。保藏物可根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款通過ATCC獲得,并服從Genentech 公司與ATCC之間的協(xié)議,它保證了在有關(guān)美國專利授權(quán)后或者在任何美國或外國專利申 請向公眾公開后,以兩者中居先者為準(zhǔn),公眾可永久且不受限制的獲得保藏培養(yǎng)物的后代, 而且保證了依據(jù)35 U. S. C. 122及依照它的管理章程(包括37 C. F. R. 1. 14,特別要提及 8860G 638)由美國專利和商標(biāo)局長批準(zhǔn)的個人將有資格獲得保藏培養(yǎng)物的后代。本申請的受讓人已同意,若保藏材料的培養(yǎng)物在合適條件下培養(yǎng)時死亡、丟失或 遭到破壞,則他將在接到通知后迅速用同一培養(yǎng)物的另一份材料更換。所保藏材料的可獲 得性并不解釋為對違反任何政府機構(gòu)依據(jù)其專利法所授予的權(quán)利實施本發(fā)明的許可。除非另有說明,實施例中提及的商品化試劑依照制造商的說明書使用。下文實 施例和整篇說明書中以ATCC編號所鑒別的那些細(xì)胞的來源是美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection,Manassas,VA)。除非另有說明,本發(fā)明使用重 組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)流程,諸如上文及以下教科書中所記載的那些Sambrook et al.,見 上文;Ausubel et al. , Current Protocols inMolecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N. Y. , 1989 ;Innis et al. ,PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N. Y. ,1990 ;Harlow et al., Antibodies :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988 ;Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984 ;Freshney, Animal CellCulture, 1987 ;Coligan et al. , Current Protocols in Immunology,1991。認(rèn)為前述書面描述足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。提供下述實施例僅出 于例示目的,并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實際上,根據(jù)上面的描述,在本文所 顯示和描述之外,本發(fā)明的多種修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的,而且落在所附權(quán) 利要求的范圍內(nèi)。
      實施例(1)直接將⑶R嫁接到受體人共有框架上用于此項工作的噬菌粒是單價Fab_g3展示載體,基本上如Lee et al.,J. Mol. Biol. 340 1073-93 (2004)中所記載的。將來自小鼠單克隆抗體7H5序列的高變序列嫁接 到人共有Kl(huKI)和人亞組III共有VH(huIII)域上。為了制備⑶R嫁接物,使用在3 個位置與人亞組III共有VH域不同的受體VH框架R71A、N73T、和L78A (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285 (1992))。 (2)對人源化7H5. vl的⑶R天冬酰胺的修飾使用針對每個位置的不同寡核苷酸通過Kimkel誘變實現(xiàn)各個位置用其它殘基進(jìn) 行的替代。利用噬菌體競爭ELISA對在噬菌體上單價展示為Fab的所有變體評估對人整聯(lián) 蛋白α5β1的結(jié)合親和力(IC50),見圖4。圖5總結(jié)了與親本人源化7Η5. vl相比損失或 改進(jìn)的結(jié)合親和力的相對倍數(shù)。結(jié)合親和力的IC50值是通過圖6中的噬菌體競爭ELISA 測定的。如所示的,選擇兩種變體h7H5. v2和h7H5. v3來包括⑶R-H2第65位甘氨酸替代, 克隆入hlgGl載體,并使用BIAcore設(shè)備評估結(jié)合親和力。在圖7中,BIAcore結(jié)合分析指 示人源化7H5. v2確實略微改善了結(jié)合親和力至亞納摩爾水平。(3)對人源化7H5. v2的框架修飾
      突變了下述位置h7H5. v2中輕鏈第46位(T46L),重鏈第48位(I48V)、第49位 (G49S)、第 66 位(K66R)、第 67 位(A67F)、第 69 位(L69I)和第 78 位(A78L)。另外,還突變 了重鏈第30位(T30S)。使用不同寡核苷酸通過Kimkel誘變生成每個位置的突變。利用噬菌體競爭ELISA 評估所有變體。在噬菌體上展示單價Fab。測定對人整聯(lián)蛋白α 5β 1的結(jié)合親和力(IC50)。 圖8顯示了與親本克隆相比,大多數(shù)突變?nèi)员A粝嗤降慕Y(jié)合親和力,除了具有重鏈第 49位(G49S)和第78位(A78L)變化的兩種變體。因此,通過包括所有下述突變生成了人源化7Η5. ν4和v5 輕鏈第46位(T46L), 重鏈第 30 位(T30S)、第 48 位(I48V)、第 66 位(K66R)、第 67 位(A67F)和第 69 位(L69I), 只在重鏈第49位不同。使用BIAcore設(shè)備測定了這兩種變體的結(jié)合親和力。圖9顯示了 h7H5. v4保留與其親本克隆人源化7H5. v2相同水平的結(jié)合親和力。(4)噬菌體競爭ELISA將MAXIS0RP 微量滴定板用PBS中的5 μ g/ml重組人整聯(lián)蛋白α 5 β 1 (R&D)包 被過夜,然后用PBST緩沖液(PBS中的0. 5% BSA和0. 05% Tween 20)于室溫封閉1小時。 將來自培養(yǎng)物上清液的噬菌體與連續(xù)稀釋的人整聯(lián)蛋白α 5β 1 —起在PBST緩沖液中在組 織培養(yǎng)微量滴定板中溫育1小時,之后將80 μ 1混合物轉(zhuǎn)移至經(jīng)靶物包被的孔達(dá)15分鐘以 捕捉未結(jié)合的噬菌體。用PBT緩沖液(PBS中的0. 05% Tween 20)清洗板,并添加偶聯(lián)有 HRP 的抗 Ml3 (Amersham Pharmacia Biotech)(在 PBST 緩沖液中 1 5000)達(dá) 40 分鐘。用 PBT緩沖液清洗板,并通過添加四甲基聯(lián)苯胺底物(Kirkegaard and PerryLaboratories, Gaithersburg, MD)來顯色。將450nm吸光度作為溶液中靶物濃度的函數(shù)來繪圖以確定噬 菌體IC5(1。這用作在噬菌體表面上展示的Fab克隆的親和力估值。(5) IgG生成和通過BIAcore實驗進(jìn)行的抗體親和力測定將感興趣克隆(嵌合的7H5,人源化的7H5. vl、v2、v3、v4、和v5)重定格式入人 IgGl pRK載體(Carter et al.,PNAS USA, 89 :4285_4289 (1992)),在 CHO 細(xì)胞中瞬時表達(dá),
      并用蛋白A親和層析純化。親和力測定是使用BIAC0RE -3000設(shè)備通過表面等離振子共振實施的。固定化 是通過使用由制造商提供的方案經(jīng)由氨基的隨機偶聯(lián)實現(xiàn)的。運行兩種不同格式以研究抗 體對人整聯(lián)蛋白α5β1的結(jié)合動力學(xué)。在圖3Α、7、和9Α中,在CM5傳感器芯片上固定化 450個響應(yīng)單位(RU)左右的抗體,并于25V以30 μ 1/min的流速注射在PBT緩沖液(PBS 中的0. 05% Tween 20)中2倍連續(xù)稀釋濃度的人整聯(lián)蛋白α 5 β 1 (300ηΜ至0. 29ηΜ)。在 圖3Β和9Β中,在CM5傳感器芯片上固定化800個RU左右的人整聯(lián)蛋白α 5 β 1,并于25°C 以30 μ 1/min的流速注射在PBT緩沖液(PBS中的0. 05% Tween 20)中2倍連續(xù)稀釋濃度 的抗體。每次注射后,使用PH1.7的IOmM甘氨酸-HCl緩沖液再生芯片。通過減去來自空 白流動室的RU來修正結(jié)合響應(yīng)。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)計算結(jié)合速率(kj 和解離速率(k。ff)。以比率 k。ff/ k。n計算平衡解離常數(shù)(Kd)。(6)皮膚傷口愈合測定法在研究中使用新西蘭白色家兔以證明人源化7H5抗體的功效。使用無菌技術(shù),使 用圓形8mm活檢打孔器產(chǎn)生傷口,深度到耳軟骨,并用骨膜起子(periosteal elevator)和精細(xì)剪刀(fine scissors)除去下面的軟骨膜。每天監(jiān)測每個傷口的總體外觀,直至研究 結(jié)束。在第0、7、14、21、和28天進(jìn)行傷口間隙測量。在第28天對所有動物處以安樂死。進(jìn) 行了兩組皮膚傷口愈合實驗。第一組使用下述研究組,每組5只動物,每只動物兩個傷口 (1)陰性對照 IgG(200yg/30y 1/傷口 每天);(2)h7H5. v2 (100 μ g/30 μ 1/傷口 每天);(3)抗 VEGF 抗 體(100 μ g/30 μ 1/傷口每天);和(4)與抗VEGF抗體(100 μ g/15 μ 1/傷口每天)組合的 1!7!1512(10(^8/15 4 1/傷口每天)??贵w是局部應(yīng)用的。圖10描繪了結(jié)果,證明了(1) 單獨施用h7H5. V2或抗VEGF抑制傷口愈合;而且⑵組合施用h7H5. v2和抗VEGF抗體增 強單獨的抗VEGF抗體對傷口愈合的效果。第二組實驗使用下述研究組,每組5只動物,每只動物兩個傷口 (1)陰性對照 IgG(200yg/30y 1/傷口 每天);(2)h7H5. ν4(100 μ g/30 μ 1/傷口 每天);(3)抗 VEGF 抗 體(100 μ g/30 μ 1/傷口每天);和(4)與抗VEGF抗體(100 μ g/15 μ 1/傷口每天)組合的 1!7!1514(10(^8/15 4 1/傷口每天)。抗體是局部應(yīng)用的。圖11描繪了結(jié)果,證明了(1) 單獨施用h7H5. V4或抗VEGF抑制傷口愈合;而且(2)組合施用h7H5. v4和抗VEGF抗體增 強單獨的抗VEGF抗體對傷口愈合的效果。在此通過述及完整收錄本文中所引用的所有出版物(包括例如專利、已公布的專 利申請、和Genbank編號)用于所有目的,就像明確地和單獨地通過述及而收錄每篇參考文
      獻(xiàn)一樣。
      權(quán)利要求
      一種抗α5β1抗體,其包含輕鏈可變域序列和重鏈可變域序列,該輕鏈可變域序列包含(1)包含氨基酸序列KASQ-N/S-VGSDVA(SEQ ID NO10)的LHVR1、(2)包含氨基酸序列STSYRYS(SEQ ID NO11)的LHVR2和(3)包含氨基酸序列QQY-N/S-SYPFT(SEQ ID NO12)的LHVR3,該重鏈可變域序列包含(1)包含氨基酸序列GYTF-T/S-DYYLY(SEQ ID NO13)的HHVR1、(2)包含氨基酸序列GISPS-N/S-GGTTF-N/A-D-N/A-FE-N/G(SEQ ID NO14)的HHVR2和(3)包含氨基酸序列DAYGDWYFDV(SEQID NO15)的HHVR3。
      2.一種抗α 5β1抗體,其包含輕鏈可變域和重鏈可變域,該輕鏈可變域具有SEQ ID NO :1、2、3、或4任一所列序列或其變體,該重鏈可變域具有SEQ ID NO :5、6、7、8、或9任一 所列序列或其變體。
      3.依照權(quán)利要求2的抗體,其中所述輕鏈可變域具有SEQID NO :3所列序列且所述重 鏈可變域具有SEQ ID NO :8所列序列。
      4.依照權(quán)利要求2的抗體,其中所述重鏈可變域變體序列包含在選自下組的殘基處的 氨基酸替代:30、48、49、54、60、62、65、66、67 和 69。
      5.依照權(quán)利要求2的抗體,其中所述輕鏈可變域包含在選自下組的殘基處的氨基酸替 代:28、46 和 92。
      6.依照權(quán)利要求4的抗體,其中所述氨基酸替代選自下組T30S、I48V、G49S、N54S、 N60A、N62A、N62S、N65G、K66R、A67F 和 L69I。
      7.依照權(quán)利要求5的抗體,其中所述輕鏈可變域包含選自下組的氨基酸替代N28S、 T46L 和 N92S。
      8.依照權(quán)利要求1、2、或3的抗體,其中所述抗體不結(jié)合ανβ3或ανβ5或ανβ1。
      9.依照權(quán)利要求1的抗體,其中所述抗體包含人IgG的Fc序列。
      10.依照權(quán)利要求9的抗體,其中所述人IgG是hlgGl或hIgG4。
      11.依照權(quán)利要求9的抗體,其中所述抗體包含缺乏抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC) 效應(yīng)器功能的Fc序列。
      12.依照權(quán)利要求11的抗體,其中所述Fc序列包含D265A替代。
      13.依照權(quán)利要求1的抗體,該抗體選自下組:Fab、Fab,、F(ab),2、單鏈Fv(ScFv)、Fv 片段、雙抗體和線性抗體。
      14.依照權(quán)利要求1的抗體,其中所述抗體是多特異性抗體。
      15.依照權(quán)利要求1的抗體,其偶聯(lián)有治療劑。
      16.依照權(quán)利要求15的抗體,其中所述治療劑選自下組細(xì)胞毒劑、放射性同位素和化 療劑。
      17.依照權(quán)利要求1的抗體,其偶聯(lián)有標(biāo)記物。
      18.依照權(quán)利要求17的抗體,其中所述標(biāo)記物選自下組放射性同位素、熒光染料和酶。
      19.一種分離的核酸分子,其編碼權(quán)利要求1的抗體。
      20.一種表達(dá)載體,其編碼權(quán)利要求19的核酸分子。
      21.一種細(xì)胞,其包含權(quán)利要求20的表達(dá)載體。
      22.—種生產(chǎn)抗體的方法,包括培養(yǎng)權(quán)利要求21的細(xì)胞并自細(xì)胞培養(yǎng)物回收抗體。
      23.一種組合物,其包含權(quán)利要求1的抗體和藥學(xué)可接受載體。
      24.一種在來自患者的樣品中檢測α 5β 1蛋白質(zhì)的方法,其通過使權(quán)利要求1的抗體 接觸樣品并檢測結(jié)合至α 5β 1蛋白質(zhì)的抗α 5β 1抗體來進(jìn)行。
      25.依照權(quán)利要求24的方法,其中在免疫組織化學(xué)測定法(IHC)中或在ELISA測定法 中使用抗體。
      26.權(quán)利要求1的抗體在制備用于在受試者抑制血管發(fā)生和/或血管通透性或滲漏的 藥物中的用途。
      27.權(quán)利要求1的抗體在制備用于在受試者治療疾病的藥物中的用途,其中所述疾病 具有異常的血管發(fā)生或血管通透性或滲漏。
      28.—種在患有疾病的受試者中抑制血管發(fā)生和/或血管通透性或滲漏的方法,包括 施用VEGF拮抗劑和權(quán)利要求1的抗α 5 β 1抗體。
      29.一種用于在受試者治療癌癥的方法,包括施用VEGF拮抗劑和權(quán)利要求1的抗 α 5 β 1抗體。
      30.一種用于在受試者中治療眼病的方法,包括施用VEGF拮抗劑和權(quán)利要求1的 α 5 β 1抗體。
      31.一種用于在受試者中治療自身免疫性疾病的方法,包括施用VEGF拮抗劑和權(quán)利要 求1的α 5 β 1抗體。
      32.依照權(quán)利要求30的方法,其中所述受試者在患病組織中沒有與來自未患病受試者 的組織相比升高的α 5 β 1水平。
      33.依照權(quán)利要求28-32任一項的方法,其中對所述受試者進(jìn)一步施用選自下組的治 療劑抗腫瘤劑、化療劑、生長抑制劑和細(xì)胞毒劑。
      34.依照權(quán)利要求28-32任一項的方法,其中所述VEGF拮抗劑對人VEGF的結(jié)合能被 .Avastin 抗體競爭性抑制。
      35.依照權(quán)利要求34的方法,其中所述VEGF拮抗劑是Avastin 抗體。
      36.一種組合物,其包含VEGF拮抗劑、權(quán)利要求1的抗體和藥學(xué)可接受抑制劑。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及VEGF拮抗劑和新型抗α5β1抗體用于治療癌癥和抑制血管發(fā)生和/或血管通透性的用途,包括抑制疾病中的異常血管發(fā)生。本發(fā)明還涉及包含新型抗α5β1抗體的組合物和試劑盒及制備和使用它們的方法。
      文檔編號A61P35/00GK101888878SQ200880117702
      公開日2010年11月17日 申請日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月26日
      發(fā)明者葉偉蘭, 吳雁, 格雷戈里·D·普洛曼, 梁偉慶 申請人:健泰科生物技術(shù)公司
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