專利名稱：表達(dá)生物治療分子的治療基因開關(guān)構(gòu)建物和生物反應(yīng)器以及它們的應(yīng)用的制作方法
表達(dá)生物治療分子的治療基因開關(guān)構(gòu)建物和生物反應(yīng)器以
及它們的應(yīng)用發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及通過將治療基因開關(guān)構(gòu)建物(therapeutic gene switch construct) 引入某對象來治療、緩解或預(yù)防該對象中疾病、病癥或病狀的方法和組合物，所述構(gòu)建物控 制一種或多種治療產(chǎn)物的表達(dá)。在進一步的實施方式中，本發(fā)明涉及通過將“生物反應(yīng)器” 引入某對象來治療、緩解或預(yù)防該對象中疾病、病癥或病狀的方法和組合物，所述“生物反 應(yīng)器”是由分泌治療性蛋白質(zhì)的一個或多個細(xì)胞構(gòu)成的治療性植入物。生物反應(yīng)器可以通 過包裹化而是免疫分離的，或是非免疫分離的。在具體的實施方式中，生物反應(yīng)器包含治療 基因開關(guān)構(gòu)建物。
背景技術(shù)：
通過將編碼治療分子，例如治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸引入對象的細(xì) 胞，或?qū)⒎置谥委煼肿拥墓こ谈脑斓男揎椉?xì)胞引入對象來治療或預(yù)防該對象中疾病的概念 已存在了數(shù)年。該概念的幾個實際問題阻礙了成功治療的發(fā)展。將遺傳材料直接引入待治 療對象的難點例如有遞送的安全性、在充足的時期內(nèi)獲得表達(dá)水平充足的治療產(chǎn)物、治療 產(chǎn)物至所需細(xì)胞的表達(dá)有限和調(diào)節(jié)或刺激治療產(chǎn)物表達(dá)的能力的保持，包括如果不再需要 可關(guān)閉治療產(chǎn)物表達(dá)的能力。基于細(xì)胞的治療會通過對象的免疫反應(yīng)而受排斥，因此，開發(fā) 了免疫分離方案，例如細(xì)胞包裹化方法來增加所植入細(xì)胞的壽命并能利用異種細(xì)胞，即，不 同物種的細(xì)胞。目前的包裹化或非包裹化細(xì)胞治療經(jīng)工程改造能組成型分泌治療蛋白質(zhì)。 一旦植入，蛋白質(zhì)分泌即不能調(diào)節(jié)。為提高直接或細(xì)胞介導(dǎo)的生物反應(yīng)器治療蛋白遞送的 安全性和臨床應(yīng)用，優(yōu)選能關(guān)閉蛋白質(zhì)產(chǎn)生或調(diào)節(jié)發(fā)生蛋白質(zhì)產(chǎn)生的速度。因此，本領(lǐng)域需要提供這些理想特征的新診斷方法和組合物。發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療、緩解或預(yù)防對象中疾病、病癥或病狀的方法和組合物。在一個實施方式中，本發(fā)明提供治療、緩解或預(yù)防對象中疾病、病癥或病狀的方 法，包括(a)將以下多核苷酸引入所述對象(1)編碼基因開關(guān)(gene switch)的第一多 核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個與治療開關(guān)啟動子(therapeutic switchpromoter)操 作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，其 中所述治療開關(guān)啟動子是組成型活化的，和(2)與因子調(diào)節(jié)的啟動子(factor-regulated promoter)操作性相連的編碼治療多肽或治療多核苷酸的第二多核苷酸，該啟動子由所述 配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化，其中，引入所述第一和第二多核苷酸從而使得它們在有配體存 在下表達(dá)；和(b)將配體給予該對象以誘導(dǎo)該治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。本發(fā)明的進一步實施方式提供在對象中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法，包括(a)將以下多核苷酸引入對象(1)編碼基因開關(guān)的第一多核苷酸，所述基因開關(guān) 包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子 序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，其中所述治療開關(guān)啟動子在待治療疾病、病癥或病狀相關(guān) 的情況下活化，和(2)與因子調(diào)節(jié)的啟動子操作性相連的編碼治療多肽或治療多核苷酸的 第二多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化，其中，引入所述第一和第二多核 苷酸從而使得它們在該疾病、病癥或病狀相關(guān)的情況下在該對象中表達(dá)；和(b)將配體給予該對象以誘導(dǎo)該治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。
本發(fā)明的進一步實施方式提供在對象中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法，包 括(a)將以下多核苷酸引入對象(1)編碼基因開關(guān)的第一多核苷酸，所述基因開關(guān) 包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子 序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，其中所述治療開關(guān)啟動子在可通過該治療多肽或治療多核 苷酸治療的疾病、病癥或病狀相關(guān)的情況下活化，和(2)與因子調(diào)節(jié)的啟動子操作性相連 的編碼治療多肽或治療多核苷酸的第二多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活 化，其中，引入所述第一和第二多核苷酸從而所述第一多核苷酸在該疾病、病癥或病狀相關(guān) 的情況下表達(dá)；和(b)將配體給予該對象以誘導(dǎo)該治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。在上述方法中，在一個實施方式中，編碼治療基因開關(guān)的所述第一多核苷酸和與 因子調(diào)節(jié)的啟動子相連的編碼治療多肽或多核苷酸的所述第二多核苷酸是較大多核苷酸， 例如載體的一部分。在另一實施方式中，編碼治療基因開關(guān)的所述第一多核苷酸和與因子 調(diào)節(jié)的啟動子相連的編碼治療多肽或多核苷酸的所述第二多核苷酸是不同的多核苷酸，二 者可作為核酸組合物給予。本發(fā)明還涉及可用于所述方法中的治療基因開關(guān)構(gòu)建物。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明治療基因開關(guān)構(gòu)建物的載體。本發(fā)明還提供在一個或多個修飾細(xì)胞中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法，包 括(a)將以下多核苷酸引入對象從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞(1)編碼基因開關(guān)的第一多 核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中 所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，其中所述治療開關(guān)啟動子在疾病、 病癥或病狀相關(guān)的情況下活化，和(2)與因子調(diào)節(jié)的啟動子操作性相連的編碼治療多肽或 治療多核苷酸的第二多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化，；和(b)將配體給予修飾的細(xì)胞以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明治療基因開關(guān)構(gòu)建物的修飾細(xì)胞。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明修飾細(xì)胞的生物反應(yīng)器器件，所述細(xì)胞未經(jīng)包裹化或經(jīng) 包裹化從而保護細(xì)胞免受對象的免疫系統(tǒng)影響。這種生物反應(yīng)器可采取諸如包被細(xì)胞、微 囊化(microencapsulation)細(xì)胞或大包裹化(macroencapsulation)細(xì)胞等形式。本發(fā)明還涉及實施本發(fā)明方法的試劑盒，其裝有，例如基因開關(guān)構(gòu)建物、載體、配 體等。
附圖簡述

圖1顯示了本發(fā)明治療基因開關(guān)的實施方式，其中編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的兩個不同部分的兩個轉(zhuǎn)錄因子序列受單一啟動子的控制?！癆D"表示反式激活 域；“HP"表示異二聚伴侶結(jié)構(gòu)域(heterodimerization partnerdomain)。AD 和 HP 結(jié)構(gòu) 域表達(dá)為融合蛋白，稱為“共活化蛋白”或“CAP”。“ DBD"表示DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；"LBD" 表示配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。DBD和LBD結(jié)構(gòu)域表達(dá)為融合蛋白，稱為“配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子”或 “LTF”?！稗D(zhuǎn)錄接頭”表示IRES(內(nèi)部核糖體進入位點)或是從單一開放讀框產(chǎn)生兩個不同 蛋白產(chǎn)物的手段?！爸委煯a(chǎn)物序列”表示編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸；“治療 產(chǎn)物”表示治療多肽或治療多核苷酸；“TSP-1”表示組成型治療開關(guān)啟動子、或在疾病、病癥 或病狀相關(guān)條件下活化的治療開關(guān)啟動子。CAP和LTF組合形成配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合 物(LDTFC)，其與配體組合后活化因子調(diào)節(jié)的啟動子(FRP)。圖2顯示了本發(fā)明治療基因開關(guān)的實施方式，其中編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合 物的兩個不同部分的兩個轉(zhuǎn)錄因子序列(CAP和LTF)受不同啟動子的控制。術(shù)語AD、HP、 CAP、DBD、LBD、LTF、“治療產(chǎn)物序列〃、“治療產(chǎn)物〃、TSP、LDTFC和FRP如圖1中的圖 標(biāo)所定義?！癟SP-1”和“TSP-2”表示兩種不同的治療開關(guān)啟動子，二者各自獨立為組成型 啟動子、或在疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下活化的啟動子。在一個實施方式中，TSP-I是組 成型啟動子，TSP-2是在疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下活化的啟動子。CAP和LTF組合形成 LDTFC,其與配體組合后活化FRP。圖3顯示了本發(fā)明治療基因開關(guān)的實施方式，其中可組合形成兩個不同LDTFC的 三個轉(zhuǎn)錄因子序列(CAP、LTF-1和LTF-2)受不同啟動子的控制。術(shù)語AD、HP、CAP、DBD、LBD、 LTF、“治療產(chǎn)物序列〃、“治療產(chǎn)物〃、TSP、LDTFC和FRP如圖1中的圖標(biāo)所定義。DBD-A 表示與LBD融合以形成LTF-I的第一 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；DBD-B表示與LBD融合以形成LTF-2 的第二 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?！爸委煯a(chǎn)物A”表示第一治療多肽或治療多核苷酸；“治療產(chǎn)物B” 表示第二治療多肽或治療多核苷酸；TSP-1、TSP-2和TSP-3表示三種不同的治療開關(guān)啟動 子，三者各自獨立為組成型啟動子、或在疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下活化的啟動子。在一 個實施方式中，TSP-I是組成型治療開關(guān)啟動子，TSP-2和TSP-3各自是在疾病、病癥或病狀 相關(guān)條件下獨立活化的不同治療開關(guān)啟動子。CAP和LTF-I組合形成LDTFC-I，其與配體組 合后活化FRP-I。CAP和LTF-2組合形成LDTFC-2，其與配體組合后活化FRP-2。圖4顯示了本發(fā)明治療基因開關(guān)的實施方式，其中編碼CAP和配體依賴性轉(zhuǎn)錄因 子復(fù)合物的兩個不同LTF部分的三個轉(zhuǎn)錄因子序列不同啟動子的控制。術(shù)語AD、HP、CAP、 DBD、LBD、LTF、“治療產(chǎn)物序列〃、“治療產(chǎn)物〃、TSP、LDTFC和FRP如圖1中的圖標(biāo)所 定義。TSP-I、TSP-2和TSP-3表示三種不同的治療開關(guān)啟動子，三者各自獨立為組成型啟 動子、或在疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下活化的啟動子。在一個實施方式中，TSP-I是組成 型啟動子，TSP-2和TSP-3各自是在疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下獨立活化的不同啟動子。 LTF-I或LTF-2可與CAP組合形成LDTFC-I或LDTFC-2。LDTFC-I或LDTFC-2與配體組合后 活化FRP。圖5是在圖1所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能在缺氧，例如 心肌缺血條件下表達(dá)胰島素生長因子(IGF-I)。圖6是在圖2所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能在缺氧，例如心肌缺血條件下表達(dá)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。圖7是在圖2所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能在缺氧，例如 心肌缺血條件下表達(dá)促紅細(xì)胞生成素(EPO)。圖8是在圖2所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能在缺氧，例如 心肌缺血條件下表達(dá)人B型利鈉肽(BNP)。圖9是在圖2所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能在炎性，例如 心肌缺血條件下表達(dá)組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)。
圖10是在圖3所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能在炎性條件 下表達(dá)松弛素和/或在缺氧的條件下表達(dá)肝細(xì)胞生長因子，兩種條件均與心肌缺血有關(guān)。圖11是在圖2所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能在缺氧，例 如心肌缺血條件下表達(dá)ΕΡ0，其中表達(dá)局限于心臟細(xì)胞。圖12是在圖4所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能在炎性條件 或缺氧，例如心肌缺血條件下表達(dá)IGF-1，其中表達(dá)局限于心臟細(xì)胞。圖13是在圖1所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能在炎性條 件，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的條件下表達(dá)腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白2(Enbrel )。圖14是在圖4所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能對TNF α表 達(dá)起反應(yīng)或在炎性條件下表達(dá)腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白2(Enbrel )，兩種條件均與類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎有關(guān)。圖15是在圖3所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能對在炎性條 件下表達(dá)腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白2 (Enbrel )和/或在HIF-驅(qū)動的缺氧的條件下表達(dá)ΕΡ0， 兩種條件均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)。圖16是在圖1所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能組成型表達(dá) 人因子VIII =Co圖17是在圖2所示方案下構(gòu)建的載體的示意圖，其經(jīng)工程改造從而能在血友病相 關(guān)缺氧條件下表達(dá)人因子VIII :c。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及利用基因開關(guān)在細(xì)胞中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法和組合 物。所述方法和組合物可在體外、離體或體內(nèi)應(yīng)用。本發(fā)明還利用基因開關(guān)控制治療多肽或 治療多核苷酸表達(dá)以便治療、緩解或預(yù)防對象中疾病、病癥或病狀的方法和組合物。本發(fā)明 方法可離體(通過將基因開關(guān)引入對象的分離細(xì)胞或非自體細(xì)胞，并將該修飾細(xì)胞引入該 對象或引入不同對象)或在體內(nèi)(通過將基因開關(guān)直接引入對象的細(xì)胞)進行。本發(fā)明方 法涉及利用配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在一個或多個治療開關(guān)啟動子控制下的基因開關(guān)。 所述方法還包括但不限于應(yīng)用基因開關(guān)技術(shù)將非包裹化和包裹化細(xì)胞治療直接引入待治 療對象。本文所述方法和組合物提供高度特異性和嚴(yán)格調(diào)節(jié)的治療技術(shù)，其中通過將配體 給予包含該基因開關(guān)的細(xì)胞來控制治療產(chǎn)物表達(dá)的水平和定時。提供以下定義以幫助理解本發(fā)明的范圍和實施。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“分離的”指從其原始環(huán)境(其天然存在的環(huán)境)取出的 生物學(xué)材料(細(xì)胞、核酸或蛋白質(zhì))。例如，存在于植物或動物的天然狀態(tài)中的多核苷酸不是分離的，然而，與其天然存在的毗鄰核酸相分離的同一多核苷酸認(rèn)為是“分離的”。適用于生物學(xué)材料的術(shù)語“純化的”不要求該材料的存在形式顯示絕對純 度，排除 其它化合物的存在。其不過是一種相對的定義?！昂怂帷薄ⅰ昂怂岱肿印?、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換使用，指單鏈形式或雙鏈螺 旋形式的核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥 苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或它們的任何磷酸酯類似物，例 如硫代磷酸酯和硫酯。雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。術(shù)語核酸分子， 特別是DNA或RNA分子僅指該分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，并不將其局限于任何具體的三級形 式。因此，該術(shù)語包括在線形或環(huán)狀DNA分子(例如，限制性片段)、質(zhì)粒、超螺旋化DNA和 染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA，等等。討論具體雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時，本文可根據(jù)沿DNA的非 轉(zhuǎn)錄鏈(即，具有與mRNA同源的序列的鏈)僅以5’到3’方向給出序列的正常慣例描述序 列?！爸亟MDNA分子”是經(jīng)過分子生物學(xué)操作的DNA分子。DNA包括但不限于cDNA、基因組 DNA、質(zhì)粒DNA、合成DNA和半合成DNA。本發(fā)明的“核酸組合物”包含本文所述的一種或多 種核酸。應(yīng)用于多核苷酸序列的術(shù)語“片段”指相對于參比核酸長度降低并在共同部分包 含與參比核酸相同的核苷酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明的這種核酸片段可以適當(dāng)?shù)匕?作為其成分的較大多核苷酸中。這種片段包含長度為至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、 23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、 135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000 或更多個本發(fā)明核酸的 連續(xù)核苷酸的寡核苷酸或由它們構(gòu)成。本文所用的“分離的核酸片段”指單鏈或雙鏈RNA或DNA聚合物，任選含有合成、 非天然或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸片段可包含cDNA、基因組DNA 或合成DNA的一個或多個片段?！盎颉敝赴幋a功能分子的核苷酸的多核苷酸，包括僅通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生(例如，生 物活性RNA分子)或通過轉(zhuǎn)錄和翻譯(例如，多肽)的功能分子。術(shù)語“基因”包括cDNA 和基因組DNA核酸。“基因”還指表達(dá)特定RNA、蛋白質(zhì)或多肽的核酸片段，其在編碼序列之 前(5’ -非編碼序列)和之后(3’ -非編碼序列)包含調(diào)控序列?！疤烊换颉敝柑烊话l(fā)現(xiàn) 的包含其本身調(diào)控序列的基因?！扒逗闲突颉敝阜翘烊换虻娜魏位?，其包含未在自然 界中一起發(fā)現(xiàn)的調(diào)控和/或編碼序列。因此，嵌合型基因可包含衍生自不同來源的調(diào)控序 列和編碼序列，或衍生自同一來源的調(diào)控序列和編碼序列，但排列方式不同于天然發(fā)現(xiàn)的。 嵌合型基因可包含衍生自不同來源的編碼序列和/或衍生自不同來源的調(diào)控序列?！皟?nèi)源 性基因”指在生物體的基因組中其天然位置發(fā)現(xiàn)的天然基因?！巴鈦怼被蚧颉爱愒础被蛑?不是宿主機體中正常發(fā)現(xiàn)的，而是通過基因傳遞引入該宿主機體的基因。外來基因可包含 插入非天然機體中的天然基因，或嵌合型基因。“轉(zhuǎn)基因”是通過轉(zhuǎn)化方法引入基因組的基 因?！爱愒碊NA”指不是天然位于細(xì)胞中，或細(xì)胞的染色體位點中的DNA。異源DNA可包 括細(xì)胞的外來基因。術(shù)語“基因組”包括染色體以及線粒體、葉綠體和病毒DNA或RNA。當(dāng)單鏈形式的核酸分子可在合適的溫度和溶液離子強度的條件下與另一核酸分子退火時，稱該核酸分子可與該另一核酸分子，例如cDNA、基因組DNA或RNA “雜交”。雜交 和洗滌條件是本領(lǐng)域熟知的，例子見Sambrook等，刊于Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第二版，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(1989)，特別是其中的第11章和表格11. 1 (通過引用全文納入 本文)。溫度和離子強度的條件決定了雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)性”。
可調(diào)整嚴(yán)謹(jǐn)性條件以篩選適度相似的片段，例如遠(yuǎn)相關(guān)生物體的同源性序列，篩 選高度相似片段，例如復(fù)制極其相關(guān)生物體的功能酶的基因。對于初步篩選同源性核酸，可 采用對應(yīng)于Tm為55°C的低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件，例如，5XSSC、0. 1 % SDS、0. 25 %奶，無甲酰胺； 或者30%甲酰胺、5X SSC、0. 5% SDS。中等嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件對應(yīng)于較高的Tm，例如，40%甲酰 胺，和5X或6X SSC0高度嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件對應(yīng)于最高Tm，例如50%甲酰胺，5X或6X SSC0雜交要求兩個核酸含有互補序列，雖然取決于雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性，但堿基之間的錯配 是可能的。利用術(shù)語“互補”描述能彼此雜交的核苷酸堿基之間的關(guān)系。例如，對于DNAjI 嘌呤與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本發(fā)明還包括與本文所公開或所用完整 序列以及那些基本上相似的核酸序列互補的分離核酸片段。在本發(fā)明的一個實施方式中，采用包括在Tm為55°C實施雜交步驟的雜交條件并利 用上述條件檢測多核苷酸。在其它實施方式中，1是601、631或65°C。雜交后洗滌也決定了嚴(yán)謹(jǐn)性條件。一組條件采用一系列洗滌，開始為6XSSC、0. 5% SDS，室溫下15分鐘(min)；然后替換為2X SSC、0. 5% SDS、45°C，30分鐘；然后是0. 2X SSC、 0.5% SDS，50°C，30分鐘，重復(fù)兩次。優(yōu)選的一組嚴(yán)謹(jǐn)性條件利用較高的溫度，其中洗滌與 上述相同，除了在0. 2XSSC、0. 5% SDS中的最后兩次30分鐘洗滌的溫度升高至60°C。優(yōu)選 的另一組高嚴(yán)謹(jǐn)性條件采用65°C，在0. IX SSC、0. 1% SDS中進行最后兩次洗滌。雜交核酸的適度嚴(yán)謹(jǐn)性取決于本領(lǐng)域熟知的變量，即核酸長度和互補程度。兩條 核苷酸序列之間的相似性或同源性越高，具有那些序列的核酸雜交體的Tm值越高。核酸雜 交的相對穩(wěn)定性(對應(yīng)于較高的Tm)按以下順序降低RNA RNA,DNA :RNA,DNA :DNA。對于長 度超過100個核苷酸的雜交體，已有計算Tm的方程(參見Sambrook等，同上，9. 50-0. 51)。 對于與較短核酸，即寡核苷酸雜交，錯配的位置更重要，寡核苷酸的長度決定其特異性(參 見 Sambrook 等，同上，11. 7-11. 8)。在本發(fā)明的一個實施方式中，采用雜交條件檢測多核苷酸，所述雜交條件包括在 低于500mM鹽和至少37°C進行雜交步驟，在2X SSPE中，至少63溫度進行洗滌步驟。在另 一實施方式中，雜交條件包括在低于200mM鹽和至少37°C進行雜交步驟。在進一步的實施 方式中，雜交條件包括雜交和洗滌步驟均為2X SSPE和63V。在另一實施方式中，可雜交核酸的長度是至少約10個核苷酸?？呻s交核酸的最低 長度優(yōu)選至少約15個核苷酸；例如至少約20個核苷酸；例如至少30個核苷酸。此外，技術(shù) 人員應(yīng)知道可根據(jù)諸如探針長度等因素，視需要調(diào)節(jié)溫度和洗滌溶液鹽濃度。術(shù)語“探針”指可與互補的單鏈靶核酸堿基配對形成雙鏈分子的單鏈核酸分子。本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”指可與基因組DNA分子、cDNA分子、質(zhì)粒DNA或mRNA 分子雜交的短核酸。寡核苷酸可以作標(biāo)記，例如32P-核苷酸，或是已共價偶連了標(biāo)記物，例 如生物素的核苷酸。標(biāo)記的寡核苷酸可用作探針來檢測核酸的存在。寡核苷酸(其中一條 和兩條可作標(biāo)記)可用作PCR引物，用于克隆全長核酸或其片段、用于DNA測序或用于檢測核酸的存在。寡核苷酸還可用于和DNA分子形成三螺旋。通常合成制備寡核苷酸，優(yōu)選用核酸合成儀。因此，可將寡核苷酸制備成含非天然產(chǎn)生的磷酸酯類似鍵，例如硫酯鍵等。“引物”指與靶核酸序列雜交以形成雙鏈核酸區(qū)域的寡核苷酸，該區(qū)域可用作合適 條件下DNA合成的起點。這種引物可用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或DNA測序中?！熬酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)”縮寫成PCR，指酶促擴增特定核酸序列的體外方法。PCR包括一 系列重復(fù)的溫度循環(huán)，其中每個循環(huán)包括3個階段模板核酸變性以分離靶分子諸鏈，單鏈 PCR寡核苷酸引物與模板核酸退火，和DNA聚合酶使得退火引物延伸。PCR提供檢測核酸的 初始組合中靶分子是否存在，以及在定量或半定量條件下測定靶分子相對量的方法。“逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”縮寫成RT-PCR，指從一種或多種RNA分子酶促產(chǎn)生一 種或多種cDNA靶分子，然后酶促擴增上述一種或多種cDNA靶分子內(nèi)一種或多種特定核酸 序列的體外方法。RT-PCR還提供檢測核酸的初始組合中靶分子是否存在，以及在定量或半 定量條件下測定靶分子相對量的方法。DNA “編碼序列”指編碼多肽的雙鏈DNA序列，當(dāng)其置于合適調(diào)控序列的控制下，能 在細(xì)胞中體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽?！昂线m的調(diào)控序列”指位于編碼序列上游(5’非編 碼序列)、其中或下游(3’非編碼序列)的核酸序列，其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工 或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)控序列可包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化識別序列、 RNA加工位點、效應(yīng)子結(jié)合位點和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。編碼序列的邊界由5’(氨基)末端的起始密 碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可包括但不限于原核生物序列、 mRNA的cDNA、基因組DNA序列和甚至是合成DNA序列。如果編碼序列要在真核生物中表達(dá)， 聚腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3’?！伴_放讀框”縮寫成0RF，指一定長度的核酸序列，可以是DNA、cDNA或RNA，其包含 翻譯起始信號或起始密碼子，例如ATG或AUG和終止密碼子，其有翻譯成多肽序列的可能。本文利用術(shù)語“頭-對-頭”描述兩條多核苷酸序列相對彼此的取向。當(dāng)一條多核 苷酸的編碼鏈的5’端毗連另一多核苷酸的編碼鏈的5’端時，該兩條多核苷酸以頭-對-頭 取向布置，從而各多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向以遠(yuǎn)離另一多核苷酸的5’端的方向進行。術(shù)語 “頭-對-頭”可縮寫為(5，)-到-(5，)，還可以符號(一一)或(3，一 5，5，一 3，)表示。
本文利用術(shù)語“尾-對-尾”描述兩條多核苷酸序列相對彼此的取向。當(dāng)一條多核 苷酸的編碼鏈的3’端毗連另一多核苷酸的編碼鏈的3’端時，該兩條多核苷酸以尾-對-尾 取向布置，從而各多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向朝另一多核苷酸進行。術(shù)語“尾-對-尾”可縮寫為 (3，)_ 到 _(3，)，還可以符號(一一)或(5，一 3，3，一 5，)表示。本文利用術(shù)語“頭-對-尾”描述兩條多核苷酸序列相對彼此的取向。當(dāng)一條多核 苷酸的編碼鏈的5’端毗連另一多核苷酸的編碼鏈的3’端時，該兩條多核苷酸以頭-對-尾 取向布置，從而各多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向與另一多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向相同。術(shù)語“頭-對-尾” 可縮寫為(5，)_到_(3，)，還可以符號(一一)或(5，一 3，5，一 3，)表示。術(shù)語“下游”指相對參比核苷酸序列3’定位的核苷酸序列。具體地說，下游核苷 酸序列通常涉及轉(zhuǎn)錄起點后的序列。例如，基因的翻譯起始密碼子位于轉(zhuǎn)錄起點的下游。術(shù)語“上游”指相對參比核苷酸序列5’定位的核苷酸序列。具體地說，上游核苷 酸序列通常涉及位于轉(zhuǎn)錄編碼序列或起點的5’側(cè)的序列。例如，大多數(shù)啟動子位于轉(zhuǎn)錄起 點的上游。
術(shù)語“限制性內(nèi)切核酸酶”和“限制性酶”可互換使用，指能結(jié)合雙鏈DNA內(nèi)的特 定核苷酸序列并在其中進行切割的酶?！巴粗亟M”指將外來DNA序列插入另一 DNA分子，例如將載體插入染色體。載體 優(yōu)選靶向用于同源重組的特異性染色體位點。對于特異性同源重組，載體可含有足夠長的 染色體序列的同源性區(qū)域，從而載體能互補結(jié)合并摻入染色體。同源性區(qū)域越長，序列相似 性越高可增加同源重組的效率?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的幾種方法來擴增本發(fā)明的多核苷酸。一旦確立合適的宿主系 統(tǒng)和生長條件，可大量擴增和制備重組表達(dá)載體。如本文所述，可用的表達(dá)載體包括但不限 于以下載體或它們的衍生物人或動物病毒，例如痘苗病毒或腺病毒；昆蟲病毒，例如桿狀 病毒；酵母載體；噬菌體載體(例如，λ噬菌體)和質(zhì)粒及粘粒DNA載體，等等?！拜d體”指用于將核酸克隆和/或傳遞入宿主細(xì)胞的任何運載體。載體可 以是可與 另一 DNA區(qū)段相連從而復(fù)制所連區(qū)段的復(fù)制子?！皬?fù)制子”指用作DNA體內(nèi)復(fù)制的自主單 元，即能在其本身控制下復(fù)制的任何遺傳元件(例如，質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、病毒)。 術(shù)語“載體”包括用于在體外、離體或體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞的病毒和非病毒運載體。本領(lǐng) 域已知的大量載體可用于操作核酸、將反應(yīng)元件和啟動子摻入基因，等等?？赡艿妮d體包 括，例如質(zhì)?；蛐揎椀牟《荆?，例如噬菌體，如λ衍生物，或質(zhì)粒，如pBR322或pUC質(zhì) 粒衍生物，或Bluescript載體?？捎糜诒景l(fā)明的載體的另一例子是如通過引用納入本文 的TO 2007/038276所述的弗吉尼亞州布萊克斯堡的英特列克星敦公司(Intrexon Corp., Blacksburg，VA)的UltraVector 產(chǎn)生系統(tǒng)。例如，可通過將合適DNA片段連接入具有互 補粘性末端的所選載體實現(xiàn)將對應(yīng)于反應(yīng)元件和啟動子的DNA片段插入合適載體。或者， 可對DNA分子的兩端作酶促修飾，或者可通過將核苷酸序列(接頭)連接入DNA末端來產(chǎn) 生任何位點。這種載體可經(jīng)工程改造而含有可選擇標(biāo)記基因以供選擇已將標(biāo)記摻入細(xì)胞基 因組的細(xì)胞。這種標(biāo)記能鑒定和/或選擇摻入標(biāo)記并表達(dá)其所編碼蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已用于細(xì)胞以及活的動物對象中的各種基因遞 送應(yīng)用。可用的病毒載體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒、痘病毒、桿狀病毒、牛痘 病毒、單純皰疹病毒、E-B病毒、腺病毒、雙粒病毒和花椰菜花葉病毒載體。非病毒載體包括 質(zhì)粒、脂質(zhì)體、荷電脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)、DNA_蛋白質(zhì)復(fù)合物和生物聚合物。除核酸外，載體 還可包含一個或多個調(diào)控區(qū)域和/或用于選擇、檢測和監(jiān)測核酸傳遞結(jié)果(傳遞至何種組 織、表達(dá)持續(xù)時間等)的可選擇標(biāo)記。術(shù)語“質(zhì)?！敝赋y帶基因的染色體外元件，其不是細(xì)胞中心代謝的一部分，通常 是環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。這種元件可以是衍生自任何來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA，線 形、環(huán)狀或超螺旋的自發(fā)復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許多核苷 酸序列連接或重組入獨特構(gòu)建物中，該構(gòu)建物能將所選基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列 連同合適的3’非翻譯序列引入細(xì)胞?！翱寺≥d體”指“復(fù)制子”，其是單位長度的核酸，優(yōu)選DNA，其順序復(fù)制并包含復(fù)制 起點，例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，另一核酸區(qū)段可與其相連從而能復(fù)制所連接的區(qū)段。克隆 載體能在一類細(xì)胞中復(fù)制，在另一類中表達(dá)(穿梭載體)?？寺≥d體可包含一條或多條序列 以便用于選擇包含該載體的細(xì)胞和/或一個或多個多克隆位點以便插入感興趣序列。術(shù)語“表達(dá)載體”指載體、質(zhì)?；蜻\載體，其設(shè)計成能在轉(zhuǎn)化入宿主后表達(dá)所插入的核酸序列?？寺〉幕颍?，插入的核酸序列通常置于調(diào)控元件，例如啟動子、最小啟動 子、增強子等的控制下。可用于驅(qū)動核酸在所需宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動調(diào)控區(qū)或啟動子多 種多樣，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉?；旧夏茯?qū)動這些基因表達(dá)的任何啟動子可用于表 達(dá)載體，包括但不限于病毒啟動子、細(xì)菌啟動子、動物啟動子、哺乳動物啟動子、合成啟動 子、組成型啟動子、組織特異性啟動子、病因或疾病相關(guān)啟動子、發(fā)育特異性啟動子、誘導(dǎo) 型啟動子、光調(diào)節(jié)啟動子(light regulated promoter) ；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、 ADHU PGK, PH05、GAPDH、ADCU TRPU URA3、LEU2、ENO, TPI、堿性磷酸酶啟動子(用于在酵 母(Saccharomyces)中表達(dá))；AOXl啟動子(用于在畢赤酵母(Pichia)中表達(dá))；β -內(nèi)酰 胺醇、lac、ara、tet、trp、1PL、1PK、T7、tac、禾口 trc 啟動子(用于在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá))；光調(diào)節(jié)_、種子特異性_、花粉特異性_、子房特異性的、花椰菜花葉病毒 35S、CMV 35S最低、木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、核酮糖1，5-二磷 酸羧化酶、枝條_特異性、根特異性、幾丁質(zhì)酶、應(yīng)激誘導(dǎo)型、水稻東格魯桿狀病毒、植物超 級啟動子、馬鈴薯亮氨酸氨肽酶、硝酸鹽還原酶、甘露堿合酶、胭脂堿合酶、泛素、玉米蛋白 和花青甙啟動子(可用于在植物細(xì)胞中表達(dá))；本領(lǐng)域已知的動物和哺乳動物啟動子，包 括但不限于SV40早期(SV40e)啟動子區(qū)域、勞斯肉瘤病毒(RSV)的3’長末端重復(fù)(LTR) 中所含的啟動子、腺病毒(Ad)的ElA或主要晚期啟動子(MLP)基因的啟動子、巨細(xì)胞病毒 (CMV)早期啟動子、單純皰疹病毒(HSV胸苷激酶(TK)啟動子、桿狀病毒IEl啟動子、延伸因 子la (EFl)啟動子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)啟動子、泛素(Ubc)啟動子、白蛋白啟動子、 小鼠金屬硫蛋白-L啟動子的調(diào)控序列和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、遍在啟動子(ubiquitouspromoter) (HPRT、波形蛋白、α-肌動蛋白、微管蛋白等)、中間絲的啟動子(索蛋白、神經(jīng)絲、角蛋白、 GFAP等)、治療基因的啟動子(MDR、CFTR或VIII型因子等的)、病因或疾病相關(guān)啟動子、 和顯示組織特異性并已用于轉(zhuǎn)基因動物中的啟動子，例如在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性 蛋白酶I基因調(diào)控區(qū)；在胰腺β細(xì)胞中有活性的胰島素基因調(diào)控區(qū)、在淋巴細(xì)胞中有活性 的免疫球蛋白基因調(diào)控區(qū)、在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒調(diào) 控區(qū)；白蛋白基因、在肝中有活性的Apo AI和Ap0AII調(diào)控區(qū)、在肝中有活性的α-胎蛋白 基因調(diào)控區(qū)、在肝中有活性的α -抗胰蛋白酶基因調(diào)控區(qū)、在骨髓細(xì)胞中有活性的β-球 蛋白基因調(diào)控區(qū)、在大腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓磷脂堿蛋白基因調(diào)控區(qū)、在骨骼肌 中有活性的肌球蛋白輕鏈_2基因調(diào)控區(qū)、和在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基 因調(diào)控區(qū)、丙酮酸激酶啟動子、絨毛蛋白啟動子、脂肪酸結(jié)合腸蛋白的啟動子、平滑肌細(xì)胞 α-肌動蛋白的啟動子，等等。此外，可通過加入增強子或調(diào)節(jié)序列等來修飾這些表達(dá)序列?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡 聚糖、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體融合)、利用基因槍或DNA載體運輸?shù)鞍讓⑤d體引入所 需的宿主細(xì)胞(參見，例如 Wu 等，J.Biol. Chem. 267 =963(1992) ；Wu 等，J. Biol. Chem. 263 14621(1988)；和 Hartmut 等，加拿大專利申請?zhí)?2,012,311)。還可通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染體內(nèi)引入本發(fā)明的多核苷酸。在過去10年，利用脂質(zhì)體在體外 包裝和轉(zhuǎn)染核酸逐漸增多。可利用合成的陽離子脂質(zhì)制備用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染編碼標(biāo)記的基因的 脂質(zhì)體，該脂質(zhì)設(shè)計成能減少脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染遇到的困難和危險(Feigner等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84 7413 (1987) ；Mackey 等，Proc. N atl. Acad. Sci. USA 85:8027(1988)；禾口 Ulmer等，Science 259:1745(1993))。使用陽離子脂質(zhì)可促進包裝帶負(fù)電的核酸，還促進與帶負(fù)電細(xì)胞膜融合(Feigner 等，Science 337:387(1989))。W095/18863、W096/17823 和 U. S. 5，459，127描述了傳遞核酸特別有用的脂質(zhì)化合物和組合物。采用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染將外源性 基因體內(nèi)引入特定生物體具有一定實際優(yōu)點。脂質(zhì)體分子靶向特定細(xì)胞代表了一類優(yōu)點。 直接轉(zhuǎn)染特定細(xì)胞類型明顯在具有細(xì)胞異質(zhì)性的組織，例如胰腺、肝臟、腎臟和腦中特別理 想。可為靶向目的將脂質(zhì)與其它分子化學(xué)偶連(Mackey等，1988，同上)?？蓪邢虻碾?，例 如激素或神經(jīng)遞質(zhì)和蛋白質(zhì)，例如抗體，或非肽分子化學(xué)偶聯(lián)于脂質(zhì)體。其它分子也可用于促進核酸的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，例如陽離子寡肽(如W095/21931)、衍生 自DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的肽(如W096/25508)或陽離子聚合物(如W095/21931)。還可能將載體作為裸DNA質(zhì)粒體內(nèi)引入(參見，美國專利號5，693，622,5, 589，466 和5，580, 859)。還可采用受體介導(dǎo)的DNA遞送方法(Curiel等，Hum. Gene Ther. 3 147 (1992)；和 Wu 等，J. Biol. Chem. 262 4429 (1987))。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”指細(xì)胞攝取外源性或異源的RNA或DNA。當(dāng)這種RNA或DNA被引入細(xì) 胞，稱 該細(xì)胞被外源性或異源的RNA或DNA“轉(zhuǎn)染”。當(dāng)轉(zhuǎn)染的RNA或DNA實現(xiàn)表型改變時， 稱細(xì)胞被外源性或異源RNA或DNA“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化RNA或DNA可以整合(共價相連)入構(gòu)成 細(xì)胞基因組的染色體DNA?！稗D(zhuǎn)化”指將核酸片段傳遞入宿主生物體的基因組，從而導(dǎo)致遺傳學(xué)穩(wěn)定的遺傳 性。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物體稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化”的生物體。此外，包含本發(fā)明多核苷酸的重組載體可包含它們要在其中擴增或表達(dá)的細(xì)胞宿 主的一個或多個復(fù)制起點，標(biāo)記或可選擇標(biāo)記。術(shù)語“可選擇標(biāo)記”指鑒定因子，通常是能基于標(biāo)記基因的作用而選擇的抗生素或 化學(xué)耐受基因(即耐受抗生素、耐受除草劑)、比色標(biāo)記、酶、熒光標(biāo)記等，其中該作用用于 示蹤感興趣核酸的遺傳性和/或鑒定遺傳了該感興趣核酸的細(xì)胞或生物體。本領(lǐng)域已知并 使用的可選擇標(biāo)記的例子包括提供氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素、雙 丙氨酰膦除草劑、磺酰胺等耐受性的基因；和用作表型標(biāo)記的基因，即，花青甙調(diào)節(jié)基因、異
(isopentanyl transferase gene)等。術(shù)語“報道基因”指編碼能依據(jù)報道基因的作用而得到鑒定的鑒定因子的核酸， 其中該作用用于示蹤感興趣核酸的遺傳性，鑒定已遺傳了感興趣核酸的細(xì)胞或生物體，和/ 或檢測基因表達(dá)誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域已知并使用的報道基因的例子包括但不限于螢光素 酶(Luc)、綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β -半乳糖苷酶(LacZ)、β -葡糖 醛酸糖苷酶(Gus)等?？蛇x擇標(biāo)記基因也可視作報道基因。“啟動子”和“啟動子序列”可互換使用，指能控制編碼序列或功能RNA表達(dá)的DNA 序列。編碼序列通常位于啟動子序列的3’端。啟動子可以完全衍生自天然基因，或由衍生 自天然發(fā)現(xiàn)的不同啟動子的不同元件構(gòu)成，或者甚至包含合成的DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)知道不同啟動子可在不同組織或細(xì)胞類型中，或在不同發(fā)育階段，或?qū)Σ煌h(huán)境或生 理條件起反應(yīng)而指導(dǎo)基因表達(dá)。導(dǎo)致基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中，在大部分時間內(nèi)表達(dá)的啟 動子通常稱為“組成型啟動子”。導(dǎo)致基因在特定細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動子通常稱為“細(xì)胞 特異性啟動子”或“組織特異性啟動子”。導(dǎo)致基因在特定發(fā)育或細(xì)胞分化階段表達(dá)的啟動 子通常稱為“發(fā)育特異性啟動子”或“細(xì)胞分化特異性啟動子”。在用誘導(dǎo)啟動子的藥劑、生 物分子、化學(xué)品、配體、光等接觸或用這些物質(zhì)處理細(xì)胞后得到誘導(dǎo)并導(dǎo)致基因表達(dá)的啟動子通常稱為“誘導(dǎo)型啟動子”或“可調(diào)節(jié)啟動子”。還應(yīng)知道，由于在大多數(shù)情況中，調(diào)控序 列的確切邊界并未完全限定，不同長度的DNA片段可具有相同的啟動子活性。
啟動子序列在其3’末端通常結(jié)合有轉(zhuǎn)錄起始位點并向上延伸(5’方向)，從而包 含在可檢測背景水平啟動轉(zhuǎn)錄所需的最少數(shù)量的堿基或元件。在啟動子序列中可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄 起始位點(通過，例如核酸酶Sl作圖不難限定)以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié) 構(gòu)域(共有序列)?！爸委熼_關(guān)啟動子” (TSP)指控制基因開關(guān)組件表達(dá)的啟動子。本文它處詳細(xì)描述 了基因開關(guān)和它們的各種組件。在某些實施方式中，TSP是組成型的，即組成型活化的。組 成型TSP可以是組成型遍在的(即，在任何組織或細(xì)胞中廣泛起作用，無需其它因子或調(diào)節(jié) 齊IJ)或組成型組織或細(xì)胞特異性的(即，在特定組織類型或細(xì)胞類型中廣泛起作用，無需 其它因子或調(diào)節(jié)劑)。在某些實施方式中，本發(fā)明的TSP在疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下活 化。在涉及兩種或更多種TSP的本發(fā)明某些實施方式中，啟動子可以是組成型或可活化啟 動子的組合。本文所用的“在疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下活化的啟動子”包括但不限于 疾病-特異性啟動子、對特定生理、發(fā)育、分化或病理狀況起反應(yīng)的啟動子、對特定生物分 子起反應(yīng)的啟動子和對疾病、病癥或病狀相關(guān)的特定組織或細(xì)胞類型，例如腫瘤組織或惡 性細(xì)胞起反應(yīng)的啟動子。TSP可包含天然產(chǎn)生啟動子的序列、衍生自天然產(chǎn)生啟動子的修飾 序列或合成序列(例如，將反應(yīng)元件插入最小啟動子序列來改變啟動子的反應(yīng)性)。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后經(jīng)反式RNA剪接(如果編碼序列含有 內(nèi)含子)并翻譯成該編碼序列所編碼的蛋白質(zhì)時，稱編碼序列受到細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控 序列的“控制”?！稗D(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，，指在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼序列的DNA調(diào)節(jié)序列，例如啟動 子、增強子、終止子等。在真核細(xì)胞中，聚腺苷酸化信號是調(diào)控序列。術(shù)語“反應(yīng)元件”(RE)指一個或多個順式作用的DNA元件，其賦予受與轉(zhuǎn)錄因子 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用介導(dǎo)的啟動子反應(yīng)性。該DNA元件的序列可以是回文的(完 美或不完美的)，或者其由被數(shù)量不同的核苷酸隔開的序列基序或半位點構(gòu)成。半位點可 以是相似或相同的，排列成正向或反向重復(fù)或排列成一個半位點或串聯(lián)的毗連半位點的多 聚體。依據(jù)要摻入反應(yīng)元件的細(xì)胞或生物體的性質(zhì)，反應(yīng)元件可包含從不同生物體分離的 最小啟動子。有或沒有配體存在下，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合反應(yīng)元件的DNA序 列以啟動或阻遏受該反應(yīng)元件調(diào)節(jié)的下游基因轉(zhuǎn)錄。天然蛻皮素受體的反應(yīng)元件的DNA 序列的例子包括:RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO 1)(參見 Cherbas 等，Genes Dev. 5 120(1991)) ；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可以是一個或多個間隔核苷酸(SEQ ID N0:2)(參 見 D' Avino 等，Mol. Cell. Endocrinol. 113 :1 (1995))；和 GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID NO: 3)(參見 Antoniewski 等，Mol. Cell Biol. 14 4465 (1994))?！耙蜃诱{(diào)節(jié)的啟動子”(FRP)指包含至少一個反應(yīng)元件的啟動子，該反應(yīng)元件為本 發(fā)明基因開關(guān)所編碼的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識別。術(shù)語“操作性連接”、“操作性結(jié)合”、“通過操作性結(jié)合”等指核酸序列與一個核酸 片段的結(jié)合，因此一個的功能受另一個的影響。例如，當(dāng)啟動子能影響編碼序列的表達(dá)時 (即，該編碼序列受啟動子的轉(zhuǎn)錄控制)，稱該啟動子操作性連接于該編碼序列。編碼序列 可以有義或反義方向操作性連接于調(diào)節(jié)序列。
本文所用的術(shù)語“表達(dá)”指通過衍生自核酸或多核苷酸的有義(mRNA)或反義RNA 的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定累積。表達(dá)還指將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語“盒”、“表達(dá)盒”和“基因表達(dá)盒”指可插入核酸或多核苷酸特定位點的DNA區(qū) 段，或通過同源重組獲得。DNA區(qū)段包含編碼感興趣多肽的多核苷酸，并且將盒和限制性位 點設(shè)計成能確保該盒插入合適的讀框以供轉(zhuǎn)錄和翻譯。“轉(zhuǎn)化盒”指包含編碼感興趣多肽的 多核苷酸，并且除該多核苷酸外，還具有有助于轉(zhuǎn)化具體宿主細(xì)胞的元件的特定載體。本發(fā) 明的盒、表達(dá)盒、基因表達(dá)盒和轉(zhuǎn)化盒還可包含能增強編碼感興趣多肽的多核苷酸在宿主 細(xì)胞中表達(dá)的元件。這些元件可包括但不限于啟動子、最小啟動子、增強子、反應(yīng)元件、終 止序列、聚腺苷酸化序列等。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“基因開關(guān)”指啟動子相關(guān)反應(yīng)元件和基于配體依賴性轉(zhuǎn) 錄因子的系統(tǒng)的組合，有一種或多種配體存在時，其調(diào)節(jié)摻入反應(yīng)元件和啟動子的基因的 表達(dá)。 對于基因開關(guān)，術(shù)語“基于蛻皮素的”指至少包含天然產(chǎn)生或合成蛻皮素受體配體 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能部分的基因開關(guān)，其對結(jié)合蛻皮素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體起反應(yīng)而 調(diào)節(jié)基因表達(dá)。本文所用的術(shù)語“生物反應(yīng)器”或“生物反應(yīng)器器件”包括要分泌治療蛋白或治療 多核苷酸的一個或多個細(xì)胞。在某些非限制性實施方式中，生物反應(yīng)器包含本文它處所述 的修飾細(xì)胞。在某些，但不是所有實施方式中，生物反應(yīng)器細(xì)胞可以是“免疫分離的”。當(dāng)生 物反應(yīng)器細(xì)胞經(jīng)處理從而該細(xì)胞在引入或植入對象后受保護而免遭該對象的免疫系統(tǒng)作 用時，稱該細(xì)胞與該對象是“免疫分離的”。例如，免疫分離的生物反應(yīng)器細(xì)胞可以包含在 屏障系統(tǒng)中，該系統(tǒng)能傳播治療蛋白或治療多核苷酸，但能防止生物反應(yīng)器細(xì)胞直接接觸 對象免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。免疫分離的細(xì)胞可以是，例如包被或包裹化的。免疫分離方法包括 但不限于細(xì)胞的保形包被(conformal coating)，細(xì)胞懸浮在生物相容材料中并分隔成球 形物質(zhì)的微囊化，或細(xì)胞包封在用于包封細(xì)胞的天然或合成聚合物構(gòu)成的器件中的大包裹 化。術(shù)語“調(diào)節(jié)”表示誘導(dǎo)、降低或抑制核酸或基因表達(dá)，從而分別導(dǎo)致蛋白質(zhì)或多肽 產(chǎn)生的誘導(dǎo)、降低或抑制。本發(fā)明的多核苷酸或載體還可包含適合驅(qū)動基因在修飾細(xì)胞中表達(dá)的至少一個 啟動子?？捎糜诒景l(fā)明實施方式中的增強子包括但不限于SV40增強子、巨細(xì)胞病毒 (CMV)增強子、延伸因子I(EFl)增強子、酵母增強子、病毒基因增強子等。本文將“3’ reg”定義為相對于基因或轉(zhuǎn)錄物編碼區(qū)3’定位的表達(dá)調(diào)節(jié)元件。這 種元件包括但不限于初級轉(zhuǎn)錄物_編碼剪接元件、加工轉(zhuǎn)錄物的UTR、聚腺苷酸化信號或 DNA-編碼轉(zhuǎn)錄終止結(jié)構(gòu)域。終止調(diào)控區(qū)，即終止子或聚腺苷酸化序列還可衍生自對優(yōu)選宿主而言各種天然的 基因。任選地，終止位點可不是必需的，但最好包含。在本發(fā)明的一個實施方式中，終止調(diào)控 區(qū)可以由以下組分構(gòu)成或衍生自它們合成序列、合成聚腺苷酸化信號、SV40晚期聚腺苷 酸化信號、SV40聚腺苷酸化信號、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號、病毒終止子序列等。術(shù)語“3’非編碼序列”或“3’非翻譯區(qū)(UTR) ”指位于編碼序列下游(3’ )的DNA序列，可包含聚腺苷酸化[Poly(A)]識別序列和編碼能影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信 號的其它序列。聚腺苷酸化信號的特征通常在于在mRNA前體的3’端加上聚腺苷酸束?！罢{(diào)控區(qū)”指調(diào)節(jié)第二核酸序列表達(dá)的核酸序列。調(diào)控區(qū)可包含天然負(fù)責(zé)特定核酸 表達(dá)的序列(同源區(qū)域)，或者可包含負(fù)責(zé)表達(dá)不同蛋白質(zhì)，甚至合成蛋白質(zhì)的不同區(qū)域的 序列(異源區(qū)域)。具體地說，所述序列可以是以特異性或非特異性方式并以誘導(dǎo)型或非誘 導(dǎo)型方式刺激或阻遏基因轉(zhuǎn)錄的原核生物、真核生物或病毒基因的序列或衍生序列。調(diào)控 區(qū)包含復(fù)制起點、RNA剪接位點、啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止序列和引導(dǎo)多肽進入靶細(xì)胞的分 泌途徑的信號序列?！爱愒磥碓础钡恼{(diào)控區(qū)指不與所表達(dá)核酸天然結(jié)合的調(diào)控區(qū)。異源調(diào)控區(qū)包括不同 物種的調(diào)控區(qū)、不同基因的調(diào)控區(qū)、雜交調(diào)節(jié)序列和天然不產(chǎn)生，而是由本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員設(shè)計的調(diào)節(jié)序列。
"RNA轉(zhuǎn)錄物”指RNA聚合酶催化DNA序列轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是該 DNA序列的完美互補拷貝時，其稱為原始轉(zhuǎn)錄物，或者其可以是衍生自原始轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后 加工的RNA序列并稱為成熟RNA?！靶攀筊NA(mRNA) ”指沒有內(nèi)含子并可由細(xì)胞翻譯成蛋白 質(zhì)的RNA?！癱DNA”指與mRNA互補，并衍生自其的雙鏈DNA。“有義” RNA指包括mRNA的RNA 轉(zhuǎn)錄物，因此可由細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)?！胺戳xRNA”指與靶原始轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或一部 分互補并阻斷靶基因表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物。反義RNA可以與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分互補， 艮口，在5'非編碼序列、3'非編碼序列或編碼序列處?！肮δ苄訰NA”指反義RNA、核酶RNA、 或不被翻譯但對細(xì)胞過程仍有影響的其它RNA。“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，指由共價連接的氨基酸殘基構(gòu)成的多聚化 合物?！胺蛛x的多肽”、“分離的肽”或“分離的蛋白質(zhì)”指基本上不含天然狀態(tài)下與其正 常結(jié)合的那些組分(例如，其它蛋白質(zhì)或多肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì))的多肽或蛋白質(zhì)。 “分離的”不表示排除含其它化合物，或存在雜質(zhì)的人工或合成混合物，它們不干擾生物學(xué) 活性，其存在可能是因為，例如純化不完全、加入穩(wěn)定劑或混入藥學(xué)上可接受的制品?！叭〈蛔冃投嚯摹被颉叭〈蛔凅w”應(yīng)理解成表示與野生型或天然產(chǎn)生的多肽相 比，在至少一個野生型或天然產(chǎn)生的氨基酸處包含不同氨基酸取代的突變型多肽。取代突 變型多肽可僅包含一個野生型或天然產(chǎn)生的氨基酸取代，可稱為“點突變型”或“單點突變 型”多肽?；蛘撸c野生型或天然產(chǎn)生的多肽相比，取代突變型多肽可包含用兩個或更多個 氨基酸取代兩個或更多個野生型或天然產(chǎn)生的氨基酸。根據(jù)本發(fā)明，與野生型或天然產(chǎn)生 的H組核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽相比，包含取代突變的H組核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽 包含用不同氨基酸取代至少一個野生型或天然產(chǎn)生的氨基酸。當(dāng)取代突變型多肽包含兩個或更多個野生型或天然產(chǎn)生氨基酸的取代時，該取代 可包含相等數(shù)量的野生型或天然產(chǎn)生氨基酸缺失取代，即兩個非野生型或天然產(chǎn)生的氨基 酸替代兩個野生型或天然產(chǎn)生的氨基酸，或者非相等數(shù)量的野生型氨基酸缺失取代，即一 個非野生型氨基酸替代兩個野生型氨基酸(取代+缺失突變)，或三個非野生型氨基酸替代 兩個野生型氨基酸(取代+插入突變)?？衫每s寫的術(shù)語體系描述取代突變體以表明參比多肽序列中被替代的氨基酸 殘基和編號以及新取代的氨基酸殘基。例如，多肽的第20個氨基酸殘基被取代的取代突變體可以縮寫為“x20z”，其中“χ”是待替代的氨基酸，“20”是該多肽中的氨基酸殘基位置或 編號，“ζ”是新取代的氨基酸。因此，可互換地縮寫成“E20A”或“Glu20Ala”的取代突變體 表示該突變體在多肽20位的谷氨酸(本領(lǐng)域中?？s寫成“G”或“Glu”)位置包含丙氨酸殘 基(本領(lǐng)域中?？s寫成“A”或“Ala”)?？捎杀绢I(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)制作取代突變，所述技術(shù)包括但不限于體外 定點誘變(Hutchinson 等，J. Biol. Chem. 253 6551(1978) ；Zoller 等，DNA3 :479 (1984)； Oliphant Gene 44:177(1986) ；Hutchinson Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 710(1986))、利用法瑪西亞公司(Pharmacia)的TAB 接頭、限制性內(nèi)切酶消化/片段缺 失和取代、PCR-介導(dǎo)的/寡核苷酸-指導(dǎo)的誘變等。定點誘變優(yōu)選基于PCR的技術(shù)(參 見 Higuchi，1989，“ Using PCR toEngineer DNA(采用 PCR 工程改造 DNA) 〃，刊于 PCR Technology =PrinciplesandApplications for DNA Amplification (PCR 技術(shù)DNA 擴增的 原理和應(yīng)用)，H. Erlich等，斯托克頓出版社(Stockton Press)，第6章，第61-70頁)。應(yīng)用于多肽的術(shù)語“片段”指氨基酸序列短于參比多肽，并在這些參比多肽的完整 部分上包含相同氨基酸序列的多肽。這種片段可以適當(dāng)?shù)匕谧鳛槠湟徊糠值妮^大多肽 中。本發(fā)明多肽的這種片段的長度可以是至少2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240 或 300 個或更多個氨基酸。多肽或蛋白質(zhì)的“變體”指衍生自多肽或蛋白質(zhì)的任何類似物、片段、衍生物或突 變體，其保留了該多肽或蛋白質(zhì)的至少一種生物學(xué)特性。多肽或蛋白質(zhì)可天然存在不同變 體。這些變體可以是特征在于編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列不同的等位基因變體， 或者可包括差別剪接或翻譯后修飾。技術(shù)人員可制備具有一個或多個氨基酸取代、缺失、添 加或替代的變體。這些變體可包括(a)其中一個或多個氨基酸殘基被保守性或非保守性 氨基酸取代的變體，(b)其中在多肽或蛋白質(zhì)中加入一個或多個氨基酸的變體，(c)其中一 個或多個氨基酸包含取代基的變體，和(d)其中多肽或蛋白質(zhì)與另一多肽，例如血清白蛋 白融合的變體。獲得這些變體的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，包括遺傳學(xué)(抑制、缺 失、突變等)、化學(xué)和酶學(xué)技術(shù)。在一個實施方式中，變體多肽包含至少約14個氨基酸。術(shù)語“同源性”指兩個多核苷酸或兩個多肽部分之間的相同性百分比?？赏ㄟ^本 領(lǐng)域已知的技術(shù)測定一個部分的序列與另一部分的序列之間的對應(yīng)性。例如，可通過比對 序列信息并利用不難獲得的計算機程序來直接比較兩個多肽分子之間的序列信息從而測 定同源性。或者，可通過在同源性區(qū)域之間能形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下使得多核苷酸雜交， 然后用單鏈特異性核酸酶消化并測定消化片段的大小來測定同源性。本文所用的術(shù)語“同源性”的所有語法形式和拼寫變化形式指具有“共同進化起源 的”蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，包括來自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白質(zhì)和不同物種 的同源蛋白質(zhì)(例如，肌球蛋白輕鏈等MReeck等，Cell50:667(1987))。高度序列相似性 反映出這種蛋白質(zhì)(和它們的編碼基因)具有序列同源性。然 而，在常規(guī)應(yīng)用和本申請中， 當(dāng)術(shù)語“同源”用副詞，例如“高度”修飾時，可指序列相似性而不指共同的進化起源。因此，術(shù)語“序列相似性”的所有語法形式指可能具有或不具有共同進化起源 的核酸和蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間的相同性或?qū)?yīng)性程度(參見Reeck等，Cell 50: 667(1987))。在一個實施方式中，當(dāng)DNA序列的規(guī)定長度上有至少約50% (例如，至少約 75%、90%或95% )的核苷酸匹配時，稱兩條DNA序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。可利用序列數(shù)據(jù)庫中可得的標(biāo)準(zhǔn)軟件，或在，例如特定體系所規(guī)定的嚴(yán)謹(jǐn)性條件下采用Southern雜交實驗來比較序列，從而鑒定基本上同源的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何 確定合適的雜交條件(參見例如，Sambrook等，1989，同上)。本文所用的“基本上相似”指這樣一種核酸片段，其中一個或多個核苷酸堿基中的 改變導(dǎo)致一個或多個氨基酸取代，但不影響該DNA序列所編碼蛋白質(zhì)的功能特性?！盎旧?相似”還指這樣一種核酸片段，其中一個或多個核苷酸堿基中的改變不影響該核酸片段通 過反義或共_阻遏技術(shù)介導(dǎo)基因表達(dá)改變的能力?！盎旧舷嗨啤边€指本發(fā)明核酸片段的修 飾物，例如缺失或插入不實質(zhì)性影響所得轉(zhuǎn)錄物功能特性的一個或多個核苷酸堿基。因此， 應(yīng)該知道本發(fā)明包括多個具體的示范性序列。所提出的各種修飾是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，與 測定編碼產(chǎn)物的生物學(xué)活性的保留程度一樣。此外，技術(shù)人員知道還可通過在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下(0. IX SSC,0. 1% SDS，65°C和用2X SSC, 0. 1% SDS，然后用0. IX SSC, 0. 1% SDS洗滌)與本文示例的序列雜交的能力來限定本 發(fā)明所包括的基本上相似的序列。本發(fā)明的基本上相似的核酸片段是其DNA序列與本文報 道的核酸片段的DNA序列有至少約70%、80%、90%或95%相同的那些核酸片段。當(dāng)大于約40%的氨基酸是相同的，或者大于60%是相似的(功能上相同)時，稱 兩條氨基酸序列“基本上同源”或“基本上相似”。優(yōu)選利用，例如GCG (Genetics Computer Group (遺傳學(xué)計算機課題組)，ProgramManual for the GCG Package (GCG軟件包的程序 手冊)，第7版，麥迪遜，威斯康星州)堆積程序，通過比對鑒定相似或同源的序列。本文利用術(shù)語“對應(yīng)于”指相似或同源序列，而無論檢測相似性或同源性的分子的 確切位置是相同還是不同。核酸或氨基酸序列比對可包括空格。因此，術(shù)語“對應(yīng)于”指序 列相似性，而不指氨基酸殘基或核苷酸堿基的編號。氨基酸或核苷酸序列的“實質(zhì)性部分”包含足夠的多肽氨基酸序列或基因核苷酸 序列，從而可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過手工評估序列，或利用諸如BLAST(局部序列比對基本 檢索工具；Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 403 (1993))；可從 ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 獲 得)等算法進行計算機自動序列比較和鑒定來推測性鑒定該多肽或基因。通常，10個或更 多個毗連的氨基酸或30個或更多個核苷酸的序列是推測性鑒定與已知蛋白質(zhì)或基因同源 的多肽或核酸序列所需。此外，對于核苷酸序列，包含20-30個毗連核苷酸的基因特異性寡 核苷酸探針可用于基因鑒定(例如，Southern雜交)和分離(例如，細(xì)菌菌落或噬菌體噬 斑的原位雜交)的序列依賴性方法。另外，12-15個堿基的短寡核苷酸可在PCR中用作擴增 引物以獲得包含引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“實質(zhì)性部分”包含足夠的序列 以特異性鑒定和/或分離包含該序列的核酸片段。本領(lǐng)域已知的術(shù)語“相同性百分比”是通過比較序列測定的兩條或更多條多肽序 列或兩條或更多條多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“相同性”還表示多肽或多核 苷酸序列之間的序列關(guān)聯(lián)性程度，例如通過這些序列諸鏈之間的匹配測定的。不難通過已 知的方法計算“相同性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下描述的Computational Molecular Biology (計算分子生物學(xué))(Lesk，A.M.編)牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press),紐約(1988) ；Biocomputing Informatics and Genome Projects (生 物計算信息和基因組項目)(Smith，D. W.編)學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，紐約 (1993) ；ComputerAnalysis of Sequence Data(序列數(shù)據(jù)的計算機分析)，第 I 部分(Griffin, A.M.和 Griffin，H. G.編)休瑪効 β 出版社(Humana Press)，新澤西州(1994)； Sequence Analysis in Molecular Biology(ifLf 白勺；^歹 1」^>豐斤)(von Heinje,G. IS) 學(xué)術(shù)出版社(1987)；和 Sequence Analysis Primer(序列分析引物)(Gribskov，Μ.和 Devereux, J.編)斯托克頓出版社，紐約(1991)。測定相同性的優(yōu)選方法設(shè)計成能給出所 測試序列之間的最佳匹配。測定相同性和相似性的方法編成公眾可得的計算機程序。可 利用序列分析軟件，例如威斯康星州麥迪遜市DNA星公司的激光基因生物信息學(xué)計算套 件白勺大型比對禾呈序(Megalign program of the LASERGENE bioinformatics computing suite, DNASTAR Inc.，Madison, WI)進行序列比對和相容性百分比計算?？衫脜?shù)默 認(rèn)(GAP PENALTY = 10，GAP LENGTH PENALTY = 10)的群集比對方法(Clustal method of alignment) (Higgins等，CABIOS. 5 151 (1989))進行序列的多重比對。利用群集方法進行 成對比對的默認(rèn)參數(shù)可以選擇為KTUPLE1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5和DIAGONALS SAVED = 5。術(shù)語“序列分析軟件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何計算機算法或 軟件程序?！靶蛄蟹治鲕浖笨梢陨唐坊彽没颡毩㈤_發(fā)的。典型的序列分析軟件包括但 不限于GCG程序套件(威斯康星軟件包(Wisconsin Package) 9. 0版，遺傳學(xué)計算機課題 組(GCG)，麥迪遜，威斯康星州)、BLASTP、BLASTN、BLASTX (Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 403 (1990))和DNASTA R(DNA星公司，圣帕克街1228號(S. Park St.)，麥迪遜，威斯康星州， 53715美國)。在本申請的內(nèi)容中，應(yīng)該知道除非另有規(guī)定，利用序列分析軟件進行分析時， 分析的結(jié)果將依據(jù)引用的程序的“默認(rèn)值”。本文所用的“默認(rèn)值”表示首次啟動時，軟件原 始加載的任何一組數(shù)值或參數(shù)。與DNA序列相關(guān)的“化學(xué)合成”表示該組分核苷酸在體外裝配。可采用已良好確 立的方法手工化學(xué)合成DNA，或者利用多種可商品化購得的機器之一進行自動化學(xué)合成。因 此，可依據(jù)反映宿主細(xì)胞的密碼子偏愛的核苷酸序列優(yōu)化來改進基因以便優(yōu)化基因表達(dá)。 技術(shù)人員應(yīng)知道如果密碼子選擇偏向宿主所喜愛的那些密碼子，則基因表達(dá)有成功的可 能。可依據(jù)衍生自有序列信息可用的宿主細(xì)胞基因調(diào)查來測定優(yōu)選的密碼子。如本文所用的，當(dāng)有以下情況時，稱兩種或更多種可單獨操作的基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)是 “正交的” :a)利用其各自配體在選擇濃度調(diào)節(jié)各給定系統(tǒng)導(dǎo)致該系統(tǒng)的基因表達(dá)幅度中有 可檢測的改變，和b)該改變在統(tǒng)計學(xué)上顯著不同于細(xì)胞、組織或生物體中可同時操作的所 有其它系統(tǒng)的表達(dá)改變，而無論實際調(diào)節(jié)是同時或順次進行的。各可單獨操作的基因調(diào)節(jié) 系統(tǒng)的調(diào)節(jié)在基因表達(dá)中實現(xiàn)的改變優(yōu)選比在細(xì)胞、組織或是生物體中所有其它可操作系 統(tǒng)的至少高2-倍，例如至少高5-倍、10-倍、100-倍、或500-倍。利用其各自配體在選擇 濃度調(diào)節(jié)各給定系統(tǒng)導(dǎo)致該系統(tǒng)的基因表達(dá)幅度有可檢測的改變，而在細(xì)胞、組織或生物 體中可操作的所有其它系統(tǒng)沒有可檢測的表達(dá)改變是理想的。在這種情況中，稱多重誘導(dǎo) 型基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)是“完全正交的”。本發(fā)明可用于檢索正交配體和基于受體的正交基因表達(dá) 系統(tǒng)，例如通過引用全文納入本文的US2002/0110861A1所述那些。術(shù)語“外源性基因”表示對象的外來基因，即，通過轉(zhuǎn)化方法引入對象的基因，內(nèi)源 性突變基因的未突變形式或內(nèi)源性未突變基因的突變形式。轉(zhuǎn)化方法不是本發(fā)明至關(guān)重要 的，可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適合于對象的任何方法。外源性基因可以是以DNA或RNA 形式引入對象的天然或合成基因，它們可通過DNA中間體，例如通過逆轉(zhuǎn)錄酶起作用。可將這些基因引入靶細(xì)胞，可通過直接引入對象，或通過將轉(zhuǎn)化細(xì)胞傳遞入對象而間接引入。
本文所用的術(shù)語“治療產(chǎn)物”和“治療分子”指賦予待治療對象有益功能的治療多 肽(“TP”，“治療蛋白質(zhì)序列”(“TPSQ”)所編碼)或治療多核苷酸。治療多肽可包括但不 限于長度小3至個氨基酸的肽，單鏈或多鏈蛋白和融合蛋白。治療多核苷酸可包括但不限 于反義寡核苷酸、小干擾性RNA、核酶和RNA外在引導(dǎo)序列。本文它處公開了治療產(chǎn)物的 非限制性例子。治療產(chǎn)物可包含天然產(chǎn)生的序列、合成序列或天然和合成序列的組合。術(shù)語“配體-依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物”或“LDTFC”指包含一個或多個蛋白質(zhì)亞基的 轉(zhuǎn)錄因子，該復(fù)合物能調(diào)節(jié)本文所述“因子調(diào)節(jié)的啟動子”所驅(qū)動的基因表達(dá)。模型LDTFC 是“蛻皮素受體復(fù)合物”，其通常指具有核受體家族的至少兩個成員，蛻皮素受體(“EcR”) 和超螺旋(ultraspiracle) ( “USP”)蛋白的異源二聚蛋白質(zhì)復(fù)合物(參見Yao等，Nature 366:476(1993)) ；Yao 等，Cell 71:63(1992))。功能性 LDTFC，例如 EcR 復(fù)合物還可包含 其它蛋白質(zhì)，例如親免蛋白。稱為轉(zhuǎn)錄因子的核受體家族蛋白的其它成員(例如，DHR38， β FTZ-I或其它昆蟲同源物)也可以是EcR和/或USP的配體依賴性或非依賴性伴侶。 LDTFC，例如EcR復(fù)合物還可以是EcR蛋白和超螺旋蛋白的脊椎動物同源物，視黃酸-X-受 體(“RXR”)蛋白的異二聚體或USP和RXR的嵌合體。術(shù)語“LDTFC”和“EcR復(fù)合物”還包 括EcR蛋白或USP的同質(zhì)二聚復(fù)合物以及起到相同功能的單一多肽或三聚體、四聚體和其 它多聚體?？赏ㄟ^結(jié)合該復(fù)合物的蛋白質(zhì)之一的活性蛻皮類固醇或非類固醇配體活化 LDTFC,例如EcR復(fù)合物，包括EcR，但不排除該復(fù)合物的其它蛋白質(zhì)。應(yīng)用于基于LDTFC 的基因開關(guān)，例如基于EcD復(fù)合物的基因開關(guān)的本文所用術(shù)語“配體”描述了小的可溶性 分子，其具有活化基因開關(guān)以刺激其中所編碼多肽表達(dá)的能力。配體的例子包括但不限 于蛻皮類固醇，例如蛻皮素、20-羥基蛻皮素、松甾酮A、米樂甾酮(muristerone A)等， 9-順式-視黃酸、視黃酸的合成類似物、N, N' - 二?；?，例如美國專利號6，013，836 ； 5，117，057 ；5，530，028 ；和 5，378，726 及美國申請公布號 2005/0209283 和 2006/0020146 公 開的那些；美國申請公布號2004/0171651描述的噁二唑啉(oxadiazoline) ；二苯甲?；?基氰基胼，例如歐洲申請?zhí)?61，809公開的那些；N-烷基-N，N' -二芳?；?，例如美國 專利號5，225，443公開的那些；N-酰基-N-烷基羰基胼，例如歐洲申請?zhí)?34，994公開的 那些；N-芳酰基-N-烷基-N'-芳?；荩缑绹鴮＠?，985，461描述的那些；酰氨 基酮(amidoketone)，例如美國申請公布號2004/0049037描述的那些；這些文獻(xiàn)各自通過 引用納入本文，和其它類似的材料，包括3，5- 二-叔丁基-4-羥基-N-異丁基-苯甲酰胺、 8-0-乙?；淋?、氧基類固醇、22 (R)羥基膽固醇、24(S)羥基膽固醇、25-環(huán)氧膽固醇、 Τ0901317、5_α -6-α -環(huán)氧膽固醇_3_硫酸酯(ECHS)、7_酮基膽固醇_3_硫酸酯、金合歡 醇(famesol)、膽汁酸、1，1_ 二膦酸酯、保幼激素III等。可用于本發(fā)明的二?；菖潴w的 例子包括RG-115819(3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-乙基_2，2-二甲基-丙基)-N' -(2-甲 基-3-甲氧基-苯甲?；?-酰胼)、1 -115932(00 -3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁 基)-N' -(2-乙基-3-甲氧基-苯甲?；?_酰胼)和RG-115830(3，5-二甲基-苯甲酸 N-(1-叔丁基-丁基)-N' -(2-乙基-3-甲氧基-苯甲?；?-酰胼)。參見，例如通過引 用全文納入本文的美國專利申請序列號12/155，111和PCT申請?zhí)朠CT/US2008/006757。LDTFC，例如EcR復(fù)合物包含作為核受體超家族成員的蛋白質(zhì)，其中所有成員的特征在于存在包含氨基-末端反式激活域("AD"、“ TD"或"TA"，在本文可互換使用)、 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(“DBD”)和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(“LBD”)的一個或多個多肽亞基。AD可表示 含“異二聚伴侶”或“HP”的融合體。本文將本發(fā)明的包含AD和HP的融合蛋白稱為“共活 化蛋白”或“CAP”。DBD和LBD可表達(dá)為融合蛋白，稱為“配體誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子”(“LTF”)。 可通過接頭，例如絞鏈區(qū)隔開融合伴侶。LTF家族的一些成員在LBD的羧基末端側(cè)還可具有 另一反式激活域。DBD的特征在于存在兩個半胱氨酸鋅指，在其間是兩個氨基酸基序，P-盒 和D-盒，其賦予蛻皮素反應(yīng)元件的特異性。這些結(jié)構(gòu)域可以是天然的、修飾的或是異源受 體蛋白的不同結(jié)構(gòu)域的嵌合體。 構(gòu)成外源性基因、反應(yīng)元件和LDTFC，例如EcR復(fù)合物的DNA序列可摻入古細(xì)菌、原 核細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)，或其它腸細(xì)菌，或真核細(xì)胞， 例如植物或動物細(xì)胞。然而，基因表達(dá)的許多蛋白質(zhì)在細(xì)菌中加工不正確，因此優(yōu)選真核細(xì) 胞。細(xì)胞可以是單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體的形式。外源性基因、反應(yīng)元件和受體復(fù)合物的核 苷酸序列也可作為RNA分子摻入，優(yōu)選功能性病毒RNA的形式，例如煙草花葉病毒。真核細(xì) 胞中優(yōu)選脊椎動物細(xì)胞，因為它們天然缺乏對EcR的本發(fā)明配體起反應(yīng)的分子。所以，它們 對于本發(fā)明配體“基本上不敏感”。因此，可用于本發(fā)明的配體對轉(zhuǎn)化細(xì)胞或整個生物體的 生理學(xué)或其它影響可以忽略。因此，細(xì)胞可生長并表達(dá)所需產(chǎn)物，而基本上不受配體本身存 在的影響。術(shù)語“對象”表示完整的昆蟲、植物或動物。還可預(yù)計，當(dāng)對象是真菌或酵母菌時， 配體可同等良好地起作用。當(dāng)對象是完整的動物時，該動物優(yōu)選脊椎動物，最優(yōu)選哺乳動 物。當(dāng)EcR配體與LDTFC，例如EcR復(fù)合物聯(lián)用，EcR復(fù)合物進而結(jié)合與外源性基因(例 如，報道基因)相連的反應(yīng)元件時，為外在瞬時調(diào)節(jié)外源性基因表達(dá)提供了手段。各種組分 彼此結(jié)合，即，配體與受體復(fù)合物以及受體復(fù)合物與反應(yīng)元件結(jié)合的順序不重要。通常，夕卜 源性基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是對LDTFC，例如EcR復(fù)合物與特異性控制或調(diào)節(jié)性DNA元件結(jié)合的反 應(yīng)。與核受體家族的其它成員相似，EcR蛋白具有至少三個結(jié)構(gòu)域:AD、DBD和LBD。與核受 體家族的亞組相似，該受體還具有未良好確定的負(fù)責(zé)異二聚化特性的區(qū)域(本文稱為“異 二聚伴侶”或“HP”)。與包含，例如AD和/或HP(如USP或RXR蛋白)的CAP異二聚后， 配體與LTF，例如EcR蛋白的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合使得該異源二聚蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 能結(jié)合活性形式的反應(yīng)元件，因此導(dǎo)致外源性基因的表達(dá)或阻遏。該機制不排除配體結(jié)合 各亞基，例如LTF或CAP，如EcR或USP，以及導(dǎo)致活性同質(zhì)二聚體復(fù)合物(例如EcR+EcR或 USP+USP)形成的可能性。在一個實施方式中，可改變一個或多個受體結(jié)構(gòu)域從而產(chǎn)生嵌合 型基因開關(guān)。該三個結(jié)構(gòu)域中的一個或多個通?？蓮呐c其它結(jié)構(gòu)域來源不同的來源選擇， 從而能在所選宿主細(xì)胞或生物體內(nèi)為反式激活活性、與配體互補結(jié)合和識別特異性反應(yīng)元 件而優(yōu)化嵌合型受體。此外，可用其它DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，例如酵母的GAL-4蛋白(參 見 Sadowski 等，Nature 335:563(1988))或大腸桿菌的 LexA 蛋白(參見 Brent 等，Cell 43 =729(1985))的反應(yīng)元件修飾或取代反應(yīng)元件本身來容納嵌合型LDTFC，例如EcR復(fù)合 物。嵌合型系統(tǒng)的另一優(yōu)點是它們能根據(jù)所需的最終結(jié)果選用驅(qū)動外源性基因的啟動子。 這種雙重控制在基因治療領(lǐng)域尤其重要，特別是當(dāng)產(chǎn)生細(xì)胞毒性蛋白時，因為既可控制表 達(dá)的時機又可控制發(fā)生表達(dá)的細(xì)胞。當(dāng)操作性連接于合適啟動子的外源性基因引入對象的細(xì)胞時，該外源性基因的表達(dá)受到本發(fā)明配體存在的控制。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型 調(diào)節(jié)的，或者可以是組織-特異性的(即，只在特定細(xì)胞類型中表達(dá))或是生物體的某些發(fā) 育階段特異性的。編碼各種多肽的許多基因組和cDNA核酸序列，例如轉(zhuǎn)錄因子和報道基因是本領(lǐng) 域熟知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得幾乎所有已知基因的核酸序列信息，可從公共保藏機構(gòu) (公布序列的研究機構(gòu))直接獲得核酸分子，或采用常規(guī)方法制備該分子。對于體內(nèi)應(yīng)用，本文所述配體可以吸收入藥學(xué)上可接受的運載體，例如溶液、懸 液、片劑、膠囊、軟膏、酏劑和可注射組合物。藥物組合物可含有0. 01重量％到99重量％的 配體。組合物可以是單劑量或多劑量形式。任何具體的藥物組合物中配體的含量應(yīng)取決于 有效劑量，即，引發(fā)所需基因表達(dá)或阻遏的所需劑量。給予藥物制品的合適途徑包括口服、直腸、局部(包括經(jīng)皮膚、口腔含化和舌下)、 經(jīng)陰道、胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、鞘內(nèi)和硬膜外)和經(jīng)鼻胃管。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)理解優(yōu)選的給藥途徑取決于所治療的病癥，可能會因，例如受者的病癥等因素 而有所不同。本發(fā)明的一個實施方式包括治療、緩解或預(yù)防對象中疾病、病癥或病狀的方法，包 括(a)將以下多核苷酸引入所述對象；(1)編碼基因開關(guān)的多核苷酸，所述基因開關(guān) 包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子 序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，其中所述啟動子在所述疾病、病癥或病狀期間活化， 和(2)與某啟動子相連的編碼治療多肽或治療多核苷酸的第二多核苷酸，該啟動子由所述 配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物活化；和(b)將配體給予所述對象以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)；其中所述治療多肽或治療多核苷酸的表達(dá)水平足以治療、緩解或預(yù)防所述疾病、 病癥或病狀。本發(fā)明的一個實施方式包括治療、緩解或預(yù)防對象中疾病、病癥或病狀的方法，包 括(a)將以下多核苷酸引入對象；(1)編碼基因開關(guān)的第一多核苷酸，所述基因開關(guān) 包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子 序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，和(2)與因子調(diào)節(jié)的啟動子操作性相連的編碼治療 多肽或治療多核苷酸的第二多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物活化， 其中，引入所述第一和第二多核苷酸從而使得它們在有所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物存 在下表達(dá)；和(b)將配體給予所述對象以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。本發(fā)明的一個實施方式包括在對象中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法，包 括(a)將以下多核苷酸引入對象；(1)編碼基因開關(guān)的第一多核苷酸，所述基因開關(guān) 包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子 序列編碼配體依賴性 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，和(2)與因子調(diào)節(jié)的啟動子操作性相連的編碼所述 治療多肽或治療多核苷酸的第二多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物活化，其中，引入所述第一和第二多核苷酸從而使得它們在有所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物存在下表達(dá)；和(b)將配體給予所述對象以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。在某些實施方式中，方法中所述的治療開關(guān)啟動子是組成型的。在某些實施方式 中，治療開關(guān)啟動子在疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下活化，例如，該啟動子對疾病起反應(yīng)、對 特定生理、發(fā)育、分化或病理狀況起反應(yīng)和/或?qū)σ环N或多種特定生物分子起反應(yīng)而活化； 和/或該啟動子在特定組織或細(xì)胞類型中活化。在某些實施方式中，所述疾病、病癥或病狀 對治療多肽或多核苷酸起反應(yīng)。例如，在某些非限制性實施方式中，治療多核苷酸或多肽可 用于治療、預(yù)防、緩解、減輕癥狀、防止進展或治愈疾病、病癥或病狀，但無需達(dá)到這些事情 中的任一項或全部。在某些實施方式中，引入所述第一和第二多核苷酸從而能在疾病、病癥 或病狀相關(guān)條件下表達(dá)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物。在一個實施方式中，實施治療方法從 而治療多肽或治療多核苷酸能表達(dá)，其在對象中的傳播水平足以治療、緩解或預(yù)防所述疾 病、病癥或病狀。本文所用的“傳播”表示多肽從修飾細(xì)胞中表達(dá)和釋放足以在對象中具有 作用或活性。傳播可以是全身性、局部或其間的任何情況。例如，治療多肽或治療多核苷酸 可以經(jīng)血流或淋巴系統(tǒng)全身性散播?；蛘撸委煻嚯幕蛑委煻嗪塑账峥梢栽诖委煹慕M織 或器官中局部散播。在一個實施方式中，通過將本發(fā)明組合物，例如上述第一和第二多核苷酸直接給 予待治療對象來實施治療方法，從而待治療對象的細(xì)胞體內(nèi)攝取該多核苷酸，在合適條件 下那些細(xì)胞會表達(dá)一種或多種治療多肽或多核苷酸，如本文它處所詳述的?？梢酝ㄟ^各種 方法將多核苷酸直接遞送至待治療的對象，包括但不限于病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體、腺伴隨病毒載體、痘病毒載體，例如牛痘病毒載體，桿狀病毒載體、皰疹病毒載體，例如 單純皰疹病毒載體或E-B病毒載體，腺病毒載體、雙粒病毒載體或花椰菜花葉病毒載體；非 病毒載體，例如可與例如脂質(zhì)體形成復(fù)合物而遞送的質(zhì)粒、荷電脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)、生物 聚合物或DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在另一實施方式中，通過將包含在一個或多個修飾細(xì)胞的本發(fā)明組合物，例如上 述第一和第二多核苷酸引入待治療對象來實施治療方法。給予修飾細(xì)胞后，修飾細(xì)胞在合 適條件下表達(dá)一種或多種治療多肽或多核苷酸，如本文它處所詳述的。術(shù)語“修飾細(xì)胞”指 至少插入了上述第一和第二多核苷酸的一個或多個細(xì)胞。因此，“修飾細(xì)胞”指含有所述第 一和第二多核苷酸的細(xì)胞，其可以是或不是細(xì)胞形式，或與待治療對象有關(guān)。這種細(xì)胞包括 在本文所述“生物反應(yīng)器”或“生物反應(yīng)器器件”的定義中。然而，本文定義的“生物反應(yīng)器” 或“生物反應(yīng)器器件”無需是修飾細(xì)胞，本文定義的生物反應(yīng)器或生物反應(yīng)器器件反而可以 是要分泌治療蛋白質(zhì)或治療多核苷酸的任何細(xì)胞或多種細(xì)胞，無論所述細(xì)胞是否是“修飾 細(xì)胞”。在一個實施方式中，通過將本發(fā)明組合物，例如上述第一和第二多核苷酸引入已 從所述對象分離的細(xì)胞，即自體細(xì)胞，從而產(chǎn)生修飾細(xì)胞，將該修飾細(xì)胞重新引入所述對象 來實施治療方法。或者，可通過將本發(fā)明組合物，例如上述第一和第二多核苷酸引入未從對象分離 的細(xì)胞(即它們相對于該對象是非自體的)以產(chǎn)生修飾的非自體(MNA)細(xì)胞從而制備修飾 細(xì)胞。這種MNA細(xì)胞相對于待治療對象是同種異體的，即它們衍生自該對象同一物種的遺傳上不同的成員。例如，在治療人對象時，細(xì)胞將是人細(xì)胞，但不是直接衍生自待治療的對 象?；蛘?，MNA細(xì)胞可以相對于待治療對象是異種的，即它們衍生自不同于待治療對象的物 種。例如，在治療人對象時，細(xì)胞可以是小鼠細(xì)胞、猴細(xì)胞或豬細(xì)胞。適用于本發(fā)明的MNA細(xì)胞可以從任何數(shù)量的細(xì)胞類型產(chǎn)生，包括但不限于固定 化細(xì)胞、原代細(xì)胞和能終末分化的細(xì)胞。適合產(chǎn)生本發(fā)明的MNA修飾細(xì)胞的細(xì)胞的非限制 性例子包括C2C12小鼠成肌細(xì)胞、HEK293人胚胎腎細(xì)胞、ARPE-19細(xì)胞、hMSC細(xì)胞、胰島細(xì) 胞、MDCK細(xì)胞、BHK細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞、星形細(xì)胞衍生細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞衍生細(xì) 胞、成肌細(xì)胞衍生細(xì)胞、甲狀旁腺衍生細(xì)胞。在利用胰島細(xì)胞產(chǎn)生修飾細(xì)胞來治療人對象的具體實施方式
中，胰島細(xì)胞可以是異種的，例如豬胰島細(xì)胞，或同種異體的，例如從尸體獲 得的人胰島細(xì)胞。在一個實施方式中，治療方法體內(nèi)進行。在一個實施方式中，連接于啟動子的編碼基因開關(guān)的多核苷酸和編碼治療多肽或 治療多核 苷酸的多核苷酸是較大多核苷酸，例如載體的一部分。在另一實施方式中，連接于 啟動子的編碼基因開關(guān)的多核苷酸和編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸是不同的 多核苷酸，它們可以組合形成“核酸組合物”。在某些實施方式中，本發(fā)明生物反應(yīng)器包含在引入對象前圍繞有屏障(例如，包 裹化的)的修飾或非修飾細(xì)胞。這種生物反應(yīng)器可用于任何對象，從而無需修飾每位個體 的自體細(xì)胞?，F(xiàn)已采用細(xì)胞包裹化方法來免疫分離細(xì)胞，從而能選擇性或非選擇性地釋放 所需生物材料。提供包裹化組合物及其制備方法，從而能提供改善的結(jié)構(gòu)特征和/或免疫 保護作用可能是理想的。這種組合物和方法可用于包裹化的細(xì)胞能耐受待治療對象內(nèi)的機 械、化學(xué)或免疫破壞作用的場合，還使得營養(yǎng)素、離子、氧和維持組織和支持正常代謝功能 所需的其它物質(zhì)自由透過，但不透過細(xì)菌、淋巴細(xì)胞和負(fù)責(zé)免疫化學(xué)反應(yīng)較大類蛋白質(zhì)。適 用于本發(fā)明的屏障能散播包含在屏障內(nèi)的修飾或非修飾細(xì)胞表達(dá)的治療蛋白或治療多核 苷酸，但防止這些細(xì)胞與對象免疫系統(tǒng)的細(xì)胞直接接觸。屏障還起到防止非自體或自體修 飾或非修飾細(xì)胞從引入部位逃脫(例如，如果進入循環(huán)可能對對象有害的劣種細(xì)胞(rogue cell))的作用。在一個實施方式中，屏障是選擇性可透過屏障，例如可透過小分子，例如激 素和小肽，但不透過較大多肽，例如抗體的屏障。例如，屏障不透過分子量大于約100，000、 約50，000、約25，000、約10，000、約5，000或約1，000道爾頓的分子。任何數(shù)量的屏障系統(tǒng)適用于本發(fā)明。在一個實施方式中，例如，屏障包括包入一 個或多個細(xì)胞的保形包被。保形包被通常由聚合物材料，例如聚乙二醇或甲基丙烯酸羥乙 酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)制成。保形包被通常包封少量修飾細(xì)胞，例如1_10個細(xì) 胞、1-20個細(xì)胞、1-30個細(xì)胞、1-50個細(xì)胞、1-70個細(xì)胞或1_90個細(xì)胞。參見，例如通過引 用全文納入本文的 Shoichet MS, Winn SR. , Adv Drug Delivery Rev. 42 :81_102 (2000)。在其它實施方式中，適用于本發(fā)明的屏障系統(tǒng)包括含有包封細(xì)胞的生物反應(yīng)器。 本領(lǐng)域已知兩種非限制性包封方法，微囊化和大包裹化。在微囊化中，細(xì)胞通常懸浮在生物 相容的包裹化材料中，然后定型成珠樣結(jié)構(gòu)，而在大包裹化中，通常先制成該器件再加入細(xì) 胞，該器件可由一種或多種合成膜構(gòu)成。與保形包被相比，包含包裹化細(xì)胞的屏障系統(tǒng)在 大小上更統(tǒng)一，孔徑更均勻，從而能更好地控制蛋白質(zhì)散播。對于包裹化，可在足夠溫和的 條件下處理活細(xì)胞和其它敏感材料，從而使得細(xì)胞或生物材料基本上不受包裹化過程的影響，但仍能形成強度足夠長期維持的膠囊?；罴?xì)胞可包裹化，通過將細(xì)胞在生物相容半透膜中包裹化，得到的包裹化細(xì)胞在 體內(nèi)長期維持。增加生物相容性的一種方法是加入生物相容帶負(fù)電材料的外表面。本文所 用的術(shù)語“生物相容”共同指完整的膠囊及其內(nèi)含物。具體地說，其指植入的完整包裹化細(xì) 胞避免身體各種保護系統(tǒng)，例如免疫系統(tǒng)或異物纖維變性反應(yīng)的破壞作用和功能維持顯著 時間的能力。包含適用于本發(fā)明的包裹化細(xì)胞的生物反應(yīng)器對于將細(xì)胞給予動物特別有用，在 該情況中要盡可能降低動物對細(xì)胞的免疫反應(yīng)。還可給予產(chǎn)生抗體、酶和其它生物活性材 料的細(xì)胞。本發(fā)明的所得包裹化細(xì)胞在對象內(nèi)體積小有助于通過注射、植入或移植將微膠 囊給予入對象?？蓪⒒罴?xì)胞包封在各種凝膠，例如藻酸鹽中以形成可植入的珠樣結(jié)構(gòu)，例如微珠 或微球，從而一旦植入待治療的對象即可在物理上分離細(xì)胞。為防止較小分子量的物質(zhì)， 例如抗體和補體(分子量約150kDa)進入這些珠-樣結(jié)構(gòu)，可用能提供孔徑受控外殼的， 例如聚-L-賴氨酸、幾丁質(zhì)或PAN-PVC等材料包被它們，或者可通過，例如交聯(lián)處理它們 以控制它們的內(nèi)部多孔性。有用材料的其它例子包括有天然或合成聚合物或共聚物制成 的常規(guī)生物相容材料，例如聚-L-賴氨酸-藻酸鹽、膠原、明膠、層粘連蛋白、甲基丙烯酸 甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、MATRIGEL、VIRT0GEN、聚乙烯醇、瓊脂糖、聚乙二醇、水凝膠、聚乳 酸、聚乙醇酸、聚(丙交酯-共_乙交酯)、聚羥基丁酸酯_聚羥基戊酸酯共聚物、聚(丙交 酯-共-己內(nèi)酯)、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚13-羥基丁酸、聚酐、聚對苯二甲酸乙酯、聚四氟 乙烯、聚丙烯酸酯類(pllyacrylates)(包括丙烯酸共聚物)、聚偏乙烯、聚氯乙烯共聚物、 聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯、聚酰胺、醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚砜(包括聚醚砜)、聚磷腈 (polyphosphazenes)、聚丙烯膽禾口聚(acrylonitrile/covinyl chloride)。一種形式的包裹化是微囊化，其涉及將細(xì)胞懸浮在液體或明膠狀包裹化材料中， 然后形成支持性顆粒基質(zhì)，例如水凝膠基質(zhì)以形成珠-樣結(jié)構(gòu)，其用作可植入器件的核心。 該核心維持合適的細(xì)胞分布，提供強度并增強細(xì)胞活力、壽命和功能。該核心還可導(dǎo)致免疫 分離。其還保護珠樣結(jié)構(gòu)中包含的內(nèi)部細(xì)胞免遭可引發(fā)待治療對象中不良免疫反應(yīng)的直接 細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。屏障系統(tǒng)可含有多層，例如各層用于不同目的(例如，支持、控制透過性)。屏障 可包含對比劑或使得屏障可成像的其它特性(例如，通過x-射線、超聲檢查等)以確保植 入細(xì)胞定位合適?？捎糜诩?xì)胞植入的屏障系統(tǒng)的其它例子描述于美國專利號7，226，978、 RE39，542(瓊脂糖)、6，960，351、6，916，640、6，911，227(聚乙 二 醇)、6，818，018、 6，808，705、6，783，964、6，762，959、6，727，322、6，610，668(聚-14-N-乙酰葡萄糖胺 (p-GIcNAc)多糖)、6，558，665、RE38, 027,6, 495，161,6, 368，612,6, 365，385,6, 337，008、 6，306，454(聚亞烷基)、6，303，355,6, 287，558 (凝膠超級基質(zhì))、6，281，015,6, 264，941、 6，258，870、6，180，007、6，126，936(多胺酸)、6，123，700、6，083，523、6，020，200、 5，916，790,5, 912，005,5, 908，623,5, 902，745,5, 858，746,5, 846，530 (多糖)、5，843，743、
5，837，747、5，837，234、5，834，274、5，834，001,5,801，033,5，800，829,5，800，828、5，798，113、5，788，988、5，786，216、5，773，286,5,759，578,5,700，848,5，656，481、5，653，975、5，648，099、5，550，178、5，550，050,4，806，355,4，689，293,4，680，174、4，673，566,4, 409，331,4, 352，883、和美國專利申請公布2006/0263405 (藻酸鹽/聚合物) 和2004/0005302 (藻酸鹽-聚-L-賴氨酸)，各自通過引用全文納入本文。在某些實施方式中，適用于本發(fā)明的屏障系統(tǒng)包含微囊化細(xì)胞。微囊化產(chǎn)生包含 包裹化細(xì)胞的大致球形和相對均勻的珠_樣結(jié)構(gòu)，其中珠_樣結(jié)構(gòu)直徑約100-700 u m，例 如直徑約100、200、300、400、500、600或700 u m?？衫蒙鲜龈鞣N包裹化材料制備本發(fā)明 的微囊化細(xì)胞。在一個實施方式中，包裹化材料包含水凝膠。在另一實施方式中，包裹化材 料包含聚合物。合適的聚合物包括但不限于纖維素，例如硫酸纖維素和藻酸鹽。例如，本 發(fā)明的一種微膠囊包含聚陰離子藻酸鹽和聚陽離子聚合物，從而能相互作用并形成物理選 擇滲透性膜屏障。微囊化的其它方法包括形成聚(L-丙交酯)酸(PLLA)或聚-L-鳥氨酸 (PL0)藻酸鹽微球。參見，例如 Darrabie，M. D.等 Biomaterials 26:6846-6852(2005)和 Blasi，P.等.Int J Pharm. 324 =27-36(2006)。基于藻酸鹽的微囊化材料還可包含也是生 物可降解的超高粘度(UHV)聚合物。參見，例如Zimmermann，U.等.Ann NYAcadSci. 944 199-215(2001)。包含微囊化細(xì)胞的本發(fā)明生物反應(yīng)器通常包含每個“珠”至少一個到最多約1000 個細(xì)胞，例如要分泌本文所述所需治療多肽或多核苷酸的修飾或非修飾細(xì)胞。例如，包含微 囊化細(xì)胞的本發(fā)明生物反應(yīng)器可包含每個“珠”至少50個、至少100個、至少200個、至少 400個、至少500個、至少800個到約1000個或更多個細(xì)胞。在某些實施方式中，適用于本發(fā)明的生物反應(yīng)器包含包封在巨囊化 (macroencapsulation)器件中的細(xì)胞。與包含微囊化細(xì)胞的生物反應(yīng)器相比，包含大包裹 化細(xì)胞的生物反應(yīng)器通常更大，常是非球形包裹化細(xì)胞實體，并可由一種或多種合成膜，例 如1、2、3、4、8、10或更多種膜構(gòu)成，這些膜的組成可以相同或不同。如名稱所示，大包裹化 細(xì)胞器件的大小使得各實體易于操作。例如，典型的巨囊化器件可以是長橢圓形，長約3mm、 4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm 或更長，直徑約 1mm、2mm、3mm、4mm 或 5mm 或更長。本發(fā)明 的示范性而非示例性巨囊化器件約6mm長，直徑約1mm。在某些實施方式中，適用于本發(fā)明的巨囊化器件包含兩種或更多種合成膜，其中 合成膜的孔徑不同從而能調(diào)節(jié)治療分子經(jīng)該器件的運輸以及它們散播入環(huán)境。在某些實 施方式中，本發(fā)明的巨囊化器件包含半透聚合物外膜和支持細(xì)胞的內(nèi)部支架。在非限制 性例子中，外膜包含約15nm的孔以交換治療分子的營養(yǎng)物。內(nèi)部支架可包含任何數(shù)量的 材料。在一個非限制性例子中，支架包含聚對苯二甲酸乙二酯紗線(購自神經(jīng)技術(shù)公司 (Neurotech，www.neurotechusa. com)) 0在另一非限制性例子中，適用于本發(fā)明的巨囊化器件包含聚合膜雙層，其中該雙 層包含層疊在內(nèi)部致密孔0. 45uM PIPE免疫屏障層上的0.5 iim聚(四氟乙烯)(PTFE)膜外 層(購自特拉賽特公司(Theracytejww. theracyte. com))。這種巨囊化器件還可在所述聚 合膜雙層外包含無紡聚合網(wǎng)層。在還有另一非限制性例子中，適用于本發(fā)明的巨囊化器件 由聚醚砜(PES)中空纖維構(gòu)成。參見，例如Li，Y.等，J.Membrane Sci. 245 =53-60(2004) 適用于本發(fā)明的巨囊化器件可任選具有額外結(jié)構(gòu)，從而能植入待治療的對象并從 中回收。例如，巨囊化器件可包含但不限于縫合夾、裝填端口、系線或便于使用的其它結(jié) 構(gòu)。本發(fā)明巨囊化器件的內(nèi)部空間通常適合包含至少1個到最多約至少105個細(xì)胞，
32例如要分泌所需治療多肽或多核苷酸的修飾細(xì)胞。例如，本發(fā)明的巨囊化器件可包含至少 500、至少1000、至少2000、至少4000、至少5000到約10，000個或更多個細(xì)胞。要分泌所需治療多肽或多核苷酸的一些本發(fā)明生物反應(yīng)器器件，例如包裹化或包 被的修飾或非修飾細(xì)胞還可在，例如屏障或膠囊內(nèi)包含保護性細(xì)胞，該保護性細(xì)胞能為要 分泌所需治療多肽或多核苷酸的修飾或非修飾細(xì)胞提供保護作用。這種保護性細(xì)胞的非限 制性例子包括修飾或非修飾的塞托利細(xì)胞和紅細(xì)胞。此外，要分泌所需治療多肽或多核苷 酸的一些本發(fā)明生物反應(yīng)器器件，例如包裹化或包被的修飾或非修飾細(xì)胞還可包含能產(chǎn)生 更相容或保護性微環(huán)境的外涂層?？僧a(chǎn)生的示范性但非限制性微環(huán)境包括抗炎性微環(huán)境和 促血管生成性微環(huán)境。在還有其它實施方式中，本發(fā)明生物反應(yīng)器器件可包括具有“安全_關(guān)閉”機制的 修飾細(xì)胞。例如，生物反應(yīng)器器件中所含的修飾細(xì)胞可包含編碼致死多肽的調(diào)節(jié)自殺基因， 當(dāng)該基因活化后將誘導(dǎo)該修飾細(xì)胞本身的破壞作用。例如，如果修飾細(xì)胞脫離屏障系統(tǒng)，或 者如果經(jīng)歷致癌轉(zhuǎn)化，其可程序性死亡。下文更詳細(xì)描述了適用于本發(fā)明的致死多肽的非 限制性例子。實施治療方法的對象可以是需要治療或預(yù)防的任何對象。例如，該對象可以是表 現(xiàn)出疾病、病癥或病狀的一種或多種癥狀的對象。該對象還可以是易患疾病、病癥或病狀的 對象，例如因為遺傳學(xué)、家族史或環(huán)境接觸的原因。該對象可以是普通公眾的成員，例如人 群中對疾病、病癥或病狀作預(yù)防性免疫接種的那部分。待用本發(fā)明方法治療或預(yù)防的疾病、病癥或病狀可以是有一種或多種治療開關(guān)啟 動子可用的任何疾病、病癥或病狀。可通過本發(fā)明方法治療或預(yù)防的疾病或病癥的例子包 括但不限于超增殖性疾病、病癥或病狀(例如，癌癥)，心血管疾病、病癥或病狀，神經(jīng)疾 病、病癥或病狀，自身免疫疾病、病癥或病狀，骨疾病、病癥或病狀，胃腸疾病、病癥或病狀， 血液疾病、病癥或病狀，代謝疾病、病癥或病狀，炎性疾病、病癥或病狀和感染性疾病、病癥 或病狀。本發(fā)明的治療開關(guān)啟動子可以是可用于治療、緩解或預(yù)防特定疾病、病癥或病狀 的任何啟動子。例子包括但不限于只在特定疾病、病癥或病狀期間顯示表達(dá)增加的基因的 啟動子和在特定細(xì)胞條件下(例如，增殖、凋亡、PH改變、氧化狀態(tài)、氧水平)顯示表達(dá)增加 的基因的啟動子。在基因開關(guān)包含多條轉(zhuǎn)錄因子序列的一些實施方式中，可通過組合疾病 或病癥-特異性啟動子與組織或細(xì)胞類型特異性啟動子以限制表達(dá)治療產(chǎn)物的組織從而 增加該治療方法的特異性。因此，治療開關(guān)啟動子的定義包括組織_或細(xì)胞類型_特異性 啟動子。作為疾病特異性啟動子的例子，治療癌癥有用的啟動子包括致癌基因的啟動子。 致癌基因類別的例子包括但不限于生長因子、生長因子受體、蛋白激酶、程序性細(xì)胞死亡 調(diào)節(jié)劑和轉(zhuǎn)錄因子。致癌基因的具體例子包括但不限于sis、erb B、erb B-2、raS、abl、myc 和bcl-2及TERT。其它癌癥相關(guān)基因的例子包括腫瘤相關(guān)抗原基因和在腫瘤細(xì)胞中過表 達(dá)的其它基因(例如，MAGE-1、癌胚抗原、酪氨酸酶、前列腺特異性抗原、前列腺特異性膜抗 原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、T/Tn、MART-1、gp 100、GM2、Tn、sTn 和湯普森-弗 萊德里系抗原(Thompson-Friedenreich antigen) (TF))。表1和2所列參考文獻(xiàn)公開了本領(lǐng)域已知并可用作本發(fā)明治療開關(guān)啟動子的啟動子序列和其它調(diào)節(jié)元件(例如增強子)，以及各啟動子相關(guān)的疾病/病癥(表1)或組織特 異性(表2)。這些參考文獻(xiàn)中公開的啟動子序列通過引用全文納入本文。表 1 表2 在特定疾病或病癥期間顯示表達(dá)水平改變，因此可提供用于本發(fā)明的啟動子的其 它基因包括但不限于表3所列的基因(連同相關(guān)的疾病/病癥)。表3
一旦鑒定到表達(dá)模式在疾病、病癥或病狀期間受調(diào)節(jié)的基因，該基因的啟動子可 用于本發(fā)明的基因開關(guān)中。許多基因的序列，包括啟動子區(qū)域是本領(lǐng)域已知的并可從公開 數(shù)據(jù)庫，例如GenBank獲得。因此，一旦鑒定到合適的基因，則不難鑒定和獲得啟動子序列。 本發(fā)明的另一方面涉及鑒定可分離其啟動子并置于基因開關(guān)中的合適基因。因此，基因的 身份對于本發(fā)明的具體實施方式
不是至關(guān)重要的，只要該啟動子能分離并可用于隨后的配 置和環(huán)境中。因此，本發(fā)明包括利用尚未鑒定的基因的啟動子。一旦鑒定了合適的基因，那 么測定啟動子功能所需的遺傳序列只是常規(guī)技術(shù)或?qū)嶒灥膯栴}。實際上，有幾種可商品化 購得的方法協(xié)助測定感興趣基因的啟動子區(qū)域。例如，Ding等最近通過使得人Spr0Uty4基 因的5'-側(cè)接序列逐漸缺失而闡明了新型Sprouty4基因的啟動子序列(Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287 :L52 (2004)，其通過引用納入本文)。簡言之，一旦測定了轉(zhuǎn) 錄起始位點，則利用普通PCR引物產(chǎn)生PCR片段，從而以單向方式克隆5’ -側(cè)接區(qū)段的區(qū) 段。將產(chǎn)生的區(qū)段克隆入螢光素酶受體載體，檢測螢光素酶活性來測定人Spr0Uty4基因的 啟動子區(qū)域。獲取和驗證基因啟動子的另一示范性方法包括以下步驟(1)獲得組織類型相似 /相同的患病和未患病細(xì)胞/組織樣品；(2)分離該樣品的總RNA或mRNA ； (3)對患病和未 患病RNA實施差別微陣列分析；(4)鑒定候選疾病-特異性轉(zhuǎn)錄物；(5)鑒定疾病特異性轉(zhuǎn) 錄物相關(guān)的基因組序列；(6)獲得或合成該疾病特異性DNA的預(yù)計轉(zhuǎn)錄起點上游和下游的 DNA序列；(7)利用步驟6所得不同長度的DNA設(shè)計和產(chǎn)生啟動子報道載體；和(8)檢驗患 病和未患病細(xì)胞/組織以及無關(guān)細(xì)胞/組織中的啟動子報道載體。插入基因開關(guān)的啟動子的來源可以是天然或合成的，啟動子的來源應(yīng)不限于本文 所述的本發(fā)明范圍。換言之，可從細(xì)胞直接克隆啟動子，或者早已從不同來源克隆的啟動 子，或者可以合成啟動子?；蜷_關(guān)系統(tǒng)基因開關(guān)可以是通過加入或除去特定配體而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的任何基因開關(guān)。在 一個實施方式中，基因開關(guān)是其中基因表達(dá)水平依賴于存在的配體水平的基因開關(guān)?？捎?于本發(fā)明基因開關(guān)中的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的例子包括但不限于由其各自配體活 化的核受體超家族的成員(例如，糖皮質(zhì)激素、雌激素、妊娠素、類視黃醇、蛻皮素及其類似 物和模擬物)和四環(huán)素活化的rTTA。在本發(fā)明的一方面?；蜷_關(guān)是基于EcR的基因開 關(guān)。這種體系的例子包括但不限于美國專利號6，258，603、7，045，315、美國專利申請公布 號2006/0014711、2007/0161086和國際申請公布號W0 01/70816所述的系統(tǒng)。嵌合型蛻 皮素受體系統(tǒng)的例子描述于美國專利號7，091，038、美國專利申請公布號2002/0110861、 2004/0033600,2004/0096942,2005/0266457 和 2006/0100416 和國際申請公布號 W0 01/70816、W0 02/066612、W002/066613、W0 02/066614、W0 02/066615、W0 02/29075 和 W02005/108617，各自通過引用全文納入本文。非類固醇蛻皮素激動劑-調(diào)節(jié)的系統(tǒng)的例 子是馬薩諸塞州伊普斯威奇市新英格蘭生物實驗室的RheoSwitch 哺乳動物誘導(dǎo)型表達(dá) 系統(tǒng)(RheoSwitch Mammalian IndueibleExpression System, New England Biolabs, Ipswich, MA) 在本發(fā)明的另一方面，基因開關(guān)基于H(506結(jié)合蛋白(FKBP)與FBBP雷帕
50霉素相關(guān)蛋白(FRAP)的異二聚化，并通過雷帕霉素或其非免疫抑制性類似物調(diào)節(jié)。這種系 統(tǒng)的例子包括但不限于馬薩諸塞州劍橋ARIAD藥物公司的ARGENT 轉(zhuǎn)錄技術(shù)(ARGENT Transcriptional Technology, ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, MA)禾口美國專利號 6，015，709,6, 117，680,6, 479，653,6, 187，757 和 6，649，595 描述的系統(tǒng)。在一個實施方式中，基因開關(guān)包含在治療開關(guān)啟動子控制下編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄 因子復(fù)合物的一條轉(zhuǎn)錄因子序列。該轉(zhuǎn)錄因子序列可編碼天然產(chǎn)生的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子 復(fù)合物或人工配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物。人工轉(zhuǎn)錄因子是其中轉(zhuǎn)錄因子的天然序列被改 變，例如通過序列突變或通過組合不同轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域獲得的轉(zhuǎn)錄因子。在一個實施方 式中，轉(zhuǎn)錄因子包含H組核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，H組核受體配體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域來自蛻皮素受體、遍在受體(UR)、孤兒受體1(0R-1)、類固醇激素核受體l(NER-l)、 類視黃醇X受體相互作用蛋白-15(RIP-15)、肝X受體0 (LXR0)、類固醇激素受體樣蛋白 (RLD-1)、肝X受體(LXR)、肝臟X受體a (LXR a )、類法呢醇X受體(FXR)、受體相互作用蛋 白14(RIP-14)、或法呢醇受體(HRR-1)。在另一實施方式中，H組核受體LBD來自蛻皮素受 體。A.基于蛻皮素的基因開關(guān)EcR和其它H組核受體是核受體超家族的成員，其中所有成員的特征通常在于存 在任選融合于異二聚伴侶(HP)以形成共活化蛋白(CAP)的氨基-末端反式激活域(AD，也 可互換稱為TA或TD)，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和經(jīng)絞鏈區(qū)融合于DBD的LBD從而形成配體 依賴性轉(zhuǎn)錄因子(LTF)。本文所用的術(shù)語“DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域”包括DNA結(jié)合蛋白的最小多肽 序列，到最多DNA結(jié)合蛋白的全長，只要DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域能起到結(jié)合特定反應(yīng)元件的作用。 核受體超家族的成員的特征還在于存在4或5個結(jié)構(gòu)域A/B、C、D、E，和在一些實施成員中 的 F(參見 US 4，981，784 和 Evans，Science 240 :889(1988))?！癆/B”結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于反式激 活域，“C”對應(yīng)于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，“D”對應(yīng)于絞鏈區(qū)，和“E”對應(yīng)于配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該家 族的一些成員還可在LBD的羧基末端側(cè)具有對應(yīng)于“F”的另一反式激活域。以下多肽序列報道為蛻皮素受體(蛻皮類固醇受體)(20-羥基-蛻皮素受體) (20E受體)(EcRH)(核受體亞家族1H組成員1)的多肽序列，其Genbank登錄號為P34021。黑腹果蠅(果腿i)的蛻皮素受體(878aa)(SEQ ID NO5)
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721tqndsqhqtq pqlqpqlppq lqgqlqpqlq pqlqtqlqpq iqpqpqllpv sapvpasvta781pgslsavsts seymggsaai gpitpattss itaavtasst tsavpmgngv gvgvgvggnv841smyanaqtam almgvalhsh qeqliggvav ksehsttaDBD的特征在于存在兩個半胱氨酸鋅指，在其間是兩個氨基酸基序，P-盒和D-盒， 其賦予反應(yīng)元件的特異性。這些結(jié)構(gòu)域可以是天然的、修飾的或是異源受體蛋白的不同結(jié) 構(gòu)域的嵌合體。與該核受體家族的亞組相似，EcR還具有未良好確定的負(fù)責(zé)異源二聚特性 的區(qū)域。因為核受體的結(jié)構(gòu)域在自然界中是模塊，LBD、DBD和TD可互換。在另一實施方式中，轉(zhuǎn)錄因子包含AD、識別與要調(diào)節(jié)其表達(dá)的治療蛋白或治療多 核苷酸相關(guān)的反應(yīng)元件的DBD和H組核受體LBD。在某些實施方式中，H組核受體LBD包含 取代突變。在另一實施方式中，基因開關(guān)包含在第一治療開關(guān)啟動子(TSP-1)控制下的第一 轉(zhuǎn)錄因子序列，例如CAP和在第二治療開關(guān)啟動子(TSP-2)控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，例 如LTF，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼的蛋白質(zhì)相互作用從而 形成蛋白質(zhì)復(fù)合物(LDTFC)，S卩，“雙重開關(guān)”或“雙雜交體”基因開關(guān)。第一和第二 TSP可 以相同或不同。在該實施方式中，基因開關(guān)中存在治療分子表達(dá)所需的兩種不同TSP提高 了治療方法的特異性(參見圖2)。圖2還證明通過插入合適的TSP能修飾治療基因開關(guān)從 而簡單地治療任何疾病、病癥或病狀。在進一步的實施方式中，該第一和第二轉(zhuǎn)錄因子序列，例如CAP或LTF在一個治療 開關(guān)啟動子(例如，圖1中的TSP-1)的控制下?；罨搯幼訒a(chǎn)生含一個開放讀框的 CAP和LTF。利用轉(zhuǎn)錄接頭，例如IRES(內(nèi)部核糖體進入位點)可實現(xiàn)。在該實施方式中， 配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的兩部分是TSP-1活化后合成的。TSP-1可以是組成型啟動子 或只在疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下活化。在進一步的實施方式中，一個轉(zhuǎn)錄因子序列，例如LTF在只在疾病、病癥或病狀相 關(guān)條件下活化的治療開關(guān)啟動子(例如，圖4中的TSP-2或TSP-3)的控制下，而另一轉(zhuǎn)錄 因子序列，例如CAP在組成型治療開關(guān)啟動子(例如，圖4中的TSP-1)的控制下。在該實 施方式中，配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的一部分是組成型存在的，而第二部分只在疾病、病 癥或病狀相關(guān)條件下合成。在另一實施方式中，一個轉(zhuǎn)錄因子序列，例如CAP在第一 TSP(例如，圖3中的 TSP-1)的控制下，而兩個或更多個不同的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，例如LTF-1和LTF-2在不同 TSP(例如，圖3中的TSP-2和TSP-3)的控制下。在該實施方式中，LTF各自可具有識別不 同因子調(diào)節(jié)的啟動子序列的不同DBD(例如，DBD-A結(jié)合因子調(diào)節(jié)的啟動子_1 (FRP-1)相關(guān) 反應(yīng)元件，DBD-B結(jié)合因子調(diào)節(jié)的啟動子-2(FRP-2)相關(guān)反應(yīng)元件)。各因子調(diào)節(jié)的啟動子 可操作性連接于不同治療基因。以此方式，可同時提供多種治療。在一個實施方式中，第一轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含AD、識別與要調(diào)節(jié)其表達(dá)的治療 產(chǎn)物序列相關(guān)的反應(yīng)元件的DBD和H組核受體LBD的多肽，第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含 核受體LBD的轉(zhuǎn)錄因子，所述LBD選自下組脊椎動物類維生素A受體(RXR)、無脊椎動物 RXR、超螺旋蛋白(USP)、或包含至少兩個不同核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽片段的嵌合型核 受體，其中所述片段選自脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR和USP (參見WO 01/70816A2和US 2004/0096942A1)?！鞍閭H”核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可包含截短突變、缺失突變、取代突變或另一修飾。在另一實施方式中，基因開關(guān)包含編碼第一多肽的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和編碼第二 多肽的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，所述第一多肽包含核受體LBD和識別與要調(diào)節(jié)其表達(dá)的治療產(chǎn) 物序列相關(guān)的反應(yīng)元件的DBD，而所述第二多肽包含AD和核受體LBD，其中核受體LBD之一 是H組核受體LBD。在優(yōu)選的實施方式中，所述第一多肽基本上不含AD，所述第二多肽基本 上不含DBD。出于本發(fā)明的目的，“基本上不含”表示所述蛋白含有的所述結(jié)構(gòu)域的序列不 足以提供活化或結(jié)合活性。在本發(fā)明的另一方面，第一轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含異二聚伴侶和AD的蛋白 (CAP)，第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含DBD和LBD的蛋白(LTF)。當(dāng)只有一個核受體LBD是H組LBD，另一核受體LBD可以來自與H組LBD構(gòu)成 二聚體的任何其它核受體。例如，當(dāng)H組核受體LBD是EcRLBD時，另一核受體LBD “伴 侶”可以來自EcR、脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR、超螺旋蛋白(USP)、或包含至少兩個不 同核受體LBD多肽片段的嵌合型核受體，所述片段選自脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR和 USP (參見通過引用全文納入本文的WO 01/70816A2，國際專利申請?zhí)朠CT/US02/05235和US 2004/0096942A1)。“伴侶”核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可包含截短突變、缺失突變、取代突變 或另一修飾。在一個實施方式中，脊椎動物RXR LBD來自智人(Homo sapiens)、小鼠 (Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、雞(Gallus gallus)、家豬(Susscrofa domestica)、娃(爪蟾(Xenopus laevis))、斑馬魚(zebrafish) (Danio rerio)、被囊云力物 ？l||f| (Polyandrocarpa misakiensis)、gJ^L (Tripedalia cysophora)ItKR。在一個實施方式中，無脊椎動物RXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自蝗蟲(Locusta migratoria)超螺旋多肽(“LmUSP”)、硬蜱(美洲鈍眼蜱(Amblyommaamericanum)) RXR 同源物1 ( “AmaRXRl”)、硬蜱(美洲鈍眼蜱)RXR同源物2( “AmaRXR2”)、招潮蟹(Celuca pugilator)RXR 同源物(“CpRXR”)、甲蟲(黃粉甲蟲(Tenebrio molitor))RXR 同源物 (“TmRXR”)、蜜蜂(Apis mellifera)RXR 同源物(“AmRXR”)、蚜蟲(Myzus persicae)RXR 同源物(“MpRXR”)、或非-雙翅類/非-鱗翅類RXR同源物。在一個實施方式中，嵌合型RXR LBD包含至少兩個選自下組的多肽片段脊椎動 物物種RXR多肽片段、無脊椎動物物種RXR多肽片段和非-雙翅類/非-鱗翅類無脊椎動 物物種RXR同源物多肽片段。本發(fā)明所用的嵌合型RXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含至少兩個不 同物種的RXR多肽片段，或者當(dāng)物種相同時，兩個或更多個多肽片段可以來自該物種RXR多 肽片段的兩種或更多種不同的同種型。在一個實施方式中，嵌合型RXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至少一個脊椎動物物種的 RXR多肽片段和一個無脊椎動物物種的RXR多肽片段。在另一實施方式中，嵌合型RXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至少一個脊椎動物物種的 RXR多肽片段和一個非_雙翅類/非_鱗翅類無脊椎動物物種的RXR同源物多肽片段。當(dāng)配體與核受體的LBD聯(lián)用，受體進而結(jié)合與治療產(chǎn)物序列相關(guān)FRP的反應(yīng)元件 時，其能外在瞬時調(diào)節(jié)治療產(chǎn)物序列的表達(dá)。本發(fā)明各種組分彼此結(jié)合的結(jié)合機制或順序， 即，例如配體與LBD結(jié)合，DBD與反應(yīng)元件結(jié)合、AD與啟動子結(jié)合等不重要。在具體的實例中，配體結(jié)合H組核受體的LBD及其核受體LBD伴侶使得治療產(chǎn)物序列表達(dá)。該機制不排除配體結(jié)合H組核受體(GHNR)或其伴侶，以及導(dǎo)致活性同源二聚體 復(fù)合物(例如GHNR+GHNR或伴侶+伴侶)形成的可能性。優(yōu)選改變受體結(jié)構(gòu)域中的一個或 多個從而產(chǎn)生雜交基因開關(guān)。該三個結(jié)構(gòu)域，DBD、LBD和AD中的一個或多個通?？蓮呐c其 它結(jié)構(gòu)域來源不同的來源選擇，從而能在所選宿主細(xì)胞或生物體內(nèi)為反式激活活性、與配 體互補結(jié)合和識別特異性反應(yīng)元件而優(yōu)化雜交基因和得到的雜交蛋白。此外，可用其它DNA 結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，例如酵母的GAL-4蛋白(參見Sadowski等，Nature 335:563(1988)) 或大腸桿菌的LexA蛋白(參見Brent等，Cell43 :729 (1985))的反應(yīng)元件或與蛋白質(zhì)靶向 相互作用的特異性合成反應(yīng)元件來修飾或取代反應(yīng)元件本身來容納雜交受體，所述蛋白質(zhì) 是為這種特異性相互作用而設(shè)計、修飾和選擇的(參見，例如Kim等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 :3616 (1997))。雙雜交系統(tǒng)的另一優(yōu)點是它們能根據(jù)所需的最終結(jié)果選擇用于驅(qū)動 基因表達(dá)的啟動子。這種雙重控制在基因治療領(lǐng)域尤其重要，特別是當(dāng)產(chǎn)生細(xì)胞毒性蛋白 時，因為既可控制表達(dá)的時機又可控制發(fā)生表達(dá)的細(xì)胞。當(dāng)操作性連接于合適啟動子的基 因引入對象的細(xì)胞時，該外源性基因的表達(dá)受到本發(fā)明系統(tǒng)存在的控制。啟動子可以是組 成型或誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)的，或者可以是組織-特異性的(即，只在特定細(xì)胞類型中表達(dá))或是生 物體的某些發(fā)育階段特異性的。有或沒有配體存在下，第一雜交蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合反應(yīng)元件的DNA序列 以啟動或阻遏該反應(yīng)元件調(diào)節(jié)下的下游基因轉(zhuǎn)錄。功能性LDTFC，例如EcR復(fù)合物還可包含其它蛋白質(zhì)，例如親免蛋白。稱為轉(zhuǎn)錄因 子的核受體家族蛋白的其它成員(例如，DHR38，0 FTZ-1)也可以是EcR、USP和/或RXR的 配體依賴性或非依賴性伴侶。此外，可能需要其它輔因子，例如通常稱為輔助活化物(也 稱為銜接頭或介導(dǎo)物)的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)不序列特異性地結(jié)合DNA，也不涉及基礎(chǔ)轉(zhuǎn) 錄。它們可通過各種機制對轉(zhuǎn)錄活化施加其影響，包括刺激活化物的DNA-結(jié)合，通過影響 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，或通過介導(dǎo)活化物啟動復(fù)合物相互作用。這種輔助活化物的例子包括RIP140、 TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-l/NCoA-l、TIF2/GRIP/NCoA_2、ACTR/AIBl/RAC3/pCIP 以 及泛宿主性共活化物C反應(yīng)元件B結(jié)合蛋白，CBP/p300 (綜述參見Glass等，Curr. Opin. Cell Biol. 9 =222(1997)) 蛋白質(zhì)輔助活化物通常也稱為輔阻遏物(也稱為阻遏物、沉寂 子或沉默介導(dǎo)物)，其可能是沒有配體存在下有效抑制轉(zhuǎn)錄活化所需。這些輔阻遏物可與未 結(jié)合配體(unliganded)的EcR相互作用以使得反應(yīng)元件活性沉默。目前的證據(jù)提示配體 結(jié)合改變了受體的構(gòu)象，從而導(dǎo)致輔阻遏物釋放和上述共活化物募集，藉此消除它們的沉 默活性。輔阻遏物的例子包括N-CoR和SMRT (綜述參見Horwitz等，Mol Endocrinol. 10 1167(1996))。這些輔因子可以是細(xì)胞或生物體內(nèi)源性的，或者可以是作為轉(zhuǎn)基因而外源性 加入從而以調(diào)節(jié)或未調(diào)節(jié)的方式表達(dá)。B.基于雷帕霉素的基因開關(guān)本發(fā)明還提供利用H(506結(jié)合蛋白作為配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物和利用雷帕 霉素作為配體的基因開關(guān)系統(tǒng)。在一個實施方式中，編碼基因開關(guān)的構(gòu)建物包含(a)編碼第一嵌合蛋白的第一多核苷酸，所述蛋白結(jié)合雷帕霉素或其類似物并包 含至少一個H(506-結(jié)合蛋白(FKBP)結(jié)構(gòu)域和至少一個與其異源的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中 FKBP結(jié)構(gòu)域包含選自以下的肽序列(1)天然產(chǎn)生的FKBP
(2)天然產(chǎn)生的FKBP的變體，其中有最多10個氨基酸殘基缺失、插入或被取代氨 基酸替換，和(3) DNA序列編碼的FKBP，所述DNA序列與編碼(1)或(2)所述H(BP的DNA序列 選擇性雜交；(b)編碼第二嵌合蛋白的第二多核苷酸，所述蛋白與(a)雷帕霉素或雷帕霉素類 似物和(b)所述第一嵌合蛋白形成復(fù)合物，并包含至少一個FKBP:雷帕霉素結(jié)合(FRB)結(jié) 構(gòu)域和至少一個異源蛋白結(jié)構(gòu)域，其中FRB結(jié)構(gòu)域包含選自以下的肽序列(4)天然產(chǎn)生的FRB結(jié)構(gòu)域，(5)天然產(chǎn)生的FRB結(jié)構(gòu)域的變體，其中有最多10個氨基酸殘基缺失、插入或被取 代氨基酸替換，和(6) DNA序列編碼的FRB結(jié)構(gòu)域，所述DNA序列與編碼(4)或(5)所述FRB的DNA 序列選擇性雜交。在該基因開關(guān)系統(tǒng)中，第一多核苷酸和第二多核苷酸各自在一個或多個本文它處 所述的治療開關(guān)啟動子的控制下。此外，在某些實施方式中，所述第一和第二嵌合蛋白質(zhì)中 FKBP和/或FRB結(jié)構(gòu)域的至少一個異源蛋白結(jié)構(gòu)域可以是一個或多個“作用”或“效應(yīng)”結(jié) 構(gòu)域。效應(yīng)結(jié)構(gòu)域可以選自各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域、細(xì) 胞定位結(jié)構(gòu)域和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(即，能在群集或聚合后觸發(fā)細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡、 基因轉(zhuǎn)錄等的結(jié)構(gòu)域)。在某些實施方式中，一種融合蛋白含有至少一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，GAL4或 ZFHD1DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，另一融合蛋白含有至少一個轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(例如，VP16或p65 轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域)。配體介導(dǎo)的融合蛋白結(jié)合代表轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的形成并啟動與融合蛋 白之一上的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識別(即，能與之結(jié)合)的DNA序列相連的靶基因轉(zhuǎn)錄。美 國專利號 6，187, 757BU6, 649, 595 BU6, 509, 152 BU6, 479, 653 B1 和 6，117,680 B1 公開 了基因表達(dá)系統(tǒng)以及配體的信息。在其它實施方式中，本發(fā)明提供包含多核苷酸的基因開關(guān)系統(tǒng)，所述多核苷酸編 碼在沒有配體存在下自我凝聚的兩種融合蛋白，其中(a)所述第一融合蛋白包含結(jié)合所選 配體的有條件凝聚結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域，(b)所述第二融合蛋白包含結(jié)合所選配體的 有條件凝聚結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和(c)沒有配體存在下，細(xì)胞表達(dá)操作性連接于調(diào)控 DNA的基因，所述調(diào)控DNA結(jié)合所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。有配體存在下，包含基因開關(guān)系統(tǒng)的 修飾細(xì)胞的擴增量足以阻遏該基因。除去配體誘導(dǎo)造成細(xì)胞死亡的所編碼蛋白質(zhì)表達(dá)。編 碼兩種融合蛋白的核酸在至少一個有條件啟動子的控制下。美國申請?zhí)?002/0048792公 開了利用有條件凝聚結(jié)構(gòu)域的基因表達(dá)系統(tǒng)。C.基于原核阻遏子/操縱子的基因開關(guān)系統(tǒng)在一個實施方式中，本發(fā)明提供包含以下的基因開關(guān)系統(tǒng)(a)編碼反式激活融 合蛋白的第一多核苷酸，該蛋白包含原核四環(huán)素(“tet”)阻遏子和真核轉(zhuǎn)錄激活蛋白結(jié) 構(gòu)域；和(b)編碼治療蛋白或治療多肽的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸操作性連 接于最小啟動子和至少一個tet操縱子序列。編碼反式激活融合蛋白的第一多核苷酸可 包含本文它處所述的治療開關(guān)啟動子。沒有四環(huán)素存在下，致死性蛋白的表達(dá)上調(diào)(參見， 例如 Gossen 等，(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. 89 :5547_5551 ;Gossen 等，(1993) TIBS 18:471-475 ；Furth 等，(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91 :9302_9306 ；和 Shockett 等，(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92 :6522_6526)。美國專利號 5，464，758B1 公開了 TetO 表達(dá)系統(tǒng)。在另一實施方式中，基因開關(guān)系統(tǒng)包含大腸桿菌(Escherichia coli)的乳糖 ("Lac")阻遏子_操縱子系統(tǒng)。本發(fā)明的基因開關(guān)系統(tǒng)還可包含(a)編碼反式激活融合 蛋白的第一多核苷酸，其包含原核lac I阻遏子和真核轉(zhuǎn)錄激活蛋白結(jié)構(gòu)域；和(b)編碼 治療蛋白或治療多肽的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸操作性連接于治療開關(guān)啟動 子。在Lac系統(tǒng)中，沒有乳糖或者合成類似物，例如異丙基-b-D-硫代半乳糖苷存在下lac 操縱子是失活的。其它基因開關(guān)系統(tǒng)包括以下文獻(xiàn)所述的US 7，091, 038 ；W02004078924 ； EP1266015 ；US20010044151 ；US20020110861 ；US20020119521 ；US20040033600 ； US20040197861 ；US20040235097 ；US20060020146 ；US20040049437 ；US20040096942 ； US20050228016 ；US20050266457 ；US20060100416 ；W02001/70816 ；W02002/29075 ； W02002/066612 ；W02002/066613 ；W02002/066614；W02002/066615 ；W02005/108617 ；US 6，258，603 ；US20050209283 ；US20050228016 ；US20060020146 ；EP0965644 ；US 7，304，162 ； US 7，304，161 ；MX234742 ；KR10-0563143 ；AU765306 ；AU2002-248500 ；禾卩 AU2002-306550。D.基因開關(guān)系統(tǒng)的組合本發(fā)明提供包含兩種或更多種含有不同配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的基因開關(guān) 系統(tǒng)的核酸組合物、修飾細(xì)胞和生物反應(yīng)器，所述轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物被有效量的一種或多種 配體激活，其中所述兩種或更多種基因開關(guān)系統(tǒng)包含第一基因開關(guān)和第二基因開關(guān)，二者 在結(jié)合一種或多種配體后選擇性誘導(dǎo)一種或多種治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。任何數(shù)量 和/或組合的基因開關(guān)系統(tǒng)屬于本發(fā)明范圍。在一個實施方式中，本發(fā)明提供包含以下的核酸組合物a第一基因開關(guān)系統(tǒng)，其包含i.包含編碼第一雜交多肽的多核苷酸的第一基因表達(dá)盒，其包含1.反式激活域，其激活操作性連接于編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸的 因子調(diào)節(jié)的啟動子；和2.異二聚伴侶結(jié)構(gòu)域，ii.包含編碼第二雜交多肽的多核苷酸的第二基因表達(dá)盒，其包含1. DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其識別操作性連接于編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷 酸的因子調(diào)節(jié)的啟動子；和2.配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和iii.包含編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸的第三基因表達(dá)盒，其包含1.由所述第二雜交多肽的反式激活域激活的因子調(diào)節(jié)的啟動子；和2.編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸，和b.第二基因表達(dá)系統(tǒng)，其包含i.包含編碼第一雜交多肽的多核苷酸的第一基因表達(dá)盒，其包含1.反式激活域，其激活操作性連接于編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸的 因子調(diào)節(jié)的啟動子；和2.異二聚伴侶結(jié)構(gòu)域，
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ii.包含編碼第二雜交多肽的多核苷酸的第二基因表達(dá)盒，其包含1.識別操作性連接于編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸的因子調(diào)節(jié)的啟 動子的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和2.配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和iii.包含編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸的第三基因表達(dá)盒，其包含1.由所述第二雜交多肽的反式激活域激活的因子調(diào)節(jié)的啟動子；和2.編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸。多種可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)在不同疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下表達(dá)給定的治療多 核苷酸或治療多肽，或者在相同疾病、病癥或病狀相關(guān)的相同條件下或在不同疾病、病癥或 病狀相關(guān)的不同條件下表達(dá)多種治療多肽或治療多核苷酸。在某些實施方式中，兩種或更多種基因開關(guān)系統(tǒng)的組合可以是(1)基于雙-開關(guān) 蛻皮素受體的表達(dá)系統(tǒng)和(2)基于單-開關(guān)蛻皮素受體的基因開關(guān)。在其它實施方式中， 該組合可以是(1)基于單-或雙-開關(guān)蛻皮素受體的基因開關(guān)和(2)基于雷帕霉素的基因 開關(guān)?；蛘?，基因開關(guān)系統(tǒng)的組合可以是上述兩個相同的基于雷帕霉素的基因開關(guān)。本發(fā) 明包括基因開關(guān)系統(tǒng)的任何可能的組合。配體本發(fā)明配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的配體結(jié)合包含配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、異二聚伴侶 結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和反式激活域中一個或多個的蛋白質(zhì)復(fù)合物。選擇激活配體依賴 性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的配體取決于所用基因開關(guān)的類型。例如，可從任何合適的配體選擇基于蛻皮素受體的基因開關(guān)的配體。天然產(chǎn)生 的蛻皮素或蛻皮素類似物(例如，20-羥基蛻皮素、牽牛留酮AOmiristerone A)、松甾酮 (ponasteroneM、松甾酮B、松甾酮C、26-碘代松甾酮A、牛膝甾酮或26-甲磺?；Ｏョ?酮)和非類固醇誘導(dǎo)物可用作本發(fā)明基因開關(guān)的配體。美國專利號6，379，945B1描述了 從煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)分離的昆蟲類固醇受體(〃 HEcR")，其可用作對類固 醇和某些非類固醇誘導(dǎo)物起反應(yīng)的基因開關(guān)。在該系統(tǒng)和對類固醇及非類固醇誘導(dǎo)物均起 反應(yīng)的許多其它系統(tǒng)中，非類固醇誘導(dǎo)物明顯優(yōu)于類固醇，原因眾多，例如生產(chǎn)成本較低、 代謝穩(wěn)定性、沒有昆蟲、植物或哺乳動物存在和環(huán)境上可接受。美國專利號描述了利用兩種 聯(lián)苯甲酰胼、1，2_聯(lián)苯甲?；?1-叔丁基胼和蟲酰胼(tebufenozide) (N_(4_乙基苯甲酰 基)-N' -(3，5_ 二甲基苯甲?；?-N'-叔丁基胼)作為基于蛻皮素的基因開關(guān)的配體。 本發(fā)明還包括其它聯(lián)苯甲酰胼作為配體，例如美國專利號5，117，057B 1所述的。美國專利 號6，147，282還公開了利用蟲酰胼作為黑腹果蠅的蛻皮素受體的化學(xué)配體。此外，蛻皮素 配體的非限制性例子是3，5- 二-叔丁基-4-羥基-N-異丁基-苯甲酰胺、8-0-乙?；?帕苷(harpagide)、l，2-二?；荨'-取代的_N，N' -二取代的胼、聯(lián)苯甲酰烷基氰基 胼、N-取代的-N-烷基-N，N- 二芳酰基胼、N-取代的-N-?；?N-烷基，羰基胼或N-芳酰 基-N'-烷基-N'-芳酰基胼(參見美國專利號6，723，531)。在一個實施方式中，基于蛻皮素的基因開關(guān)系統(tǒng)的配體是二?；菖潴w或手性二 ?；菖潴w。基因開關(guān)系統(tǒng)中所用的配體可以是式I所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、 水合物、結(jié)晶形式或無定形形式

式 式中A是烷氧基、芳基烷基氧基或芳氧基；B是任選取代的芳基或任選取代的雜芳基；和R1和R2獨立為任選取代的烷基、芳基烷基、羥基烷基、商代烷基、任選取代的環(huán)烷 基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的雜環(huán)基、任選取代的芳基或任選取代的 雜芳基。在另一實施方式中，配體可以是式II所示對映體富集的化合物或其藥學(xué)上可接 受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式 式中A是烷氧基、芳基烷基氧基、芳氧基、芳基烷基、任選取代的芳基或任選取代的雜芳 基；B是任選取代的芳基或任選取代的雜芳基；和R1和R2獨立為任選取代的烷基、芳基烷基、羥基烷基、商代烷基、任選取代的環(huán)烷 基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的雜環(huán)基、任選取代的芳基或任選取代的 雜芳基；前提是R1不等于R2 ；其中攜帶R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要是S。在某些實施方式中，配體可以是式III所示對映體富集的化合物或其藥學(xué)上可接 受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式
式 式中A是烷氧基、芳基烷基氧基、芳氧基、芳基烷基、任選取代的芳基或任選取代的雜芳 基；B是任選取代的芳基或任選取代的雜芳基；和R1和R2獨立為任選取代的烷基、芳基烷基、羥基烷基、商代烷基、任選取代的環(huán)烷 基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的雜環(huán)基、任選取代的芳基或任選取代的 雜芳基；前提是R1不等于R2 ；其中攜帶R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要是R。
在一個實施方式中，配體可以是具有對映體過量為至少95%的(R)-3，5_ 二甲 基-苯甲酸N- (1-叔丁基-丁基)-N' - (2-乙基-3-甲氧基-苯甲?；?-胼或其藥學(xué)上 可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式。當(dāng)與基于蛻皮素的基因開關(guān)系統(tǒng)聯(lián)用時，式I所示二?；菖潴w和式II或III所 示手性二?；菖潴w提供外部臨時調(diào)節(jié)本發(fā)明治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)的手段。本發(fā)明所用的配體可形成鹽。本文所用的術(shù)語“鹽”表示用無機和/或有機酸和堿 形成的酸性和/或堿性鹽。此外，當(dāng)式I、II或III所示化合物同時含有堿性部分和酸性部 分時，可以形成兩性離子(“內(nèi)鹽”)，其屬于本文所用的術(shù)語“鹽”。藥學(xué)上可接受的(即， 無毒、生理學(xué)上可接受的)鹽可用于，例如制備期間可能采用的分離或純化步驟中，但是其 它鹽也可用?？稍诮橘|(zhì)中，通過，例如將化合物與一定量(例如相等量)的酸或堿反應(yīng)來形 成式I、II或II所示化合物的鹽，所述介質(zhì)可以是例如鹽在其中沉淀的介質(zhì)或在水性介質(zhì) 中然后凍干。含有堿性部分的配體可與各種有機和無機酸形成鹽。示范性酸加成鹽包括乙酸鹽 (例如與乙酸或三鹵代乙酸，如三氟乙酸形成的那些)、己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天 冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸 鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油 磷酸鹽、半硫酸鹽(hemisulfate)、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽(與鹽酸形成的)、氫溴酸鹽(氫 溴酸形成的)、氫碘化物、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽(馬來酸形成的)、甲磺酸鹽 (甲磺酸形成)、2_萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、果膠酯酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、 3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、三甲基乙酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽(例 如，硫酸形成的)、磺酸鹽(例如，本文所述那些)、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽，例如甲 磺酸鹽，十一烷酸鹽等。含有酸性部分的配體可與各種有機和無機堿形成鹽。示范性堿性鹽包括銨鹽、 堿金屬鹽，例如鈉、鋰和鉀鹽，堿土金屬鹽，例如鈣和鎂鹽，有機堿的鹽(例如，有機胺)，例 如芐星青霉素(benzathine)、二環(huán)己基胺、哈胺(hydrabamine)(與N，N_ 二(脫氫松香基 (abietyl))乙二胺形成)、N-甲基_D_葡糖胺、N-甲基_D_葡糖酰胺(glucamides)、叔丁 胺、和與氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸等形成的鹽。利用H(506結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的配體的非限制性例子是H(506、 環(huán)孢菌素A或雷帕霉素。美國專利號6，649，595B2和6，187，757公開了 H(506、雷帕霉素和 它們的類似物。也參見美國專利號7，276，498和7，273，874。本文所述的配體可單獨給予或作為包含藥學(xué)上可接受的運載體的藥物組合物的 一部分給予。在一個實施方式中，藥物組合物是溶液、混懸液、片劑、膠囊、軟膏、酏劑或可注 射組合物。藥物組合物藥學(xué)上可接受的運載體包括填充劑，例如糖，如乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨醇，纖 維素制品和/或磷酸鈣，例如磷酸三鈣或磷酸氫鈣，以及粘合劑，例如利用諸如玉米淀粉、 小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉的淀粉漿液、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維 素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可加入崩解劑，例如上述淀粉和羧 甲基_淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽，例如藻酸鈉。輔助劑是流動調(diào)節(jié)劑和潤滑劑，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其鹽，例如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣和/或聚乙二 醇。在一個實施方式中，如果需要，給錠劑核心提供耐受胃液的合適包被。為該目的，可利 用濃糖溶液，其可任選含有阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化鈦、 漆溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物。為產(chǎn)生耐受胃液的包被，利用合適纖維素制品，例 如鄰苯二甲酸醋酸纖維素或鄰苯二甲酸羥丙基甲基-纖維素的溶液?？蓪⑷玖匣蛏丶尤?片劑或錠劑核心包被，例如，為鑒定或為表征活性化合物劑量的組合?？煽诜褂玫钠渌幬镏破钒髂z制成的推入式(push-fit)膠囊以及明膠和 增塑劑，例如甘油或山梨醇制成的軟密封膠囊。推入式膠囊可含有顆?；蚣{米顆粒形式的 活性化合物，可任選與填充劑，例如乳糖，粘合劑，例如淀粉和/或潤滑劑，例如滑石粉或硬 脂酸鎂和任選的穩(wěn)定劑混合。在一個實施方式中，溶解或懸浮于任選含穩(wěn)定劑的合適液體， 例如脂肪油或液體石蠟中。脂肪油可含有單酸甘油酯、甘油二酯或甘油三酯。單酸甘油酯、甘油二酯或甘油三 酯包括衍生自c6、c8、c1(1、c12、c14、c16、c18、c2(1和c22酸的那些。具體地說，示范性甘油二酯包括 甘油二油酸酯、甘油二棕櫚酸酯(dipalmitolein)和混合的辛酸甘油酯-癸酸甘油酯甘油 二酯。甘油三酯包括植物油、魚油、動物脂肪、氫化植物油、部分氫化植物油、合成甘油三酯、 修飾甘油三酯、分餾甘油三酯、中鏈和長鏈甘油三酯、結(jié)構(gòu)化甘油三酯和它們的混合物。示 范性甘油三酯包括杏仁油；巴西棕櫚油(babassu oil)；琉璃苣油；黑醋栗籽油；蕓苔油； 蓖麻油；椰油；玉米油；棉籽油；月見草油；葡萄籽油；花生油；芥子油；橄欖油；棕櫚油；棕 櫚仁油；花生油；菜籽油；紅花油；芝麻油；鯊魚肝油；大豆油；葵花子油；氫化蓖麻油；氫化 椰油；氫化棕櫚油；氫化大豆油；氫化植物油；氫化棉籽油和蓖麻油；部分氫化的大豆油； 部分(氫化)的大豆和棉籽油；三己酸甘油酯；三辛酸甘油酯；三癸酸甘油酯；三十一烷酸 甘油酯；三月桂酸甘油酯；三油酸甘油酯；三亞油酸甘油酯；三亞麻酸甘油酯；三辛酸/癸 酸甘油酯；三辛酸/癸酸/月桂酸甘油酯；三辛酸/癸酸/亞油酸甘油酯；和三辛酸/癸酸 /硬脂酸甘油酯。在一個實施方式中，甘油三酯是以商品名拉巴法克(LABRAFAC CC)出售的中鏈甘 油三酯。其它甘油三酯包括中性油，例如中性植物油，特別是分餾的椰油，例如已知以商 品名 MIGLY0L 出售的，包括以下產(chǎn)物:MIGLY0L 810 ；MIGLY0L 812 ；MIGLY0L 818 和 CAPTEX 355。其它甘油三酯是辛酸-癸酸甘油三酯，例如以商品名MYRIT0L出售的，包括以下產(chǎn)物 MYRIT0L 813。該類的其它甘油三酯是 CAPMUL MCT、CAPTEX 200,CAPTEX 300,CAPTEX 800、 NEOBEE M5 禾口 MAZOL 1400。包含甘油三酯的藥物組合物還可包含親脂性和/或親水性表面活性劑，用水性溶 劑溶解后其可形成清澈溶液。一種這樣的表面活性劑是生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯 (維生素E TPGS)。這種組合物的例子描述于美國專利號6，267，985。在另一實施方式中，藥學(xué)上可接受的運載體包括伽塔佛絲公司的拉巴索 (LABRASOL,Gattefosse SA)，其是PEG-8辛酸/公司甘油酯。在另一實施方式中，藥學(xué)上可 接受的運載體包括PL90G、維生素E TPGS和Miglyol 812N?？山?jīng)直腸使用的可能藥物制品包括，例如由一種或多種配體和栓劑基構(gòu)成的栓 劑。合適的栓劑基是，例如天然或合成的甘油三酯或石蠟烴類。此外，還可能利用由配體和 基料組成的明膠直腸膠囊?？赡艿幕习ǎ缫后w甘油三酯、聚乙二醇或石蠟烴類。
胃腸外給藥的合適制劑包括水溶形式配體的水性溶液，例如水溶性鹽和堿性溶 液。此外，可給予配體的懸液，例如合適的油性注射懸液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂 肪油，例如芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯或聚乙二醇-400。水性注射 懸液可含有增加懸液粘度的物質(zhì)，包括，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。懸液 還任選含有穩(wěn)定劑。可通過選擇合適的運載體將局部制劑配制成油、乳膏、洗液、軟膏等。合適 的運載 體包括植物或礦物油、白礦物脂(白軟石蠟)、支鏈脂肪或油、動物脂肪和高分子量醇(高 于C12)。如果需要，還可包括乳化劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑和抗氧化劑以及賦予顏色或香味的試 齊U。此外，這些局部制劑中可利用經(jīng)皮穿透增強劑。這種增強劑的例子可見美國專利號 3，989，816 和 4，444，762。可從礦物油、自乳化蜂蠟和水的混合物配制乳膏，在其中混合溶解于少量油，例如 杏仁油中的配體。這種乳膏的典型例子包含約40份水、約20份蜂蠟、約40份礦物油和約 1份杏仁油?？赏ㄟ^混合配體的植物油，例如杏仁油懸液與溫暖的軟石蠟并使該混合物冷卻來 配制軟膏。這種軟膏的典型例子包含約30重量％杏仁油和約70重量％白軟石蠟。可在合適高分子量醇，例如丙二醇和聚乙二醇中制備配體懸液來方便地制備洗 液?？杉尤胨幬锝M合物的抗氧化劑的例子包括BHA和BHT。在一個實施方式中，藥物組合物在固體明膠膠囊中每毫升LABRAS0L包含30mg配 體。在另一實施方式中，膠囊含有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95 或 IOOmg 配體。藥物組合物可含有0. 01重量％ -99重量％的配體。組合物可以是單一或多種劑 型。任何具體藥物組合物中配體的含量取決于有效劑量，即引發(fā)所需基因表達(dá)或阻遏所需 的劑量。在一個實施方式中，將0. 1-7. 5mg/kg給予對象。在另一實施方式中，將0. l-3mg/ kg給予對象。在另一實施方式中，給予0. l-3mg/kg。給予藥物組合物的合適途徑包括口服、直腸、局部(包括真皮、口腔含化和舌下)、 經(jīng)陰道、胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、鞘內(nèi)、腫瘤內(nèi)和硬膜外)和通過鼻-胃 管。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道給藥途徑取決于所治療的病癥，可根據(jù)諸如受者的病癥等因素 而有所不同?？擅咳找淮位蚨啻谓o予藥物組合物。治療分子治療分子，例如編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸可以是編碼可用于治 療、緩解或預(yù)防疾病、病癥或病狀的多肽或多核苷酸的任何序列。治療多肽可以是已知有效 治療、緩解或預(yù)防疾病、病癥或病狀的任何多肽?？捎糜诒景l(fā)明的治療多肽類別的例子包括 但不限于細(xì)胞因子、趨化因子、激素、抗體、工程改造的免疫球蛋白-樣分子、單鏈抗體、融 合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫調(diào)節(jié)分子、靶蛋白的反式顯性負(fù)突變體、毒素、有條件的 毒素(conditional toxin)、抗原、腫瘤阻遏蛋白、生長因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗 病毒蛋白或它們的變體。治療多核苷酸包括但不限于反義序列、小干擾RNA、核酶和RNA外 在引導(dǎo)序列。治療多核苷酸可靶向特定疾病、病癥或病狀相關(guān)并且優(yōu)選降低或消除其表達(dá) 的任何轉(zhuǎn)錄物。本領(lǐng)域已知疾病、病癥或病狀期間顯示表達(dá)升高的許多基因，包括上表1-3所列的基因。編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸操作性連接于或操作性結(jié)合包含至少 一個反應(yīng)元件的因子調(diào)節(jié)的啟動子，該反應(yīng)元件為基因開關(guān)編碼的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù) 合物的DBD所識別。在一個實施方式中，啟動子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多拷貝的 反應(yīng)元件。包含所需反應(yīng)元件的啟動子可以是天然產(chǎn)生的啟動子或采用本領(lǐng)域熟知技術(shù)產(chǎn) 生的人工啟動子，例如操作性連接于最小啟動子的將一個或多個反應(yīng)元件。可利用治療基因開關(guān)表達(dá)的具體治療多肽包括但不限于抗體，包括單克隆抗體、 最小抗體，融合蛋白、內(nèi)源性蛋白質(zhì)模擬物、酶、激素、細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和片 段，任何這種多肽的變體或衍生物。非限制性的代表性治療分子如下所述。這些分子的所 有參考文獻(xiàn)，包括專利出版物、科學(xué)文獻(xiàn)及多核苷酸和多肽序列登錄號通過引用全文納入 本文。單克隆抗體可利用本發(fā)明的治療基因開關(guān)構(gòu)建物表達(dá)治療性單克隆抗體，或其片段、變體或 類似物(統(tǒng)稱為“單克隆抗體”)。這種單克隆抗體可用于治療疾病和病癥，包括但不限于 癌癥、自身免疫疾病(例如，MS、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、癌癥、感染性疾病、炎性疾病、 變態(tài)反應(yīng)、心臟病和移植排異。用于本發(fā)明的抗體包括任何已知的治療性單克隆抗體，包括 但不限于以下所列的結(jié)合與已知單克隆抗體相同的表位或靶標(biāo)的單克隆抗體。適合通過 治療基因開關(guān)構(gòu)建物表達(dá)的單克隆抗體構(gòu)建物包括多特異性、人、人源化、靈長類化或嵌合 型抗體、單鏈抗體、表位結(jié)合片段，例如Fab、Fab'和F(ab' )2，F(xiàn)d、Fv、單鏈Fv(scFv)、單 鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(SdFv)和包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段。本領(lǐng)域已知scFv分子，其 描述于，例如美國專利5，892，019。本發(fā)明免疫球蛋白或抗體分子可以是任何類型(例如， IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、類別(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞 類的免疫球蛋白分子。包括單鏈抗體在內(nèi)的抗體片段可單獨包含可變區(qū)或與以下的全部或 部分組合絞鏈區(qū)、CHI、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還包括抗原結(jié)合片段，其還包含可變區(qū) 與絞鏈區(qū)、CHI、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的任何組合。在某些實施方式中，本發(fā)明包括編碼針對抗原的單克隆抗體的治療基因開關(guān)構(gòu)建 物，所述抗原包括但不限于CTLA4、CD25、HER-2/neu (ErbB2)、CD20、TNF a、EGFR 和 VEGF。
本發(fā)明可用的抗-CTLA4抗體和產(chǎn)生它們的方法描述于國際申請?zhí)朠CT/ US99/30895，2000 年 6 月 29 日公布為 W0 00/37504 (例如，提犀利莫單抗(ticilimumab), 也稱為11. 2. 1和CP-675, 206)；歐洲專利申請?zhí)朎P1262193A1，2002年4月12日公布；美 國專利申請?zhí)?9/472，087，現(xiàn)授權(quán)為美國專利號6，682，736 ；美國專利申請?zhí)?9/948, 939， 現(xiàn)公布為美國專利申請公布號2002/0086014 (例如，伊匹利莫單抗(ipilimumab)，也稱為 10D1和MDX-010，梅達(dá)萊克斯公司(Medarex)，普林斯頓，新澤西州)。本發(fā)明可用的抗-⑶25抗體包括但不限于達(dá)克珠單抗。參見，例如美國專利號 5，530，101。達(dá)克珠單抗(商標(biāo)名Zenapax ，由羅氏公司(Roche)投入市場)是針對 CD25(IL-2受體)的人源化IgGl單克隆抗體。其用作IL-2受體拮抗劑，高親和力地結(jié)合高 親和力IL-2受體復(fù)合物的Tac亞基。當(dāng)與環(huán)孢菌素或糖皮質(zhì)激素聯(lián)用時，達(dá)克珠單抗適用 于預(yù)防腎臟移植患者中的急性器官排異?？捎糜诒景l(fā)明的抗-HER-2/neu(ErbB2)抗體包括但不限于曲妥單抗。參見，例如美國專利號5，677，171。曲妥單抗(商標(biāo)名稱Herceptin ，由基因技術(shù)公司(Genentech) 投入市場)是針對c-erbB2/HER2/neU蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域的人源化單克隆抗體，該蛋白質(zhì) 是在某些類型的乳腺癌中過表達(dá)的跨膜受體蛋白(與表皮生長因子受體結(jié)構(gòu)相關(guān))。作為 抗體依賴性細(xì)胞毒性的介質(zhì)，曲妥單抗優(yōu)選對表達(dá)HER2的癌細(xì)胞有毒性?？捎糜诒景l(fā)明的抗-CD20抗體包括但不限于利妥昔單抗(參見，例如美國專利號 5，736，137)。利妥昔單抗(商標(biāo)名Rituxan ，由BGI公司(Biogenldec)和基因技術(shù)公司 投入市場)是嵌合型(鼠/人)單克隆IgGl k抗體。利妥昔單抗首先設(shè)計并批準(zhǔn)用于治 療非霍奇金淋巴瘤，最近批準(zhǔn)用于治療抗-TNF難治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。可用于本發(fā)明的抗-TNFa抗體包括但不限于阿達(dá)木單抗(參見，例如美國專利 號7，223，394)和英夫利昔單抗(參見，例如美國專利號7138118)。阿達(dá)木單抗(商標(biāo)名 Humira ，由阿伯特公司(Abbott)投入市場)是特異性結(jié)合TNFa從而阻斷TNFa與p55 和p75表面TNF受體相互作用的重組人IgGlK單克隆抗體。阿達(dá)木單抗批準(zhǔn)用于類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎和青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。阿達(dá)木單抗的其它適應(yīng)癥包括克羅恩病、斑塊狀銀屑病、 銀屑病關(guān)節(jié)炎和強直性脊柱炎。英夫利昔單抗(商標(biāo)名雷米卡德(Remicade)，由森托科公 司(Centocor)投入市場)是特異性結(jié)合TNF a從而阻斷TNF a與p55和p75表面TNF受 體相互作用的重組嵌合型IgGl k單克隆抗體。英夫利昔單抗批準(zhǔn)用于克羅恩病。其它適 應(yīng)癥包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、嚴(yán)重的慢性斑塊狀銀屑病和強直性脊柱炎?？捎糜诒景l(fā)明的抗EGFR(表皮生長因子受體)抗體包括但不限于西妥昔單抗 (參見，例如美國專利號6，217，866)。西妥昔單抗(商標(biāo)名Erbitux ,由伊姆克隆公司 (Imclone)和布里斯托-美時施貴寶公司(Bristol-MeyersSquibb)(北美)和默克公司 (Merck KgaA)(其它地區(qū))投入市場)是特異性結(jié)合EGFR的嵌合型單克隆抗體。西妥昔單 抗適用于轉(zhuǎn)移性直腸結(jié)腸癌和頭頸癌。可用于本發(fā)明的抗-VEGF抗體包括但不限于貝伐單抗(參見，例如美國專利號 6，383，486)。貝伐單抗(商標(biāo)名Avastin ，由基因技術(shù)公司投入市場)是抑制血管內(nèi)皮 生長因子(VEGF)功能，從而抑制腫瘤新血管生成的人單克隆抗體。貝伐單抗適于和其它抗 癌癥化療劑聯(lián)用作為治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者的第一和第二線治療劑和復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性 非鱗狀細(xì)胞非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的第一線治療劑。融合蛋白本發(fā)明的治療基因開關(guān)構(gòu)建物可用于表達(dá)治療性融合蛋白，例如嵌合型TNFa結(jié) 合蛋白2。通過蛋白水解過程從膜形式制備腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白2 (Enbrel)。Enbrel是 由人IgGl分子的Fc片段相連的兩個可溶性TNF受體構(gòu)成的重組融合蛋白。其結(jié)合TNF a 并阻斷TNFa與其受體相互作用。Enbrel用于治療中等到嚴(yán)重的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。編碼 Enbrel的氨基酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號P20333。Enbrel的多核苷酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號DD292498和DD292499，其序列通 過引用納入本文。酶可利用本發(fā)明的治療基因開關(guān)構(gòu)建物表達(dá)治療性酶，包括組織纖維蛋白溶酶原激 活劑。組織纖維蛋白溶酶原激活劑，組織型同種型3前蛋白原(tPA)是分泌的絲氨酸蛋 白酶，其將酶原-纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶-一種纖維蛋白溶解酶。該酶在細(xì)胞遷移和組織重塑中起作用。編碼tPA的氨基酸序列可見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號NP_127509和 NP_000921 (均是人)，其序列通過引用納入本文。編碼tPA的多核苷酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號NM_033011和NM_000930 (均是 人)，其序列通過引用納入本文。內(nèi)源性蛋白模擬物本發(fā)明的治療基因開關(guān)構(gòu)建物可用于表達(dá)內(nèi)源性蛋白的治療性模擬物，例如以下 的當(dāng)其將因子X轉(zhuǎn)化成活化形式的因子Xa時，阿法耐特(Alphanate)(凝固因子 III)連同鈣和磷脂用作因子IXa的輔因子。阿法耐特是純化的因子VIII (也稱為抗血友病 球蛋白因子)和血管假性血友病因子。阿法耐特批準(zhǔn)用于預(yù)防和控制因子VIII缺陷型的 A型血友病或獲得性因子VIII缺陷型的患者出血。編碼因子VIII的氨基酸序列見公開數(shù) 據(jù)庫的登錄號AAA52485 (人)；和AAA37385 (小鼠)，其序列通過引用納入本文。編碼因子VIII的多核苷酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號M14113(人)；和 L05573(小鼠)，其序列通過引用納入本文。阿拉斯特(Aralast) ( a -1蛋白酶抑制劑)的氨基酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號 AAB59375 ( A a 1-抗胰蛋白酶)；AAC28869(小鼠a-1蛋白酶抑制劑)；和AAA40788 (大鼠 a -1-抗胰蛋白酶)，其序列通過引用納入本文。編碼a-1蛋白酶抑制劑的多核苷酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號K01396(人)； M75721 (小鼠)；和M32247(大鼠)，其序列通過引用納入本文。奈西立肽(Natrecor )是已批準(zhǔn)用于靜脈內(nèi)治療急性代償失調(diào)充血性心力衰竭 (CHF)患者的重組形式人B-型利鈉肽(hBNP)，這種患者在休息時或最低限度活動時呼吸困 難。編碼腦利鈉肽的氨基酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號NP_002512，其序列通過引用納入本 文。編碼腦利鈉肽的多核苷酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號NM_002521，其序列通過引 用納入本文。編碼人胰島素的氨基酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號AAH05255，其序列通過引用納 入本文。編碼人胰島素的多核苷酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號BC005255，其序列通過引用 納入本文。粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是用作血細(xì)胞生長因子的細(xì)胞因子， 其刺激干細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)和單核細(xì) 胞。編碼粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的氨基酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號 AAA52122(人)；NP_034099 (小鼠)；NP_001032749 (大鼠 Csf2ra)；和 NP_598239 (Csf2rb)， 其序列通過引用納入本文。編碼GM-CSF的多核苷酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號Ml 1734(人)；NM_009969(小 鼠)；NM_001037660 (大鼠Csf2ra)；和NM_133555(大鼠Csf2rb)，其序列通過引用納入本文。編碼促紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號AAH93628(人)； AAI19266 (小鼠)；和BAA01593(大鼠)，其序列通過引用納入本文。
編碼促紅細(xì)胞生成素的多核苷酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號BC093628(人)； BC119265 (小鼠)；和D10763 (大鼠)，其序列通過引用納入本文。編碼生長激素的氨基酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號AAA98618 (人)； NP_032143(小鼠)；和NP_001030020 (大鼠)，其序列通過引用納入本文。編碼生長激素的多核苷酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號M13438 (人) ’ NM_008117(小鼠)；和NM_001034848 (大鼠)，其序列通過引用納入本文。重組蛋白本發(fā)明的治療基因開關(guān)構(gòu)建物可用于表達(dá)治療性重組蛋白，例如肉毒桿菌毒 素。肉毒桿菌毒素抑制神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿在神經(jīng)末稍的釋放，以商品名BOTOX用于治療 張力障礙和頸張力障礙相關(guān)的斜視和眼瞼痙攣。BOTOX還用于治療偏側(cè)顏面痙攣和特征 在于肌肉收縮異常的許多其它神經(jīng)學(xué)疾病。編碼肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型前體(BoNT/A) (Bontoxilysin-A) (BOTOX)的氨基酸序列見公開數(shù)據(jù)庫的登錄號P10845。心血管疾病的治療本發(fā)明還涉及治療、緩解或預(yù)防心血管疾病的方法，包括給予需要這種治療的對 象在前述開關(guān)蛋白的控制下能緩解、預(yù)防或治療心血管相關(guān)疾病的治療基因產(chǎn)物?？蓪⑦@ 種治療直接遞送給待治療的對象，或者通過含有包裹化或非包裹化的非修飾或遺傳修飾細(xì) 胞的生物反應(yīng)器而遞送，所述細(xì)胞分泌本文它處所述的一種或多種治療蛋白或治療多肽。 按照該實施方式，植入對象，例如植入心血管疾病患者的梗塞區(qū)域時，細(xì)胞會表達(dá)有效治療 心血管疾病的一種或多種治療基因產(chǎn)物。下文更詳細(xì)地描述了這種治療基因產(chǎn)物的例子。 在某些實施方式中，本發(fā)明的遺傳修飾細(xì)胞組成型表達(dá)一種或多種治療基因產(chǎn)物，即，細(xì)胞 中一種或多種異源治療基因產(chǎn)物持續(xù)表達(dá)?；蛘?，細(xì)胞表達(dá)一種、兩種、三種或更多種異源 治療基因產(chǎn)物受治療基因開關(guān)的控制。在某些方面，治療、緩解或預(yù)防心血管疾病的生物反 應(yīng)器包含包裹化的細(xì)胞，例如細(xì)胞包裹在基于藻酸鹽的制劑中。本文它處詳細(xì)描述了細(xì)胞 包裹化的例子和方法以提供，例如與所治療對象分開的物理或免疫學(xué)屏障。本發(fā)明還提供通過操作性結(jié)合于啟動子而可用于治療、緩解或預(yù)防心血管疾病 的，包含表達(dá)治療基因產(chǎn)物，例如治療多肽和/或治療多核苷酸的一種或多種多核苷酸的 核酸組合物。在某些實施方式中，通過配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物激活治療基因產(chǎn)物的啟 動子控制性表達(dá)，其中轉(zhuǎn)錄因子的至少一部分是經(jīng)操作性連接于一個或多個治療開關(guān)啟動 子而表達(dá)的，其中所述治療開關(guān)啟動子的活性是組成型的和/或在組織類型相關(guān)或疾病、 病癥或病狀相關(guān)條件下得到調(diào)節(jié)。在治療、緩解或預(yù)防心血管疾病的實施方式中，治療開關(guān) 啟動子可以是，例如心臟特異性啟動子或在例如充血性心力衰竭、缺血性心臟病、高血壓性 心臟病、冠狀動脈疾病、外周血管疾病和缺血性心臟事件，如心肌梗塞、心臟病發(fā)作、心力衰 竭、心律失常、心肌破裂、心包炎和心源性休克等病癥期間活化的啟動子。示范性啟動子見 表1-3。本文在它處，例如實施例1-8中描述了其它啟動子。通過本文所述的方法也不難鑒 定其它啟動子。心臟細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因開關(guān)表達(dá)可用的或在心臟疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下可 用的治療開關(guān)啟動子的例子包括但不限于S100A6啟動子，其是心肌細(xì)胞組織特異性的 (Tsoporis 等，J. Biol. Chem. (2008)(印刷前的電子版；PMID 18753141))；心房利鈉肽因 子(Atrial Naturetic Factor) (ANF)啟動子、a -肌球蛋白重鏈啟動子、c-fos啟動子、BNP啟動子或a肌動蛋白啟動子，所有均是心肌細(xì)胞組織特異性的(Nelson等，J. Mol. Cell. Cardiol. 39(3) =479(2005))；促紅細(xì)胞生成素啟動子，缺血性條件下其在心肌中活 化(Su 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14) 9480(2002)) ； a B_ 晶體蛋白(CRYAB) 啟動子，包括，例如BRG1-反應(yīng)元件，其是脊椎動物眼睛晶狀體組織特異性的(Duncan B.和 Zhao K.DNA Cell. Biol. 26(10) =745(2007))；具有順式作用調(diào)節(jié)元件的 a B-晶 體蛋白(CRYAB)啟動子，例如aBE-1、a BE-2、a BE_3和MRF，其是骨骼肌組織特異性的 (Gopal-Srivastava 等，J.Mol.Cell Biol. 15(12) 7081(1995)) ；NCX1 啟動子，其是心肌細(xì) 胞組織特異性的(Xu等，J.Biol. Chem. 281(45) =34430(2006)) ；^肌球蛋白重鏈啟動子，其 是心肌細(xì)胞組織特異性的(Nelson 等，J.Mol.Cell Cardiol. 39(3) =479(2005), Ross 等， Development. 122(6) :1799 (1996)，和 Lee 等，Mol. Cell. Biol. 14(2) :1220 (1994))，肌球蛋 白輕鏈-2心室啟動子，包括HF-la/HF-lb/MEF-2組合元件(Ross等，Development. 122(6) 1799(1996))或 HF-la/HF-lb 元件和 HF-3 調(diào)節(jié)元件(Lee 等，Mol. Cell. Biol. 14(2) 1220 (1994))，其是心室組織特異性的；肌球蛋白輕鏈啟動子，例如MLC 1F和MLC3F，它們在 骨骼肌發(fā)育期間差別性活化(Kelly等，J. Cell. Biol. 129(2) =383(1995))；肌球蛋白輕鏈 2v (MLC-2v)啟動子，其是心肌組織特異性的(Su 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101 (46) 16280(2004))；和心肌肌鈣蛋白I(Tnlc)啟動子，其是心肌中組織特異性和發(fā)育階段特異 性的(Bhavsar 等，J. Mol. Cell Cardiol. 32(1) :95(2000))。本發(fā)明還提供包含上述核酸組合物的一種或多種載體和包含這種載體的一種或 多種遺傳修飾的細(xì)胞。相對于待治療的對象，這種細(xì)胞可以是同種異體的、自體的或異種 的。本發(fā)明還提供一種或多種包裹化方法以供治療、緩解或預(yù)防心血管疾病，包括上述修飾 細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)處理從而在引入對象后受保護而免遭該對象免疫系統(tǒng)的破壞。這種處理包括 但不限于提供保形包被、微囊化或巨囊化。心血管疾病包括但不限于充血性心力衰竭、缺血性心臟病、高血壓性心臟病、冠 狀動脈疾病、外周血管疾病和缺血性心臟事件，如心肌梗塞、心臟病發(fā)作、心力衰竭、心律失 常、心肌破裂、心包炎和心源性休克。這種事件的誘因包括但不限于血栓形成、栓塞、動脈 粥樣硬化和狹窄。敏感人群包括但不限于吸煙者、患糖尿病、高血壓或血脂障礙的人。治療、緩解或預(yù)防心血管疾病的合適治療分子包括但不限于促血管生成因子、心 臟保護性因子和心臟再生因子。可用于本發(fā)明以預(yù)防、治療或緩解心血管疾病的治療分子包括但不限于心房利 鈉因子(ANF)、卡培立肽、腦鈉素(BNP)、奈西立肽、松弛素、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF 165)、 肝細(xì)胞生長因子(HGF)、血管生成素-l(Ang-l)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、成纖維 細(xì)胞生長因子4 (FGF-4)、胰島素樣生長因子1 (IGF-1)、缺氧-誘導(dǎo)的因子1_ a (HIF1-a )、 促紅細(xì)胞生成素、組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)、生長激素、間質(zhì)-衍生的因 子-1 (SDF-1)、肌-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA2a)、腺苷環(huán)化酶VI型(AC6)、S100A1、細(xì)小白 蛋白、磷酸酶抑制劑2、和磷酸酶抑制劑1。已知這些分子通過各種機制，例如血液動力學(xué)、 血管生成、心臟再生、抗_纖維變性和/或心臟修復(fù)對心臟組織施加作用。這些治療分子可 提供多種治療作用，可彼此或與公眾已知的其它分子聯(lián)用。在一個實施方式中，目前利用可用于促進新血管生成的治療蛋白來實施治療、緩 解或預(yù)防心血管疾病的促血管生成基因治療臨床試驗。這些蛋白包括但不限于促血管生成因子，例如VEGF、HGF、bFGF、Ang_l、FGF-4、IGF-1和HIF1- a以及它們的片段、變體和衍 生物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能鑒定促進新血管生成的合適分子。這種促血管生成因子刺激 新血管生成以便在梗塞區(qū)域內(nèi)供應(yīng)氧和營養(yǎng)物。這會限制梗塞區(qū)域增大并維持遷移入梗塞 區(qū)域的任何心臟祖細(xì)胞。實際上，已知促血管生成因子VEGF 165誘導(dǎo)新血管生成(Benest等， Microcirculation. 13(6) 423(2006) ；Riley 等，Biomaterials. 27 (35) 5935(2006) ；Shyu 等，Life Sci. 73(5) 563(2003) ；Arsic 等，Mol Ther. 7 (4) 450(2003) ；Ye 等，J. Heart Lung Transplant. 24 (9) 1393 (2005) ；Lubiatowski 等，Plast. Reconstr. Surg. 110 (1) 149(2002)(錯刊于:Plast. Reconstr. Surg. 111(3) 1380 (2003)) ；Kim 等，Ann. Thorac. Surg. 83 (2) :640(2007)(注釋在Ann. Thorac. Surg. 83 (2) 646(2007)) ；Thurston G.， J. Anat. 200 (6) 575(2002) ；Ryu 等，Mol. Ther. 13 (4) 705(2006) ；Chae 等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 20(12) 2573 (2000)；和 Chen 等，Acta. Pharmacol. Sin. 28 (4) 493(2007))。治療性新血管生成中早期臨床試驗的缺點部分歸因于一次性給予高劑量的生 長因子。參見，Zacchigna 等，Hum. Gene Ther. 18(6) 515(2007)和 Yla-Herttuala 等，J Am Coll Cardiol. 49(10) : 1015 (2007)(注釋在 JAm CollCardiol. 50(2) : 186 (2007))。此后， VEGF表達(dá)和釋放的臨床前數(shù)據(jù)提示延長接觸導(dǎo)致形成穩(wěn)定的血管，而短期遞送僅產(chǎn)生易于 退化的滲漏血管。例如，產(chǎn)生VEGF-A的成肌細(xì)胞造成的局部高濃度導(dǎo)致血管滲漏和異常， 而中等量的生長因子啟動健康血管的生長。參見，Arsic等，Mol Ther. 7 (4) =450(2003)； Benest 等，Microcirculation. 13(6) 423(2006) ；Yamauchi 等，J GeneMed. 5(11) 994(2003) Jiang 等，Acta Cardiol. 61(2) 145 (2006) ；Ozawa 等，JClin Invest. 113(4) 516(2004)。此外，聯(lián)用VEGF (啟動血管生成)和Ang-1 (血管的成熟)顯示導(dǎo)致血管生長 更穩(wěn)定。參見，Thurston G.，J Anat. 200 (6) 575(2002) Jiang 等，Acta Cardiol. 61(2) 145(2006) ；Benest 等，Microcirculation. 13(6) 423(2006) ；Zhou 等，Gene Ther. 12(3) 196(2005)(錯刊于Gene Ther. 12(6) 552(2005) ；Liu 等，Scand Cardiovasc J. 41(2) 95(2007) ；Shyu 等，LifeSci. 73(5) 563 (2003) ；Yamauchi 等，J Gene Med. 5(11) 994(2003) ；Arsic 等，Mol Ther. 7 (4) 450(2003) ；Ye 等，J HeartLung Transplant. 24(9) 1393(2005) ；Ye 等，Eur J Heart Fail. 9(1) 15 (2007) ；Lubiatowski 等，Plast Reconstr Surg. 110(1) : 149(2002)(錯刊于Plast Reconstr Surg. 111(3) 1380 (2003)) ；Ryu 等， Mol Ther. 13(4) 705(2006) ；Chen 等，Eur J Pharmacol. 568(1-3) 222(2007) ；Chae 等，Arterioscler Thromb Vase Biol. 20(12) 2573(2000)；禾口 Chen 等，ActaPharmacol Sin. 28(4) 493(2007)。因此，促血管生成因子VEGF165已知能預(yù)防、治療或緩解各種心血管疾 病(Yamauchi 等，J Gene Med. 5(11) 994(2003)禾口 Xu 等，Cytotherapy. 6 (3) 204 (2004)(注釋在:Cytotherapy. 7 (1) 74 (2005)))，包括但不限于心肌梗塞(Zhou 等，Gene Ther. 12(3) 196 (2005)(錯干于Gene Ther. 12(6) 552(2005) ；Ye 等， Circulation. 116(llSuppl) I 113 (2007) ；Liu 等，Scand Cardiovasc J. 41 (2) 95(2007) ；Ye 等，Eur. J. Heart Fail. 7(6) 945(2005) ；Zhang等，CellTransplant. 14(10) 787 (2005) ；Bonaros 等，Interact. Cardiovasc. Thorac. Surg. 7 (2) 249(2008) ；Shyu 等，J.Biomed. Sci. 13(1) 47(2006) ；Ventura 等，JBiolChem. 282 (19) 14243(2007)；
67Sugimoto 等，Jpn. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 51 (5) 192 (2003) ；Yau 等，Ann. Thorac. Surg. 83(3) : 1110 (2007)(注釋在AnnThorac Surg. 83 (3) :1119 (2007)) ;Rong 等， Chin. Med. J. (Engl). 121(4) 347(2008) ；Yang 等，Cardiology. 107(1) 17 (2007) ；Wang 等，J. Mol. Cell Cardiol. 40(5) 736(2006) ；Chen 等，Eur J Clin Invest. 35(11) 677(2005) ；Suzuki 等，Circulation. 104 (12Suppl 1) :I207(2001) ；Ye 等，Ann. Acad. Med. Singapore. 32(5Suppl) :S21 (2003)；和 Haider 等，J Mol Med. 82 (8) :539 (2004)(注釋在 JMol Med. 82(8) =485(2004)))或缺血性或再灌注損傷(Becker 等，Int JCardiol. 113(3) 348(2006) ；Gao 等，Can. J. Cardiol. 23(11) 891(2007) ；Ye 等 Eur J Heart Fail. 9(1) 15 (2007) ；Chen 等，Eur. J. Pharmacol. 568 (1-3) 222 (2007)；禾口 Jiang 等，Acta Cardiol. 61(2) : 145 (2006))。此外，本發(fā)明可利用提供多能作用的另一促血管生成因子HGF(人核苷酸序列登錄 號M29145，人氨基酸序列登錄號NP_000592. 3)。由c_Met受體介導(dǎo)的HGF通過以下機制 提供促血管生成作用對內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂促進活性，對心肌細(xì)胞的心臟保護性抗-凋 亡作用，通過阻遏TGF-0 1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗纖維變性作用，HGF是通過將⑶117(+)/c-Met(+) 干細(xì)胞遷移入缺血心肌的I型膠原再生因子。參見Li等，Chin Med J (Engl) 121 (4) 336(2008) ；Guo 等，Arch. Med. Res. 39(2) 179 (2008) ；Ventura 等，J. Biol. Chem. 282 (19) 14243(2007) ；Yang 等，Gene Ther. 13(22) 1564(2006) ；Tambara 等，Circulation. 112(9 增刊)1129(2005) ；Zhang 等，Tissue Eng. A 部分.14 (6) 1025(2008)；和 Sakaguchi 等， Ann. Thorac. Surg. 79 (5) 1627 (2005)。類似地，bFGF(氨基酸序列登錄號NP_001997)已顯示通過促進血管生成、 新血管生成和組織再生而有心臟保護的附加作用。(Doi等，Heart Vessels. 22 (2) 104(2007) ；Fujita J. Surg. Res. 126 (1) 27 (2005) ；Fujita WoundRepair Regen. 15(1) 58(2007) ；Hosaka等，Circulation. 110 (21) 3322(2004) ；Iwakura等，Heart Vessels. 18(2) 93(2003) ；Lai 等，Tissue Eng. 12(9) 2499(2006) ；Nakajima等，J. Artif-Qrgans. 7 (2) 58(2004) ；Perets 等，J. Biomed. Mater. Res. A. 65 (4) 489 (2003) ；Pike 等， Biomaterials. 27(30) 5242 (2006) ；Sakakibara J Thorac Cardiovasc Surg. 124(1) 50(2002) ；Sakakibara 等,Eur J Cardiothorac Surg. 24(1) 105(2003) ；Shao 等， Circ J. 70 (4) 471(2006) ；Tabata Y.和 Ikada Y.，Biomaterials. 20(22) 2169(1999)； Yamamoto 等，Artif. Organs. 27 (2) 181 (2003) ；Yamamoto 等，Jpn. Circ. J. 65 (5) 439(2001) ；Yang等，Ophthalmic Res. 32(1) 19 (2000)；和 Zhu等，Chin. Med. Sci. J. 15 (4) 210(2000))。在某些實施方式中，bFGF可用于預(yù)防、治療或緩解骨關(guān)節(jié)炎。參見Inoue等， Arthritis Rheum. 54(1) :264(2006)。還已知IGF_1(人氨基酸序列登錄號NP_001104753. 1)能施加保護心肌細(xì)胞免 遭凋亡并增強新血管生成的多能作用(Su等，Am J Physiol HeartCirc Physiol. 284(4) H1429(2003) ；Chao 等，J. Gene Med. (4) 277(2003) ；Rabinovsky E. D.和 Draghia-Akli R.，Mol Ther. 9(1) 46 (2004)；和 Barton 等，Circulation. 112 (9 增刊):146 (2005))，其可 用于本發(fā)明。此外，F(xiàn)GF-4可用作治療分子通過誘導(dǎo)心肌血管生成/動脈生成而預(yù)防、 治療或緩解慢性缺血性心臟病。(Kapur N. K.和Rade J. J.，Trends Cardiovasc.Med. 18(4) 133 (2008) ；Henry 等，J.Am. Coll. Cardiol. 50(11) 1038 (2007) ；Grines 等， Am. J. Cardiol. 92 (9B) :24N(2003)；(作者未列出)BioDrugs. 16(1) :75(2002))。此夕卜，HIFl-a基因治療，例如 HIFl-a (aa 1-390)/VP16 (aa 413-490)已 知能通過增強BNP基因表達(dá)而治療、預(yù)防或緩解缺血性疾病(Rajagopalan等， Circulation. 115(10) 1234(2007)(注釋在 Circulation. 115(10) 1180(2007))； ffilhide M. E.和 Jones ff. K. , Mol Pharmacol. 69 (6) 1773 (2006)(注釋在Mol Pharmacol. 69(6) 1953(2006)) ；Luo 等，Mol Pharmacol. 69(6) 1953 (2006)(注釋在: Mol. Pharmacol. 69(6) 1773 (2006))或改善心肌梗塞中的血管生成(Shyu 等，Cardiovasc Res. 54(3) 576(2002) ；Vincent 等，Circulation. 102(18) :2255 (2000))。在某些實施方式中，單獨或與血管生成性因子和/或心臟再生因子組合提供治 療、緩解或預(yù)防心血管疾病的心臟保護性因子。心臟保護性分子提供抗_纖維變性、抗_凋 亡信號以使心肌細(xì)胞駐留，限制梗塞區(qū)域大小并提供存活信號以使遷移干細(xì)胞。在某些實 施方式中，心臟保護性因子是促紅細(xì)胞生成素(EP0)(人氨基酸序列登錄號CAA26095. 1)， 例如人促紅細(xì)胞生成素a或安進公司(Amgen)生產(chǎn)的EPOGEN 。促紅細(xì)胞生成素顯示 具有心臟保護、血管生成和神經(jīng)保護作用(Ben-Dor等，Cardiovasc Drugs Ther. 21(5) 339 (2007) ；Lin 等，Circ J. 71 (1) 132 (2007) ；Prunier 等，Am J. Physiol Heart CircPhysiol. 292(1) :H522(2007))。顯示對實驗性心肌缺血_再灌注損傷具有保護作用的其它心臟保護性激素包括 但不限于腎上腺髓質(zhì)素，緩激肽，松弛素，ANF，也稱為心房利鈉肽(ANP，人核苷酸序列登 錄號NM_006172，人氨基酸序列登錄號NP_006163)，BNP,也稱為B-型利鈉肽或GC-B (人 氨基酸序列登錄號NP_002512. 1 ；人核苷酸序列登錄號M25296)，C-型利鈉肽(CNP)，卡 培立肽，組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)和urocortin(—種促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激 素)。許多還顯示能降低纖維變性或介導(dǎo)血液動力學(xué)。奈西立肽(商標(biāo)名Natrecor ，由西 奧斯公司(Scios)投入市場)(重組形式的人B-型利鈉肽)、ANF和卡培立肽用于治療、緩解 或預(yù)防急性代償失調(diào)的心力衰竭，也可用于本發(fā)明(Burnett J. C. Jr. , J. Cardiol. 48 (5) 235(2006))。已知對女性生殖系統(tǒng)有作用的松弛素(人氨基酸登錄號NP_604390. 1)還是涉 及氧化氮作用機理的全身和冠狀循環(huán)的強效舒張劑，其影響心臟搏動率。松弛素還已知 是可預(yù)防、治療或緩解缺血性心臟疾病(急性和慢性心肌梗塞)、心臟纖維變性和閉塞 性外周動脈疾病并在細(xì)胞移植中恢復(fù)心臟功能的心血管藥物。(Nistri等，Pharmacol. Res. 57(1) 43(2008) ；Samuel 等，Adv. Exp. Med. Biol. 612 :88 (2007) ；Du XJ. , J. Cell Mol. Med. 11(5) 1101 (2007) ；Formigli 等，J. Cell Mol. Med. 11 (5) 1087 (2007) ；Bathgate ^f, Mol. CellEndocrinol. 280(1-2) 30(2008) ；Nistri 等，Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem. 5(2) : 101 (2007) ；Moore 等，Endocrinology. 148 (4) : 1582 (2007)； Lekgabe 等，Endocrinology. 147(12) 5575(2006) ；Samuel 等，Pharmacol. Ther. 112(2) 529(2006) ；Zhang 等，Peptides. 26(9) 1632 (2005) ；Perna 等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 1041 431(2005) ；Perna 等，F(xiàn)ASEB J. 19(11) 1525 (2005) ； Samuel 等，Endocrinology. 145(9) 4125(2004) ；Masini 等，Br J Pharmacol. 137(3) 337(2002) ；Ndisang 等，Inflamm. Res. 50 增刊.2 :S122-3(2001) ；Dschietzig 等，F(xiàn)ASEB. J. 15(12) 2187(2001) ；Bani 等，Am JPathol. 152(5) 1367 (1998)；和 Masini 等，Inflamm. Res. 45Suppl 1 :S27 (1996))。在某些實施方式中，用于治療、緩解或預(yù)防心血管疾病的本發(fā)明治療蛋白具有 多種治療益處。例如，在心肌梗塞后的早期，據(jù)報道梗塞區(qū)的水平升高(SDF-1，人核苷酸 序列登錄號U16752，人氨基酸序列登錄號NP_954637)。這為干細(xì)胞作為天然修復(fù)過程 的一部分而從BM小環(huán)境(BMniches)遷移到受損部位提供了所需的刺激。SDF-1將骨髓 造血干細(xì)胞(主要是⑶31+、C-kit+和⑶34+細(xì)胞)募集至梗塞心臟，從而導(dǎo)致新血管生 成和心臟保護活性。此外，SDF-1通過G蛋白-偶聯(lián)的失調(diào)CXCR4再生因子激活細(xì)胞存 活因子蛋白激酶B(PKB/Akt)。也參見美國專利申請公布號20060111290A1 ；Elmadbouh
J Mol Cell Cardiol. 42(4) 792(2007) ；Bonaros Interact Cardiovasc Thorac Surg. 7 (2) 249(2008) ；Zhang等，JMol Cell Cardiol. 44(2) 281(2008) ；Ma等，Basic Res Cardiol. 100(3) 217(2005)；和 Zhang 等，Tissue Eng. 13(8) =2063(2007) 此外，tPA (人氨基酸登錄號28274638)，例如人組織纖維蛋白溶酶原激活劑或PDL 生物醫(yī)藥公司(PDL BioPharma, Inc)生產(chǎn)的Retavase 已知能通過抑制移植物動脈粥樣 硬化而預(yù)防、治療或緩解心臟移植后并發(fā)癥(Scholl等，J Heart Lung Transplant. 20(3) 322(2001) ；Dunn 等，Circulation. 93(7) 1439(1996)(注釋在 Circulation. 93(7) 1319(1996))；和 Gong 等，Gene Ther. 14(21) 1537 (2007))。此外，還知道生長激素能 通過促進血管生成而預(yù)防、治療或緩解心血管疾病，進而用于本發(fā)明(Isgaard J.和 BerghC. H.，BioDrugs. 12(4) 245(1999) ；Fazio 等，J. Clin. Endocrinol. Metab. 92(11) 4218(2007) ；Climent 等，Curr Med Chem. 14(13) 1399 (2007) ；Perez-Berbel 等，Int J Cardiol. 124(3) :393(2008)(注釋在Int J Cardiol. 110(3) 313(2006))；和 Le Corvoisier 等，J Clin Endocrinol Metab. 92 (1) : 180 (2007))，并可減弱凋亡(Rong 等， Chin MedJ(Engl). 121(4) :347(2008))。在其它實施方式中，本發(fā)明包括能恢復(fù)心臟功能的治療分子。心臟修復(fù)分子 包括但不限于SERCA2a、AC6、S100A1、細(xì)小白蛋白、磷酸酶抑制劑2和磷酸酶抑制劑1。 例如，SERCA2a已知能在體內(nèi)和體外改善心臟收縮性和心力衰竭中的心臟功能(Asahi 等，Proc NatlAcadSci USA. 101 (25) :9199 (2004) ；Cavagna 等，J Physiol. 528Pt 1 53(2000) ；Chaudhri 等，Mol CellBiochem. 251(1-2) 103 (2003) ；Davia 等，J Mol Cell Cardiol. 33(5) : 1005 (2001) ；del Monte 等，Circulation. 100 (23) :2308 (1999)(注釋在 Circulation. 100(23) 2303(1999) ；del Monte 等，Circulation. 104(12) 1424(2001)； Haj jar 等，Circ Res. 81 (2) 145(1997)(注釋在Circ Res. 88 (4) 373(2001)和 Circulation. 101 (7) 790(2000)) ；Kawase 等，J AmCollCardiol. 51(11) 1112(2008)； Maier 等，Cardiovasc Res. 67(4) 636(2005)(注釋在Cardiovasc Res. 67(4) 581(2005) ；Meyer M.禾口 Dillmann ff. H. , Cardiovasc Res. 37(2) 360(1998) ；Miyamoto 等，Proc Natl Acad Sci U SA. 97 (2) 793(2000) ；Muller 等，Cardiovasc Res. 59(2) 380(2003) ；Sakata 等，J Mol CellCardiol. 42(4) 852(2007) ；Sakata 等，Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292(2) :H1204(2007) ；Schmidt 等，Circulation. 101(7) =790(2000) (注釋在Circulation. 101(7) 738(2000), CircRes. 81(2) : 145 (1997)，CircRes. 83(9) 889(1998)，禾口 Circulation. 95(2) 423(1997))Suarez 等，AmJPhysiol Heart Circ Physiol. 287(5) :H2164(2004) ；Terracciano 等，CellCalcium. 31(6) 299 (2002) ；Trost等，Diabetes. 51(4) 1166 (2002)；和 Vetter 等，F(xiàn)ASEB J 16(12) 1657 (2002)) 此外，已知AC6能恢復(fù)心肌病中SERCA2a對鈣的親合力以及肌質(zhì)網(wǎng)的心臟鈣 攝入的最高速度(Gao 等，Proc Natl Acad Sci U S A. 95(3) 1038 (1998) ；Roth 等， Circulation. 99(24) 3099(1999) ；Lai 等，Circulation. 102(19) 2396(2000) ；Roth 等， Circulation. 105(16) : 1989 (2002)(注釋在Circulation. 105 (16) 1876(2002)) ；Gao 等，CardiovascRes. 56(2) 197 (2002)(注釋在Cardiovasc Res. 56 (2) 181 (2002))； Roth 等，Basic Res Cardiol. 98(6) 380 (2003) ；Roth 等，Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287(1) :H 172(2004) ；Gao 等，JBiolChem. 279 (37) 38797(2004) ；Tang 等， AmJPhysiolHeart CircPhysiol. 287(5) :H 1906(2004) ；Lai 等，Circulation. 110(3) 330(2004)(注釋在 Circulation. 110(3) 242(2004) ；Roth 等，Hum Gene Ther. 15(10) 989(2004) ；Timofeyev 等，JMol Cell Cardiol. 41 (1) 170 (2006)(注釋在J Mol CellCardiol. 41 (3) 424(2006) ；Takahashi 等，Circulation. 114(5) 388(2006)(錯 刊于Circulation. 114(11) :e497(2006)；注釋在Circulation. 114(5) 365(2006)； Sastry 等，J Am Coll Cardiol. 48(3) 559(2006) ；Rebolledo 等，Hum Gene Ther. 17(10) 1043(2006) ；Hammond H. K. , Ann N YAcad Sci. 1080 426(2006) ；Phan 等，Trends Cardiovasc Med. 17(7) 215(2007) ；Tang 等，Circulation. 117 (1) 61(2008)；和 Lai 等，J Am Coll Cardiol. 51(15) 1490 (2008)) 在某些實施方式中，&2+_結(jié)合蛋白S100A1可恢復(fù)心臟功能，因此可用于本發(fā) 明。S 100A1已知能體內(nèi)增加心臟收縮并降低心肌梗塞后的心力衰竭可能性。(Most等， J Clin Invest. 114(11) 1550(2004) ；Most 等，Circulation. 114 (12) 1258(2006)； Pleger 等，Mol Ther. 12(6) 1120(2005) ；Pleger 等，Eur JMed Res. 11(10) 418(2006)； Remppis J Gene Med. 6 (4) 387(2004) ；Most Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 293(2) :R568 (2007) ；Remppis 等，Basic Res Cardiol. 97Suppl 1:156(2002)； Pleger 等，Circulation. 115(19) 2506(2007)；和 Most 等，J Biol Chem. 278(36) 33809(2003))。改善或恢復(fù)心臟功能的治療分子的其它非限制性例子有擬清蛋白 (Hirsch 等，Am J PhysiolHeart Circ Physiol. 286(6) :H2314(2004) ；Michele 等，Mol Ther. 10(2) 399(2004)；和 Sakata 等，J Mol Cell Cardiol. 42(4) :852 (2007))、磷酸酶抑 制劑 2(Yamada 等，F(xiàn)ASEB J. 20 (8) 1197 (2006) ；Gupta 等，Mol Cell Biochem. 269(1-2) 49(2005)；和 Kirchhefer 等，Cardiovasc Res. 68(1) 98(2005))和磷酸酶抑制劑 1 (Gupta 等，Mol Cell Biochem. 269(1-2) 49 (2005)和 Gupta 等，Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285(6) :H2373(2003))?？捎糜诒景l(fā)明來預(yù)防、治療或緩解疾病或病癥的其它治療分子包括但不限 于單克隆抗體(例如，HERCEPTIN -HC，HERCEPTIN "LC, TlCILIMUMAB "HC, TlCILIMUMAB -LC，ZENAPAX -HC, ZENAPAX -LC，HUMIRA "HC, HUMIRA _LC， RITUXAN "HC, RITUXAN "LC, IPILIMUMAB "HC, IPILIMUMAB _LC，AVASTIN -HC, AVASTIN -LC, Erbitux -HC,和 ERB1TUX -LC)、重組酶(例如，RETAVASE , ACTRAPID -A 鏈，ACTRAPID "B 鏈，NEULASTA ，前胰島素原，EPOGEN ，和 NORDITROPIN )、融合蛋白(例如，ENBREL )或任何純化蛋白(例如，ALPHANATE 和ARALAST )。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能鑒定合適的治療分子以供預(yù)防、治療或緩解特 定疾病或病癥。載體和宿主細(xì)胞利用載體將多核苷酸引入細(xì)胞。載體可以是，例如質(zhì)粒載體或單鏈或雙鏈RNA或 DNA病毒載體。這種載體可以通過熟知技術(shù)引入細(xì)胞以便將DNA和RNA引入細(xì)胞。病毒載 體可以是能復(fù)制的或復(fù)制缺陷型的。后一情況中，病毒通常只在互補的病毒感受態(tài)細(xì)胞中 增殖。因此，載體至少必須包含本發(fā)明多核苷酸。載體的其它組分可包括但不限于可選 擇標(biāo)記、染色質(zhì)修飾結(jié)構(gòu)域、驅(qū)動載體上還可能存在的其它多肽(例如，致死多肽)表達(dá)的 其它啟動子、基因組整合位點、重組位點和分子插入支點(molecular insertion pivot)。 載體可在或不在該多核苷酸內(nèi)包含任何數(shù)量的這些額外元件，從而該載體可為所需治療方 法的特定目標(biāo)而作改進。在本發(fā)明的一個實施方式中，引入細(xì)胞的載體還包含“可選擇標(biāo)記基因”，當(dāng)其表 達(dá)時，表示本發(fā)明的治療基因開關(guān)構(gòu)建物已整合入修飾細(xì)胞的基因組。在此方式中，選擇者 基因(selector gene)可以是基因組整合的正標(biāo)記物。雖然對于本發(fā)明方法不是至關(guān)重要 的，但選擇者基因的存在使得實施者能選擇載體構(gòu)建物已整合入細(xì)胞基因組的活細(xì)胞群。 因此，本發(fā)明的某些實施方式包括選擇載體已成功整合的細(xì)胞。當(dāng)本文所用的術(shù)語“選擇” 或其改變形式與細(xì)胞聯(lián)用時，其應(yīng)表示選擇具有特定遺傳組成或表型的細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)熟知方 法。典型的方法包括但不限于有抗生素，例如G418、新霉素和氨芐青霉素存在下培養(yǎng)細(xì) 胞。可選擇標(biāo)記基因的其它例子包括但不限于賦予對二氫葉酸還原酶、潮霉素或霉酚酸耐 受性的基因。選擇的其它方法包括但不限于允許利用胸苷激酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖 轉(zhuǎn)移酶或腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶作為選擇劑的可選擇標(biāo)記基因。然后包含含有一種或多種 抗生素耐受性基因的載體構(gòu)建物的細(xì)胞能耐受培養(yǎng)基中的抗生素。類似地，不包含含有一 種或多種抗生素耐受性基因的載體構(gòu)建物的細(xì)胞不能耐受培養(yǎng)基中的抗生素。本文所用的“染色質(zhì)修飾結(jié)構(gòu)域”(CMD)指與維持和/或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)的 各種蛋白質(zhì)相互作用的核苷酸序列，例如但不限于DNA絕緣子。參見通過引用納入本文 的 Ciavatta 等，Proc. Nat，1 Acad. Sci. U. S. A.，103 9958 (2006)。CMD 的例子包括但不限 于雞球蛋白絕緣子和雞超敏位點4(cHS4)。例如，利用在一個或多個基因程序(gene program)之間不同的CMD ( S卩，啟動子、編碼序列和3’調(diào)控區(qū))有助于聯(lián)用差別CMD DNA序 列作為“最小同源臂”與各種微生物或體外重組技術(shù)，從而在現(xiàn)有多基因和單基因穿梭載體 之間“交流”基因程序。染色質(zhì)修飾結(jié)構(gòu)域的其它例子是本領(lǐng)域已知或者不難鑒定的。本發(fā)明所用的具體載體是編碼多肽或多核苷酸的表達(dá)載體。這種載體通常包含操 作性連接于待表達(dá)多核苷酸的順式_作用調(diào)控區(qū)以便在修飾細(xì)胞中有效表達(dá)。合適的反式 作用因子由修飾細(xì)胞、互補載體(complementing vector)或在引入細(xì)胞后由載體本身提 {共?？衫酶鞣N表達(dá)載體表達(dá)多肽或多核苷酸。這種載體包括染色體、附加體和病毒 衍生的載體，例如衍生自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒，例如腺伴 隨病毒、慢病毒、桿狀病毒、乳多空病毒，例如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病 病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，以及衍生自它們組合的載體，例如衍生自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件，例如粘粒和噬菌粒的那些載體。按照本發(fā)明的該方面，所有載體可用于表達(dá)。就此而言， 適于在細(xì)胞中維持、增殖或表達(dá)多核苷酸或多肽的任何載體通?？捎糜诒磉_(dá)。表達(dá)載體中的多核苷酸序列操作性連接于合適的表達(dá)控制序列，包括例如指導(dǎo) mRNA轉(zhuǎn)錄的啟動子。其它代表性啟動子包括但不限于組成型啟動子和組織特異性或誘導(dǎo) 型啟動子。組成型真核生物啟動子的例子包括但不限于小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子 (Hamer 等，J. Mol. Appl. Gen. 1 273(1982))；皰疹病毒的 TK 啟動子(McKnight，Cell 31 355(1982)) ；SV40 早期啟動子(Benoist 等，Nature 290:304(1981))；和牛痘病毒啟動子。 上述所有參考文獻(xiàn)通過引用納入本文?？捎糜隍?qū)動蛋白質(zhì)或多核苷酸表達(dá)的啟動子的其它 例子包括但不限于組織特異性啟動子和特定蛋白質(zhì)的其它內(nèi)源性啟動子，例如白蛋白啟動 子(肝細(xì)胞)、胰島素原啟動子(胰腺0細(xì)胞)等。表達(dá)構(gòu)建物通常含有轉(zhuǎn)錄、起始和終 止位點以及在轉(zhuǎn)錄區(qū)域中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。構(gòu)建物表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼 部分可包含開始處的翻譯起始AUG，和適當(dāng)位于待翻譯多肽末端的終止密碼子(UAA、UGA或 UAG)。此外，構(gòu)建物可含有調(diào)節(jié)以及引起表達(dá)的調(diào)控區(qū)。這些區(qū)域通常通過控制轉(zhuǎn)錄起 作用，例如阻遏物結(jié)合位點和增強子等。真核生物載體的例子包括但不限于斯特拉塔基因公司(Stratagene)的 pW-LNE0、pSV2CAT、p0G44、pXT 1 禾PpSG;APB 公司(Amersham PharmaciaBiotech)的 pSVK3、 pBPV、pMSG 和 pSVL ；和克隆技術(shù)公司(Clontech)的 pCMVDsRed2_ 表達(dá)、pIRES2_DsRed2、 PDsRed2-Mito, pCMV_EGFP。許多其它載體是熟知且可商品化購得的。包含分子插入支點以供快速插入和除去基因程序元件的尤其有用載體描述于 美國專利申請公布號2004/0185556、美國專利申請?zhí)?1/233，246和國際申請公布號TO 2005/040336及W0 2005/116231，所有這些通過引用納入本文。這種載體的例子是通過 引用納入本文的W0 2007/038276所述的弗吉尼亞州布萊克斯堡的英特列克星敦公司的 UltraVector 產(chǎn)生系統(tǒng)。本文所用的“基因程序”是包含啟動子(P)、表達(dá)序列(E)和3' 調(diào)控序列(3)的遺傳元件的組合，例如“PE3”是基因程序。該基因程序內(nèi)的諸元件不難在 側(cè)接該基因程序各元件的分子支點之間交流。本文所用的分子支點定義為包含至少兩個以 線形方式排列的不可變罕有或稀有限制性位點的多核苷酸。在一個實施方式中，分子支點 包含至少三個以線形方式排列的不可變罕有或稀有限制性位點。通常，任一分子支點不會 包含同一基因程序中任何其它分子支點的罕有或稀有限制性位點。給定限制性酶在其上起 作用的大于6個核苷酸的同源序列稱為“罕有”限制性位點。然而，有的6bp限制性位點比 統(tǒng)計學(xué)預(yù)計的更罕見，這些位點和切割它們的核酸內(nèi)切酶稱為“稀有”限制性位點。罕有或 稀有限制性位點的例子包括但不限于:AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、 Not I.Sal I、Swa I、Rsr II.BSiff I、Sfo I、Sgr AI、Afllll、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、SdaI、SgfI、SrfI、和 Sse8781I。載體還可包含第二類限制性酶，稱為歸巢核酸內(nèi)切酶(HE)的限制性位點。HE酶具 有大的不對稱限制性位點(12-40個堿基對)，它們的限制性位點是天然罕見的。例如，稱 為 I-Scel 的 HE 具有 18bp 的限制性位點(5' TAGGGATAACAGGGTAAT3 ‘ (SEQ ID NO 4)), 預(yù)計在隨機序列的每7xl01(l個堿基對中產(chǎn)生一個。這種發(fā)生率等于在哺乳動物基因組大小 的20倍的基因組中只有一個位點。如果克隆載體質(zhì)粒的適當(dāng)位置包含HE位點，則HE位點的罕有特性極大增加了遺傳工程師切割某基因程序而不破壞該基因程序完整性的可能性。選擇合適的載體和啟動子在宿主細(xì)胞中表達(dá)是熟知的方法，載體構(gòu)建和引入宿主 及其在宿主中表達(dá)的必需技術(shù)是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。將多核苷酸引入細(xì)胞可以是瞬時轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，或者可以是基因座特異性插入 載體。可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)_介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn) 導(dǎo)、感染或其它方法實現(xiàn)載體瞬時而穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞。通過引用納入本文的許多標(biāo) 準(zhǔn)實驗室手冊描述了這些方法，例如Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(分 子生物學(xué)基本方法)(1986) ；Keown 等，1990，Methods Enzymol. 185 :527_37 ；Sambrook 等， 2001，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (分子克隆-實驗室手冊)，第三版，冷泉 港實驗室出版社，紐約。這些穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)致載體隨機插入細(xì)胞的基因組。此外，載體 的拷貝數(shù)量和取向一般也是隨機的。在另一實施方式中，可通過重組酶位點特異性基因插入進行基因座特異性插入。 簡言之，細(xì)菌重組酶，例如但不限于PhiC31整合酶可作用于人基因組內(nèi)的“偽”重組位點。 這些偽重組位點可以是利用重組酶的基因座特異性插入的靶點。重組酶-位點特異性基因 插入描述于通過引用納入本文的Thyagarajan等，Mol. Cell Biol. 21 =3926(2001) 重組酶 的其它例子和它們可用于重組酶-位點特異性基因插入的各位點包括但不限于絲氨酸重 組酶，例如R4和TP901-1和通過引用納入本文的W0 2006/083253描述的重組酶。為將一個或多個基因表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定整合入修飾細(xì)胞，任何已知的整合方法可用 于本發(fā)明的目的。在一個實施方式中，可通過重組酶位點特異性基因插入進行基因座特 異性插入。簡言之，細(xì)菌重組酶，例如但不限于PhiC31整合酶可作用于人基因組內(nèi)的 “偽”重組位點。參見美國公布號 2004/0003420A1 ；Groth 等，Proc. Natl. Acad. Science, 97, 5995-6000 (2000)。這些偽重組位點可以是利用重組酶的基因座特異性插入的靶 點。重組酶_位點特異性基因插入描述于Thyagarajan，B.等，Mol. Cell Biol. 21 (12) 3926-34(2001)。在某些實施方式中，第一可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)還包含整合酶，其將該第一基因開 關(guān)系統(tǒng)穩(wěn)定整合入靶向細(xì)胞基因組內(nèi)的偽_位點。第二基因開關(guān)系統(tǒng)還可包含整合酶，其 將該第二基因開關(guān)系統(tǒng)整合入靶向細(xì)胞基因組內(nèi)的偽位點。該第一基因開關(guān)系統(tǒng)還可包含 整合接受位點，其可將該第二可誘導(dǎo)基因開關(guān)系統(tǒng)整合在靶向細(xì)胞基因組內(nèi)的預(yù)置接受位 點o以下多肽序列報道為編碼鏈霉菌噬菌體PhiC31整合酶多肽序列的多肽序列，其 在Genbmk中的登錄號為NP 047974。鏈霉菌噬菌體phiC31 整合酶(605aa) (SEQ ID NO 6)lmdtyagaydr qsrerenssa aspatqrsan edkaadlqre verdggrfrf vghfseapgt61safgtaerpe ferilnecra grlnmiivyd vsrfsrlkvm daipivsell algvtivstq121egvfrqgnvm dlihlimrld ashkesslks akildtknlq relggyvggk apygfelvse181tkeitrngrm vnvvinklah sttpltgpfe fepdvirwww reikthkhlp fkpgsqaaih241pgsitglckr mdadavptrg etigkktass awdpatvmri lrdpriagfa aeviykkkpd301gtpttkiegy riqrdpitlr pveldcgpii epaewyelqa wldgrgrgkg lsrgqailsa361mdklycecga vmtskrgees ikdsyrcrrr kvvdpsapgq hegtcnvsma aldkfvaeri
421fnkirhaegd eetlallwea arrfgkltea peksgeranl vaeradalna leelyedraa481gaydgpvgrk hfrkqqaalt lrqqgaeerl aeleaaeapk lpldqwfped adadptgpks541wwgrasvddk rvfvglfvdk ivvtksttgr gqgtpiekra sitwakpptd ddeddaqdgt601edvaa可用于重組酶位點特異性基因插入的重組酶和它們的各自位點的其它例子包括 但不限于絲氨酸重組酶，例如R4和TP901-1。位點-特異性重組酶(SSR)，例如細(xì)菌噬菌體 P1-衍生的Cre重組酶識別特異性DNA序列(“識別位點”“識別序列”或"整合酶接受位 點")并在兩個識別位點之間催化重組。例如，Cre重組酶識別34堿基對(bp)的loxP基 序(Austin等，Cell 25，729-736 (1981))。如果兩個位點以相同取向位于同一 DNA分子上， 重組酶從作為閉合環(huán)的親代分子上切下間插DNA序列，從而在各反應(yīng)產(chǎn)物上留下一個識別 位點。如果兩個位點是顛倒取向，側(cè)接識別的區(qū)域通過重組酶介導(dǎo)的重組而顛倒。或者，如 果兩個識別位點位于不同分子上，重組酶介導(dǎo)的重組會導(dǎo)致環(huán)狀分子整合或在兩個線形分 子之間的易位。除了 Cre，少數(shù)重組酶已在哺乳動物細(xì)胞中顯示一定活性。最佳表征的例子是 酵母衍生的FLP和Kw重組酶，其在30°C顯示最佳活性，在37°C不穩(wěn)定(Buchholz等， Nature Biotech. ,16,657-662(1998) ；Ringrose ， Eur. J. Biochem. ，248，903—912)。 在哺乳動物細(xì)胞中顯示一定活性的其它重組酶包括噬菌體X的突變型整合酶、噬菌體 HK022的整合酶、突變型Y S -解離酶和0 -重組酶(Lorbach等，J. Mol. Biol.，296， 1175-81(2000) ；Kolot 等，Moi. Biol. R印.26,207-213(1999) ；Schwikardi 等，F(xiàn)EBS Lett., 471，147-150(2000) ；Diaz 等，J. Biol. Chem.，274，6634-6640 (1999))。此外，現(xiàn)已開發(fā)了改 進形式的phiC31整合酶。該修飾的C31-Int(C31-Int(CNLS))攜帶C-末端核定位信號區(qū) (NLS)，其在哺乳動物細(xì)胞中展示明顯強于野生型形式的重組效率并與Cre重組酶相當(dāng)(EP 1205490 ；美國公布號2004/0003420A1)。這使得C31_Int成為哺乳動物基因組修飾的有價 值工具。在本發(fā)明的一個實施方式中，載體插入基因組的生物中立位點(bio-neutral site)。生物中立位點是基因組中多核苷酸的插入極少干擾(如果有的話)細(xì)胞正常功能 的位點?？刹捎每傻玫纳镄畔W(xué)方法分析生物中立位點。許多生物中立位點是本領(lǐng)域已 知的，例如R0SA-等價基因座?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)鑒定其它生物中立位點。采 用本領(lǐng)域已知的方法表征基因組插入位點。為控制將載體引入細(xì)胞時多核苷酸的位置、拷 貝數(shù)量和/或取向，可采用基因座特異性插入的方法?；蜃禺愋圆迦敕椒ㄊ潜绢I(lǐng)域熟 知的，包括但不限于同源重組和重組酶介導(dǎo)的基因組插入。當(dāng)然，如果本發(fā)明方法中要采 用基因座特異性插入方法，載體可包含有助于這種基因座特異性插入，例如但不限于同源 重組的元件。例如，載體可包含1、2、3、4或更多個基因組整合位點(GIS)。本文所用的“基 因組整合位點”定義為載體序列的一部分，其核苷酸序列與允許載體插入基因組的細(xì)胞內(nèi) 的基因組諸部分相同或幾乎相同。特別是，載體可包含至少側(cè)接該多核苷酸的兩個基因組 插入位點。當(dāng)然，GIS可側(cè)接其它元件，甚至載體上存在的所有元件。在進一步的實施方式中，載體可包含化學(xué)耐受性基因，例如多元抗藥性基因mdrl、 二氫葉酸還原酶或06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶?；瘜W(xué)耐受性基因可以在組成型(例 如，CMV)或誘導(dǎo)型(例如，RheoSwitch )啟動子的控制下。在該實施方式中，如果需要治
75療在對象的疾病而同時將修飾細(xì)胞維持在該對象中，臨床醫(yī)師可應(yīng)用化療劑來破壞患病細(xì) 胞，而修飾細(xì)胞因表達(dá)合適的化學(xué)耐受性基因而免遭該化療劑作用并且可繼續(xù)用于治療、 緩解或預(yù)防疾病、病癥或病狀。將化學(xué)-耐受性基因置于誘導(dǎo)型啟動子控制下，可避免該化 學(xué)耐受性基因不必要的表達(dá)，但如果需要持續(xù)治療，其仍可用。如果修飾細(xì)胞本身變得患 病，也可通過誘導(dǎo)致死性多肽表達(dá)來破壞它們，如下所述。通過將編碼基因開關(guān)和治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸引入對象的細(xì)胞來 實施本發(fā)明方法?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的將多核苷酸引入細(xì)胞的任何已知方法，例如上述那 些。當(dāng)要將多核苷酸離體引入細(xì)胞時，可通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)獲得對象的細(xì) 胞，包括但不限于活檢、刮除術(shù)和外科組織取出。可以培養(yǎng)分離的細(xì)胞足夠時間以使多核 苷酸引入細(xì)胞，例如2、4、6、8、10、12、18、24、36、48小時或更長時間。短期培養(yǎng)原代細(xì)胞的 方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，可在平板(例如，微孔平板)中粘附或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。對于離體治療方法，從對象分離細(xì)胞并在適于將多核苷酸引入細(xì)胞的條件下培 養(yǎng)。一旦多核苷酸引入細(xì)胞，將該細(xì)胞溫育足夠的時間以使配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物表 達(dá)，例如0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18、或24小時或更長時間。在多核苷酸引入細(xì)胞 后的某時(配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物表達(dá)顯著水平之前或之后)，將該細(xì)胞引回該對象。 可通過本領(lǐng)域已知的任何方法實施重新引入，例如靜脈內(nèi)輸注或直接注射入組織或體腔。 在一個實施方式中，先測定細(xì)胞中是否存在多核苷酸，再將該細(xì)胞弓I回對象。在另一實施方 式中，選擇含有多核苷酸的細(xì)胞(例如，根據(jù)多核苷酸中可選擇標(biāo)記的存在)，只將含有該 多核苷酸的那些細(xì)胞重新引入對象。細(xì)胞重新引入對象后，將配體給予對象以誘導(dǎo)治療多 肽或治療多核苷酸表達(dá)。在其它實施方式中，甚至可在細(xì)胞重新引入對象前將配體給予細(xì) 胞，從而能在重新引入細(xì)胞之前表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸?？赏ㄟ^任何合適的方法，全 身性(例如，口服、靜脈內(nèi))或局部(例如，腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、直接注射入重新引入細(xì)胞 的組織或器官)給予配體?？蓛H采用常規(guī)技術(shù)測定各類細(xì)胞和疾病、病癥或病狀的最佳配 體給予時機。在不同的實施方式中，可利用非自體細(xì)胞，例如對象的同種異體或異種細(xì)胞，而非 對象的自體細(xì)胞實施離體治療方法。可將多核苷酸離體引入非自體細(xì)胞以產(chǎn)生修飾細(xì)胞， 然后將修飾細(xì)胞引入該對象。非自體細(xì)胞可以是移植后能存活的任何細(xì)胞，包括但不限于 干細(xì)胞(例如胚胎干細(xì)胞或造血干細(xì)胞)和成纖維細(xì)胞。本發(fā)明的體內(nèi)治療方法包括將多核苷酸直接體內(nèi)引入對象的細(xì)胞?？蓪⒍嗪塑账?全身性或局部(例如，疾病、病癥或病狀的部位)引入對象。一旦多核苷酸引入對象，可給 予配體以誘導(dǎo)治療多肽或治療多核苷酸的表達(dá)?？赏ㄟ^任何合適的方法，全身性(例如，口 服、靜脈內(nèi))或局部(例如，腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、直接注射入發(fā)生疾病、病癥或病狀的組織 或器官)給予配體?？蓛H采用常規(guī)技術(shù)測定各類細(xì)胞和疾病、病癥或病狀的最佳配體給予 時機。在一個實施方式中，可將配體連續(xù)或間歇給予對象，可視需要根據(jù)疾病、病癥或病 狀的狀態(tài)改變配體給予的模式。可通過配體給予的時間表和配體的給予量調(diào)整治療多肽或 治療多核苷酸的表達(dá)水平，從而能仔細(xì)控制治療性治療。還可聯(lián)用本發(fā)明治療方法與診斷技術(shù)以提高諸如藥物診斷學(xué)或治療診斷學(xué)領(lǐng)域已知各種方法的治療結(jié)果。例如，給予配體可與監(jiān)測疾病、病癥或病狀的狀態(tài)或進展向配 合。在一個實施方式中，本發(fā)明多核苷酸與設(shè)計用于診斷或監(jiān)測疾病、病癥或病狀的一種或 多種多核苷酸一起引入細(xì)胞。在另一實施方式中，診斷多核苷酸存在于包含本發(fā)明多核苷 酸的同一載體中。在該實施方式中，治療性治療和監(jiān)測療效的診斷檢驗在一個單位中一起 給予，從而確保接受治療的所有細(xì)胞也接受診斷檢驗。在一個實施方式中，診斷多核苷酸包 含操作性連接于報道基因的診斷開關(guān)啟動子(即，其活性在疾病、病癥或病狀期間受到調(diào) 節(jié)的啟動子)，而監(jiān)測疾病、病癥或病狀的狀態(tài)包括檢測報道基因的表達(dá)水平。在本發(fā)明的另一治療實施方式中，通過檢測報道基因的表達(dá)水平監(jiān)測治療多肽或 治療多核苷酸的表達(dá)水平，其中報道基因的表達(dá)水平與治療多肽或治療多核苷酸的表達(dá)水 平直接相關(guān)。例如，可通過生物中立報道分子，例如人2型生長激素抑制素受體非侵入性地 監(jiān)測各種組織中治療蛋白，例如白介素-12的表達(dá)水平，該受體可用放射性標(biāo)記的生長激 素抑制素類似物成像(參見，例如Zirm等，J.Nucl.Med41 :887_895 (2000))。報道基因可連 接于與治療多肽或多核苷酸相同的啟動子，或者可置于受治療多肽或多核苷酸調(diào)節(jié)的不同 啟動子控制下。本發(fā)明的其它實施方式涉及在對象中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法，包 括(a)將以下多核苷酸引入所述對象的細(xì)胞從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞(1)編碼基因開 關(guān)的多核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序 列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，其中所述啟動子在 所述疾病、病癥或病狀期間活化，和(2)與啟動子相連的編碼治療多肽或治療多核苷酸的 多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物活化；和(b)將配體給予所述對象以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。在一個實施方式中，可利用實驗室動物(例如，小鼠、大鼠、貓、狗、猴)或農(nóng)業(yè)動物 (例如，豬、綿羊、奶牛)實施在對象中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法。例如，可為研 究或大規(guī)模生產(chǎn)治療多肽或治療多核苷酸的目的在動物中實施表達(dá)治療產(chǎn)物的方法。本發(fā)明的進一步實施方式涉及在細(xì)胞中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法，包 括(a)將以下多核苷酸引入所述細(xì)胞從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞(1)編碼基因開關(guān)的多 核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中 所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，其中所述啟動子在所述疾 病、病癥或病狀期間活化，和(2)與啟動子相連的編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷 酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物活化；和(b)將配體給予所述修飾細(xì)胞以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。本發(fā)明的另一實施方式是在一個或多個修飾細(xì)胞中表達(dá)治療多肽或治療多核苷 酸的方法，包括(a)將以下多核苷酸引入細(xì)胞從而產(chǎn)生修飾細(xì)胞；(1)編碼基因開關(guān)的第一多核 苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所 述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，其中所述治療開關(guān)啟動子在疾 病、病癥或病狀相關(guān)條件下活化，和(2)與因子調(diào)節(jié)的啟動子操作性相連的編碼治療多肽或治療多核苷酸的第二多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物活化；和(b)將配體給予所述修飾細(xì)胞以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。在一個實施方式中，可在體外，例如在培養(yǎng)細(xì)胞中實施在細(xì)胞中表達(dá)治療多肽或 治療多核苷酸的方法。例如，可為研究或大規(guī)模生產(chǎn)治療多肽或治療多核苷酸的目的實施 治療產(chǎn)物的體外表達(dá)方法。在本文所述的任何實施方式中，多核苷酸或含有多核苷酸的載體可包含編碼致死 性多肽的序列，開啟該序列可表達(dá)殺傷含有該多核苷酸或載體的細(xì)胞的產(chǎn)物。致死性多肽 表達(dá)可用于從對象中消除修飾細(xì)胞，因為不再需要治療或者因為修飾細(xì)胞出了問題(例 如，過度增殖或毒性)。本文所用的致死性多肽是在表達(dá)時對于表達(dá)該多肽的細(xì)胞有致死 性的多肽，因為該多肽本身是致死性的或者該多肽產(chǎn)生致死性的化合物。本文所用的致死 性多肽包括以任何方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的多肽，包括但不限于壞死、凋亡和細(xì)胞毒性。致死 性多肽的例子包括但不限于凋亡誘導(dǎo)型腫瘤阻遏基因，例如但不限于p53、Rb和BRCA-1， 毒素，例如白喉毒素(DTA)、志賀菌神經(jīng)毒素、肉毒桿菌毒素、破傷風(fēng)毒素、霍亂毒素、CSE-V2 和蝎子蛋白毒素的其它變體等等，自殺基因，例如胞嘧啶脫氨酶和胸苷激酶，以及細(xì)胞毒素 基因，例如腫瘤壞死因子、干擾素_a。本發(fā)明不限于致死性多肽的身份，只要該多肽對表達(dá) 其的細(xì)胞有致死性即可。如果修飾細(xì)胞是短壽細(xì)胞，例如壽命有限的細(xì)胞(例如，約10天 或更短，如樹突細(xì)胞)，可能無需在多核苷酸或載體中包含致死性多肽，因為該細(xì)胞自然會 在短期內(nèi)除去。對于上述各方法，在一個實施方式中，連接于啟動子的編碼基因開關(guān)的多核苷酸 和編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸是較大多核苷酸，例如載體的一部分。在另一 實施方式中，與因子調(diào)節(jié)的啟動子相連的編碼治療基因開關(guān)的多核苷酸和編碼治療多肽或 多核苷酸的多核苷酸是不同的多核苷酸，二者可組合形成“核酸組合物”。在一方面，本發(fā)明涉及可用于本發(fā)明方法的多核苷酸。在一個實施方式中，該多核 苷酸編碼基因開關(guān)，所述基因開關(guān)包含至少一個操作性連接于治療開關(guān)啟動子的轉(zhuǎn)錄因子 序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，其中所述啟動子 的活性在所述疾病、病癥或病狀期間受到調(diào)節(jié)。在另一實施方式中，該多核苷酸還編碼與因 子調(diào)節(jié)的啟動子相連的治療多肽或治療多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù) 合物活化。在一個實施方式中，基因開關(guān)是基于EcR的基因開關(guān)。在另一實施方式中，基因 開關(guān)包含第一治療開關(guān)啟動子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二治療開關(guān)啟動子控制下 的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼的蛋白質(zhì) 相互作用從而形成起到配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。在一個實施方式 中，所述第一治療開關(guān)啟動子和第二治療開關(guān)啟動子是不同的。在另一實施方式中，所述第 一治療開關(guān)啟動子和第二治療開關(guān)啟動子是相同的。在另一實施方式中，所述第一轉(zhuǎn)錄因 子序列編碼包含異源二聚體伴侶和反式激活域的蛋白質(zhì)，所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。在進一步的實施方式中，操作性連接于誘導(dǎo)型 啟動子的所述多核苷酸還編碼致死性多肽。本發(fā)明的另一方面涉及包含上述任何多核苷酸的載體。在一個實施方式中，所述 載體是質(zhì)粒載體或病毒載體。在另一方面，本發(fā)明提供可與本發(fā)明方法聯(lián)用的試劑盒。本發(fā)明該方面的試劑盒可裝有一個或多個容器，其可包含一種或多種選自下組的組分一種或多種核酸分子、限制 性酶和一種或多種包含這種核酸分子的細(xì)胞。本發(fā)明試劑盒還可裝有一個或多個含有適合 支持培養(yǎng)本發(fā)明細(xì)胞的支持細(xì)胞的容器，一個或多個含有適于培養(yǎng)本發(fā)明細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng) 基的容器，一個或多個含有適合在本發(fā)明培養(yǎng)細(xì)胞中使用的抗生素的容器，一個或多個含 有緩沖液的容器，一個或多個含有轉(zhuǎn)染試劑的容器，一個或多個含有酶反應(yīng)底物和/或基 因開關(guān)活化的配體的容器。本發(fā)明試劑盒可裝有各種可用于本發(fā)明的核酸分子。本發(fā)明試劑盒中提供的核酸 分子的例子包括含有以下的那些核酸分子啟動子、編碼基因開關(guān)的序列、增強子、阻遏子、 選擇標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄信號、翻譯信號、引物雜交位點(例如，用于測序或PCR)、重組位點、限制性 位點和聚合接頭、在有阻遏tRNA存在下阻止翻譯終止的位點、阻遏tRNA編碼序列、編碼結(jié) 構(gòu)域和/或區(qū)域的序列，復(fù)制起點、端粒酶、著絲粒，等等。在一個實施方式中，試劑盒可裝 有包含基因開關(guān)而沒有任何治療開關(guān)啟動子的多核苷酸，該多核苷酸適于插入任何感興趣 的治療開關(guān)啟動子。除上述多核苷酸外，本發(fā)明核酸分子可包含這些元件中的任一種或多 種。本發(fā)明試劑盒可裝有包含一種或多種重組蛋白的容器。合適的重組蛋白包括但不 限于Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3 解離酶、①C31、TndX、XerC 和 XerD。 其它合適的重組位點和蛋白質(zhì)是可從加利福尼亞州卡爾斯巴德市英杰公司(Irwitrogen Corp.，Carlsbad, CA)購得的GATEWAY 克隆技術(shù)相關(guān)的那些，并描述于通過引用全文納入 本文的GATEWAY 克隆技術(shù)的產(chǎn)品文獻(xiàn)中(E版，2003年9月22日)。本發(fā)明的試劑盒還可提供引物。通常將這些引物設(shè)計成能與具有特異性核苷酸序 列的分子退火。例如，可將這些引物設(shè)計成用于PCR中以擴增特定核酸分子。試劑盒還可 提供測序引物。本發(fā)明試劑盒可提供一種或多種緩沖劑(例如，1、2、3、4、5、8、10、15種)。這些緩 沖劑可以工作濃度提供或以濃縮形式提供，隨后稀釋至工作濃度。這些緩沖劑常含有鹽、金 屬離子、輔因子、金屬離子螯合劑等以便增強緩沖劑本身或緩沖劑分子的活性或穩(wěn)定性。此 外，這些緩沖劑可以干燥或水性形式提供。當(dāng)緩沖劑以干燥形式提供時，通常先將它們通常 溶解于水中再使用。實際上，本發(fā)明試劑盒可含有上述或本文它處所述組分的任何組合。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)知道可依據(jù)試劑盒所需的應(yīng)用來改變本發(fā)明試劑盒提供的組分。因此，可將試劑盒 設(shè)計成能執(zhí)行本申請所述的各種功能，而這種試劑盒的組分也據(jù)此而變。
實施例以下實施例進一步說明了本發(fā)明，但不應(yīng)理解成以任何方式限制了本發(fā)明的范 圍。除非另有表述，本發(fā)明，包括以下實施例的實施將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細(xì)胞生 物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、微生物和重組DNA的常規(guī)技術(shù)。以下文獻(xiàn)完全 解釋了這些技術(shù)。參見，例如Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實 驗室手冊)(3-卷裝)，J. Sambrook, D. ff. Russell，冷泉港實驗室出版社(2001) ；Genes (基 因)VIII，B. Lewin，Prentice Hall (2003) ；PCR Primer (PCR 引物)，C. W. Dieffenbach 和 G. S. Dveksler，CSHL 出版社(2003) ；DNA Cloning (DNA 克隆)，D. N. Glover 編 第 I 和 II 卷(1985) ；Oligonucleotide Synthesis :Methods and Applications(Methods in Molecular Biology)(寡核苷酸合成方法和應(yīng)用(分子生物學(xué)方法))，P. Herdewijn(編)，休 5馬 W 出片反 ± (Humana Press)(2004) ；Culture ofAnimal Cells :A Manual of Basic Technique (動物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)手冊)，第 4 版，R. I. Freshney，Wiley-Liss (2000)； Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)，M. J. Gait (編)，(1984) ；Mullis 等，美國 專利號 4，683，195 ；NucleicAcid Hybridization (核酸雜交)，B. D. Hames 和 S. J. Higgins 編(1984) ；Nucleic Acid Hybridization (核酸雜交)，M. L. M. Anderson，Springer (1999)； Animal Cell Culture and Technology (動物細(xì)胞培養(yǎng)和技術(shù))，第 2 版，M. Butler，生物 科學(xué)出版社(BIOS Scientific Publishers) (2004) ；ImmobilizedCells and Enzymes :A Practical Approach (固定化細(xì)胞和酶實用方法)(Practical Approach Series(實用方 法叢書))，J. Woodward, IRL 出版社(1992) ；Transcription And Translation(轉(zhuǎn)錄和翻 譯)，B.D. Hames 和 S.J. Higgins(編)(1984) ； Culture OfAnimal Cells (動物細(xì)胞培養(yǎng))， R. I. Freshney, ARL 公司(Alan R. Liss, Inc. ), (1987) ；A Practical Guide To Molecular Cl0ning(分子克隆的實際指導(dǎo))，第3版，B. Perbal，約翰威利父子公司(John ffiley&Sons Inc. ) (1988) ；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移 載體)，了.11.]\^1161~和]\1卩丄&108編，冷泉港實驗室(1987) ；Methods In Enzymology (酶學(xué) 方法)，第 154 和 155 卷，Wu 等(編)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (細(xì)胞和分子生物學(xué)的免疫化學(xué)方法)，Mayer和Walker，(編)，學(xué)術(shù)出版社 (Academic Press),倫敦(1987)；禾口 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物學(xué)方法)，約翰威利父子出版社，巴爾的摩，馬里蘭州(1989)。實施例1本實施例描述了通過促進血管生成而能用于治療缺血性心臟疾病的基因治療載 體。胰島素樣生長因子1是可用于治療缺血性心臟病的激素(IGF-1，GenBank登錄號 NP_001104753. 1, SEQ ID NO :20)。IGF-1在臨床前模型中的應(yīng)用與心臟功能、抗凋亡、新 血管生成和心肌再生的改進有關(guān)(綜述見Santini，M. P.等，Novartis Found Symp (諾華 基金會論壇).274 :228-38(2006)；討論 239-43，272-6 ；及 Saetrum Opgaard, 0.和 Wang， P. H. Growth Horm IGFRes. 15 :89_94 (2005))。為該目的，給出了對缺血和/或炎癥起反應(yīng) 的誘導(dǎo)型IGF-1表達(dá)的實例。在缺血性組織中發(fā)生的缺氧的條件下，給予配體后表達(dá)IGF-1 的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)示于圖5。SEQ ID NO 20 MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVDALQFVCGD RGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKYQPPSTNKNT KSQRRKGSTFEERK圖5所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO :7。該構(gòu)建物的特征性元件 (salient element)的核苷酸坐標(biāo)(nucleotide coordinate)見表 4。表 4 根據(jù)圖1所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖5所示載體。在該系統(tǒng)下，利用內(nèi)部核糖體進 入位點(IRES)，通過操作性結(jié)合于單治療開關(guān)啟動子(TSP-1)表達(dá)配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù) 合物(LDTFC)的CAP亞基和LTF亞基。用于該系統(tǒng)中的啟動子是UV-同形(UV-conformed) 的合成缺氧-誘導(dǎo)型啟動子。治療產(chǎn)物IGF-1的編碼區(qū)操作性結(jié)合于有配體存在下，接觸LDTFC后活化的因 子-調(diào)節(jié)啟動子(FRP)。將圖5所示構(gòu)建物插入合適的載體系統(tǒng)，例如病毒載體以便向需要治療缺血性心 臟病的對象作遞送?？蓪⑤d體全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注，或者可直接遞送至心臟組織， 例如通過血管成形術(shù)。全身性和/或局部給予基因治療載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。遞送 后，細(xì)胞，例如心臟細(xì)胞攝入載體，轉(zhuǎn)錄因子可在合適的生理條件下表達(dá)。載體編碼的LTF 將在，例如心肌缺血相關(guān)的缺氧條件下表達(dá)。將配體給予待治療的對象，與表達(dá)的LDTFC組 合從而在因子調(diào)節(jié)的啟動子控制下驅(qū)動IGF-1表達(dá)。IGF-1表達(dá)進而促進缺血組織中的靶
81向血管生成。實施例2本實施例描述了通過促進血管生成和心臟保護作用而可用于治療缺血性心血管 疾病的生物反應(yīng)器/細(xì)胞治療載體。給予配體后，圖6所示的載體在缺血組織中發(fā)生的缺 氧條件下表達(dá)人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF，GenBank登錄號NP_001997，SEQ ID NO: 21)。SEQ ID NO 21 MVGVGG⑶VEDVTPRPGGCQISGRGARGCNGIPGAAAWEAALPRRRPRRHPSVNPRSRAAGSPRTRGRR TEERPSGSRL⑶RGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTAAPRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALP EDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGR LLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS圖6所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO :8。該構(gòu)建物的特征性元件的 核苷酸坐標(biāo)見表5。表 5 根據(jù)圖2所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖6所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合于 第一組成型治療開關(guān)啟動子TSP-1表達(dá)LDTFC的CAP亞基，通過操作性結(jié)合于第二誘導(dǎo)型 治療開關(guān)啟動子(TSP-2)表達(dá)LDTFC的LTF亞基。用于該構(gòu)建物中的啟動子是缺氧-誘導(dǎo) 型控制啟動子-1。治療產(chǎn)物bFGF的編碼區(qū)操作性結(jié)合于有配體存在下，接觸LDTFC后活化的FRP?？稍谶m于引入細(xì)胞的載體中制備圖6所示構(gòu)建物，再引入待治療的對象。細(xì)胞可 以是取自待治療對象的自體細(xì)胞或非自體的同種異體或異種細(xì)胞，可以是原代細(xì)胞或培養(yǎng) 維持的細(xì)胞系?？赏ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔將載體引入細(xì)胞， 從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。引入載體后，可任選處理修飾細(xì)胞以產(chǎn)生屏障系統(tǒng)，例如可將細(xì)胞包 被或包裹化從而提供免疫分離作用。然后可將修飾細(xì)胞配制成生物反應(yīng)器以便給予需要治 療缺血性心臟病的對象?？蓪⑤d體全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注，或者可直接遞送至心臟組織， 例如通過血管成形術(shù)。全身性和/或局部給予細(xì)胞治療的方法是本領(lǐng)域熟知的。遞送后，細(xì) 胞，例如心臟細(xì)胞攝入載體，載體編碼的LTF將在，例如心肌缺血相關(guān)的缺氧條件下表達(dá)。 將配體給予待治療的對象，與表達(dá)的LDTFC組合從而在FRP控制下驅(qū)動bFGF表達(dá)。bFGF表 達(dá)進而促進缺血組織中的靶向血管生成和/或心臟保護作用。實施例3本實施例描述了通過促進心臟保護作用而可用于治療缺血性心血管疾病的生物 反應(yīng)器/細(xì)胞治療載體。給予配體后，圖7所示的載體在缺血組織中發(fā)生的缺氧條件下表 達(dá)促紅細(xì)胞生成素(EPO，GenBank登錄號CAA26095. 1，SEQ ID NO :22)。促紅細(xì)胞生成素 顯示對缺血起反應(yīng)而起到心臟保護和抗重塑的作用。SEQ ID NO 22 MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLQRYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVP DTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAI SPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTCDR圖7所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO :9。該構(gòu)建物的特征性元件的 核苷酸坐標(biāo)見表6。表 6 根據(jù)圖2所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖7所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合于 第一組成型治療開關(guān)啟動子(TSP-1)表達(dá)LDTFC的CAP亞基，通過操作性結(jié)合于第二誘導(dǎo) 型治療開關(guān)啟動子(TSP-2)表達(dá)LDTFC的LTF亞基。用于該載體中的啟動子是缺氧-誘導(dǎo) 型控制啟動子-1。治療產(chǎn)物EP0的編碼區(qū)操作性結(jié)合于有配體存在下，接觸LDTFC后活化的FRP?？稍谶m于引入細(xì)胞的載體中制備圖7所示構(gòu)建物，再引入待治療的對象。細(xì)胞可 以是取自待治療對象的自體細(xì)胞或非自體的同種異體或異種細(xì)胞，可以是原代細(xì)胞或培養(yǎng) 維持的細(xì)胞系。可通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔將載體引入細(xì)胞，從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。引入載體后，可任選處理修飾細(xì)胞以產(chǎn)生屏障系統(tǒng)，例如可將細(xì)胞包 被或包裹化從而提供免疫分離作用。然后可將修飾細(xì)胞配制成生物反應(yīng)器以便給予需要治 療缺血性心臟病的對象?？蓪⑤d體全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注，或者可直接遞送至心臟組織， 例如通過血管成形術(shù)。全身性和/或局部給予細(xì)胞治療的方法是本領(lǐng)域熟知的。遞送后，細(xì) 胞，例如心臟細(xì)胞攝入載體，載體編碼的LTF將在，例如心肌缺血相關(guān)的缺氧條件下表達(dá)。 將配體給予待治療的對象，與表達(dá)的LDTFC組合從而在FRP控制下驅(qū)動EP0表達(dá)。EP0表達(dá) 進而促進缺血組織中的心臟保護作用。實施例4本實施例描述了通過促進血管生成和血液動力學(xué)而可用于治療缺血性心血管疾 病的生物反應(yīng)器/細(xì)胞治療載體。給予配體后，圖8所示載體在缺血組織中發(fā)生的缺氧條件 下表達(dá)人腦鈉素(BNP, GenBank登錄號:NP 002512，SEQID NO 23)。BNP以及其它利鈉肽， 例如松弛素、ANF、CNP和腎上腺調(diào)控蛋白(adrenomodulin)顯示在心臟中起到心臟保護、血 管舒張和抗重塑作用。為該目的，給出了對缺血起反應(yīng)的BNP誘導(dǎo)型表達(dá)的實例。SEQ ID NO 23 MDPQTAPSRALLLLLFLHLAFLGGRSHPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQE SPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPRSPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH圖8所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO: 10。該構(gòu)建物的特征性元件 的核苷酸坐標(biāo)見表7。表 7 根據(jù)圖2所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖8所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合于 第一組成型治療開關(guān)啟動子(TSP-1)表達(dá)LDTFC的CAP亞基，通過操作性結(jié)合于第二誘導(dǎo) 型治療開關(guān)啟動子(TSP-2)表達(dá)LDTFC的LTF亞基。用于該載體中的誘導(dǎo)型啟動子是缺 氧-誘導(dǎo)型控制啟動子-1。治療產(chǎn)物BNP的編碼區(qū)操作性結(jié)合于有配體存在下，接觸LDTFC后活化的FRP?？稍谶m于引入細(xì)胞的載體中制備圖8所示構(gòu)建物，再引入待治療的對象。細(xì)胞可 以是取自待治療對象的自體細(xì)胞或非自體的同種異體或異種細(xì)胞，可以是原代細(xì)胞或培養(yǎng) 維持的細(xì)胞系?？赏ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔將載體引入細(xì)胞， 從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。引入載體后，可任選處理修飾細(xì)胞以產(chǎn)生屏障系統(tǒng)，例如可將細(xì)胞包 被或包裹化從而提供免疫分離作用。然后可將修飾細(xì)胞配制成生物反應(yīng)器以便給予需要治 療缺血性心臟病的對象。可將載體全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注，或者可直接遞送至心臟組織， 例如通過血管成形術(shù)。全身性和/或局部給予細(xì)胞治療的方法是本領(lǐng)域熟知的。遞送后，細(xì) 胞，例如心臟細(xì)胞攝入載體，載體編碼的LTF將在，例如心肌缺血相關(guān)的缺氧條件下表達(dá)。 將配體給予待治療的對象，與表達(dá)的LDTFC組合從而在FRP控制下驅(qū)動BNP表達(dá)。BNP表達(dá) 進而促進缺血組織中的靶向心臟保護作用、舒張和抗重塑。實施例5本實施例描述了通過分解心臟中的纖維蛋白沉積而可用于治療缺血性心血管疾 病的生物反應(yīng)器/細(xì)胞治療載體。給予配體后，圖9所示載體在缺血組織中發(fā)生的炎性條 件下表達(dá)人組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA，GenBank登錄號AA034406，SEQ ID NO :24)。 組織纖維蛋白溶酶原激活劑是催化纖維蛋白溶酶原成為降解纖維蛋白的活化纖溶酶的絲 氨酸蛋白酶。利用重組tPA顯示可作為有效的溶解血栓劑以便在諸如肺部栓塞、心肌梗塞 和中風(fēng)等疾病中分解纖維蛋白凝塊。除了形成凝塊，過量的纖維蛋白沉積在心臟和血管中 還與胰島素耐受性糖尿病、動脈粥樣硬化和對炎癥起反應(yīng)的心肌梗塞相關(guān)。為該目的，給出 了對缺血起反應(yīng)的tPA誘導(dǎo)型表達(dá)的實例。SEQ ID NO 24 MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRRGARSYQVICRDEKTQMIYQQHQSWLRPVLRSNRVEYC WCNSGRAQCHSVPVKSCSEPRCFNGGTCQQALYFSDFVCQCPEGFAGKCCEIDTRATCYEDQGISYRGTWSTAESGA ECTNWNSSALAQKPYSGRRPDAIRLGLGNHNYCRNPDRDSKPWCYVFKAGKYSSEFCSTPACSEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGNVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPD⑶AKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCG LRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYR VVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEA LSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTD匪LCA⑶TRSGGPQANLHDACQ⑶SGGPLVCLNDGRMTLVGII SWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP圖9所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID N0:11。該構(gòu)建物的特征性元件 的核苷酸坐標(biāo)見表8。表9 根據(jù)圖2所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖9所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合于第一組成型治療開關(guān)啟動子(TSP-1)表達(dá)LDTFC的CAP亞基，通過操作性結(jié)合于第二誘導(dǎo) 型治療開關(guān)啟動子(TSP-2)表達(dá)LDTFC的LTF亞基。用于該載體中的誘導(dǎo)型治療開關(guān)啟動 子是人叢蛋白D1啟動子。治療產(chǎn)物tPA的編碼區(qū)操作性結(jié)合于有配體存在下，接觸LDTFC后活化的FRP?？稍谶m于引入細(xì)胞的載體中制備圖9所示構(gòu)建物，再引入待治療的對象。細(xì)胞可 以是取自待治療對象的自體細(xì)胞或非自體的同種異體或異種細(xì)胞，可以是原代細(xì)胞或培養(yǎng) 維持的細(xì)胞系?？赏ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔將載體引入細(xì)胞， 從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。引入載體后，可任選處理修飾細(xì)胞以產(chǎn)生屏障系統(tǒng)，例如可將細(xì)胞包 被或包裹化從而提供免疫分離作用。然后可將修飾細(xì)胞配制成生物反應(yīng)器以便給予需要治 療缺血性心臟病的對象?？蓪⑤d體全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注，或者可直接遞送至心臟組織， 例如通過血管成形術(shù)。全身性和/或局部給予細(xì)胞治療的方法是本領(lǐng)域熟知的。遞送后，細(xì) 胞，例如心臟細(xì)胞攝入載體，載體編碼的LTF將在，例如心肌缺血相關(guān)的炎性反應(yīng)事件中表 達(dá)。將配體給予待治療的對象，與表達(dá)的LDTFC組合從而在FRP控制下驅(qū)動tPA表達(dá)。tPA 表達(dá)進而促進缺血組織中纖維蛋白沉積的靶向分解。實施例6本實施例描述了通過促進心臟保護作用、血管生成和血液動力學(xué)而可用于治療缺 血性心血管疾病的生物反應(yīng)器/細(xì)胞治療載體。給予配體后，圖10所示載體分別在缺血 組織中發(fā)生的炎性條件和/或缺氧條件下表達(dá)兩種治療多肽，人松弛素(GenBank登錄號 NP_604390. 1，SEQ ID NO 25)和人肝細(xì)胞生長因子(HGF，GenBank 登錄號NP_000592. 3， SEQ ID NO :26)。松弛素是涉及氧化氮作用機理的全身和冠狀循環(huán)的強效舒張劑，其影響心 臟搏動率。HGF在心肌梗塞中提供促血管生成作用、抗_凋亡作用、抗-纖維變性作用，并且 是I型膠原再生因子。為該目的，給出了對缺血起反應(yīng)的松弛素和HGF的各自受控誘導(dǎo)型 表達(dá)的實例。SEQ ID NO 25 MPRLFFFHLLGVCLLLNQFSRAVADSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRSLSQEDAPQTPRPV AEIVPSFINKDTETINMMSEFVANLPQELKLTLSEMQPALPQLQQHVPVLKDSSLLFEEFKKLIRNRQSEAADSSPS ELKYLGLDTHSRKKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQ ID NO 26 MWVTKLLPALLLQHVLLHLLLLPIAIPYAEGQRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQ CANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSG IKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLM DHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPL ETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYC SQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYT GNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLT ARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPE KTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMR MVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS
圖10所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO :13。該構(gòu)建物的特征性元件 的核苷酸坐標(biāo)見表9。表9 根據(jù)圖3所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖10所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合于 第一組成型治療開關(guān)啟動子(TSP-1)表達(dá)LDTFC的CAP亞基，通過操作性結(jié)合于第二誘導(dǎo) 型治療開關(guān)啟動子(TSP-2)表達(dá)第一 LTF(LTF-l)亞基，通過操作性結(jié)合于第三誘導(dǎo)型治療 開關(guān)啟動子(TSP-3)表達(dá)第二 LTF(LTF-2)亞基。該載體中的TSP-2是人叢蛋白D1啟動子， 該載體中的TSP-3是缺氧誘導(dǎo)型控制啟動子。第一治療產(chǎn)物松弛素的編碼區(qū)操作性結(jié)合于具有反應(yīng)元件的第一 FRP(FRP-l)， 該反應(yīng)元件識別LTF-1的第一 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域DBD-A，第二治療產(chǎn)物HGF的編碼區(qū)操作性 結(jié)合于具有反應(yīng)元件的第二 FRP (FRP-2)，該反應(yīng)元件識別LTF-2的第二 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (DBD-B)。有配體存在下，接觸各自的LDTFC后，兩種FRP激活?？稍谶m于引入細(xì)胞的載體中制備圖10所示構(gòu)建物，再引入待治療的對象。細(xì)胞可 以是取自待治療對象的自體細(xì)胞或非自體的同種異體或異種細(xì)胞，可以是原代細(xì)胞或培養(yǎng) 維持的細(xì)胞系?？赏ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔將載體引入細(xì)胞， 從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。引入載體后，可任選處理修飾細(xì)胞以產(chǎn)生屏障系統(tǒng)，例如可將細(xì)胞包 被或包裹化從而提供免疫分離作用。然后可將修飾細(xì)胞配制成生物反應(yīng)器以便給予需要治 療缺血性心臟病的對象?？蓪⑤d體全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注，或者可直接遞送至心臟組織， 例如通過血管成形術(shù)。全身性和/或局部給予細(xì)胞治療的方法是本領(lǐng)域熟知的。遞送后， 細(xì)胞，例如心臟細(xì)胞攝入載體，LTF-1和/或LTF-2將在，例如心肌缺血相關(guān)的炎性反應(yīng)和/ 或缺氧事件中表達(dá)。將一種或多種配體給予待治療的對象，與表達(dá)的LDTFC組合從而在FRP 控制下驅(qū)動松弛素和/或HGF表達(dá)。實施例7本實施例描述了通過促進心臟修復(fù)和保護作用而可用于治療缺血性心血管疾病 的生物反應(yīng)器/細(xì)胞治療載體。給予配體后，圖11所示載體在缺血組織中發(fā)生的缺氧條件 下表達(dá)人EP0 (參見實施例3)。EP0顯示對缺血起反應(yīng)而在心臟保護和抗重塑中起作用。在 本實施例中，EP0表達(dá)專門局限于心臟組織。根據(jù)圖2所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖11所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合于 心臟組織的特異性啟動子(Nxcl心肌細(xì)胞-特異性啟動子)表達(dá)CAP亞基，通過操作性結(jié) 合于缺氧_誘導(dǎo)型控制啟動子-1表達(dá)LTF亞基。治療產(chǎn)物EP0的編碼區(qū)操作性結(jié)合于有配體存在下，接觸LDTFC后活化的FRP。圖11所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO :12。該構(gòu)建物的特征性元件 的核苷酸坐標(biāo)見表10。表 10
將圖11所示構(gòu)建物插入合適載體系統(tǒng)，例如病毒載體以便遞送給需要治療缺血 性心臟病的對象?？蓪⑤d體全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注，或者可直接遞送至心臟組織， 例如通過血管成形術(shù)。全身性和/或局部給予基因治療載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。遞送 后，細(xì)胞，例如心臟細(xì)胞攝入載體，LDTFC可在合適的生理條件下表達(dá)。載體編碼的LDTFC 將在，例如心肌缺血相關(guān)的缺氧條件下，在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)。將配體給予待治療的對 象，與表達(dá)的LDTFC組合從而在FRP控制下驅(qū)動EP0表達(dá)。EP0表達(dá)進而促進缺血組織中的 靶向心臟保護。實施例8本實施例描述了通過促進心臟修復(fù)和血管生成而可用于治療缺血性心臟疾病的
基因治療載體。給予配體后，圖12所示載體在缺血組織中發(fā)生的缺氧條件下，在炎性反應(yīng)中表達(dá)人IGF-1 (參見實施例1)。為該目的，給出了對缺氧起反應(yīng)和/或在炎性反應(yīng)中的誘 導(dǎo)型IGF-1表達(dá)的實例。在本實施例中，IGF-1的誘導(dǎo)型表達(dá)專門局限于心肌細(xì)胞。根據(jù)圖4所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖12所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合于 心臟組織的特異性啟動子(Nxcl心肌細(xì)胞-特異性啟動子)表達(dá)CAP亞基，通過兩個誘導(dǎo) 型TSP之一表達(dá)LDTFC的LTF亞基(LTF-1和LTF-2)，其中第一個操作性結(jié)合于缺氧-誘導(dǎo) 型控制啟動子-1，而第二個操作性結(jié)合于人叢蛋白D1啟動子。治療產(chǎn)物IGF-1的編碼區(qū)操作性結(jié)合于有配體存在下，接觸LDTFC后活化的FRP。圖12所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO :14。該構(gòu)建物的特征性元件 的核苷酸坐標(biāo)見表11。表11 將圖12所示構(gòu)建物插入合適載體系統(tǒng)，例如病毒載體以便遞送給需要治療缺血 性心臟病的對象?？蓪⑤d體全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注，或者可直接遞送至心臟組織， 例如通過血管成形術(shù)。全身性和/或局部給予基因治療載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。遞送 后，細(xì)胞，例如心臟細(xì)胞攝入載體，LDTFC可在合適的生理條件下表達(dá)。載體編碼的LDTFC 將在缺氧條件下，和/或在，例如心肌缺血相關(guān)的炎性反應(yīng)事件中，在心肌細(xì)胞中特異性表 達(dá)。將配體給予待治療的對象，與表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子組合從而在FRP控制下驅(qū)動IGF-1表達(dá)。 IGF-1表達(dá)進而促進缺血組織中的靶向血管生成。實施例9本實施例描述了可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、活動性強直性脊柱炎或斑塊狀銀屑 病或用于抑制活動性關(guān)節(jié)炎所致結(jié)構(gòu)破壞(“RA或相關(guān)疾病”)的基因治療載體。RA及相 關(guān)疾病的常規(guī)治療包括傳統(tǒng)的疾病改進性抗-風(fēng)濕病藥物(DMARD)以及生物DMARD，例如依 那西普、英夫利昔單抗和阿達(dá)木單抗。例如，安進公司生產(chǎn)的依那西普(Enbrel )是融合蛋 白，其含有的人TNF-a受體2的兩個胞外結(jié)構(gòu)域通過絞鏈肽與Fc部分相融合。參見美國 專利號7，276，477 (通過引用全文納入本文)。依那西普皮下一周給予一次或兩次。因此， 由于沒有TNF激活存在下依那西普的任何產(chǎn)生受限制，利用炎性或細(xì)胞因子反應(yīng)元件的依 那西普基因開關(guān)系統(tǒng)可用于增加便利性和安全性。圖13所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO :16。該構(gòu)建物的特征性元件 的核苷酸坐標(biāo)見表12。表 12 根據(jù)圖1所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖13所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合于 單TSP-1，利用內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)表達(dá)LDTFC的CAP亞基和LTF亞基。該系統(tǒng)所用 的啟動子是有TNF-a激活的血管細(xì)胞粘附分子(VCAM1)啟動子。可用于本發(fā)明的TNF-a 調(diào)節(jié)啟動子的另一例子是對TNF-a或白介素(IL)-10起反應(yīng)的人正五聚蛋白3(PTX3)啟 動子。參見 Basile 等，J.Biol.Chem.272(13) :8172(1997)。治療產(chǎn)物依那西普的編碼區(qū)操作性結(jié)合于有配體存在下，接觸LDTFC后活化的 FRP?？稍谶m于引入細(xì)胞的載體中制備圖13所示構(gòu)建物，再引入待治療的對象。細(xì)胞可 以是取自待治療對象的自體細(xì)胞或非自體的同種異體或異種細(xì)胞，可以是原代細(xì)胞或培養(yǎng) 維持的細(xì)胞系?？赏ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔將載體引入細(xì)胞， 從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。引入載體后，可任選處理修飾細(xì)胞以產(chǎn)生屏障系統(tǒng)，例如可將細(xì)胞包 被或包裹化從而提供免疫分離作用。然后可將修飾細(xì)胞配制成生物反應(yīng)器以便給予需要治 療RA的對象。
可將細(xì)胞全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注，或者可直接遞送至關(guān)節(jié)。全身 性和/或局部給予基因治療細(xì)胞是本領(lǐng)域熟知的。細(xì)胞遞送后，LDTFC可在合適的生理條 件下表達(dá)。載體編碼的LDTFC將在，例如RA相關(guān)的TNF-a存在下表達(dá)。將配體給予待治 療的對象，與表達(dá)的LDTFC組合從而在TNF-a調(diào)節(jié)啟動子控制下驅(qū)動依那西普表達(dá)。依那 西普表達(dá)進而捕捉TNF-a并降低組織中的TNF-a濃度。實施例10本實施例描述了通過降低TNF-a水平而可用于治療RA和相關(guān)疾病的生物反應(yīng)器 /細(xì)胞治療載體。給予配體后，圖14所示載體在RA或相關(guān)疾病中均發(fā)生的TNF-a和/或 嚴(yán)重炎癥存在下表達(dá)依那西普。為該目的，給出了對TNF-a起反應(yīng)和/或在炎性反應(yīng)中的 誘導(dǎo)型依那西普表達(dá)的實例。根據(jù)圖4所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖14所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合 于組成型啟動子(TSP-1)表達(dá)CAP亞基，通過兩個誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄盒之一表達(dá)LDTFC的LTF亞 基，通過操作性結(jié)合于人纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑2-型(PAI2)啟動子(TSP-2)表達(dá) 第一(LTF-1)，通過操作性結(jié)合于人血清淀粉樣蛋白Al(SAAl)啟動子(TSP-3)表達(dá)第二 (LTF-2)。人 PAI2 啟動子在有 TNF-a 存在下激活。參見Mahony 等，Eur. J. Biochem. 263(3) (1999)和Matsuo等，Biochem. J. 405 =605(2007) SAA1啟動子不由致炎細(xì)胞因子，例如 TNF-a，而由其它急性炎性信號，例如糖皮質(zhì)激素直接上調(diào)。參見Kumon等，Scandinavian J. Immunol. 56 504(2002)。治療產(chǎn)物依那西普的編碼區(qū)操作性結(jié)合于有配體存在下，接觸LDTFC后活化的 FRP。圖14所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO :15。該構(gòu)建物的特征性元件 的核苷酸坐標(biāo)見表13。表 13 可在適于引入細(xì)胞的載體中制備圖14所示構(gòu)建物，再引入待治療的對象。細(xì)胞可 以是取自待治療對象的自體細(xì)胞或非自體的同種異體或異種細(xì)胞，可以是原代細(xì)胞或培養(yǎng) 維持的細(xì)胞系?？赏ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔將載體引入細(xì)胞， 從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。引入載體后，可任選處理修飾細(xì)胞以產(chǎn)生屏障系統(tǒng)，例如可將細(xì)胞包 被或包裹化從而提供免疫分離作用。然后可將修飾細(xì)胞配制成生物反應(yīng)器以便給予需要治 療RA的對象?？蓪⒓?xì)胞全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注，或者可直接遞送至關(guān)節(jié)。全身 性和/或局部給予基因治療細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的。細(xì)胞遞送后，LDTFC可在合適的 生理條件下表達(dá)。載體編碼的LDTFC將在TNF- a和/或嚴(yán)重炎癥存在下專門在給予的細(xì) 胞中表達(dá)。將配體給予待治療的對象，與表達(dá)的LDTFC組合從而在FRP控制下驅(qū)動依那西 普表達(dá)。依那西普表達(dá)進而捕捉TNF-a并降低組織中的TNF-a濃度。實施例11本實施例描述了可用于治療RA的生物反應(yīng)器/細(xì)胞治療載體。給予配體后， 載體在RA患者中均發(fā)生的TNF- a和/或炎性條件存在下表達(dá)兩種治療多肽，依那西普 和人促紅細(xì)胞生成素(EPO)。EP0在貧血RA患者中誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成。參見Mercuriali ^ ■ Transfusion 34(6) :501(2003)。為該目的，給出了對RA和貧血起反應(yīng)的依那西普和EP0的分別受控誘導(dǎo)型表達(dá)的實例。圖15所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO :17。該構(gòu)建物的特征性元件 的核苷酸坐標(biāo)見表14。表14 根據(jù)圖3所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖15所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合于 第一組成型TSP-1表達(dá)LDTFC的CAP亞基，通過操作性結(jié)合于第二誘導(dǎo)型TSP-2表達(dá)LDTFC 的第一 LTF亞基(LTF-1)，通過操作性結(jié)合于第三誘導(dǎo)型TSP-3表達(dá)LDTFC的第二 LTF亞基 (LTF-2)。該載體中所用的第二誘導(dǎo)型TSP-2是人血清淀粉樣蛋白Al(SAAl)啟動子，該載 體中所用的第三誘導(dǎo)型TSP-3是缺氧-誘導(dǎo)型控制啟動子1。第一治療產(chǎn)物依那西普的編碼區(qū)操作性結(jié)合于具有反應(yīng)元件的第一 FRP-1，該反 應(yīng)元件識別LTF-1結(jié)合的第一 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD-A)，第二治療產(chǎn)物EP0的編碼區(qū)操作 性結(jié)合于具有反應(yīng)元件的第二 FRP-2，該反應(yīng)元件識別LTF-2結(jié)合的第二 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (DBD-B)。有配體存在下，接觸各自的LDTFC后，兩種因子-調(diào)節(jié)的啟動子均激活。可在適于引入細(xì)胞的載體中制備圖15所示構(gòu)建物，再引入待治療的對象。細(xì)胞可 以是取自待治療對象的自體細(xì)胞或非自體的同種異體或異種細(xì)胞，可以是原代細(xì)胞或培養(yǎng) 維持的細(xì)胞系?？赏ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔將載體引入細(xì)胞， 從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。引入載體后，可任選處理修飾細(xì)胞以產(chǎn)生屏障系統(tǒng)，例如可將細(xì)胞包 被或包裹化從而提供免疫分離作用。然后可將修飾細(xì)胞配制成生物反應(yīng)器以便給予需要治 療RA的對象。 可將細(xì)胞全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注，或者可直接遞送至關(guān)節(jié)。全身 性和/或局部給予基因治療細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的。細(xì)胞遞送后，LDTFC可在合適的 條件下表達(dá)。將一種或多種配體給予待治療的對象，與表達(dá)的LDTFC組合從而在FRP-1或 FRP-2控制下驅(qū)動依那西普和/或EP0表達(dá)。依那西普表達(dá)進而捕捉TNF-a并降低組織中 的TNF- a濃度，EP0表達(dá)誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成和改進貧血。實施例12本實施例描述了可用于治療血友病的生物反應(yīng)器/細(xì)胞治療載體。血友病是缺乏 因子VIII或因子IX所致。因子VIII缺陷型成為A型血友病，因子IX缺陷型成為B型血友 病?？煞謩e給予重組產(chǎn)生的因子VIII或IX來治療A或B型血友病。參見Garcia-Martin 等，J. Gene Med. 4(2) :215(2002)。例如，可用于本發(fā)明的重組產(chǎn)生的因子VIII包括但 不限于全長因子VIII，例如REC0MB1NATE (由巴克斯特公司(Baxter)投入市場)、 BIOCLATE (由阿方蒂斯公司(Aventis)投入市場)、KOGENATE (由拜耳公司(Bayer) 投入市場)、HELIXATE (由阿方蒂斯公司投入市場)或ADVATE (由巴克斯特公司 投入市場)，B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII，例如REFACTO 和XYNTHA (由遺傳學(xué)研究所 (Genetics Institute)和惠氏公司(ffyeth)投入市場)，或因子VIII和血管假性血友病因 子復(fù)合物，例如ALPHANATE (由格利弗生物公司公司(GrifolsBiologicals，Inc.)投入 市場)。為該目的，圖16顯示了對給予配體起反應(yīng)的誘導(dǎo)型ALPHANATE 表達(dá)以供生物 反應(yīng)器/細(xì)胞治療的例子。利用生物反應(yīng)器/細(xì)胞治療改善了穩(wěn)定性和連續(xù)輸注的問題。
98參見 Pipe S. ff.，J. Thromb. Haemost. 3 (8) 1692 (2005)。圖16所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO :18。該構(gòu)建物的特征性元件 的核苷酸坐標(biāo)見表15。表 15 根據(jù)圖2所示基因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖16所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合于 第一組成型啟動子(TSP-1)表達(dá)CAP亞基，通過操作性結(jié)合于第二組成型啟動子(TSP-2) 表達(dá)LDTFC的LTF亞基。用作第一組成型啟動子的啟動子是UbC(短)啟動子，用作第二組 成型啟動子的啟動子是UbB (短)啟動子。治療產(chǎn)物，ALPHANATE 的編碼區(qū)操作性結(jié)合于有配體存在下，接觸LDTFC后活 化的FRP?？稍谶m于引入細(xì)胞的載體中制備圖16所示構(gòu)建物，再引入待治療的對象。細(xì)胞可
以是取自待治療對象的自體細(xì)胞或非自體的同種異體或異種細(xì)胞，可以是原代細(xì)胞或培養(yǎng)維持的細(xì)胞系?？赏ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔將載體引入細(xì)胞， 從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。引入載體后，可任選處理修飾細(xì)胞以產(chǎn)生屏障系統(tǒng)，例如可將細(xì)胞包 被或包裹化從而提供免疫分離作用。然后可將修飾細(xì)胞配制成生物反應(yīng)器以便給予需要治 療血友病的對象。可將細(xì)胞全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注。全身性和/或局部給予基 因治療細(xì)胞是本領(lǐng)域熟知的。細(xì)胞遞送后，LDTFC可組成型表達(dá)。將配體給予待治療的 對象，與表達(dá)的LDTFC組合從而在因子調(diào)節(jié)的啟動子控制下驅(qū)動ALPHANATE 表達(dá)。 ALPHANATE 表達(dá)進而治療血友病癥狀。實施例13本實施例描述了用于治療血友病的生物反應(yīng)器/細(xì)胞治療載體。根據(jù)圖1所示基 因開關(guān)系統(tǒng)構(gòu)建圖17所示載體。在該系統(tǒng)下，通過操作性結(jié)合單組成型啟動子(TSP-1)， 利用內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)表達(dá)LDTFC的CAP亞基和LTF亞基。該組成型啟動子是 UbC(短)啟動子。治療產(chǎn)物，ALPHANATE 的編碼區(qū)操作性結(jié)合于有配體存在下，接觸LDTFC后活 化的FRP。圖17所示構(gòu)建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO :19。該構(gòu)建物的特征性元件 的核苷酸坐標(biāo)見表16。表16 (MOD 8361) 可在適于引入細(xì)胞的載體中制備圖17所示構(gòu)建物，再引入待治療的對象。細(xì)胞可 以是取自待治療對象的自體細(xì)胞或非自體的同種異體或異種細(xì)胞，可以是原代細(xì)胞或培養(yǎng) 維持的細(xì)胞系?？赏ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔將載體引入細(xì)胞， 從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞。引入載體后，可任選處理修飾細(xì)胞以產(chǎn)生屏障系統(tǒng)，例如可將細(xì)胞包 被或包裹化從而提供免疫分離作用。然后可將修飾細(xì)胞配制成生物反應(yīng)器以便給予需要治 療血友病的對象?？蓪⒓?xì)胞全身性遞送給對象，例如通過靜脈內(nèi)輸注。全身性和/或局部給予基 因治療細(xì)胞是本領(lǐng)域熟知的。細(xì)胞遞送后，LDTFC可組成型表達(dá)。將配體給予待治療的 對象，與表達(dá)的LDTFC組合從而在因子調(diào)節(jié)的啟動子控制下驅(qū)動ALPHANATE 表達(dá)。 ALPHANATE 表達(dá)進而治療血友病癥狀。本發(fā)明的其它實施方式包括以下E1. 一種治療、緩解或預(yù)防對象中疾病或病癥的方法，包括(a)將以下多核苷酸引入所述對象的細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的細(xì)胞(1)編碼基因開關(guān) 的多核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列， 其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，其中所述啟動子在所述疾病或 病癥期間活化，和(2)與某啟動子相連的編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸，該啟 動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化；和(b)將配體給予所述對象以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)；其中所述治療多肽或治療多核苷酸以足以治療、緩解或預(yù)防所述疾病或病癥的水 平表達(dá)。E2. 一種在對象中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法，包括(a)將以下多核苷酸引入所述對象的細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的細(xì)胞(1)編碼基因開關(guān) 的多核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列， 其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，其中所述啟動子在所述疾病或 病癥期間活化，和(2)與某啟動子操作性相連的編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷 酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化；和(b)將配體給予所述對象以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。E3.如E1或E2所述的方法，其中，所述多核苷酸引入從所述對象分離的細(xì)胞以產(chǎn) 生修飾細(xì)胞，并將所述修飾的細(xì)胞重新引入所述對象。
E4.如E1或E2所述的方法，其中，所述方法在體內(nèi)進行。E5.如E1或E2所述的方法，其中，所述基因開關(guān)是基于蛻皮素受體(EcR)的基因
開關(guān)。
E6.如E5所述的方法，其中，所述配體結(jié)合EcR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
E7.如E6所述的方法，其中，所述配體是二酰基胼。
E8.如E7所述的方法，其中，所述配體選自RG-115819、RG-115932和RG-115830。E9.如E6所述的方法，其中，所述配體是酰氨基酮或噁二唑啉。E10.如E1或E2所述的方法，其中，所述基因開關(guān)包含第一治療開關(guān)啟動子控制下 的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二治療開關(guān)啟動子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn) 錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼的蛋白質(zhì)相互作用從而形成起到配體依賴性轉(zhuǎn) 錄因子作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。E11.如E10所述的方法，其中所述第一治療開關(guān)啟動子和所述第二治療開關(guān)啟動
子不同<E12.如E10所述的方法，其中所述第一治療開關(guān)啟動子和所述第二治療開關(guān)啟動
子相同<E13.如E10所述的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含異二聚體伴侶和反式激活域的蛋白質(zhì)。E14.如E10所述的方法，其中所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。E15.如E1或E2所述的方法，其中操作性連接于誘導(dǎo)型啟動子的所述多核苷酸之 一還編碼致死多肽。E16. 一種在細(xì)胞中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法，包括(a)將以下多核苷酸引入所述細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的細(xì)胞(1)編碼基因開關(guān)的多核 苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個與治療開關(guān)啟動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所 述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，其中所述啟動子在所述疾病或病癥期 間活化，和(2)與某啟動子相連的編碼治療多肽或治療多核苷酸的多核苷酸，該啟動子由 所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子活化；和(b)將配體給予所述修飾的細(xì)胞以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。E17.如E16所述的方法，其中，所述方法在體外進行。E18.如E16所述的方法，其中，所述方法在已從對象分離的細(xì)胞中離體進行。E19.如E16所述的方法，其中，所述方法在體內(nèi)進行。E20.如E16所述的方法，其中，所述基因開關(guān)是基于EcR的基因開關(guān)。E21.如E20所述的方法，其中，所述配體結(jié)合EcR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。E22.如E21所述的方法，其中，所述配體是二?；荨23.如E22所述的方法，其中，所述配體選自RG_115819、RG-115932和
RG-115830。E24.如E21所述的方法，其中，所述配體是酰氨基酮或噁二唑啉。E25.如E16所述的方法，其中，所述基因開關(guān)包含第一治療開關(guān)啟動子控制下的 第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二治療開關(guān)啟動子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼的蛋白質(zhì)相互作用從而形成起到配體依賴性轉(zhuǎn)錄 因子作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。E26.如E25所述的方法，其中所述第一治療開關(guān)啟動子和所述第二治療開關(guān)啟動 子不同。E27.如E25所述的方法，其中所述第一治療開關(guān)啟動子和所述第二治療開關(guān)啟動 子相同。E28.如E25所述的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含異二聚體伴侶和反 式激活域的蛋白質(zhì)。E29.如E25所述的方法，其中所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和 配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。E30.如E16所述的方法，其中操作性連接于誘導(dǎo)型啟動子的所述多核苷酸之一還 編碼致死多肽。E31. 一種編碼基因開關(guān)的多核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個與治療開關(guān)啟 動子操作性相連的轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因 子，其中所述啟動子的活性在所述疾病或病癥期間受到調(diào)節(jié)。E32.如E31所述的多核苷酸，其還編碼連接于由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的 啟動子的報道基因。E33.如E31所述的多核苷酸，其中，所述基因開關(guān)是基于EcR的基因開關(guān)。E34.如E31所述的多核苷酸，其中，所述基因開關(guān)包含第一治療開關(guān)啟動子控制 下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二治療開關(guān)啟動子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述第一 轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼的蛋白質(zhì)相互作用從而形成起到配體依賴性 轉(zhuǎn)錄因子作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。E35.如E34所述的多核苷酸，其中所述第一治療開關(guān)啟動子和所述第二治療開關(guān) 啟動子不同。E36.如E34所述的多核苷酸，其中所述第一治療開關(guān)啟動子和所述第二治療開關(guān) 啟動子相同。E37.如E34所述的多核苷酸，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含異二聚體伴侶 和反式激活域的蛋白質(zhì)。E38.如E34所述的多核苷酸，其中所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu) 域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。E39.如E31所述的多核苷酸，其中操作性連接于誘導(dǎo)型啟動子的所述多核苷酸之 一還編碼致死多肽。E40. 一種包含E31所述多核苷酸的載體。E41.如E40所述的載體，其中所述載體是質(zhì)粒載體。E42.如E40所述的載體，其中所述載體是病毒載體。E43. 一種包含E31所述多核苷酸的試劑盒。E44. 一種包含E42所述載體的試劑盒。本發(fā)明還涉及實施一種或多種本發(fā)明方法的使用說明書。這種使用說明書可指導(dǎo) 用戶適合實施本發(fā)明方法的條件。本發(fā)明的使用說明書可以是有形的，例如書面使用說明
1書(例如，打印在紙上)，或者可以是無形的，例如經(jīng)由計算機磁盤或從因特網(wǎng)上獲得。應(yīng)該知道無需提供實施本發(fā)明方法的或者當(dāng)使用說明書包括在試劑盒中時，利用 試劑盒的完整使用說明書。例如，本發(fā)明試劑盒未裝有這種全長使用說明書的情況是所提 供的指示告知試劑盒的用戶從哪里可獲得實施使用該試劑盒的方法的使用說明書。因此， 可從因特網(wǎng)頁，單獨出售或分發(fā)的手冊或其它產(chǎn)品文獻(xiàn)等獲得實施本發(fā)明方法的使用說明 書。因此，本發(fā)明包括的試劑盒可指示試劑盒用戶到一個或多個地點獲得未隨該試劑盒直 接包裝和/或分發(fā)的使用說明書。這種使用說明書可以是任何形式，包括但不限于電子或 打印形式?，F(xiàn)在已完全描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該知道可在廣泛而等價的條 件、制劑和其它參數(shù)中作出相同發(fā)明而不影響本發(fā)明或其任何實施方式的范圍。本文引用 的所有專利、專利申請和出版物通過弓I用全文納入本文。
權(quán)利要求
一種治療、緩解或預(yù)防對象中疾病、病癥或病狀的方法，包括(a)將以下多核苷酸引入所述對象(1)編碼基因開關(guān)的第一多核苷酸，所述基因開關(guān)包含至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列通過與治療開關(guān)啟動子操作性結(jié)合而編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物(LDTFC)，和(2)與因子調(diào)節(jié)的啟動子操作性結(jié)合的編碼治療多肽或治療多核苷酸的第二多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物活化，其中，引入所述第一和第二多核苷酸以表達(dá)所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物；和(b)將配體給予所述對象以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。
2.一種在對象中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法，包括(a)將以下多核苷酸引入對象(1)編碼基因開關(guān)的第一多核苷酸，所述基因開關(guān)包含 至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列通過與治療開關(guān)啟動子操作性結(jié) 合而編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，和(2)與因子調(diào)節(jié)的啟動子操作性相連的編碼治療 多肽或治療多核苷酸的第二多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物活化， 其中，引入所述第一和第二多核苷酸以表達(dá)所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物；和(b)將配體給予所述對象以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述治療開關(guān)啟動子是組成型的。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述治療開關(guān)啟動子在疾病、病癥或病 狀相關(guān)條件下活化，從而在所述疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下表達(dá)所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因 子復(fù)合物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述疾病、病癥或病狀對所述治療多肽或治 療多核苷酸起反應(yīng)。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述治療多肽或治療多核苷酸的表達(dá)和 傳播水平足以治療、緩解或預(yù)防所述疾病、病癥或病狀。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因開關(guān)是基于蛻皮素受體(EcR) 的基因開關(guān)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述配體結(jié)合EcR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述配體是二?；荨?br> 10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述配體選自RG-115819、RG-115932和 RG-115830。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述配體是酰氨基酮或噁二唑啉。
12.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因開關(guān)包含第一治療開關(guān)啟動 子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二治療開關(guān)啟動子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所 述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼的蛋白質(zhì)相互作用從而形成起到配體 依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一治療開關(guān)啟動子和所述第二治 療開關(guān)啟動子不同。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一治療開關(guān)啟動子和所述第二治 療開關(guān)啟動子相同。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含異二聚體伴侶和反式激活域的蛋白質(zhì)。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含DNA結(jié)合 結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。
17.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，將所述第一和第二多核苷酸引入所述 對象的一個或多個修飾細(xì)胞中。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述修飾細(xì)胞是通過將所述第一和第二 多核苷酸引入已從所述對象分離的細(xì)胞制備的，從而產(chǎn)生修飾的自體細(xì)胞，然后重新引入 所述對象。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述修飾細(xì)胞是其中摻入了所述第一和 第二多核苷酸的修飾的非自體(MNA)細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述MNA細(xì)胞是所述對象的自體細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述MNA細(xì)胞是所述對象的異種細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，從選自下組的細(xì)胞類型產(chǎn)生所述MNA細(xì) 胞能終末分化的無限增殖細(xì)胞和原代細(xì)胞。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，從選自下組的細(xì)胞類型產(chǎn)生所述MNA細(xì) 胞C2C12小鼠成肌細(xì)胞、HEK293人胚胎腎細(xì)胞、ARPE-19細(xì)胞、hMSC細(xì)胞、胰島細(xì)胞、MDCK 細(xì)胞、CH0細(xì)胞、星形細(xì)胞衍生細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞衍生細(xì)胞和成肌細(xì)胞衍生細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述胰島細(xì)胞是豬胰島細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述胰島細(xì)胞是獲自尸體的人胰島細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述修飾細(xì)胞經(jīng)處理，從而所述細(xì)胞在引 入所述對象后免遭該對象的免疫系統(tǒng)破壞。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述修飾細(xì)胞包含在允許所述治療蛋白 或治療多核苷酸傳播，但防止所述修飾細(xì)胞直接接觸該對象的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的屏障系統(tǒng) 內(nèi)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述屏障系統(tǒng)包含具有保形包被的修飾 細(xì)胞。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述保形包被包含聚合物。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述聚合物選自聚乙二醇和甲基丙烯酸 羥乙酯_甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述屏障系統(tǒng)包含包裹化的修飾細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述修飾細(xì)胞包含在巨囊化器件中。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件包含一層或多層合成膜。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件包含兩層或更多層合成 膜，所述合成膜包含不同孔徑從而調(diào)節(jié)經(jīng)所述巨囊化器件的物質(zhì)運輸。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件包含半透聚合物外膜和 支持細(xì)胞的內(nèi)部支架。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件長約6mm，直徑約1mm。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述外膜包含約15nm的孔。
38.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)部支架包含聚對苯二甲酸乙二酯紗線。
39.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件的內(nèi)部空間包含至少1個 到約105個修飾細(xì)胞。
40.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件包含聚合膜雙層，所述雙 層包含層疊在內(nèi)部致密孔0. 45 ii M PFTE免疫屏障層上的5 u mPTFE膜外層。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件在所述聚合膜雙層外還 包含無紡聚合網(wǎng)層。
42.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件包含PES中空纖維器件。
43.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件還包含縫合夾。
44.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件是可植入和可收回的。
45.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述修飾細(xì)胞是微囊化的。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述修飾細(xì)胞懸浮在生物相容包裹化材 料中，然后制成珠-樣結(jié)構(gòu)。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述包裹化材料包含水凝膠。
48.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述包裹化材料包含選自纖維素或藻酸 鹽的聚合物。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述聚合物包含多聚陰離子藻酸鹽和多 聚陽離子聚合物，從而相互作用并形成物理透過選擇性膜屏障。
50.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述珠_樣結(jié)構(gòu)各包含至少1個到約103 個修飾細(xì)胞。
51.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述珠-樣結(jié)構(gòu)包含聚(L-丙交酯)酸 (PLLA)藻酸鹽微球。
52.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述珠-樣結(jié)構(gòu)還包含聚-L-鳥氨酸 (PL0)藻酸鹽包被。
53.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述包裹化材料包含基于藻酸鹽的超高 粘度(UHV)-生物聚合物。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述基于藻酸鹽的UHV-聚合物是生物可 降解的。
55.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述珠-樣結(jié)構(gòu)是大致球形的，直徑約 500 u m。
56.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述屏障系統(tǒng)還包含能為所述修飾細(xì)胞 提供保護作用的保護細(xì)胞，其中所述保護細(xì)胞選自塞托利細(xì)胞和紅細(xì)胞。
57.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述屏障系統(tǒng)還包含能產(chǎn)生保護性微環(huán) 境的外層包被。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述保護性微環(huán)境是抗炎性的。
59.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述保護性微環(huán)境是促血管生成性的。
60.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述修飾細(xì)胞還包含調(diào)節(jié)型自殺基因，其 在激活后誘導(dǎo)破壞所述修飾細(xì)胞。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述自殺基因在逃離屏障系統(tǒng)或致癌轉(zhuǎn)化事件中激活。
62.在一種或多種修飾細(xì)胞中表達(dá)治療多肽或治療多核苷酸的方法，包括(a)將以下多核苷酸引入細(xì)胞從而產(chǎn)生修飾的細(xì)胞(1)編碼基因開關(guān)的第一多核苷 酸，所述基因開關(guān)包含至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列通過與治 療開關(guān)啟動子操作性結(jié)合而編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，和(2)與因子調(diào)節(jié)的啟動子 操作性結(jié)合的編碼治療多肽或治療多核苷酸的第二多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物活化；和(b)將配體給予所述修飾細(xì)胞以誘導(dǎo)所述治療多肽或治療多核苷酸表達(dá)。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述治療開關(guān)啟動子是組成型的。
64.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述治療開關(guān)啟動子在疾病、病癥或病狀 相關(guān)條件下活化，從而在所述疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下表達(dá)所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子 復(fù)合物。
65.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述方法在體外進行。
66.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述方法在已從對象分離的細(xì)胞中離體 進行。
67.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述方法在體內(nèi)進行。
68.一種包含編碼基因開關(guān)的第一多核苷酸的核酸組合物，所述基因開關(guān)包含至少一 個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列與治療開關(guān)啟動子操作性結(jié)合而編碼配 體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物。
69.如權(quán)利要求68所述的核酸組合物，其特征在于，所述治療開關(guān)啟動子是組成型的。
70.如權(quán)利要求68所述的核酸組合物，其特征在于，所述治療開關(guān)啟動子在疾病、病癥 或病狀相關(guān)條件下活化，從而在所述疾病、病癥或病狀相關(guān)條件下表達(dá)所述配體依賴性轉(zhuǎn) 錄因子復(fù)合物。
71.如權(quán)利要求68所述的核酸組合物，其特征在于，還包含與啟動子操作性結(jié)合的編 碼疾病、病癥或病狀相關(guān)的多肽或多核苷酸的第二多核苷酸，該啟動子由所述配體依賴性 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物活化。
72.如權(quán)利要求71所述的核酸組合物，其特征在于，所述疾病、病癥或病狀相關(guān)多肽或 多核苷酸包括能治療、緩解或預(yù)防疾病、病癥或病狀的治療多肽或治療多核苷酸。
73.如權(quán)利要求68-72中任一項所述核酸組合物，其特征在于，所述基因開關(guān)是基于 EcR的基因開關(guān)。
74.如權(quán)利要求73所述的核酸組合物，其特征在于，所述配體結(jié)合EcR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
75.如權(quán)利要求74所述的核酸組合物，其特征在于，所述配體是二?；荨?br> 76.如權(quán)利要求75所述的核酸組合物，其特征在于，所述配體選自RG-115819、 RG-115932 和 RG-115830。
77.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述配體是酰氨基酮或噁二唑啉。
78.如權(quán)利要求68-72中任一項所述的方法，其特征在于，所述基因開關(guān)包含第一治療 開關(guān)啟動子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二治療開關(guān)啟動子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序 列，其中所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼的蛋白質(zhì)相互作用從而形成起到配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
79.如權(quán)利要求78所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一治療開關(guān)啟動子和所述第 二治療開關(guān)啟動子不同。
80.如權(quán)利要求78所述的核酸組合物，其特征在于，所述第一治療開關(guān)啟動子和所述 第二治療開關(guān)啟動子相同。
81.如權(quán)利要求78所述的核酸組合物，其特征在于，所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含 異二聚體伴侶和反式激活域的蛋白質(zhì)。
82.如權(quán)利要求78所述的核酸組合物，其特征在于，所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼包含 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。
83.如權(quán)利要求71所述的核酸組合物，其特征在于，還包含操作性連接于誘導(dǎo)型啟動 子，編碼致死多肽的第三多核苷酸。
84.—種包含權(quán)利要求71所述核酸組合物的載體。
85.如權(quán)利要求84所述的載體，其特征在于，所述載體是質(zhì)粒載體。
86.如權(quán)利要求84所述的載體，其特征在于，所述載體是病毒載體。
87.一種包含權(quán)利要求71所述核酸組合物的試劑盒。
88.—種包含權(quán)利要求84所述載體的試劑盒。
89.—種產(chǎn)生修飾細(xì)胞的方法，包括將權(quán)利要求71所述的核酸組合物引入細(xì)胞。
90.一種產(chǎn)生修飾細(xì)胞的方法，包括將權(quán)利要求84所述的載體引入細(xì)胞。
91.一種包含權(quán)利要求71所述的核酸組合物的修飾細(xì)胞。
92.一種包含權(quán)利要求84所述的載體的修飾細(xì)胞。
93.如權(quán)利要求91所述的修飾細(xì)胞，其特征在于，其是衍生自從需要所述多肽或多核 苷酸的對象分離的細(xì)胞的修飾自體細(xì)胞，其中所述修飾細(xì)胞適于重新引入所述對象。
94.如權(quán)利要求91所述的修飾細(xì)胞，其特征在于，其衍生自選自下組的細(xì)胞類型能終 末分化的無限增殖細(xì)胞和原代細(xì)胞。
95.如權(quán)利要求94所述的修飾細(xì)胞，其特征在于，其衍生自選自下組的細(xì)胞類型 C2C12小鼠成肌細(xì)胞、HEK293人胚胎腎細(xì)胞、ARPE-19細(xì)胞、hMSC細(xì)胞、胰島細(xì)胞、MDCK細(xì) 胞、CH0細(xì)胞、星形細(xì)胞衍生細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞衍生細(xì)胞和成肌細(xì)胞衍生細(xì)胞。
96.如權(quán)利要求95所述的修飾細(xì)胞，其特征在于，所述胰島細(xì)胞是豬胰島細(xì)胞。
97.如權(quán)利要求95所述的修飾細(xì)胞，其特征在于，所述胰島細(xì)胞是獲自尸體的人胰島 細(xì)胞。
98.如權(quán)利要求91所述的修飾細(xì)胞，其特征在于，所述修飾細(xì)胞還包含調(diào)節(jié)型自殺基 因，其在激活后誘導(dǎo)破壞所述修飾細(xì)胞。
99.如權(quán)利要求98所述的修飾細(xì)胞，其特征在于，所述自殺基因在逃離屏障系統(tǒng)或致 癌轉(zhuǎn)化事件中激活。
100.一種包含一種或多種如權(quán)利要求91-99中任一項所述修飾細(xì)胞的生物反應(yīng)器器件。
101.如權(quán)利要求100所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述修飾細(xì)胞經(jīng)處理，從而 所述細(xì)胞在引入對象后免遭該對象的免疫系統(tǒng)破壞。
102.如權(quán)利要求100所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述修飾細(xì)胞包含在允許所述多肽或多核苷酸傳播，但防止所述修飾細(xì)胞直接接觸該對象的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的屏障系 統(tǒng)內(nèi)。
103.如權(quán)利要求102所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述屏障系統(tǒng)包含具有保 形包被的修飾細(xì)胞。
104.如權(quán)利要求103所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述保形包被包含聚合物。
105.如權(quán)利要求104所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述聚合物選自聚乙二醇 和甲基丙烯酸羥乙酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)。
106.如權(quán)利要求102所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述屏障系統(tǒng)包含包裹化 的修飾細(xì)胞。
107.如權(quán)利要求106所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述修飾細(xì)胞包含在巨囊 化器件中。
108.如權(quán)利要求107所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述巨囊化器件包含一層 或多層合成膜。
109.如權(quán)利要求108所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述巨囊化器件包含兩層 或更多層合成膜，所述合成膜包含不同孔徑從而調(diào)節(jié)經(jīng)所述巨囊化器件的物質(zhì)運輸。
110.如權(quán)利要求107所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述巨囊化器件包含半透 聚合物外膜和支持細(xì)胞的內(nèi)部支架。
111.如權(quán)利要求110所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述巨囊化器件長約6mm， 直徑約1mm。
112.如權(quán)利要求110所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述外膜包含約15nm的孔。
113.如權(quán)利要求110所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述內(nèi)部支架包含聚對苯二甲酸乙二酯紗線。
114.如權(quán)利要求107所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述巨囊化器件的內(nèi)部空 間包含至少1個到約105個修飾細(xì)胞。
115.如權(quán)利要求107所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述巨囊化器件包含聚合 膜雙層，所述雙層包含層疊在內(nèi)部致密孔0.45 iiM PFTE免疫屏障層上的5iim PTFE膜外層。
116.如權(quán)利要求115所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述巨囊化器件在所述聚 合膜雙層外還包含無紡聚合網(wǎng)層。
117.如權(quán)利要求107所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述巨囊化器件包含PES中 空纖維器件。
118.如權(quán)利要求107所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述巨囊化器件還包含縫口大o
119.如權(quán)利要求107所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述巨囊化器件是可植入 和可收回的。
120.如權(quán)利要求106所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述修飾細(xì)胞是微囊化的。
121.如權(quán)利要求120所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述修飾細(xì)胞懸浮在生物 相容包裹化材料中，然后制成珠_樣結(jié)構(gòu)。
122.如權(quán)利要求121所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述包裹化材料包含水凝膠。
123.如權(quán)利要求121所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述包裹化材料包含選自 纖維素或藻酸鹽的聚合物。
124.如權(quán)利要求123所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述聚合物包含多聚陰離 子藻酸鹽和多聚陽離子聚合物，從而相互作用并形成物理透過選擇性膜屏障。
125.如權(quán)利要求121所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述珠-樣結(jié)構(gòu)各包含至少 1個到約103個修飾細(xì)胞。
126.如權(quán)利要求121所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述珠-樣結(jié)構(gòu)包含聚 (L-丙交酯)酸(PLLA)藻酸鹽微球。
127.如權(quán)利要求121所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述珠-樣結(jié)構(gòu)還包含 聚-L-鳥氨酸(PL0)藻酸鹽包被。
128.如權(quán)利要求123所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述包裹化材料包含基于 藻酸鹽的超高粘度(UHV)-生物聚合物。
129.如權(quán)利要求128所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述基于藻酸鹽的UHV-聚 合物是生物可降解的。
130.如權(quán)利要求121所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述珠-樣結(jié)構(gòu)是大致球形 的，直徑約500 iim。
131.如權(quán)利要求102所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述屏障系統(tǒng)還包含能為 所述修飾細(xì)胞提供保護作用的保護細(xì)胞，其中所述保護細(xì)胞選自塞托利細(xì)胞和紅細(xì)胞。
132.如權(quán)利要求102所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述屏障系統(tǒng)還包含能產(chǎn) 生保護性微環(huán)境的外層包被。
133.如權(quán)利要求132所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述保護性微環(huán)境是抗炎 性的。
134.如權(quán)利要求132所述的生物反應(yīng)器器件，其特征在于，所述保護性微環(huán)境是促血 管生成性的。
135.如權(quán)利要求68-83中任一項所述核酸組合物在治療疾病、病癥或病狀中的應(yīng)用。
136.如權(quán)利要求84-86中任一項所述載體在治療疾病、病癥或病狀中的應(yīng)用。
137.如權(quán)利要求91-99中任一項所述修飾細(xì)胞在治療疾病、病癥或病狀中的應(yīng)用。
138.如權(quán)利要求100-134中任一項所述生物反應(yīng)器器件在治療疾病、病癥或病狀中的應(yīng)用。
139.如權(quán)利要求68-83中任一項所述核酸組合物在制備治療疾病、病癥或病狀的藥 物中的應(yīng)用，所述疾病、病癥或病狀選自下組超增殖性疾病、病癥或病狀，心血管疾病、病 癥或病狀，神經(jīng)疾病、病癥或病狀，自身免疫疾病、病癥或病狀，骨疾病、病癥或病狀，胃腸疾 病、病癥或病狀，血液疾病、病癥或病狀，代謝疾病、病癥或病狀，炎性疾病、病癥或病狀和感 染性疾病、病癥或病狀。
140.如權(quán)利要求84-86中任一項所述載體在制備治療疾病、病癥或病狀的藥物中的應(yīng) 用，所述疾病、病癥或病狀選自下組超增殖性疾病、病癥或病狀，心血管疾病、病癥或病狀， 神經(jīng)疾病、病癥或病狀，自身免疫疾病、病癥或病狀，骨疾病、病癥或病狀，胃腸疾病、病癥或 病狀，血液疾病、病癥或病狀，代謝疾病、病癥或病狀，炎性疾病、病癥或病狀和感染性疾病、病癥或病狀。
141.如權(quán)利要求91-99中任一項所述修飾細(xì)胞在制備治療疾病、病癥或病狀的藥物中 的應(yīng)用，所述疾病、病癥或病狀選自下組超增殖性疾病、病癥或病狀，心血管疾病、病癥或 病狀，神經(jīng)疾病、病癥或病狀，自身免疫疾病、病癥或病狀，骨疾病、病癥或病狀，胃腸疾病、 病癥或病狀，血液疾病、病癥或病狀，代謝疾病、病癥或病狀，炎性疾病、病癥或病狀和感染 性疾病、病癥或病狀。
142.如權(quán)利要求100-134中任一項所述生物反應(yīng)器器件在制備治療疾病、病癥或病 狀的藥物中的應(yīng)用，所述疾病、病癥或病狀選自下組超增殖性疾病、病癥或病狀，心血管疾 病、病癥或病狀，神經(jīng)疾病、病癥或病狀，自身免疫疾病、病癥或病狀，骨疾病、病癥或病狀， 胃腸疾病、病癥或病狀，血液疾病、病癥或病狀，代謝疾病、病癥或病狀，炎性疾病、病癥或病 狀和感染性疾病、病癥或病狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過將控制一種或多種治療產(chǎn)物表達(dá)的治療基因開關(guān)引入對象細(xì)胞從而治療、緩解或預(yù)防對象中疾病或病癥的方法和組合物。
文檔編號A61K31/7088GK101868241SQ200880117657
公開日2010年10月20日 申請日期2008年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者A·P·特列季亞科夫, B·L·梅倫涅克, R·E·彼得森, R·P·比奇, T·D·瑞德 申請人:英特瑞克斯頓股份有限公司