專利名稱：尼古丁特異性人單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組產(chǎn)生的特異性結(jié)合尼古丁并且能夠阻止尼古丁從血液轉(zhuǎn)移至腦 中的人單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些抗體在被動免疫中的應(yīng)用，優(yōu)選地在人的被動 免疫中的應(yīng)用，并且涉及這些抗體在治療人的尼古丁成癮中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Bjercke 等人.1986 (J Immunol Methods, Vol. 90 (2) pp. 203-13)公開了抗 (S)-(-)-尼古丁的立體特異性單克隆抗體。Bjercke等人.1986的單克隆抗-尼古丁抗體 通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生，因此來源于小鼠細(xì)胞。Bjercke等人.1986進(jìn)一步描述了這些單克隆 抗體在開發(fā)基于ELISA的尼古丁分析中的應(yīng)用。Isomura 等人 2001 (J. Org. Chem. Vol. 66pp. 4115-4121)描述了半抗原的制備，該 半抗原用于產(chǎn)生具有高光學(xué)純度的天然存在的(S)-尼古丁、(S)-和(R)_降煙堿和代謝 物(S)_可替寧的特異性抗體。作者報(bào)告了抗尼古丁抗體(包括單克隆抗體)的初步數(shù)據(jù)。 Isomura等人.2001的單克隆抗體從小鼠獲得，并且顯示1. 6xlO_7M至3. 4xlO_7M的尼古丁 結(jié)合Kd值。Keyler 等人 2005 (Drug Metab Dispos，Vol. 33 (7) pp. 1056-61)描述了 使用抗 尼古丁單克隆抗體對大鼠的被動免疫。作者尤其發(fā)現(xiàn)被動免疫后尼古丁向腦的分布減少。 Keyler等人.2005的單克隆抗體也是通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的。Pentel 等人 2006 (J Pharmacol Exp Ther,Vol. 317 (2) pp. 660-6)尤其研究了單 克隆抗體Mc311對大鼠的被動免疫，該抗體由K印ler等人.2005描述，由此特別研究了使 用該抗體的被動免疫對急性和慢性尼古丁腦分布的不同影響?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)提示使用尼 古丁特異性抗體對人的被動免疫在尼古丁成癮的治療中可能有用，并且可能在戒煙過程中 是有利的。但是，關(guān)于Nic311，Pentel等人.2006進(jìn)一步得出以下結(jié)論治療性單克隆抗體 需要進(jìn)行人源化來降低其自身的免疫原性才能用于臨床應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)已知的抗尼古丁單克隆抗體來自于非人來源，因此，由于它們在人體中 的強(qiáng)免疫原性和由此引起的安全性考慮，它們在治療上是不可用的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供特異性結(jié)合尼古丁的人單克隆抗體，其中優(yōu)選地所述單克隆抗體是完 全人抗體。典型且優(yōu)選地，此處公開的單克隆抗體在人體中沒有免疫原性，因此適用于人類 的被動免疫。此外，已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的單克隆抗體特異性結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R)_(+)_尼古丁。同(S)-(-)_尼古丁一樣，尼古丁的(R)_(+)_立體異構(gòu)體也存在于煙草 植物中。另外，它也可以通過吸煙時的燃燒過程形成，并且具有與(s)-(-)-尼古丁性質(zhì)上 相似的對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活性(Hukkanen J.等人.，2005，Pharmacol. Rev. 57，79-115)。本發(fā)明的單克隆抗體按照PCT/EP2007/061570中公開的方法克隆(1)選擇人類 受試者的尼古丁特異性B細(xì)胞；(2)將這些細(xì)胞的VH和VL區(qū)克隆到甲病毒文庫中；(3)在哺乳動物細(xì)胞上進(jìn)行scFv抗體的細(xì)胞表面展示；(4)選擇展示尼古丁特異性scFv抗體的 細(xì)胞；(5)克隆這些scFv抗體的VH和VL區(qū)；和(6)以不同的形式表達(dá)特異性結(jié)合尼古丁 的單克隆抗體，例如作為scFv-Fc-融合蛋白或者作為人IgG2，優(yōu)選地作為完全人IgG2。通 過應(yīng)用這一方法，獲得了 7個獨(dú)立的抗體克隆，當(dāng)它們表達(dá)為scFv-Fc融合蛋白或IgG2時， 以納摩爾或低納摩爾范圍的Kd值結(jié)合尼古丁。因此，一方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合尼古丁的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體 是人單克隆抗體，并且其中優(yōu)選地所述人單克隆抗體是完全人單克隆抗體。將這些克隆測序，并且鑒定提供尼古丁特異性的人⑶R。驚奇地發(fā)現(xiàn)，這些抗體中 的幾種具有不同組合的相同的CDR(見表1)。表1.尼古丁 -特異性人抗體的⑶R序列的SEQ ID NO 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合尼古丁的單克隆抗體，其中優(yōu)選地所述 單克隆抗體是人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體包含至少一個重鏈可變區(qū)(HCVR)， 其中所述HCVR包含(a) —個HC⑶R1，其中所述HC⑶R1包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :1、 11和17中任一個的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1 位置處；(b) 一個HC CDR2，其中所述HC CDR2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :2、12和18中 任一個的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和 /或(c) 一個HC CDR3，其中所述HC CDR3包含或者優(yōu)選地由SEQ IDN0:3、4、13和19中任 一個的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合尼古丁的單克隆抗體，其中優(yōu)選 地所述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含至少一個輕鏈可變區(qū) (LCVR)，其中所述LCVR包含(a)—個LC⑶R1，其中所述LC⑶R1包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :5、6、7、14和20中任一個的肽組成；并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架 內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :8、 15和21中任一個的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2 位置處；和/或(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :9、10、 16和22中任一個的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3 位置處。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合尼古丁的單克隆抗體，其中優(yōu)選地 所述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HCXDRl，其中所述HC⑶Rl包含或者優(yōu)選地由SEQ ID N0:1、11和17中任一個的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶Rl位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶Rl位置 處；(b) 一個HC CDR2，其中所述HC CDR2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :2、12和18中任一 個的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和/或 (c) 一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3包含或者優(yōu)選地由SEQ IDN0:3、4、13和19中任一個 的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；和/或， 優(yōu)選地，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LCXDRl，其 中所述LC⑶Rl包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :5、6、7、14和20中任一個的肽組成；并且其 中優(yōu)選地所述LC⑶Rl位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶Rl位置處；(b) —個LC⑶R2，其中所 述LCXDR2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :8、15和21中任一個的肽組成，并且其中優(yōu)選地所 述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和/或(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC ⑶R3包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :9、10、16和22中任一個的肽組成，并且其中優(yōu)選地所 述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。典型且優(yōu)選地，所述單克隆抗體是重組產(chǎn)生的。本發(fā)明的單克隆抗體可以以任何 天然存在的或合成的形式表達(dá)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是IgG，優(yōu)選地是 IgG2。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及單克隆抗體的HCVR，其中所述單克隆抗體是一種人 單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體特異性結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，并 且其中所述HCVR包含(a) 一個HC⑶Rl，其中所述HC⑶Rl由SEQ ID NO 1的肽組成；(b) 一個HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽組成；和(c) 一個HC CDR3，其中所述 HC CDR3由SEQ ID NO 3和4中任一個的肽組成。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及單克隆抗體的LCVR，其中所述單克隆抗體是一種人 單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體特異性結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，并 且其中所述LCVR包含(a) —個LC CDRl，其中所述LC CDRl由SEQ ID N0:5、6和7中任一 個的肽組成；(b) —個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成；(c) 一個LC ⑶R3，其中所述LC CDR3由SEQ ID NO 9和10中任一個的肽組成。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是人單克隆 抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)-(+)-尼古丁，其中所述單克 隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為I-IOOnM;并且其中所述單克 隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-lOOnM。在一個優(yōu)選實(shí)施方 案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與 所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-70ηΜ，優(yōu)選地1-40ηΜ，進(jìn)一步優(yōu)選地 1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克隆 抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-70ηΜ，優(yōu)選地1-50ηΜ，進(jìn)一步 優(yōu)選地1-40ηΜ，再進(jìn)一步優(yōu)選地1-20ηΜ，更加進(jìn)一步優(yōu)選地1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使 用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體 結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)-(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的 所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-70ηΜ，優(yōu)選地1-40ηΜ，進(jìn)一步優(yōu)選地1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選 地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd;并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為l-20nM，進(jìn)一步優(yōu)選地1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用 IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。在一個更加非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗 體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古 丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗 體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為 1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。優(yōu)選地，所述單克隆 抗體是一種人單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含 (a) 一個HC⑶R1，其中所述HCXDR1包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :1、11和17中任一個的 肽組成，非常優(yōu)選地由SEQ ID NO :1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR 的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個HC⑶R2，其中所述HC⑶R2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :2、12和18中任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQ ID NO :2的肽組成，并且其中優(yōu)選地 所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和/或(c) 一個HCXDR3，其中所述 HC⑶R3包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :3、4、13和19中任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQ ID NO 3的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處； 和/或，優(yōu)選地，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC ⑶R1，其中所述LC⑶R1包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :5、6、7、14和20中任一個的肽組成； 非常優(yōu)選地由SEQ ID NO :5的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu) 架內(nèi)的CDR1位置處；(b) —個LC CDR2，其中所述LCCDR2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :8、 15和21中任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQ ID NO :8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC ⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和/或(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3 包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :9、10、16和22中任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQ ID NO: 9的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。
在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R) - (+)-尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 為1-lOnM;并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為 1-lOnM，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體包 含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC CDR1，其中所述HC CDR1由SEQ ID NO 1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個 HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR2位于 所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 3的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且， 其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC⑶R1，其中所述 LC⑶R1由SEQ ID NO 5的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi) 的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所 述LC⑶R3由SEQ IDN0 9的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架 內(nèi)的⑶R3位置處，并且其中優(yōu)選地所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 24的肽組成，并 且其中所述LCVR的第5-107位由SEQ IDN0 26的肽組成。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的可變區(qū)、本發(fā)明的單克隆抗體或其單 個鏈的核酸分子。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含至少一種本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)載體。在進(jìn) 一步的方面，本發(fā)明涉及包含至少一種本發(fā)明的核酸分子或至少一種本發(fā)明的表達(dá)載體的 宿主細(xì)胞。本發(fā)明的單克隆抗體可用于被動免疫，優(yōu)選地用于人的被動免疫，以及用于治療 尼古丁成癮。因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含至少一種本發(fā)明的單克隆抗體的藥物 組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種被動免疫方法，所述方法包括給受試者施用有 效量的本發(fā)明的單克隆抗體或有效量的本發(fā)明的藥物組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種治療尼古丁成癮的方法，所述方法包括向受試 者施用有效量的本發(fā)明的單克隆抗體或有效量的本發(fā)明的藥物組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于被動免疫，優(yōu)選地用于人的被動免疫的本發(fā)明 的單克隆抗體或本發(fā)明的藥物組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于治療尼古丁成癮，優(yōu)選地用于治療人的尼古丁 成癮的本發(fā)明的單克隆抗體或本發(fā)明的藥物組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的單克隆抗體在制備用于被動免疫(優(yōu)選地 針對尼古丁)的藥物中的用途。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的單克隆抗體在制備用于治療(優(yōu)選地人 的)尼古丁成癮的藥物中的用途。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的抗體在定量和/或定性檢測尼古丁的方法中的應(yīng) 用，優(yōu)選地檢測血樣，最優(yōu)選地通過ELISA檢測。應(yīng)當(dāng)理解，此處公開的所有實(shí)施方案和技術(shù)特征都涉及本發(fā)明的所有方面以及任 何可能的組合。


圖1. IgG2-F018的特異性。在濃度逐漸增加的未標(biāo)記的(_)_尼古丁、(_)_可 替寧或乙酰膽堿的存在下，通過平衡透析法檢測氚標(biāo)記的(-)_尼古丁(56nM)與 IgG2-F018(50nM)的結(jié)合。給出了兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。發(fā)明詳述“抗體”:本文使用的術(shù)語“抗體”是指一種分子，優(yōu)選地一種蛋白質(zhì)，它能夠特異性 結(jié)合一種抗原，典型且優(yōu)選地，通過結(jié)合所述抗原的表位或抗原決定簇，或結(jié)合半抗原。優(yōu) 選地，術(shù)語抗體是指包含至少一個可變區(qū)的抗原或半抗原結(jié)合分子，其中優(yōu)選地所述分子 包含至少一個HCVR和/或至少一個LCVR。進(jìn)一步優(yōu)選地，術(shù)語抗體是指包含至少一個、優(yōu) 選地正好兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗原或半抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)中的每一個 由一個HCVR和一個LCVR形成。此外，術(shù)語抗體還指完整的抗體，優(yōu)選IgG、IgA、IgE、IgM或 IgD類別的抗體，更優(yōu)選IgG類別的抗體，最優(yōu)選IgGl、IgG2、IgG3和IgG4類別的抗體，及 其抗原結(jié)合片段。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述完整抗體包含k或、輕鏈。術(shù)語“抗體” 也指抗原或半抗原結(jié)合抗體片段，優(yōu)選蛋白水解片段及其重組類似物，最優(yōu)選Fab、Fab'和F(ab' )2和Fv。術(shù)語抗體進(jìn)一步包括包含至少一個、優(yōu)選兩個可變區(qū)的蛋白質(zhì)，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述蛋白質(zhì)包含正好一個HCVR和正好一個LCVR。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù) 語抗體是指單鏈抗體，優(yōu)選scFv。因此，優(yōu)選的抗體是單鏈抗體，優(yōu)選scFv、二硫鍵連接的 Fv(sdFv)和包含輕鏈可變區(qū)(LCVR)或重鏈可變區(qū)(HCVR)的片段。在本發(fā)明的上下文中， 術(shù)語“抗體”優(yōu)選地指重組抗體，包括由一個多肽組成的重組蛋白，其中所述多肽包含至少 一個、優(yōu)選正好一個可變區(qū)。在本發(fā)明的上下文中，重組抗體可以進(jìn)一步包含功能元件，如 接頭區(qū)、信號肽或疏水前導(dǎo)序列、檢測標(biāo)簽和/或純化標(biāo)簽(例如Fe)?！癋v” 術(shù)語Fv是指能夠結(jié)合抗原或半抗原的抗體的最小的蛋白水解片段，以及所 述片段的重組類似物?！皢捂溈贵w”單鏈抗體是由一個多肽組成的抗體。優(yōu)選的單鏈抗體由包含至少一 個、優(yōu)選地正好一個VR的多肽組成，其中優(yōu)選地所述VR是HCVR。更優(yōu)選的單鏈抗體由包含 至少一個、優(yōu)選地正好一個HCVR和至少一個、優(yōu)選地正好一個LCVR的多肽組成。再更優(yōu)選 的單鏈抗體包含正好一個HCVR和正好一個LCVR。最優(yōu)選的單鏈抗體是scFv，其中所述scFv 由一個包含正好一個HCVR和正好一個LCVR的多肽組成，其中所述HCVR和所述LCVR通過接 頭區(qū)彼此連接，其中優(yōu)選地所述接頭區(qū)由至少15個、優(yōu)選地15-20個氨基酸組成(Bird等 人.(1988) Science，242 (4877) :423_426)。進(jìn)一步優(yōu)選的單鏈抗體是scFv，其中所述scFv 由一個編碼區(qū)編碼，其中所述編碼區(qū)在5'至3’方向上以下列順序包含(1)由來自κ或 λ 輕鏈的輕鏈構(gòu)架(LC FR) 1、互補(bǔ)決定區(qū)(LC CDR) 1、LC FR2、LC CDR 2、LC FR3、LC CDR3 和LCFR4組成的輕鏈可變區(qū)(LCVR) ； (2)柔性接頭(L)；和(3)由構(gòu)架(HCFR) 1、互補(bǔ)決定區(qū) (HC CDR) 1、HC FR2、HC CDR2、HC FR3、HCCDR3 和 HC FR4 組成的重鏈可變區(qū)(HCVR)?；蛘?， 單鏈抗體是scFv，其中所述scFv由一個編碼區(qū)編碼，其中所述編碼區(qū)在5'至3’方向上以 下列順序包含(1)由構(gòu)架(HC FR) 1、互補(bǔ)決定區(qū)(HC CDR) UHC FR2、HC CDR2、HC FR3、HC ⑶R3和HC FR4組成的重鏈可變區(qū)(HCVR) ； (2)柔性接頭(L)；和(3)由來自κ或λ輕鏈 的輕鏈構(gòu)架(LC FR) 1、互補(bǔ)決定區(qū)(LC CDR) ULC FR2、LC CDR2、LC FR3、LC DR3 禾口 LC FR4 組成的輕鏈可變區(qū)(LCVR)?！半p鏈抗體(diabody)，，術(shù)語“雙鏈抗體”是指包含兩個多肽鏈、優(yōu)選地兩個相 同的多肽鏈的抗體，其中每條多肽鏈包含HCVR和LCVR，其中所述HCVR和所述LCVR通過 接頭區(qū)彼此連接，其中優(yōu)選地所述接頭區(qū)包含最多10個氨基酸(Huston等人.(1988)， PNAS85(16) 587958-83 ；HolIiger 等人.(1993)，PNAS 90(14) =6444-6448, Hollinger & Hudson，2005，Nature Biotechnology 23(9) 1126-1136 ；Arndt 等人·(2004)FEBS Letters 578(3) :257_261)。雙鏈抗體的優(yōu)選的接頭區(qū)包含O、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個 氨基酸?！叭丝贵w”:本文使用的術(shù)語“人抗體”是指基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序 列的抗體，優(yōu)選重組抗體，或其片段，并且包括從人免疫球蛋白文庫中分離的抗體。在本發(fā) 明的上下文中，“人抗體”可以包含有限數(shù)量的與天然人抗體序列相比的氨基酸交換。這 些氨基酸交換可以是，例如，由克隆過程引起的。但是，本發(fā)明的人抗體中這些氨基酸交換 的數(shù)目優(yōu)選地最小化。優(yōu)選地，人抗體的氨基酸序列與天然人抗體的序列至少85%，優(yōu)選 地90 %，更優(yōu)選地95 %，甚至更優(yōu)選地至少96 %，更優(yōu)選地97 %，更優(yōu)選地98 %，更優(yōu)選地 99%，最優(yōu)選地100%相同。更優(yōu)選地，人抗體的氨基酸序列與特異性結(jié)合目的抗原或半抗原的天然人抗體的序列至少85%，優(yōu)選地90%，更優(yōu)選地95%，甚至更優(yōu)選地至少96%，更 優(yōu)選地97 %，更優(yōu)選地98%，更優(yōu)選地99%，最優(yōu)選地100 %相同。最優(yōu)選地，人抗體的氨 基酸序列與特異性結(jié)合尼古丁、優(yōu)選(幻-(-)-尼古丁和/或(R)_(+)_尼古丁的天然人抗 體的序列至少85 %，優(yōu)選地90 %，更優(yōu)選地95 %，更優(yōu)選地至少96 %，更優(yōu)選地97 %，更優(yōu) 選地98 %，更優(yōu)選地99 %，最優(yōu)選地100 %相同。優(yōu)選的重組人抗體與天然人抗體最多有20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基
酸不同，非常優(yōu)選地，通過分子克隆消除重組人抗體與天然人抗體的氨基酸序列的差異，因 此，最優(yōu)選地，重組人抗體與天然人抗體的氨基酸序列相同。這種抗體也被稱為“完全人抗 體”。實(shí)施例6提供了一個如何從選自人抗體文庫的人抗體獲得完全人抗體的說明性實(shí)施 例。典型且優(yōu)選地，完全人抗體在人體中沒有免疫原性。優(yōu)選的人抗體包含(a)至少一個，優(yōu)選一個HCVR，(b)至少一個，優(yōu)選一個HCCR， (c)至少一個，優(yōu)選一個LCVR，和(d)至少一個，優(yōu)選一個LCCR，其中所述至少一個HCVR和 /或所述至少一個HCCR和/或所述至少一個LCVR和/或所述至少一個LCCR與相應(yīng)的天然 人區(qū)域至少85 %，優(yōu)選地90 %，更優(yōu)選地95 %，更優(yōu)選地至少96 %，更優(yōu)選地97 %，更優(yōu)選 地98 %，更優(yōu)選地99 %，最優(yōu)選地100 %相同。已經(jīng)確定，免疫球蛋白(包括人免疫球蛋白)的恒定區(qū)以多種同種型存在，即， 群體的個體之間所述恒定區(qū)的氨基酸序列可能有一定程度的不同。非常深入地研究了 人免疫球蛋白的恒定區(qū)的同種型，技術(shù)人員容易從各種來源獲得序列信息，包括Imirnmo Geneticslnformation System(http://imRt. cines. fr/)。應(yīng)當(dāng)理解，對于本發(fā)明的目的， 一種免疫球蛋白的恒定區(qū)的不同同種型可以交換。例如，本發(fā)明的單克隆抗體的Y2重鏈 可以包含人Y2HCCR的任何存在的同種型?！皢慰寺】贵w”本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指只包括一個抗體種類(即，具 有相同氨基酸序列的抗體)的抗體群體。“恒定區(qū)(CR) ”術(shù)語“恒定區(qū)”是指抗體的輕鏈恒定區(qū)(LCCR)或重鏈恒定區(qū) (HCCR)。典型且優(yōu)選地，所述CR包含1-4個以二硫鍵穩(wěn)定化的環(huán)結(jié)構(gòu)為特征的免疫球蛋白 結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的CR是免疫球蛋白的CR，優(yōu)選地是人免疫球蛋白的CR，其中進(jìn)一步優(yōu)選地， 所述免疫球蛋白，優(yōu)選地所述人免疫球蛋白，選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM和 IgD。非常優(yōu)選的CR是包含或由可從公共數(shù)據(jù)庫中獲得的氨基酸序列組成的人CR，所述數(shù) 據(jù)庫包括，例如，Immunogenetic Information System(http //imgt. cines. fr/)。輕鏈恒定區(qū)(LCCR) :LCCR,更特別地K LCCR或入LCCR, 一般代表天然抗體的天然 k或\輕鏈的C-末端部分。LCCR—般包含大約110個氨基酸，代表一個免疫球蛋白結(jié)構(gòu) 域。重鏈恒定區(qū)(HCCR)重鏈的恒定區(qū)包含抗體重鏈的大約四分之三或更多，并且 位于其C-末端。HCCR —般包含3或4個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的HCCR選自y HCCR、 a HCCR、e HCCR、我們的HCCR和S HCCR。非常優(yōu)選的是Y HCCR，其中優(yōu)選地所述y HCCR選 自 yIHCCR、y 2HCCR, Y 3HCCR 禾口 Y 4HCCR，其中最優(yōu)選地所述 Y HCCR 是 Y 2HCCR。“可變區(qū)(VR)，，是指抗體的可變區(qū)或可變域，更具體地是指重鏈可變區(qū)(HCVR)或 輕鏈可變區(qū)(LCVR)。典型且優(yōu)選地，VR包含一個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的VR是免疫球 蛋白的VR，優(yōu)選人免疫球蛋白的VR，其中進(jìn)一步優(yōu)選地，所述免疫球蛋白，優(yōu)選地所述人免疫球蛋白，選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM和IgD。各個種類的VR是本領(lǐng)域已 知的。優(yōu)選的VR是人VR，其中所述人VR的構(gòu)架顯示與任何已知人VR序列的構(gòu)架有至少 80 %，優(yōu)選地至少85 %，更優(yōu)選地90 %，更優(yōu)選地至少95 %，最優(yōu)選地至少99 %的序列同一 性。優(yōu)選的VR是人VR，其中所述人VR的構(gòu)架顯示與可從公共數(shù)據(jù)庫獲得的任何人VR序列 的構(gòu)架，最優(yōu)選地與可從 ImmunogeneticsInformation System(http//imRt. cines. fr/) 獲得的任何人VR序列，有至少80 %，優(yōu)選地至少85 %，更優(yōu)選地90 %，更優(yōu)選地至少95 %， 最優(yōu)選地至少99 %的序列同一性。每個VR包含所謂的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，互補(bǔ)決定區(qū)決定抗體的結(jié)合特性，并且包 埋在所謂的構(gòu)架內(nèi)。典型且優(yōu)選地，VR包含3個⑶R，優(yōu)選地為⑶R1、⑶R2和⑶R3，它們包 埋在構(gòu)架(FR 1-4)內(nèi)。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，VR從N-端到C-端以如下順序包含 以下元件FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。通常，VR包含多肽或優(yōu)選地由多肽組成，其中所述多肽是V-基因區(qū)段家族的成員 與其它基因區(qū)段例如D和J基因區(qū)段(HCVR)或J基因區(qū)段(LCDR)組合的產(chǎn)物?！拜p鏈可變區(qū)(LCVR)”輕鏈可變區(qū)由重排的核酸分子編碼，并且是KLCVR或 入LCVR。人kLCVR包含一個多肽，其中所述多肽是人KV-基因區(qū)段家族1-7的成員的 產(chǎn)物。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的kLCVR是人KLCVR，優(yōu)選地是由一種DNA編碼的人 k LCVR,該DNA可以使用PCT/EP2007/061570作為SEQ ID NO :49_52公開的任一種寡核苷 酸與PCT/EP2007/061570作為SEQ ID NO :53_56公開的任一種寡核苷酸的引物組合，進(jìn)一 步優(yōu)選地，使用PCT/EP2007/061570的實(shí)施例3所述的PCR條件，從人B細(xì)胞擴(kuò)增。人XLCVR包含一個多肽，其中所述多肽是人XV-基因區(qū)段家族1-11的成員 的產(chǎn)物。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的X LCVR是人XLCVR，優(yōu)選地是由一種DNA編碼的 人入 LCVR,該 DNA 可以使用 PCT/EP2007/061570 的 SEQ ID NO :57_65 中的任一種與 PCT/ EP2007/061570的SEQ ID NO :66_68中的任一種的引物組合，進(jìn)一步優(yōu)選地，使用PCT/ EP2007/061570的實(shí)施例3所述的PCR條件，從人B細(xì)胞擴(kuò)增。 典型且優(yōu)選地，LCVR包含三個LC⑶R，優(yōu)選地LC⑶R1、LC⑶R2和LC⑶R3，它們 包埋在輕鏈構(gòu)架(LC FR 1-4)內(nèi)。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，LCVR從N-端到C-端以 如下順序包含以下元件LC FR1-LC CDR1-LC FR2-LC CDR2-LC FR3-LC CDR3-LCFR4。“重鏈可變區(qū)(HCVR) ”:重鏈可變區(qū)由重排的核酸分子編碼。人HCVR包含一個多肽， 其中所述多肽是人XV-基因區(qū)段的家族1-7的成員的產(chǎn)物。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的 HCVR是人HCVR，優(yōu)選地是由一種DNA編碼的人HCVR，該DNA可以使用PCT/EP2007/061570 的 SEQ ID NO :42-47 中的任一種與 PCT/EP2007/061570 的 SEQ ID NO :48 的引物組合，進(jìn)一 步優(yōu)選地，使用PCT/EP2007/061570的實(shí)施例3所述的PCR條件，從人B細(xì)胞擴(kuò)增。典型且優(yōu)選地，HCVR包含三個HC CDR，優(yōu)選地HC CDRUHC CDR2禾P HC CDR3，它們 包埋于重鏈構(gòu)架(HC FR 1-4)內(nèi)。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，HCVR從N-端到C-端以 如下順序包含以下元件HC FR1-HC CDR1-HC FR2-HC CDR2-HC FR3-HC CDR3-HCFR4?！阿荝” 抗體的HCVR和LCVR的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R) 1、2和3分別可以通過本 領(lǐng)域公知的方法來鑒定。對于本申請，⑶R和FR邊界如Scavinger等人.1999 (Exp Clin Immunogenet. , Vol. 16pp. 234-240)或 Lefranc 等 人.2003(Developmental and Comparative Immunology Vol. 27pp. 55-77)所述定義。
“抗原”本文使用的術(shù)語“抗原”是指被抗體結(jié)合的分子。抗原被免疫系統(tǒng)和/或 體液免疫應(yīng)答識別，并且可能具有一個或多個表位，優(yōu)選地B細(xì)胞表位，或抗原決定簇?！鞍肟乖毙g(shù)語“半抗原”通常是指一種化學(xué)化合物，其中所述化合物本身不能在 動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，但是其中所述化合物當(dāng)與載體結(jié)合、優(yōu)選地與載體蛋白結(jié)合時能夠 在動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的上下文中，“半抗原”是指尼古丁?！澳峁哦　?本文使用的術(shù)語“尼古丁”優(yōu)選地是指(S)-(-)_尼古丁或(R)_(+)尼 古丁或其任何混合物。最優(yōu)選地，尼古丁是指(s)-(-)-尼古丁?！疤禺愋越Y(jié)合”抗體的特異性與抗體特異性結(jié)合抗原或半抗原的能力有關(guān)?？贵w 與抗原/半抗原之間這種相互作用的特異性(親和力)用結(jié)合常數(shù)來表征，或者相反地，用 解離常數(shù)(Kd)來表征。應(yīng)當(dāng)理解，多價相互作用中抗體對抗原/半抗原的表觀親和力取決 于抗體和抗原/半抗原的結(jié)構(gòu)，并且取決于實(shí)際測定條件。由于親合力，多價相互作用中抗 體對抗原/半抗原的表觀親和力可能顯著高于單價相互作用。因此，優(yōu)選地在有利于單價 相互作用的條件下確定親和力。Kd可以用本領(lǐng)域已知的方法來確定?？贵w和抗原/半抗原 的給定組合的Kd優(yōu)選地通過ELISA來確定，其中恒定量的固定的抗原/半抗原與已知濃度 的純化抗體(優(yōu)選單價抗體，例如scFv或Fab片段)的連續(xù)稀釋液接觸。然后以觀察到半 數(shù)最大結(jié)合時的抗體濃度確定Kd。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選地在實(shí)施例7所述的條件 下，通過平衡透析確定Kd?；蛘?，抗體與抗原/半抗原的單價相互作用的Kd通過Biacore 分析作為結(jié)合速率(k。n)與解離速率(k。ff)的比例來確定。與較高的數(shù)值相比，較低的Kd值 表示特異性更高的抗體與抗原/半抗原的結(jié)合。在本申請的上下文中，當(dāng)解離常數(shù)(Kd)(優(yōu) 選地如上所述測定的，進(jìn)一步優(yōu)選地在單價相互作用中測定的)最多為lmM( <= 10_3M)， 優(yōu)選地最多為1 P M( <= 10_6M)，最優(yōu)選地最多為lnM( <= 10_9M)時，抗體被認(rèn)為“特異性 結(jié)合抗原/半抗原”。非常優(yōu)選的是能夠以低于lOOnM(“低納摩爾范圍”)的Kd結(jié)合抗原 /半抗原的抗體，其中進(jìn)一步優(yōu)選地，在單價相互作用中測定Kd。進(jìn)一步優(yōu)選的抗體能夠以 l-1000nM,更優(yōu)選地以5-800nM，更優(yōu)選地以5_90nM，最優(yōu)選地以5_50nM的Kd結(jié)合抗原/ 半抗原，其中進(jìn)一步優(yōu)選地在單價相互作用中測定Kd?！跋嗟取痹诒旧暾埖纳舷挛闹?，當(dāng)單克隆抗體和物質(zhì)的兩個解離常數(shù)(Kd)的值相 差最多10倍，優(yōu)選最多9倍，更優(yōu)選最多8倍，更優(yōu)選最多7倍，更優(yōu)選地最多6倍，更優(yōu)選 最多5倍，更優(yōu)選地最多4倍，更優(yōu)選最多3倍，更優(yōu)選最多2倍，最優(yōu)選最多1. 5倍時，所 述值被認(rèn)為是“相等”的。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)兩個Kd值相差不到5倍時，它 們被認(rèn)為是相等的?！坝行Я俊?本發(fā)明的單克隆抗體或本發(fā)明的藥物組合物的有效量通常是指在必要 的劑量和時間段內(nèi)足以獲得希望的治療結(jié)果的量，其中優(yōu)選地所述結(jié)果是預(yù)防、減少或減 緩尼古丁向(優(yōu)選地人)腦中的進(jìn)入，和/或，最終戒煙。對于人的治療性處置，“有效量” 一般是指lmg至lOOOmg，優(yōu)選地10mg至500mg，更優(yōu)選地10mg至300mg，更優(yōu)選地50mg至 200mg，最優(yōu)選地大約100mg所述單克隆抗體的量?！皹?biāo)簽”術(shù)語標(biāo)簽，優(yōu)選地純化或檢測標(biāo)簽，是指能夠連接到第二多肽上以提供第 二多肽的純化或檢測或者提供第二多肽與底物連接的位點(diǎn)的多肽區(qū)段。原則上，可以獲得 其抗體或其它特異性結(jié)合劑的任何肽或蛋白質(zhì)可以用作親和力標(biāo)簽。標(biāo)簽包括血凝素標(biāo) 簽、myc標(biāo)簽、聚組氨酸標(biāo)簽、蛋白A、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、Glu_Glu親和力標(biāo)簽、P物質(zhì)、FLAG肽、鏈霉親和素結(jié)合肽或其它抗原性表位或結(jié)合域(大多數(shù)來自US06686168)。PCT/EP2007/061570中公開了一種用于鑒定、分離和克隆特異性結(jié)合目的抗原或半抗原的scFv的基于文庫的篩選方法。具體而言，所述方法可以鑒定、分離和克隆人scFv 及隨后產(chǎn)生完全人抗體，包括Fab片段和整個IgG。通過應(yīng)用所述技術(shù)，已經(jīng)鑒定和克隆了 特異性結(jié)合尼古丁的人單克隆抗體。在一方面，本發(fā)明提供特異性結(jié)合尼古丁的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是 人單克隆抗體，其中優(yōu)選地所述尼古丁選自(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，并且其中 最優(yōu)選地所述尼古丁是(s)-(-)-尼古丁 ；并且其中進(jìn)一步優(yōu)選地，所述人單克隆抗體是完 全人單克隆抗體。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單克隆抗體特異性結(jié)合(S)-(-)_尼古丁和 (R)_(+)_ 尼古丁。在一個實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合尼古丁，優(yōu)選地結(jié)合(S)-(-)-尼古丁， 其解離常數(shù)Kd為1-lOOOnM，更優(yōu)選1-800ηΜ，更優(yōu)選1-lOOnM，最優(yōu)選5_90nM，其中進(jìn)一步 優(yōu)選地，使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，Kd在 單價相互作用中測定，最優(yōu)選地在基本如實(shí)施例7所述的分析中測定。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)_尼古丁和 (R)_(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的結(jié)合的解離常數(shù)Kd 為I-IOOnM;并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的結(jié)合的解離常數(shù)Kd為 1-lOOnM。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)_尼古丁和 (R)-(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的結(jié)合的解離常數(shù)Kd為 0. I-IOOnM,優(yōu)選地0. 1-70ηΜ,進(jìn)一步優(yōu)選地0. 1_50ηΜ，再進(jìn)一步優(yōu)選地0. 1_40ηΜ，再進(jìn)一 步優(yōu)選地0. 1-20ηΜ，進(jìn)一步優(yōu)選地0. 1-lOnM，進(jìn)一步優(yōu)選地1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使 用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd;并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古 丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為0. 1-lOOnM，優(yōu)選地0. 1_70ηΜ，進(jìn)一步優(yōu)選地0. 1_50ηΜ，再 進(jìn)一步優(yōu)選地0. 1-40ηΜ,再進(jìn)一步優(yōu)選地0. 1-20ηΜ,并且再進(jìn)一步優(yōu)選地0. I-IOnM,再進(jìn) 一步優(yōu)選地1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。在另一 個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，其 中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)KdSO. 1-40ηΜ，進(jìn)一步 優(yōu)選地0. 1-lOnM，再進(jìn)一步優(yōu)選地1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克 隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體與所述(R)-(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù) Kd為0. 1-50ηΜ,優(yōu)選地0. 1_20ηΜ，進(jìn)一步優(yōu)選地0. I-IOnM,再進(jìn)一步優(yōu)選地1-lOnM，其中 進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。在又另一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)-(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述 (S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為0. 1-lOnM，優(yōu)選地1-lOnM，其中優(yōu)選地使用 IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd;并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的 所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為0. 1-lOnM，優(yōu)選地1-lOnM，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單 克隆抗體測定Kd。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)_尼古丁和(R)-(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù) Kd為1-lOOOnM，優(yōu)選地1-800ηΜ，更優(yōu)選地1-lOOnM，再進(jìn)一步優(yōu)選地1_70ηΜ，再進(jìn)一步優(yōu) 選地1_50ηΜ，再進(jìn)一步優(yōu)選地1_40ηΜ，再進(jìn)一步優(yōu)選地1_20ηΜ，更進(jìn)一步優(yōu)選地1-lOnM， 其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd;并且其中所述單克隆抗體 與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-lOOOnM，優(yōu)選地1_800ηΜ，更優(yōu)選 地1-lOOnM，再進(jìn)一步優(yōu)選地1-70ηΜ，再進(jìn)一步優(yōu)選地1_50ηΜ，再進(jìn)一步優(yōu)選地1_40ηΜ， 再進(jìn)一步優(yōu)選地1-20ηΜ，更進(jìn)一步優(yōu)選地1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所 述單克隆抗體測定Kd。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼 古丁和(R)_(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解 離常數(shù)Kd為1-lOOnM，優(yōu)選地1-70ηΜ，再進(jìn)一步優(yōu)選地1_40ηΜ，進(jìn)一步優(yōu)選地1-ΙΟηΜ，其 中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體與所 述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-lOOnM，優(yōu)選地1_70ηΜ，再進(jìn)一步優(yōu)選 地1_50ηΜ，再進(jìn)一步優(yōu)選地1_40ηΜ，再進(jìn)一步優(yōu)選地1_20ηΜ，進(jìn)一步優(yōu)選地1-lOnM，其中 進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。在又一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所 述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-70ηΜ，優(yōu)選地1-40ηΜ，進(jìn)一步優(yōu)選地 1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克隆 抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-50ηΜ，優(yōu)選地1-20ηΜ，進(jìn)一步 優(yōu)選地1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。在一個更加非 常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，其中所述 單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選 地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼 古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆 抗體測定Kd。 在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)_尼古丁和(R) - (+)-尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 低于ΙΟΟηΜ，優(yōu)選地低于70nM，進(jìn)一步優(yōu)選地低于50nM，再進(jìn)一步優(yōu)選地低于40nM，再進(jìn)一 步優(yōu)選地低于20nM，并且再進(jìn)一步優(yōu)選地低于ΙΟηΜ，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所 述單克隆抗體測定Kd;并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的所 述解離常數(shù)Kd低于ΙΟΟηΜ，優(yōu)選地低于70nM，進(jìn)一步優(yōu)選地低于50nM，再進(jìn)一步優(yōu)選地低于 40nM，再進(jìn)一步優(yōu)選地低于20nM，并且再進(jìn)一步優(yōu)選地低于ΙΟηΜ，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用 IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合 (S)-(-)-尼古丁和(R)-(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述 結(jié)合的解離常數(shù)Kd低于70nM，優(yōu)選地低于40nM，進(jìn)一步優(yōu)選地低于ΙΟηΜ，其中進(jìn)一步優(yōu)選 地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼 古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd低于50nM，優(yōu)選地低于20nM，進(jìn)一步優(yōu)選地低于ΙΟηΜ，其中 進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。在另一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)-(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述 (S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd低于ΙΟηΜ，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的 解離常數(shù)Kd低于20，優(yōu)選地低于lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗 體測定Kd。在一個更加非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)_尼古丁和 (R)_(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 低于lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd;并且其中所述單克 隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd低于lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使 用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所述單克隆 抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)_尼古丁和(R)_(+)_尼 古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd和所述單克 隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd相等，其中優(yōu)選地使用IgG2形式 的所述單克隆抗體測定Kd。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是 一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，其 中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為所述單克隆抗體與 所述(R) “ (+)“尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd的2-5倍，優(yōu)選大約2倍，最優(yōu)選2倍，其 中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體能夠防止、減少或減慢尼古丁 向(優(yōu)選地人)腦中的進(jìn)入。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體能夠減少 尼古丁向腦中的進(jìn)入，當(dāng)在基本如實(shí)施例8所述的條件下測定時，優(yōu)選地減少至少10%、 20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %。最優(yōu)選地，所述單克隆抗體能夠減少尼古 丁向腦中的進(jìn)入，當(dāng)在基本如實(shí)施例8所述的條件下測定時，優(yōu)選地減少至少60%。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)施用于受試者，優(yōu)選地施用于人時，所述單克 隆抗體能夠防止、減少或減慢尼古丁向所述受試者(優(yōu)選地所述人)腦中的進(jìn)入，其中優(yōu)選 地所述單克隆抗體以lmg至lOOOmg，優(yōu)選地10mg至500mg，更優(yōu)選地10mg至300mg，再更優(yōu) 選地50mg至200mg，最優(yōu)選地大約100mg的量施用于所述受試者，優(yōu)選地施用于所述人?？贵w的特異性主要取決于所述抗體的重鏈可變區(qū)(HCVR)中互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的 氨基酸序列和/或所述抗體的輕鏈可變區(qū)(LCVR)的CDR。本發(fā)明公開了單克隆抗體的HCVR 的CDR(HC CDR)和LCVR的CDR(LC CDR)，其中所述單克隆抗體能夠特異性結(jié)合尼古丁。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述 HCVR包含(a) —個HC⑶R1，其中所述HCXDR1包含或者優(yōu)選地由SEQ ID N0:1、11和17 中任一個的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處； (b) 一個HC CDR2，其中所述HC CDR2包含或者優(yōu)選地由SEQ IDN0 :2、12和18中任一個的 肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的CDR2位置處；和/或(c) 一個HC CDR3，其中所述HC CDR3包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :3、4、13和19中任一個的 肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述 LCVR包含(a) 一個LC CDR1，其中所述LCXDR1包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :5、6、7、14禾口 20中任一個的肽組成；并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個LC CDR2，其中所述LC CDR2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :8、15和21中任一 個的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC CDR2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的CDR2位置處；和/或 (c) 一個LCXDR3，其中所述LC⑶R3包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :9、10、16和22中任一個 的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，一些能夠以納摩爾范圍的Kd結(jié)合尼古丁的單克隆抗體，特別是 卩0181063、川04、川42和冊49，具有不同組合的相同的此CDR和/或LC CDR(參見表1)。 此外，已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，抗體F018、F063、J004、J042和N049的重鏈和輕鏈可變區(qū)彼此非常 相關(guān)，只在幾個氨基酸位置處不同。因此，在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)所述HC⑶R1包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 1的肽組成；(b)所述HC⑶R2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 2的肽組成；且(c)所述 HC⑶R3包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 3和4中任一個的肽組成，其中優(yōu)選地(a)所述LC ⑶R1包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :5、6和7中任一個的肽組成；(b)所述LCXDR2包含或者 優(yōu)選地由SEQ ID NO 8的肽組成；且(c)所述LC⑶R3包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 9和 10中任一個的肽組成。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述HCVR包含一個構(gòu)架，其中所述構(gòu)架是V-基因區(qū)段的 VH家族的成員、優(yōu)選V-基因區(qū)段的VH4家族的成員與JH-基因區(qū)段組合的產(chǎn)物。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)所述HC⑶R1由SEQ IDN0 1的肽組成；(b)所 述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽組成；且(c)所述HC CDR3由SEQ ID NO 3的肽組成。在一個進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)所述HC⑶R1由SEQID NO :1的肽組成； (b)所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽組成；且(c)所述HC CDR3由SEQ ID NO 4的肽組 成。在一個實(shí)施方案中，所述HCVR的第7-117位由SEQ IDN0 :24、28、33和39中任一 個的肽組成。在另一個實(shí)施方案中，所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO :23、27、32、29和 38中任一個的核酸編碼。本發(fā)明的抗體可能由于克隆偽跡(cloning artifacts)而在VR的某些氨基酸位 置處與完全人抗體不同，其中這些位置一般位于可變區(qū)的N-末端和/或C-末端附近。優(yōu) 選地，為了獲得完全人抗體從抗體中除去這些偽跡。實(shí)施例6中說明了一種從仍然包含所 述克隆偽跡的抗體產(chǎn)生完全人單克隆抗體的方法。一種類似的方法應(yīng)用于此處公開的所有 HCVR和LCVR。例如，為了獲得完全人HCVR，將本發(fā)明的HCVR的第1_6位替換為SEQ ID NO 50。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述HCVR的第1-6位由SEQ ID NO :50組成。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述LC⑶R1包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :5、6和 7中任一個的肽組成；(b)所述LC⑶R2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID N0 8的肽組成；且(c) 所述LC⑶R3包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 9和10中任一個的肽組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述LCVR包含一個構(gòu)架，其中所述構(gòu)架是V-基因區(qū)段的 V入家族的成員、優(yōu)選V-基因區(qū)段的VX1家族的成員與JX基因區(qū)段組合的產(chǎn)物。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述LC CDR1由SEQ ID N0 5的肽組成；(b)所述LC CDR2 由SEQ ID NO 8的肽組成；且(c)所述LC CDR3由SEQ ID NO 9的肽組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)所述LC⑶R1由SEQ IDN0 6的肽組成；(b) 所述LC CDR2由SEQ ID NO 8的肽組成；且(c)所述LC CDR3由SEQ ID NO 10的肽組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)所述LC⑶Rl由SEQ ID NO 7的肽組成；(b)所述LC CDR2由SEQ ID NO 8的肽組成；且(c)所述LC CDR3由SEQ ID NO 10的肽組成。在一個 進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)所述LC⑶Rl由SEQ IDNO 5的肽組成；(b)所述LC⑶R2由 SEQ ID NO 8的肽組成；且(c)所述LC CDR3由SEQ ID NO 10的肽組成。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述LCVR的第5-107位由SEQID NO :26、31、35、 37和41中任一個的肽組成。在進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述LCVR的第5-107位由 SEQ ID NO :25、30、34、36和40中任一個的核酸編碼。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所 述LCVR的第1-4位由SEQ ID NO 51組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述LCVR的 第 108-110 位由 SEQ ID NO 53 組成。在一個進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 24的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 26的肽組成；(b)所述HCVR 的第7-117位由SEQ IDNO :28的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 31 的肽組成；(c)所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 33的肽組成，并且其中所述LCVR的 第5-107位由SEQ ID NO 35的肽組成；(d)所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 28的肽 組成，并且其中所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 37的肽組成；或者(e)所述HCVR的 第7-117位由SEQ ID NO 39的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 41 的肽組成。在另外一個進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 24的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 26的肽組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案，所述特異性結(jié)合尼古丁的人單克隆抗體包含至少 一個HCVR和至少一個LCVR，其中所述HCVR的第7-117位與SEQ ID NO :24、28、33和39的 第7-117位、優(yōu)選地與SEQID NO 24的第7-117位至少80%，優(yōu)選地85%，更優(yōu)選地90%， 再更優(yōu)選地95 %，甚至更優(yōu)選地至少96 %，更優(yōu)選地97 %，更優(yōu)選地98 %，更優(yōu)選地99 %， 最優(yōu)選地100%相同；并且其中所述LCVR的第5-107位與SEQ ID NO :26、31、35、37和41的 第5-107位、優(yōu)選地與SEQ ID NO 26的第5-107位至少80%，優(yōu)選地85%，更優(yōu)選地90%， 更優(yōu)選地95 %，甚至更優(yōu)選地至少96 %，更優(yōu)選地97 %，更優(yōu)選地98 %，更優(yōu)選地99 %，最 優(yōu)選地100%相同。一種肽或多肽的氨基酸序列是否與另一種的氨基酸序列至少80%、85%、90%、 95 %、97 %或99 %相同可以使用已知的計(jì)算機(jī)程序如Bestfit程序常規(guī)確定。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合尼古丁的人單克隆抗體包含至少一個 HCVR和至少一個LCVR，其中所述HCVR的第7-117位與SEQ ID NO :24、28、33和39的第 7-117位、優(yōu)選地與SEQ IDNO 24的第7-117位至少80%，優(yōu)選地85%，更優(yōu)選地90%，更 優(yōu)選地95 %，甚至更優(yōu)選地至少96 %，更優(yōu)選地97 %，更優(yōu)選地98 %，更優(yōu)選地99 %，最優(yōu) 選地100%相同；并且其中所述LCVR的第5-107位與SEQ ID NO :26、31、35、37和41的第 5-107位、優(yōu)選地與SEQ IDNO 26的第5-107位至少80%，優(yōu)選地85%，更優(yōu)選地90%，更 優(yōu)選地95 %，甚至更優(yōu)選地至少96 %，更優(yōu)選地97 %，更優(yōu)選地98 %，更優(yōu)選地99 %，最優(yōu) 選地100%相同，并且其中所述HCVR包含(i) 一個由SEQ ID NO 1的肽組成的HC⑶Rl ； (ii) 一個由SEQ ID NO 2的肽組成的HC CDR2 ；和(iii) 一個由SEQ ID NO 3的肽組成的 HC CDR3，并且其中所述LCVR包含(i) 一個由SEQ ID NO 5的肽組成的LCCDRl ； (ii) 一個 由SEQ ID NO 8的肽組成的LC CDR2 ； (iii) 一個由SEQ ID NO 9的肽組成的LC CDR3。
在一個進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 23的核酸編碼，并且其中所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 25的核酸編碼；(b)所述 HCVR的第7-117位由SEQID NO 27的核酸編碼，并且其中所述LCVR的第5-107位由SEQ IDNO 30的核酸編碼；(c)所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 32的核酸編碼，并且其中 所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 34的核酸編碼；(d)所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO :29的核酸編碼，并且其中所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO :36的核酸編碼；或者 (e)所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 38的核酸編碼，并且其中所述LCVR的第5-107 位由SEQ ID NO 40的核酸編碼。本發(fā)明的抗體可以作為單鏈抗體的形式產(chǎn)生。因此，在一個進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí) 施方案中，所述單克隆抗體包含或者優(yōu)選地由SEQ IDNO :60、62、64、66和68中任一個的肽 組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是一種單鏈抗體，其中優(yōu)選地所述 單鏈抗體包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :60、62、64、66和68中任一個的肽組成。在進(jìn)一步 非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含或者優(yōu)選地由一個肽組成，其中所述肽由SEQ ID NO :59、61、63、65和67中任一個的核酸編碼。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體表達(dá)為IgG，優(yōu)選地表達(dá)為 IgG2。因此，在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含至少一個Y2重鏈，其 中優(yōu)選地所述Y 2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :73、75、77和80中任一個的肽組成。 在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含至少一個λ輕鏈，其中優(yōu)選地所述 λ輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :74、76、78、79和81中任一個的肽組成。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含至少一個Υ 2重鏈和至少一 個λ輕鏈，其中(a)所述Y 2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ IDNO :73的肽組成，并且其中所 述λ輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 74的肽組成；(b)所述、2重鏈包含或者優(yōu)選地 由SEQ ID NO 75的肽組成，并且其中所述λ輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 76的肽組 成；(c)所述Y 2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 77的肽組成，并且其中所述λ輕鏈包 含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 78的肽組成；(d)所述、2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 75的肽組成，并且其中所述λ輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 79的肽組成；或者(e) 所述Y 2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :80的肽組成，并且其中所述λ輕鏈包含或者 優(yōu)選地由SEQ ID NO 81的肽組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含輕鏈恒定區(qū)(LCCR)，其中 優(yōu)選地所述LCCR是λ LCCR。在另一個實(shí)施方案中，(a)所述HC⑶Rl包含或者優(yōu)選地由SEQID NO 11的肽組 成；(b)所述HC⑶R2包含或者優(yōu)選地由SEQ IDNO 12的肽組成；且(c)所述HC⑶R3包含 或者優(yōu)選地由SEQ IDNO 13的肽組成，其中優(yōu)選地所述HCVR包含一個構(gòu)架，其中所述構(gòu)架 是V-基因區(qū)段的VH家族的成員、優(yōu)選V-基因區(qū)段VH4家族的成員與JH-基因區(qū)段組合的產(chǎn)物。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，(a)所述HC⑶Rl由SEQ ID NO=Il的肽組成；(b)所述 HC CDR2由SEQ ID NO 12的肽組成；且(c)所述HCCDR3由SEQ ID NO 13的肽組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HCVR的第7-121位由SEQ ID NO 43的肽 組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HCVR的第7-121位由SEQ ID NO 42的核酸編碼。并且在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HCVR的第1-6位由SEQ ID NO 50組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)所述LC CDRl包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 14的肽組成；(b)所述LC⑶R2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 15的肽組成；且(c)其中所 述LC⑶R3包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 16的肽組成，其中優(yōu)選地所述LCVR包含一個構(gòu) 架，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述構(gòu)架是V-基因區(qū)段的V κ家族的成員、優(yōu)選V-基因區(qū)段V κ 3 家族的成員與Jk基因區(qū)段組合的產(chǎn)物。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)所述LC⑶Rl由SEQ IDNO 14的肽組成； (b)所述LC CDR2由SEQ ID NO 15的肽組成；且(c)所述LC CDR3由SEQ ID NO 16的肽 組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述LCVR的第5-104位由SEQ ID NO 45的肽組 成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述LCVR的第5-104位由SEQ ID NO :44的核酸所 編碼。并且在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述LCVR的第1-4位由SEQ ID N0:52組成。 并且在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述LCVR的第105-107位由SEQ ID NO 54組成。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HCVR的第7-121位由SEQID NO 43的肽組 成，并且所述LCVR的第5-104位由SEQ ID NO 45的肽組成。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述HCVR的第7-121位由SEQ ID NO 42的核酸編碼，并且所述LCVR的第5-104位由 SEQ IDNO 44的核酸編碼。在一個進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 70的肽組成。在一個進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是一種單鏈抗體， 其中所述單鏈抗體包含或者優(yōu)選地由SEQ ID N0:70的肽組成。在一個進(jìn)一步非常優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含或者優(yōu)選地由一個肽組成，其中所述肽由SEQ ID N0:69 的核酸編碼。在一個進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含至少一個Y2重鏈， 其中所述Y 2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID N0:82的肽組成。在一個進(jìn)一步非常優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含至少一個κ輕鏈，其中所述κ輕鏈包含或者優(yōu)選地由 SEQ ID N0:83的肽組成。在一個進(jìn)一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含至少 一個Y 2重鏈和至少一個κ輕鏈，其中所述γ 2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQID NO 82的肽 組成，并且其中所述κ輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ IDNO :83的肽組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含輕鏈恒定區(qū)(LCCR)，其中 優(yōu)選地所述LCCR是κ LCCR0在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，(a)所述HC⑶Rl包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 17的肽 組成；(b)所述HC⑶R2包含或者優(yōu)選地由SEQ IDNO 18的肽組成；且(c)所述HC⑶R3包 含或者優(yōu)選地由SEQ IDNO 19的肽組成，其中優(yōu)選地所述HCVR包含一個構(gòu)架，其中所述構(gòu) 架是V-基因區(qū)段的VH家族的成員、優(yōu)選V-基因區(qū)段VH4家族的成員與JH-基因區(qū)段組合 的產(chǎn)物。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，(a)所述HC⑶Rl由SEQ ID NO 17的肽組成；(b)所述 HC CDR2由SEQ ID NO 18的肽組成；且(c)所述HCCDR3由SEQ ID NO 19的肽組成。在一 個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HCVR的第7-121位由SEQ ID NO :47的肽組成。在一個進(jìn) 一步非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HCVR的第7-121位由SEQ ID NO :46的核酸編碼。在一 個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HCVR的第1-6位由SEQ ID NO 50組成。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，(a)所述LC⑶Rl包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :20的 肽組成；(b)所述LC⑶R2包含或者優(yōu)選地由SEQ IDNO 21的肽組成；且(c)其中所述LC ⑶R3包含或者優(yōu)選地由SEQ IDNO 22的肽組成，其中優(yōu)選地所述LCVR包含一個構(gòu)架，其中 所述構(gòu)架是V-基因區(qū)段的V λ家族的成員、優(yōu)選V-基因區(qū)段νλ 家族的成員與JX基因 區(qū)段組合的產(chǎn)物。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，(a)所述LC⑶Rl由SEQ ID NO 20的肽組成；(b)所述 LC CDR2由SEQ ID NO 21的肽組成；且(c)所述LCCDR3由SEQ ID NO 22的肽組成。 在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 49的肽 組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 48的核酸 編碼。并且在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述LCVR的第1-4位由SEQ ID NO :51組成。并且在 一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述LCVR的第108-110位由SEQ ID N0:53組成。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HCVR的第7-121位由SEQID NO 47的肽組 成，并且所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 49的肽組成。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HCVR的第7-121位由SEQID NO :46的核酸編 碼，并且所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 48的核酸編碼。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含或者優(yōu)選地由SEQID NO 72的肽組 成。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是一種單鏈抗體，其中所述單鏈抗體包含 或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :72的肽組成。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含或者 優(yōu)選地由一個肽組成，其中所述肽由SEQ ID NO 71的核酸編碼。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含至少一個Y2重鏈，其中 優(yōu)選地所述Y 2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 84的肽組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含至少一個λ輕鏈，其中所 述λ輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 85的肽組成。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含至少一個Υ 2重鏈和至少一 個λ輕鏈，其中所述Y 2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ IDNO :84的肽組成，并且其中所述λ 輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 85的肽組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含輕鏈恒定區(qū)(LCCR)，其中 優(yōu)選地所述LCCR是λ LCCR。本發(fā)明的單克隆抗體可以作為天然存在的形式或合成的形式重組產(chǎn)生。以下實(shí)施 方案詳細(xì)說明了本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方案。在一個實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是一 種重組抗體。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體是選自以下的抗體(a)單鏈抗 體，優(yōu)選地 scFv ;(b)Fab 片段；(c)F(ab，)2 片段；(cOscFv-Fc 融合蛋白；(e) IgGl ； (f) IgG2 ； (g) IgG3 ； (h) IgG4 ；⑴ IgA ； (j) IgE ； (k) IgM ； (1) IgD ；和(m)雙鏈抗體。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含或者優(yōu)選地由正好一個HCVR和/或 正好一個LCVR組成。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含重鏈恒定區(qū)(HCCR)，其中 優(yōu)選地所述 HCCR 選自(a) γ HCCR、(b) α HCCR、(c) ε HCCR、(d)我們的 HCCR，和(e) δ HCCR, 其中進(jìn)一步優(yōu)選地，所述HCCR，優(yōu)選地所述γ HCCR、α HCCR、ε HCCR、我們的HCCR和/或 δ HCCR,是人 HCCR。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HCCR是YHCCR，其中優(yōu)選地所述Y HCCR選 自(a) y 1HCCR ； (b) y 2HCCR ； (d) y 3HCCR ；和(c) y 4HCCR ；其中優(yōu)選地所述 y HCCR 是 y2HCCR。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含輕鏈恒定區(qū)(LCCR)，其中 優(yōu)選地所述LCCR選自(a) X LCCR;和(b) k LCCR，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述LCCR，最優(yōu)選地所 述入LCCR和/或所述k LCCR,是人LCCR。優(yōu)選地，本發(fā)明的單克隆抗體是IgG2，最優(yōu)選地是完全人IgG2。因此，在一個優(yōu)選 實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含兩個，優(yōu)選正好兩個所述、2重鏈，其中進(jìn)一步優(yōu)選地， 所述兩個，優(yōu)選地所述正好兩個所述Y 2重鏈?zhǔn)窍嗤?。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體包含兩個，優(yōu)選地正好兩個輕 鏈，其中優(yōu)選地所述輕鏈選自(a) A輕鏈；和(b) k輕鏈；其中進(jìn)一步優(yōu)選地，所述兩個，優(yōu) 選地所述正好兩個所述輕鏈?zhǔn)窍嗤?。?yōu)選地，所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC ⑶R1，其中所述HC⑶R1包含或者優(yōu)選地由SEQID NO :1、11和17中任一個的肽組成，非常 優(yōu)選地由SEQ ID NO :1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的 CDR1位置處；(b) 一個HC CDR2，其中所述HC CDR2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :2、12和 18中任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQID NO :2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2 位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和/或(c) 一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3包含 或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :3、4、13和19中任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQ ID NO 3的 肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的CDR3位置處；和/或，優(yōu) 選地，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LCXDR1，其中 所述LC⑶R1包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :5、6、7、14和20中任一個的肽組成；非常優(yōu)選 地由SEQ ID NO :5的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1 位置處；(b) 一個LC CDR2，其中所述LC CDR2包含或者優(yōu)選地由SEQ IDN0 :8、15和21中 任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQ ID NO :8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于 所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和/或(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3包含或者 優(yōu)選地由SEQ ID NO :9、10、16和22中任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQID NO 9的肽組 成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R)-(+)_尼古丁 ；并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) 一個HC⑶R1，其中所述HC⑶R1由SEQ ID NO :1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCXDR1位 于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個HC⑶R2，其中所述HC⑶R2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HCCDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NO :3的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR3位 于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中 所述LCVR包含(a) 一個LC CDR1，其中所述LC CDR1由SEQ ID NO 5的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述 LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 9的肽組成，并且其 中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R) - (+)-尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 為0. 1-lOnM，優(yōu)選地1-lOnM ；并且其中所述單克隆抗體與所述(R) _(+) _尼古丁的所述結(jié) 合的解離常數(shù)Kd為0. 1-lOnM，優(yōu)選地1-lOnM，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗 體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC ⑶R1，其中所述HCXDR1由SEQ ID NO 1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述 HCVR的構(gòu)架內(nèi)的CDR1位置處；(b) —個HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽 組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個 HC CDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NO :3的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCCDR3位于所 述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述 LCVR包含(a) —個LCXDR1，其中所述LC⑶R1由SEQ ID NO 5的肽組成，并且其中優(yōu)選地 所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2 由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2 位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 9的肽組成，并且其中優(yōu)選 地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R) - (+)-尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 為0. 1-lOnM，優(yōu)選地1-lOnM ；并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合 的解離常數(shù)Kd為0. 1-lOnM，優(yōu)選地1-lOnM，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體 測定Kd;并且其中所述單克隆抗體包含一個Y 2重鏈和一個\輕鏈，其中所述Y2重鏈包 含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 73的肽組成，并且其中所述\輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 74的肽組成。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是 一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，其 中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd等于，優(yōu)選地2-5倍 于，更優(yōu)選地大約2倍于，最優(yōu)選地2倍于所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述 結(jié)合，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd，并且其中所述單克隆抗體包含 至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC CDR1，其中所述HC CDR1由SEQ ID NO 1 的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) —個 HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR2位于 所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 3的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且， 其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC⑶R1，其中所述 LC⑶R1由SEQ ID NO 5的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi) 的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所 述LC⑶R3由SEQ IDN0 9的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架 內(nèi)的⑶R3位置處。優(yōu)選地，所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC ⑶R1，其中所述HC⑶R1包含或者優(yōu)選地由SEQID NO :1、11和17中任一個的肽組成，非常 優(yōu)選地由SEQ ID NO :1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的 CDR1位置處；(b) 一個HC CDR2，其中所述HC CDR2包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :2、12和 18中任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQID NO :2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2 位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和/或(c) 一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3包含 或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :3、4、13和19中任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQ ID NO 3的 肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的CDR3位置處；和/或，優(yōu) 選地，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LCXDR1，其中 所述LC⑶R1包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :5、6、7、14和20中任一個的肽組成；非常優(yōu)選 地由SEQ ID NO :5的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1 位置處；(b) 一個LC CDR2，其中所述LC CDR2包含或者優(yōu)選地由SEQ IDN0 :8、15和21中 任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQ ID NO :8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于 所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和/或(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3包含或者 優(yōu)選地由SEQ ID NO :9、10、16和22中任一個的肽組成，非常優(yōu)選地由SEQID NO 9的肽組 成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個更加非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)_尼古丁和 (R) - (+)-尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 低于lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克 隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd低于lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使 用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd，并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中 所述HCVR包含(a) —個HC⑶R1，其中所述HC⑶R1由SEQ ID NO 1的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個HC⑶R2，其中所述 HC⑶R2由SEQ ID NO :2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCXDR2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的 ⑶R2位置處；和(c) 一個HCXDR3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 3的肽組成，并且其中優(yōu) 選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含 至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC CDR1，其中所述LC CDR1由SEQ ID NO 5 的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) —個 LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于 所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 9的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R)-(+)_尼古丁 ；并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) 一個HC⑶R1，其中所述HC⑶R1由SEQ ID NO :1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCXDR1位 于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個HC⑶R2，其中所述HC⑶R2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HCCDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NO :4的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR3位 于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中 所述LCVR包含(a) 一個LC⑶R1，其中所述LC⑶R1由SEQ ID NO 6的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述 LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi) 的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 10的肽組成，并且 其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R)-(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù) Kd為lO-lOOnM，優(yōu)選地25-75nM，最優(yōu)選地25_35nM ；并且其中所述單克隆抗體與所述 (R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為0. 1-lOnM，優(yōu)選地1-lOnM，其中優(yōu)選地使用 IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所 述HCVR包含(a) —個HCXDR1，其中所述HC⑶R1由SEQ ID NO 1的肽組成，并且其中優(yōu) 選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個HC⑶R2，其中所述HC ⑶R2由SEQ ID NO :2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的 ⑶R2位置處；和(c) 一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 4的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包 含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC⑶R1，其中所述LC⑶R1由SEQ ID NO 6的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) — 個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO :8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位 于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ IDN0 10的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R)-(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù) Kd為lO-lOOnM，優(yōu)選地25-75nM，最優(yōu)選地25_35nM ；并且其中所述單克隆抗體與所述 (R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為0. 1-lOnM，優(yōu)選地1-lOnM，其中優(yōu)選地使用 IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd;所述單克隆抗體包含一個Y2重鏈和一個入輕鏈，其 中所述Y2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ IDN0:75的肽組成，并且其中所述\輕鏈包含或者 優(yōu)選地由SEQ ID NO 76的肽組成。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是 一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，其 中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd等于，優(yōu)選地2-7倍 于，更優(yōu)選地大約5倍于，最優(yōu)選地5倍于所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述 結(jié)合，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd，并且其中所述單克隆抗體包含 至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC CDR1，其中所述HC CDR1由SEQ ID NO 1 的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) —個HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR2位于 所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 4的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且， 其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC⑶R1，其中所述 LC⑶R1由SEQ ID NO 6的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi) 的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所 述LC⑶R3由SEQ IDN0 10的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架 內(nèi)的⑶R3位置處。在一個更加非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)_尼古丁和 (R) - (+)-尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 低于40nM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克 隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd低于lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使 用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd，并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中 所述HCVR包含(a) —個HC⑶R1，其中所述HC⑶R1由SEQ ID NO 1的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個HC⑶R2，其中所述 HC⑶R2由SEQ ID NO :2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCXDR2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的 ⑶R2位置處；和(c) 一個HCXDR3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 4的肽組成，并且其中優(yōu) 選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含 至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC CDR1，其中所述LC CDR1由SEQ ID NO 6 的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) —個 LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于 所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 10的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R)-(+)_尼古丁 ；并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) 一個HC⑶R1，其中所述HC⑶R1由SEQ ID NO :1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCXDR1位 于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個HC⑶R2，其中所述HC⑶R2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HCCDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NO :4的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR3位 于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中 所述LCVR包含(a) —個LC⑶R1，其中所述LC⑶R1由SEQ ID NO 7的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述 LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi) 的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 10的肽組成，并且 其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和(R)-(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為ΙΟ-ΙΟΟηΜ，優(yōu)選地25-75nM;并且其中所述單克隆抗體與所述(R) _ (+)-尼古丁的所述結(jié) 合的解離常數(shù)Kd為1-20ηΜ，優(yōu)選地10-15nM，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗 體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC ⑶R1，其中所述HCXDRl由SEQ ID NO 1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶Rl位于所述 HCVR的構(gòu)架內(nèi)的CDRl位置處；(b) —個HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽 組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個 HC CDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NO :4的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCCDR3位于所 述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述 LCVR包含(a) —個LCXDRl，其中所述LC⑶Rl由SEQ ID NO 7的肽組成，并且其中優(yōu)選地 所述LC CDRl位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的CDRl位置處；(b) 一個LC CDR2，其中所述LC CDR2 由SEQ ID NO :8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2 位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 10的肽組成，并且其中優(yōu)選 地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R)-(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 為ΙΟ-ΙΟΟηΜ，優(yōu)選地25-75nM;并且其中所述單克隆抗體與所述(R) _ (+)-尼古丁的所述結(jié) 合的解離常數(shù)Kd為1-20ηΜ，優(yōu)選地10-15nM，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體 測定Kd;并且其中所述單克隆抗體包含一個Y 2重鏈和一個λ輕鏈，其中所述γ 2重鏈包 含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :77的肽組成，并且其中所述λ輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 78的肽組成。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是 一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)-(+)-尼古丁，其 中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd等于，優(yōu)選地2-7倍 于，更優(yōu)選地大約5倍于，最優(yōu)選地5倍于所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述 結(jié)合，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd，并且其中所述單克隆抗體包含 至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC CDRl，其中所述HC CDRl由SEQ ID NO 1 的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶Rl位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶Rl位置處；(b) —個 HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR2位于 所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 4的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且， 其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC⑶R1，其中所述 LC⑶Rl由SEQ ID NO 7的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶Rl位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi) 的⑶Rl位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所 述LC⑶R3由SEQ IDNO 10的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架 內(nèi)的⑶R3位置處。在一個更加非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)_尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 低于75nM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克 隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd低于15nM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使 用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd，并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中 所述HCVR包含(a) —個HC⑶R1，其中所述HC⑶R1由SEQ ID NO 1的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個HC⑶R2，其中所述 HC⑶R2由SEQ ID NO :2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCXDR2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的 ⑶R2位置處；和(c) 一個HCXDR3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 4的肽組成，并且其中優(yōu) 選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含 至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC CDR1，其中所述LC CDR1由SEQ ID NO 7 的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) —個 LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于 所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 10的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R) - (+)-尼古丁，并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) 一個HC⑶R1，其中所述HC⑶R1由SEQ ID NO :1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCXDR1位 于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個HC⑶R2，其中所述HC⑶R2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HCCDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NO :4的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR3位 于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中 所述LCVR包含(a) 一個LC⑶R1，其中所述LC⑶R1由SEQ ID NO 5的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述 LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi) 的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 10的肽組成，并且 其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R) - (+)-尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 為20-60nM，優(yōu)選地30-50nM;并且其中所述單克隆抗體與所述(R) _(+)-尼古丁的所述結(jié) 合的解離常數(shù)Kd為0. 1-lOnM，優(yōu)選地1-lOnM，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗 體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC ⑶R1，其中所述HCXDR1由SEQ ID NO 1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述 HCVR的構(gòu)架內(nèi)的CDR1位置處；(b) —個HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽 組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個 HC CDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NO :4的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCCDR3位于所 述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述 LCVR包含(a) —個LCXDR1，其中所述LC⑶R1由SEQ ID NO 5的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC CDR1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的CDR1位置處；(b) 一個LC CDR2，其中所述LC CDR2 由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2 位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 10的肽組成，并且其中優(yōu)選 地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R) - (+)-尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 為20-60nM，優(yōu)選地30-50nM ；并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合 的解離常數(shù)Kd為0. 1-lOnM，優(yōu)選地1-lOnM，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體 測定Kd;其中所述單克隆抗體包含一個Y 2重鏈和一個\輕鏈，其中所述Y 2重鏈包含或 者優(yōu)選地由SEQ ID NO 75的肽組成，并且其中所述\輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 79的肽組成。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是 一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，其 中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd等于，優(yōu)選地2-7倍 于，更優(yōu)選地大約4倍于，最優(yōu)選地4倍于所述單克隆抗體與所述(R) - (+)-尼古丁的所述 結(jié)合，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd，并且其中所述單克隆抗體包含 至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC CDR1，其中所述HC CDR1由SEQ ID NO 1 的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) —個 HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR2位于 所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 4的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且， 其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC⑶R1，其中所述 LC⑶R1由SEQ ID NO 5的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi) 的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所 述LC⑶R3由SEQ IDN0 :10的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架 內(nèi)的⑶R3位置處。在一個更加非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)_尼古丁和 (R) - (+)-尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 低于60nM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中所述單克 隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd低于lOnM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使 用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd，并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中 所述HCVR包含(a) —個HC⑶R1，其中所述HC⑶R1由SEQ ID NO 1的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個HC⑶R2，其中所述 HC⑶R2由SEQ ID NO :2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCXDR2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的 ⑶R2位置處；和(c) 一個HCXDR3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 4的肽組成，并且其中優(yōu) 選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含 至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC CDR1，其中所述LC CDR1由SEQ ID NO 5的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) —個 LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于 所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 10的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R) -(+)-尼古丁，并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) 一個HC⑶R1，其中所述HC⑶R1由SEQ ID NO :1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCXDR1位 于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個HC⑶R2，其中所述HC⑶R2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HCCDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NO :4的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC CDR3位 于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中 所述LCVR包含(a) 一個LC⑶R1，其中所述LC⑶R1由SEQ ID NO 6的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述 LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi) 的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 10的肽組成，并且 其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R) - (+)-尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 為20-80nM，優(yōu)選地30-75nM;并且其中所述單克隆抗體與所述(R) _(+)-尼古丁的所述結(jié) 合的解離常數(shù)Kd為0. l-15nM，優(yōu)選地l_12nM，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗 體測定Kd ；并且其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC ⑶R1，其中所述HCXDR1由SEQ ID NO 1的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R1位于所述 HCVR的構(gòu)架內(nèi)的CDR1位置處；(b) —個HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽 組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個 HC CDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NO :4的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HCCDR3位于所 述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述 LCVR包含(a) —個LCXDR1，其中所述LC⑶R1由SEQ ID NO 6的肽組成，并且其中優(yōu)選地 所述LC⑶R1位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R1位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2 由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2 位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 10的肽組成，并且其中優(yōu)選 地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處。在一個非常優(yōu)選的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所 述單克隆抗體是一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(s)-(-)-尼古丁和 (R) - (+)-尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd 為20-80nM，優(yōu)選地30-75nM ；并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合 的解離常數(shù)Kd為0. l-15nM，優(yōu)選地l_12nM，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體 測定Kd;其中所述單克隆抗體包含一個Y 2重鏈和一個\輕鏈，其中所述Y 2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 80的肽組成，并且其中所述λ輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 81的肽組成。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是 一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)-(+)-尼古丁，其 中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd等于，優(yōu)選地2-7倍 于，更優(yōu)選地大約3倍于，最優(yōu)選地3倍于所述單克隆抗體與 所述(R)_(+)_尼古丁的所述 結(jié)合，其中優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd，并且其中所述單克隆抗體包含 至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HC CDR1，其中所述HC CDRl由SEQ ID NO 1 的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶Rl位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶Rl位置處；(b) —個 HC⑶R2，其中所述HC⑶R2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于 所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 4的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且， 其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC⑶R1，其中所述 LC⑶Rl由SEQ ID NO 6的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶Rl位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi) 的⑶Rl位置處；(b) 一個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO 8的肽組成，并且其中 優(yōu)選地所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所 述LC⑶R3由SEQ IDNO 10的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架 內(nèi)的CDR3位置處。在一個更加非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼 古丁和(R)_(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離 常數(shù)Kd低于80nM，其中進(jìn)一步優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd ；并且其中 所述單克隆抗體與所述(R)-(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd低于15nM，其中進(jìn)一步 優(yōu)選地使用IgG2形式的所述單克隆抗體測定Kd，并且其中所述單克隆抗體包含至少一個 HCVR，其中所述HCVR包含(a) —個HCXDRl，其中所述HC⑶Rl由SEQ ID NO 1的肽組成， 并且其中優(yōu)選地所述HC⑶Rl位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶Rl位置處；(b) 一個HC⑶R2， 其中所述HC⑶R2由SEQ ID NO 2的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R2位于所述HCVR 的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO :4的肽組 成，并且其中優(yōu)選地所述HC⑶R3位于所述HCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R3位置處；并且，其中所述 單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(a) —個LC⑶R1，其中所述LC⑶Rl 由SEQ ID NO 6的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶Rl位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶Rl 位置處；(b) —個LC⑶R2，其中所述LC⑶R2由SEQ ID NO :8的肽組成，并且其中優(yōu)選地 所述LC⑶R2位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的⑶R2位置處；和(c) 一個LC⑶R3，其中所述LC ⑶R3由SEQ IDNO 10的肽組成，并且其中優(yōu)選地所述LC⑶R3位于所述LCVR的構(gòu)架內(nèi)的 ⑶R3位置處。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何使用特異性結(jié)合尼古丁的第一抗體的HCVR 從合適的來源中選擇相應(yīng)的LCVR，以及產(chǎn)生第二抗體，其中所述第二抗體包含所述第一抗 體的所述HCVR和選擇的LCVR，并且其中所述第二抗體能夠以與所述第一抗體大約相同的 特異性結(jié)合尼古丁(“鏈改組(chain suf fling)”，參見實(shí)施例9)。而且本領(lǐng)域技術(shù)人員明 白，以類似的方式，可以使用第一抗體的LCVR從合適的來源中選擇相應(yīng)的HCVR。用于擴(kuò)增 LCVR和/或HCVR的合適的來源是，例如，來自天然人B細(xì)胞的cDNA、來自用尼古丁 -載體偶聯(lián)物免疫的人受試者的B細(xì)胞的cDNA，以及完全合成的文庫，如Morphosys'HuCAL文庫。 這些方法在 Kang AS 等人.(Proc Natl AcadSci USA 88，11120-11123，1991)，Marks JD 等 人.(Biotechnology (N Y) 10，779-783，1992)，和 Jespers 等人.(Biotechnology (N Y) 12， 899-903,1994)中有詳細(xì)描述。因此，本發(fā)明的一個進(jìn)一步的方面是單克隆抗體的HCVR，其中所述單克隆抗體是 一種人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體特異性結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼 古丁，并且其中所述HCVR包含(a) —個HC⑶R1，其中所述HC CDR1由SEQ ID NO 1的肽 組成；(b) 一個HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽組成；和(c) 一個HC CDR3， 其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 3和4中任一個的肽組成。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO :24、28、33和39中 任一個的肽組成。本發(fā)明的另一方面是單克隆抗體的LCVR，其中所述單克隆抗體是一種人單克隆抗 體，并且其中所述單克隆抗體特異性結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁，并且其中所 述LCVR包含(a) 一個LCCDR1，其中所述LC CDR1由SEQ ID NO :5、6和7中任一個的肽組 成；(b) 一個LC CDR2，其中所述LC CDR2由SEQ ID NO 8的肽組成；(c) 一個LC CDR3，其 中所述LC⑶R3由SEQ ID NO 9和10中任一個的肽組成。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述LCVR的第5-107位由SEQ IDN0 :26、31、35、37和41 中任一個的肽組成。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種編碼本發(fā)明的可變區(qū)、本發(fā)明的單克隆抗體或 其各個鏈的核酸分子。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼選自以下的肽(a)本發(fā) 明的HCVR，其中優(yōu)選地所述HCVR包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :24、28、33、39、43和47中 任一個的肽組成；(b)本發(fā)明的LCVR，其中優(yōu)選地所述LCVR包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 26、31、35、37、41、45和49中任一個的肽組成；(c)本發(fā)明的單鏈抗體，其中優(yōu)選地所述單鏈 抗體包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :60、62、64、66、68、70和72中任一個的肽組成；(d)本發(fā) 明的Y 2重鏈，其中優(yōu)選地所述Y 2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ IDN0 73、75、77、80、82和 84中任一個的肽組成；(e)本發(fā)明的\輕鏈，其中優(yōu)選地所述\輕鏈包含或者優(yōu)選地由 SEQ ID N0:74、76、78、79、81和85中任一個的肽組成，(f)本發(fā)明的k輕鏈，其中優(yōu)選地所 述k輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 83的肽組成；和(g)本發(fā)明的單克隆抗體。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或由以下序列組成SEQ ID NO :23、27、29、32、38、42 和 46 中任一個的核苷酸序列；和 / 或 SEQ ID NO :25、30、34、36、40、 44和48中任一個的核苷酸序列；和/或SEQ ID NO :59、61、63、65、67、69和71中任一個的 核苷酸序列。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含至少一種本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)載體。適于 表達(dá)本發(fā)明的單克隆抗體的表達(dá)載體例如在PCT/EP2007/061570中公開。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的至少一種核酸分子或至少一種表達(dá)載 體的宿主細(xì)胞，其中優(yōu)選地所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞或真核細(xì)胞。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中， 所述宿主細(xì)胞是選自以下的真核細(xì)胞(a)酵母細(xì)胞，(b)昆蟲細(xì)胞；和(c)哺乳動物細(xì)胞， 其中優(yōu)選地所述哺乳動物細(xì)胞選自HEK-293T細(xì)胞、CH0細(xì)胞和COS細(xì)胞。非常優(yōu)選地，所 述哺乳動物細(xì)胞是HEK-293T細(xì)胞。
本發(fā)明的單克隆抗體可以摻入適于向受試者施用的組合物中。因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種包含至少一種本發(fā)明的單克隆抗體的藥物組合物，其中優(yōu)選地所述 藥物組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。藥學(xué)上可接受的載體、稀 釋劑或賦形劑例如在 Remington，The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Gennaro (ed. )，Mack publishing Co.，Easton，PA，1995 中公開。本發(fā)明的藥物組合物以單 劑量或多劑量施用。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物進(jìn)一步包含至少一種另外的抗體，其中 優(yōu)選地所述至少一種另外的抗體特異性結(jié)合尼古丁。本發(fā)明的單克隆抗體可以用于被動免疫，優(yōu)選地用于人的被動免疫，進(jìn)一步優(yōu)選 地用于對抗尼古丁。本發(fā)明的單克隆抗體因此在尼古丁成癮的治療中有用。在進(jìn)一步的方 面，本發(fā)明涉及一種被動免疫方法，優(yōu)選地對抗尼古丁的被動免疫方法，所述方法包括向受 試者施用有效量的本發(fā)明的單克隆抗體或有效量的本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的單克隆抗體和/或藥物組合物優(yōu)選地施用于受試者，優(yōu)選地施用于人， 使用標(biāo)準(zhǔn)給藥技術(shù)，優(yōu)選地選自口服、靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、皮下給藥、經(jīng)肺給藥、透皮 給藥、肌肉內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥、口腔給藥、舌下給藥和栓劑給藥。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種治療尼古丁成癮的方法，所述方法包括向受試 者施用有效量的本發(fā)明的單克隆抗體或有效量的本發(fā)明的藥物組合物，其中優(yōu)選地所述受 試者是人，并且其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述受試者為尼古丁成癮的。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于被動免疫的本發(fā)明的單克隆抗體或本發(fā)明的藥 物組合物，優(yōu)選地用于對抗尼古丁，優(yōu)選地用于人，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述單克隆抗體施用 于所述人。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于治療(優(yōu)選地人的)尼古丁成癮的本發(fā)明的單 克隆抗體或本發(fā)明的藥物組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的單克隆抗體在制備用于被動免疫(優(yōu)選地 對抗尼古丁)的藥物中的用途。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于被動免疫(優(yōu)選地對抗尼古丁)的本發(fā)明的單 克隆抗體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的單克隆抗體在制備用于治療(優(yōu)選地人 的)尼古丁成癮的藥物中的用途。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及在治療(優(yōu)選地人的)尼古丁成癮的方法中使用的 本發(fā)明的單克隆抗體。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的抗體在定量和/或定性檢測尼古丁的方法中的應(yīng) 用，優(yōu)選地檢測血樣，最優(yōu)選地通過ELISA檢測。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的所有方面都涉及此處公開的任何單克隆抗體。 實(shí)施例實(shí)施例1通過哺乳動物細(xì)胞展示法鑒定尼古丁特異性單鏈抗體使用BD Vacutainer CPT 試管法(BD Bioscience)，從接種 QP -尼古丁的志愿者的32ml肝素化血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。PBMC與Alexa 647nm-標(biāo)記的 Q3 (3 u g/ml)和小鼠y球蛋白(10ug/ml Jackson ImmunoResearch)預(yù)溫育，然后用以下 物質(zhì)染色(1)Q3-尼古丁 (1 U g/ml)與Alexa 488nm_標(biāo)記的Q3 -特異性小鼠mAb (1 y g/ ml)和Alexa488nm-標(biāo)記的尼古丁特異性小鼠mAb(l u g/ml)組合；(2)PE_標(biāo)記的小鼠 抗人 IgM(l 50 稀釋；BD Biosciences Pharmingen)，小鼠抗人 IgD (1 100 稀釋；BD Biosciences Pharmingen)，/」、鼠抗人 CD14 (1 ； 50 稀釋；BD Biosciences Pharmingen)禾口 小鼠抗人CD3(1 50稀釋；BD BiosciencesPharmingen)抗體；和(4) PE-德克薩斯紅-標(biāo) 記的小鼠抗人CD19抗體(1 50稀釋；Caltag Laboratories)。染色后，洗滌并過濾細(xì)胞， 并且在FACSVantage SE流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)中分選443個尼古丁特異性B細(xì) 胞(FL1-陽性、FL2-陰性、FL3-陽性、FL4-陰性)?；救缫郧八鍪褂每乖禺愋訠細(xì)胞構(gòu)建基于辛德畢斯病毒的scFv細(xì)胞表 面展示文庫(基于辛德畢斯病毒的篩選總的請見W01999/025876A1，其在抗體篩選中的應(yīng) 用請見PCT/EP2007/061570)。展示尼古丁特異性scFv抗體的細(xì)胞使用RNase-尼古丁與 RNase特異性兔多克隆抗體(2. 5 u g/ml ；Abeam)和FITC-標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體(1. 5 u g/ ml Jackson ImmunoResearch)的組合進(jìn)行分離。將每個細(xì)胞分選到含有50%匯合的BHK 飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板的一個孔中。病毒擴(kuò)散后(分選后2天)，通過FACS分析檢測感染的細(xì) 胞的尼古丁結(jié)合，以鑒定編碼尼古丁特異性scFv抗體的病毒克隆。實(shí)施例2尼古丁特異性抗體的基因拯救、ELISA篩選和測序如以前所述(參見申請PCT/EP2007/061570)對編碼推斷的尼古丁特異性抗體的 BHK細(xì)胞的上清液(均含有單克隆重組辛德畢斯病毒)進(jìn)行RT-PCR。得到的各自包含scFv 編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切核酸酶Sfil消化，并克隆到表達(dá)載體pCEP-SP-Sfi-Fc (在 申請PCT/EP2007/061570中作為SEQ ID N0:37公開)中，以允許在CMV啟動子的控制下表 達(dá)與C-末端人Fc- y 1結(jié)構(gòu)域融合的scFv蛋白。對于ELISA 分析，使用 Lipofectamin 2000 (Invitrogen)，按照廠商推薦，以 24 孔 板的形式，用每個克隆轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染2_3天后，收集含有瞬時表達(dá)的scFv-Fc 融合蛋白的上清液。為了檢查尼古丁特異性結(jié)合，用在磷酸鹽緩沖液(PBS)中濃度為 4 u g/ml的尼古丁偶聯(lián)的RNAse包被ELISA板，4°C過夜。平行地，通過夾心法ELISA監(jiān)測 scFv-Fc表達(dá)水平。為此，用濃度為2. 5iig/ml的Fcy特異性的山羊抗人F(ab' ) 2抗體 (Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-006-098)包被一組相同的板。然后用洗滌 緩沖液(PBS/0. 05% Tween)洗板，并用洗滌緩沖液中的3% BSA在室溫下封閉2小時。然 后再次洗板，并與開始于1/10稀釋液的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的3倍連續(xù)稀釋液溫育。所有稀釋 都在洗滌緩沖液中進(jìn)行。板在室溫下溫育2小時，然后用洗滌緩沖液充分洗滌。然后如下 檢測結(jié)合的scFv-Fc融合蛋白與HRP0-標(biāo)記的Fc Y _特異性山羊抗人IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-035-098)溫育1小時。用洗滌緩沖液充分洗滌后，用 0PD溶液將板顯色(1個0PD片，25ml 0PD緩沖液和8u 1 30% H202) 5-10分鐘，用5% H2S04 溶液終止反應(yīng)。然后用ELISA讀板器(Biorad Benchmark)在0D 450nm讀板。編碼尼古丁特異性scFv抗體的ELISA陽性克隆如以前所述進(jìn)行測序(參見申請 PCT/EP2007/061570)，包括克隆 F018、F063、J004、J042、N049、1022 和 N038 (參見表 2)。
表2.尼古丁特異性scFv抗體的核酸序列和氨基酸序列的SEQ ID NO 其中，所有重鏈可變區(qū)包含VH4家族序列(SEQ ID NO :24、28、33、39、43和47)。除 包含Vk 3序列(SEQ ID NO 45)的1022以外，輕鏈可變區(qū)都包含V X 1家族序列(SEQ ID NO :26、31、35、37、41 和 49)。重要的是，抗體 F018、F063、J004、J042 和 N049 的重鏈和輕鏈 可變區(qū)彼此非常密切地相關(guān)，僅在幾個氨基酸位點(diǎn)處不同。克隆F063和J042的重鏈可變 區(qū)相同(SEQ ID N0:28)。關(guān)于尼古丁結(jié)合抗體的可變區(qū)包含的核酸序列和氨基酸序列的 概括在表3中提供。表3.尼古丁特異性抗體HCVR和LCVR包含的核酸序列和氨基酸序列的SEQ ID NO “所有HCVR包含VH4序列；2)除了 1022的LCVR以外，所有LCVR包含V A 1序列；
SI022 的 LCVR 包含 VK 3 序列。實(shí)施例3尼古丁特異性scFv-Fc融合蛋白的表達(dá)和純化scFv-Fc融合蛋白的大規(guī)模表達(dá)在HEK-293T細(xì)胞中進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前一天，對于 將要表達(dá)的每種蛋白質(zhì)，將5xl06個293T細(xì)胞接種到10cm組織培養(yǎng)板上。然后使用 Lipofectamin Plus (Invitrogen)，按照廠商推薦，用相應(yīng)的scFv-Fc融合構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 溫育1天，并重新接種到一塊存在1 P g/ml嘌呤霉素的14cm培養(yǎng)皿上。選擇3天后，將嘌呤 霉素抗性細(xì)胞轉(zhuǎn)移到三個用聚-L-賴氨酸包被的14cm板上，并生長至匯合。然后將培養(yǎng)基 替換為無血清培養(yǎng)基，每3天收集含有相應(yīng)的scFv-Fc融合蛋白的上清液，并通過0. 22 y M Millex GV 無菌濾器(Millipore)過濾。對于每種scFv-Fc融合蛋白，將連續(xù)收獲物合并在一起，并且加到蛋白 A-sepharose柱上。用10倍柱體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗柱，結(jié)合的蛋白質(zhì)用0. 1M甘 氨酸pH 3. 6洗脫。將lml級分收集在含有用于中和的0. lml 1M Tris pH 7. 5的試管中。 通過SDS-PAGE分析并合并含蛋白質(zhì)級分。通過使用10’000MWC0 Slide-A_Lyzer透析盒 (Pierce)透析將緩沖液更換為PBS。然后將PBS中的純化蛋白質(zhì)通過0. 22 y匪illex GV 無菌濾器(Millipore)過濾，并等分。將工作貯存液保存在4°C下，而長期貯存的等份在液 氮中快速冰凍，并保存在-80°C下。實(shí)施例4通過抑制ELISA驗(yàn)證尼古丁特異性結(jié)合為了排除抗體的可能的接頭特異性，通過抑制ELISA證實(shí)與游離尼古丁的結(jié)合。 因此，ELISA板用在磷酸鹽緩沖液(PBS)中濃度為4 u g/ml的尼古丁 -偶聯(lián)的RNAse包被， 4°C過夜。然后用洗滌緩沖液(PBS/0.05%Tween)洗板，并在室溫下用洗滌緩沖液中的3% BSA封閉2小時。然后再次洗板，在存在或不存在濃度逐漸提高的游離尼古丁(0. 1-100 uM) 的情況下，與濃度為 100ng/ml 的純化的 scFv-F018、scFv_F063、scFv-1022、scFv_J004、 scFv-N038和ScFv-N049溫育。板在室溫下溫育2小時，然后用洗滌緩沖液充分洗滌。然 后如下檢測結(jié)合的scFv-Fc融合蛋白與HRP0-標(biāo)記的Fc Y _特異性山羊抗人IgG抗體 (Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-035-098)溫育 1 小時。用洗滌緩沖液充分 洗滌后，用0PD溶液使板顯色(1個0PD片，25ml 0PD緩沖液和8 yl 30% H202) 5-10分鐘， 并用5%H2S04溶液終止反應(yīng)。然后用ELISA讀板器(Biorad Benchmark)在0D 450nm讀 板。每種抗體與固定的尼古丁的結(jié)合被游離的尼古丁有效抑制，IC50值在低微摩爾范圍內(nèi)。實(shí)施例5人尼古丁特異性IgG2的構(gòu)建、表達(dá)和純化使用可變區(qū)特異性轉(zhuǎn)移引物(在申請PCT/EP2007/061570中作為SEQ ID NO 92-103 公開)，通過 PCR 擴(kuò)增 scFv-F018、scFv_F063、scFv-1022、scFv_J004、 scFv-J042、scFv-N038和scFv-N049的重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼區(qū)段。例如，使用引物 VL-Sacl-F4(5，-CAG GCG GCC GAGATC GAG CTC ACT CAG C_3，)和 VL-EcoR5_Bl (5，-ACC GCC GAGGAT ATC CAG CTG GGT-3’)擴(kuò)增編碼抗體F018的輕鏈可變區(qū)的DNA。使用引物 VH-XhoI-F(5，-SAG GTG CAG CTG CTC GAG TCKGG-3，)和 VH-Apal-B(5，-GCC ACT AGT GAC CGA TGG GCC-3，)擴(kuò)增編碼重鏈可變區(qū)的DNA。編碼其它輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA相應(yīng)地?cái)U(kuò)增。得到的λ或Κ輕鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物用限制酶SacI和EcoR5消化，通過瓊脂糖凝 膠電泳純化，并分別連接到SacI-EcoR5消化的pCMV-LC-λ或pCMV-LC-κ中(在申請PCT/ EP2007/061570中作為SEQID NO :110和71公開)。得到的載體允許表達(dá)完整的人輕鏈， 包括信號肽，例如F018X輕鏈(SEQ ID NO :56)。類 似地，重鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物用限制酶 XhoI和ApaI消化，凝膠純化，并且連接到XhoI-ApaI消化的pCMV_HC- γ 2內(nèi)(在申請PCT/ ΕΡ2007/061570中作為SEQ ID NO 78公開)。得到的載體允許表達(dá)完整的人Y 2重鏈，包 括信號肽，例如F018 γ 2重鏈(SEQ ID NO 55)。pCMV-LC- λ或-K表達(dá)構(gòu)建體各自與相應(yīng)的pCMV_HC- γ 2表達(dá)構(gòu)建體的共表達(dá)原 則上能夠產(chǎn)生完整的IgG2。但是，為了提高產(chǎn)率和有利于大規(guī)模的抗體生產(chǎn)，首先將重鏈和 輕鏈編碼區(qū)組合到一個基于EBNA的表達(dá)載體pCB15中(在申請PCT/EP2007/061570中作 為SEQID N0:104公開)。例如，為了將抗體F018表達(dá)為完整的IgG2，通過用限制酶AscI 和PacI消化從pCMV-F018-HC- γ 2上切下、2重鏈編碼區(qū)，得到的1403bp片段通過瓊脂 糖凝膠電泳純化，然后連接到Ascl-Pacl消化的pCB15中，產(chǎn)生pCB15-F018_HC- γ 2。然后 通過用Nhel和Pmel消化從pCMV-F018_LC- λ上切下F018 λ輕鏈編碼區(qū)，凝膠純化得到的 723bp片段，然后連接到Nhel-Pmel消化的pCB15-F018_HC- γ 2內(nèi)，產(chǎn)生完整的IgG表達(dá)載 體pCB15-F018-IgG2 λ。完全如對于scFv_Fc融合蛋白所述(實(shí)施例2)，在HEK-293T細(xì)胞 中進(jìn)行完整IgG的表達(dá)。實(shí)施例6完全人尼古丁特異性IgG2的構(gòu)建、表達(dá)和純化如實(shí)施例4所述構(gòu)建的pCB15表達(dá)載體引導(dǎo)主要為人的完整IgG2分子的合 成。但是，與完全人抗體相比，仍然存在兩個微小的差異。第一，重鏈或輕鏈信號肽的序 列由表達(dá)載體編碼，并且一般不對應(yīng)于所述可變區(qū)的天然信號肽。第二，位于重鏈或輕 鏈可變區(qū)側(cè)翼的氨基酸位點(diǎn)由載體預(yù)先決定，例如，是由于存在限制性位點(diǎn)。因此，為了 產(chǎn)生完全人mAb，需要修正重鏈和輕鏈表達(dá)載體中每一個的這些差異。例如，引導(dǎo)包括天 然信號肽的完全人F018 γ 2重鏈(SEQ IDNO 57)表達(dá)的載體如下產(chǎn)生。首先使用引物 FO18-HC-fh-F1(5，-TTCCTC CTG TTG GTG GCA GCA CCC AGG TGG GTG CTG TCC CAGCTG CAA CTG CAG GAG TC-3’)禾口 F018-HC-fh_Bl (5’-GAC CGA TGGGCC CTT GGT GGA AGC-3’)， 通過PCR從質(zhì)粒pCMV-F018-HC- γ 2擴(kuò)增F018重鏈可變區(qū)。得到的PCR產(chǎn)物然后使用引 物 F018-HC-fh-F2(5，-GAG GGC GCG CCA CCA TGA AGC ACC TGT GGT TCT TCCTCC TGT TGG TGG CAG C-3，)和 F018-HC-fh_Bl 進(jìn)一步擴(kuò)增。PCR 終產(chǎn)物用限制酶 Ascl 和 Apal 消化，通過瓊脂糖凝膠電泳純化，并連接到Ascl-Apal消化的pCMV_HC-γ 2內(nèi)，產(chǎn)生質(zhì)粒 pCMV-fhF018-HC-γ2。類似地，引導(dǎo)包括天然信號肽的完全人F018 λ輕鏈(SEQ IDNO 58)表達(dá)的載體如 下產(chǎn)生。首先，使用引物 F018-LC-fh-Fl(5，-CCTCCT CAC CCT CCT CAC TCA CTG CGC CGG GTC CTG GGC CCAGTC TGT GCT CAC-3’ )和 F018-LC-fh_Bl (5，-GGG CTG ACC TAG CACGGT CAG CTG GGT GCC-3，)，通過PCR從pCMV-F018_LC-λ擴(kuò)增F018輕鏈可變區(qū)。平行地，使用 引物 F018-LC-fh-F3(5，-GGC ACCCAG CTG ACC GTG CTA GGT CAG CCC-3，)禾口 T7(5，-TAA TAC GACTCA CTA TAG GG-3，)擴(kuò)增 λ 輕鏈。其次，使用引物 F018_LC-fh_F2 (5，-GAG GCTAGC GCC ACC ATG GCC GGC TTC CCC CTC CTC CTCACC CTC CTC ACT C-3')禾口 T7 通過 PCR 裝配得到的PCR產(chǎn)物。PCR終產(chǎn)物用限制酶Nhel和Pmel消化，通過瓊脂糖凝膠電泳純化， 并連接到Nhel-Pmel消化的pCMV-LC- k內(nèi)，產(chǎn)生質(zhì)粒pCMV-fhF018_LC-入。使用如實(shí)施例4所述的克隆策略，通過將重鏈和輕鏈編碼區(qū)依次克隆到PCB15內(nèi)， 構(gòu)建引導(dǎo)完全人mAb 018表達(dá)的載體？〔815- ^018-1862人。引導(dǎo)完全人mAbs F063、 1022、J004、J042、N038和N049表達(dá)的表達(dá)載體以類似的方式構(gòu)建。實(shí)施例7通過平衡透析確定親和力使用 DispoEqui 1 ibriumDialyzer (Harvard Biosciences),通過平衡透析測定抗 體對(S)-(-)-尼古丁的親和力。透析儀的兩個室用膜(lO'OOODa截?cái)嘀?隔開。一個室 充滿在PBS/2% BSA中濃度分別為5. 4u g/ml或7. 5 y g/ml的純化的scFv-Fc或IgG2，而 另一個室不含抗體。使用濃度為3-444nM的氚標(biāo)記的(S)-(-)-尼古丁(Amersham)。讓平 衡透析進(jìn)行48-72小時。從室的兩側(cè)取等份，并在閃爍計(jì)數(shù)器中測量放射性。對應(yīng)于抗體 結(jié)合的(s)-(-)-尼古丁的放射性通過用含抗體的室測量的放射性減去不含抗體的室測量 的放射性而計(jì)算。由不含抗體的室測量的放射性確定游離(s)-(-)-尼古丁濃度。通過用 單點(diǎn)結(jié)合模型擬合作為游離(s)-(-)-尼古丁濃度的函數(shù)的測定的結(jié)合放射性，獲得平衡 解離常數(shù)(Kd)。大多數(shù)尼古丁特異性抗體以低納摩爾范圍的Kd值結(jié)合游離的(S)-(-)-尼 古丁(表4)。IgG2抗體的親和力與scFv-Fc相當(dāng)，Kd值相差不超過大約2倍。IgG2_F018 具有7nM的解離常數(shù)，幾乎比scFV-Fc-F018測量的值低2倍，比另一 IgG2的Kd至少低4 倍。值得注意的是，抗(S)-(-)_尼古丁多克隆抗體的親和力為30-70nM，即大大低于克隆 F018 的親和力(Maurer P.等人 ,2005, Eur. J. Immunol. 35，2031-2040)。表4.通過平衡透析測定的解離常數(shù)Kd值(nM)。除了只測定一次的IgG2_N038以 外，所示的值為至少2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SD。 mAb IgG2_F018與(-)_可替寧和乙酰膽堿的交叉反應(yīng)性通過將這些化合物的10 倍連續(xù)稀釋液(lnM-100iiM)與56nM氚標(biāo)記的(S)-(-)-尼古丁在如上所述的平衡透析室 中共溫育來確定(圖1)。如預(yù)期的，未標(biāo)記的(-)-尼古丁容易置換氚標(biāo)記的(s)-(-)-尼 古丁。相反，在結(jié)構(gòu)上與尼古丁無關(guān)但是結(jié)合尼古丁乙酰膽堿受體的相同結(jié)合袋的乙酰 膽堿(CelieP. H.等人.，2004，Neuron 41，907-914)甚至在4000倍摩爾過量時也不干擾 (s)-(-)-尼古丁的結(jié)合。類似地，作為(s)-(-)-尼古丁的主要代謝產(chǎn)物并且在吸煙者血液 中相對于尼古丁 10-20倍摩爾過量存在的(-)_可替寧(Benowitz N. L.，1997，Br. J. Clin. Pharmacol. 43, 259-267)不能與(S)-(-)-尼古丁有效競爭結(jié)合IgG2_F018?；谟^測到的 IC50，可以估計(jì)IgG2-F018與(-)_可替寧的結(jié)合比與(S)-(-)-尼古丁的結(jié)合弱大約1000 倍。因此，吸煙者血液中摩爾過量的(-)_可替寧的存在不可能干擾IgG2-F018的治療效果。我們接下來測定了mAbs IgG2-F018、-F063、-J004、-J042 和-N049 對尼古丁的(R)_(+)_異構(gòu)體的親和力。這種立體異構(gòu)體存在于煙草植物中。另外，它可以通過吸 煙時的燃燒過程形成，并且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有與(s)-(-)-尼古丁性質(zhì)上相似的活性 (Hukkanen J.等人.，2005，Pharmacol. Rev. 57，79-115)。因此，在濃度逐漸提高的未標(biāo) 記的(R)_(+)_尼古丁(lnM-lOOyM)的存在下，通過平衡透析檢測固定濃度的氚標(biāo)記的 (S)-(-)-尼古丁 (F018 :56nM ;F063、J004、J042、N049 :lllnM)與每種抗體的結(jié)合。通過用 單點(diǎn)競爭模型擬合作為(R)_(+)_尼古丁濃度的函數(shù)的測定的結(jié)合放射性獲得平衡解離常 數(shù)(Kd)。令人驚奇的是，(R)_(+)_尼古丁在與(S)-(-)-尼古丁競爭結(jié)合每種抗體方面非 常有效，其Kd值比(S)-(-)-尼古丁大約低2-5倍(表5)。表5.通過平衡透析測定的抗體_ (R) - (+)-尼古丁相互作用的解離常數(shù)Kd (nM) 實(shí)施例8小鼠血漿和腦中尼古丁分布的評價由5-6只雌性Balb/c小鼠組成的各組小鼠腹膜內(nèi)注射0. l_3mg各種重組人IgG2 單克隆抗體。一天后，通過向尾靜脈內(nèi)注射氚標(biāo)記的(S)-(-)-尼古丁(Amersham) (375、 750或1500ng)分析尼古丁進(jìn)入腦的抑制。5分鐘后通過C02窒息殺死小鼠，并采集血液和 腦。由存在的放射性計(jì)算血清和腦中的尼古丁濃度。根據(jù)腦的血含量校正腦尼古丁濃度 (3ul/100mg)。相對于在注射對照IgG的小鼠腦中發(fā)現(xiàn)的尼古丁濃度，計(jì)算腦中的尼古丁 攝取的降低百分比。對于檢測的所有尼古丁特異性抗體，觀察到尼古丁向腦中分布的減少。 對于大多數(shù)抗體，在劑量為每只小鼠0. 5mg時觀察到的減少一般為40%或更高。在這些實(shí) 驗(yàn)條件下最強(qiáng)的mAb是F018，尼古丁向腦中的進(jìn)入總是減少60%以上(表6和7)。表6.尼古丁特異性抗體對尼古丁進(jìn)入小鼠腦的抑制(使用0. 5mg IgG2被動免疫； 使用750ng尼古丁攻擊) 表7.尼古丁特異性抗體對尼古丁進(jìn)入小鼠腦的抑制(使用0. 5mg IgG2被動免疫； 使用750ng尼古丁攻擊) 實(shí)施例9使用抗尼古丁抗體F018的重鏈可變區(qū)鑒定互補(bǔ)輕鏈可變區(qū)(“鏈改組”)本文中未提供序列的、本實(shí)施例中使用的所有引物的核苷酸序列可以在Phage Display-A Laboratory Manual， Cold Spring HarborLaboratory Press，2001， Protocol 9. 2中在相同的名稱下找到。使用引物HSCVH35-FL 和 HSC-F018-B(5，-CCT GGC CGG CCTGGC CAC TAG TGA CCG ATG GGC CCT TGG TGG AAG C_3，，SEQID NO :86)，通過 PCR 從包含 scFv_F018 序列(SEQ ID NO 59)的DNA分子擴(kuò)增編碼抗體F018的重鏈可變區(qū)的DNA序列。使用4種有義引物 HSCK1-F、HSCK24-F、HSCK3-F和HSCK5-F的等摩爾混合物，加上4種反義引物HSCJK14o_B、 HSCJK2o-B、HSCJK3o-B和HSCJK5o_B的等摩爾混合物，通過PCR從來自尼古丁 -載體偶聯(lián) 物免疫的人受試者的B細(xì)胞的cDNA擴(kuò)增編碼人k輕鏈可變區(qū)的DNA序列的文庫。使用9 種有義引物 HSCLamla、HSCLamlb、HSCLam2、HSCLam3、HSCLam4、HSCLam6、HSCLam78、HSCLam9 和HSCLamlO的等摩爾混合物，加上3種反義引物HSCJLaml236、HSCJLam4和HSCJLam57的 等摩爾混合物，通過PCR從來自尼古丁 -載體偶聯(lián)物免疫的人受試者的B細(xì)胞的cDNA擴(kuò)增 編碼人\輕鏈可變區(qū)的DNA序列的文庫。為了選擇互補(bǔ)輕鏈可變區(qū)，使用引物RSC-F和RSC-B，通過F018 VH PCR產(chǎn)物與VK 文庫PCR產(chǎn)物或V入文庫PCR產(chǎn)物的PCR重疊延伸，裝配scFv編碼區(qū)。得到的約750_800bp PCR產(chǎn)物編碼尼古丁特異性抗體F018的5’輕鏈可變區(qū)文庫(k或X)和3’重鏈可變區(qū)， 該輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)通過18個氨基酸的柔性接頭連接，側(cè)翼為兩個Sfil限制性位 點(diǎn)。scFv-k和文庫片段以等摩爾比例混合，用限制性內(nèi)切核酸酶Sfil消化，并克隆到 載體pDel-SP-TM內(nèi)，用于基本如實(shí)施例1所述通過基于辛德畢斯病毒的scFv細(xì)胞表面展 示法進(jìn)行篩選?；蛘?，將Sfil-消化的scFv文庫片段克隆到Sfil-消化的pC0mb3H(Rader C, Barbas CF 3rd. , 1997, Curr Op in Biotechnol. 8，503-508)中。然后表達(dá)抗體，并使 用所述的程序通過噬菌體展示法進(jìn)行選擇，用于結(jié)合固定的RNAse-尼古丁偶聯(lián)物(Phage Display :A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)o
權(quán)利要求
特異性結(jié)合尼古丁的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是人單克隆抗體，并且(a)其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含(i)一個HC CDR1，其中所述HC CDR1由SEQ ID NO1的肽組成；(ii)一個HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO2的肽組成；和(iii)一個HC CDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NO3和4中任一個的肽組成；優(yōu)選地，其中所述HC CDR3由SEQ ID NO3的肽組成，且(b)其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(i)一個LC CDR1，其中所述LC CDR1由SEQ ID NO5、6和7中任一個的肽組成，優(yōu)選地，其中所述LC CDR1由SEQ ID NO5的肽組成；(ii)一個LC CDR2，其中所述LC CDR2由SEQ ID NO8的肽組成；(iii)一個LC CDR3，其中所述LC CDR3由SEQ ID NO9和10中任一個的肽組成，優(yōu)選地，其中所述LC CDR3由SEQ ID NO9的肽組成。
2.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中(a)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :24、28、33和39中任一個的肽組成，優(yōu)選地， 所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 24的肽組成；且(b)其中所述LCVR的第5-107位由SEQID NO :26、31、35、37和41中任一個的肽組成， 優(yōu)選地，其中所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 26的肽組成。
3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的單克隆抗體，其中(a)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :24的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107 位由SEQ ID NO 26的肽組成；(b)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :28的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107 位由SEQ ID NO 31的肽組成；(c)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :33的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107 位由SEQ ID NO 35的肽組成；(d)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :28的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107 位由SEQ ID NO 37的肽組成；或(e)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :39的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107 位由SEQ ID NO 41的肽組成；其中優(yōu)選地，所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 24的肽組成，并且其中所述LCVR 的第5-107位由SEQ ID NO 26的肽組成。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含至少一個Y2重鏈 和至少一個入輕鏈，其中(a)所述Y2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQID NO :73的肽組成，且其中所述\輕鏈包 含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 74的肽組成；(b)所述Y2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 75的肽組成，且其中所述\輕鏈包 含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 76的肽組成；(c)所述Y2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQID NO :77的肽組成，且其中所述\輕鏈包 含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 78的肽組成；(d)所述Y2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQID NO :75的肽組成，且其中所述\輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 79的肽組成；或(e)所述Y 2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 80的肽組成，且其中所述\輕鏈包 含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 81的肽組成；其中優(yōu)選地，所述Y2重鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO :73的肽組成，且其中所述入 輕鏈包含或者優(yōu)選地由SEQ ID NO 74的肽組成。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是IgG2。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體特異性結(jié)合 (S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_ 尼古丁。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體結(jié)合(S)-(-)-尼古丁 和(R)_(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù) Kd為1-lOOnM;并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù) Kd為1-lOOnM，優(yōu)選地，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常 數(shù)Kd為l-70nM;并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù) Kd為l-50nM，進(jìn)一步優(yōu)選地，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解 離常數(shù)Kd為1-lOnM;并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離 常數(shù)Kd為l-10nM。
8.單克隆抗體的HCVR，其中所述單克隆抗體是人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗 體特異性結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古??；其中優(yōu)選地所述單克隆抗體與所述 (S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-lOOnM;并且其中所述單克隆抗體與所述 (R)-(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-lOOnM ；并且其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述單克隆 抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為l-70nM;并且其中所述單克隆抗 體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為l-50nM，進(jìn)一步優(yōu)選l_20nM ；并且 再進(jìn)一步優(yōu)選l-10nM ；并且其中所述HCVR包含(a)一個HC CDR1，其中所述HC CDR1由SEQ ID NO 1的肽組成；(b)一個HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽組成；和(c)一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO :3和4中任一個的肽組成，優(yōu)選地 其中所述HC CDR3由SEQ ID NO 3的肽組成。
9.權(quán)利要求8的110^，其中所述110^的第7-117位由5￡010NO :24、28、33和39中任 一個的肽組成，其中優(yōu)選地所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 24的肽組成。
10.單克隆抗體的LCVR，其中所述單克隆抗體是人單克隆抗體，并且其中所述單克隆 抗體特異性結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)_(+)_尼古丁 ；其中優(yōu)選地所述單克隆抗體與所述 (S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-lOOnM;并且其中所述單克隆抗體與所述 (R)-(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-lOOnM ；并且其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述單克隆 抗體與所述(S)-(-)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為l-70nM;并且其中所述單克隆抗 體與所述(R)_(+)_尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為l-50nM，進(jìn)一步優(yōu)選l_20nM ；并且 再進(jìn)一步優(yōu)選1-lOnM ；并且其中所述LCVR包含(a)一個LC⑶R1，其中所述LC CDR1由SEQ ID NO :5、6和7中任一個的肽組成，優(yōu)選 地其中所述LC⑶R1由SEQ ID NO 5的肽組成；(b)一個LC CDR2，其中所述LC CDR2由SEQ ID NO 8的肽組成；(C) 一個LC⑶R3，其中所述LC⑶R3由SEQ ID NO :9和10中任一個的肽組成，優(yōu)選地 其中所述LC CDR3由SEQ ID NO 9的肽組成。
11.權(quán)利要求10的LCVR，其中所述LCVR的第5-107位由SEQIDNO :26、31、35、37和41 中任一個的肽組成，優(yōu)選地其中所述LCVR的第5-107位由SEQ ID NO 26的肽組成。
12.一種單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是人單克隆抗體，并且其中所述單克隆抗體 特異性結(jié)合(S)-(-)-尼古丁和(R)-(+)_尼古丁，其中所述單克隆抗體與所述(S)-(-)-尼 古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為I-IOOnM;并且其中所述單克隆抗體與所述(R)_(+)_尼 古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為I-IOOnM ；其中進(jìn)一步優(yōu)選地，所述單克隆抗體與所述 (S)-(-)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-70ηΜ;并且其中所述單克隆抗體與所述 (R) - (+)-尼古丁的所述結(jié)合的解離常數(shù)Kd為1-50ηΜ，進(jìn)一步優(yōu)選1-20ηΜ ；并且再進(jìn)一步 優(yōu)選 1-lOnM。
13.權(quán)利要求12的單克隆抗體，(a)其中所述單克隆抗體包含至少一個HCVR，其中所述HCVR包含⑴一個HC CDR1，其中所述HC CDRl由SEQ ID NO 1的肽組成；(ii)一個HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NO 2的肽組成；禾口(iii)一個HC⑶R3，其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 3和4中任一個的肽組成；優(yōu)選 地其中所述HC⑶R3由SEQ ID NO 3的肽組成，并且(b)其中所述單克隆抗體包含至少一個LCVR，其中所述LCVR包含(i)一個LC⑶R1，其中所述LC⑶Rl由SEQ ID NO :5、6和7中任一個的肽組成，優(yōu)選 地其中所述LC⑶Rl由SEQ ID NO 5的肽組成；(ii)一個LC CDR2，其中所述LC CDR2由SEQ ID NO 8的肽組成；(iii)一個LC⑶R3，其中所述LC CDR3由SEQ ID NO :9和10中任一個的肽組成，優(yōu)選 地其中所述LC CDR3由SEQ ID NO 9的肽組成。
14.權(quán)利要求12或13的單克隆抗體，其中(a)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :24、28、33和39中任一個的肽組成，優(yōu)選地 其中所述HCVR的第7-117位由SEQ IDNO 24的肽組成；且(b)其中所述LCVR的第5-107位由SEQID NO :26、31、35、37和41中任一個的肽組成， 優(yōu)選地其中所述LCVR的第5-107位由SEQID NO 26的肽組成。
15.權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的單克隆抗體，其中(a)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :24的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107 位由SEQ ID NO 26的肽組成；(b)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :28的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107 位由SEQ ID NO 31的肽組成；(c)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :33的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107 位由SEQ ID NO 35的肽組成；(d)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :28的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107 位由SEQ ID NO 37的肽組成；或者(e)所述HCVR的第7-117位由SEQID NO :39的肽組成，并且其中所述LCVR的第5-107 位由SEQ ID NO 41的肽組成；其中優(yōu)選地，所述HCVR的第7-117位由SEQ ID NO 24的肽組成，并且其中所述LCVR 的第5-107位由SEQ ID NO 26的肽組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組產(chǎn)生的特異性結(jié)合尼古丁的人單克隆抗體，以及編碼它們的核酸。本發(fā)明還涉及這些抗體在治療尼古丁成癮中的應(yīng)用。
文檔編號A61K39/395GK101878228SQ200880118188
公開日2010年11月3日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日
發(fā)明者M·巴克曼, M·鮑爾, P·莫勒, R·貝爾利 申請人:賽托斯生物技術(shù)公司