專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抗sftsv的人源抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體，具體而言涉及一種抗SFTSV的人源抗體。
背景技術(shù)：
2010年中國(guó)中東部部分地區(qū)，包括安徽、江蘇、湖北、河南、山東等省先后暴發(fā)多起由蜱蟲(chóng)叮咬而致人死亡的公共衛(wèi)生事件，造成社會(huì)恐慌，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)厝罕娊】蛋踩徒?jīng)濟(jì)發(fā)展。經(jīng)包括國(guó)家和相關(guān)省疾控中心多家單位的聯(lián)合攻關(guān)，查明引起該傳染病的病原為一新型的出血熱病毒，在分類(lèi)學(xué)上屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae),目前命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe Febrile and Thrombocytopenic Syndrome Virus,SFTSV)[Xuej ie Yu,Mifang Liang,Shouyin Zhang,et al. Fever with thrombocytopeniaassociated with a novel bunyavirus in China. N Engl Med 2011 ；364 (16)1523-1532]。隨著全國(guó)監(jiān)測(cè)力度的加強(qiáng)，目前在我國(guó)浙江也發(fā)現(xiàn)該病毒的存在。另外，中東阿聯(lián)酋最近也有疑似該病例的報(bào)道；在美國(guó)密蘇里州發(fā)現(xiàn)的一種被稱(chēng)為Heartland的病毒[McMu 11 an, Laura K. , Folk, Scott Μ. , Kelly, Aubree J. et. al. A New PhlebovirusAssociated with S evere Febrile Illness in Missouri. New England Journal ofMedicine, 2012，367 (9) :834-841]，其與SFTSV基因組的同源性很高，說(shuō)明SFTSV或許呈現(xiàn)世界性分布，或者能被生物媒介攜帶快速傳播。布尼亞病毒科現(xiàn)分為5個(gè)屬,其中有4個(gè)屬對(duì)人致病，分別為正布尼亞病毒屬、漢坦病毒屬、內(nèi)羅病毒屬和白蛉病毒屬。該科成員大多由媒介生物，如蜱、螨、蚊、鼠等傳播，引起地區(qū)或全球性流行。在我國(guó)主要有漢坦病毒(漢坦病毒屬)和新疆出血熱病毒(內(nèi)羅病毒屬)引起地方性流行，而新發(fā)現(xiàn)的SFTSV則為白蛉病毒屬的新成員。SFTSV基因組由大(L)、中(M)、小(S)三個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成，與布尼亞病毒科其他病毒相似，病毒基因組3'末端和5'末端序列互補(bǔ)，形成非共價(jià)閉環(huán)RNA。L片段編碼由2084個(gè)氨基酸組成的RNA依賴(lài)的RNA聚合酶;M片段編碼具有1073個(gè)氨基酸的膜蛋白前體，翻譯后經(jīng)宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的修飾形成Gn和Ge兩個(gè)糖蛋白；S片段屬雙義RNA，分別編碼核衣殼蛋白NP和非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。該病毒引起人感染的典型癥狀為，病人起病急，高熱伴全身乏力、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)酸痛，其典型臨床特征為白細(xì)胞和血小板明顯降低，轉(zhuǎn)氨酶升高，血清乳酸脫氫酶明顯升高，凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)，鈉、鉀、氯等電解質(zhì)偏低。病例大都生活于丘陵地區(qū)，首發(fā)病例多為有野外工作經(jīng)歷的中老年人，病死率較高(可高達(dá)30% )，死亡原因主要是多臟器功能衰竭。該病例多為散發(fā)，亦可引起家庭聚集性暴發(fā)，人傳人現(xiàn)象嚴(yán)重[Bao CJ, Guo XL, Qi X，et. al. A family cluster of infections by a newly recognized bunyavirus in easternChina, 2007 further evidence of person-to-person transmission. Clin InfectDis.2011,53(12) 1208-1214 ；Yan Liu, Qun Li, Wanfu Hu, et.al.Person-to-PersonTransmission of Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus. Vector-Borneand Zoonotic Diseases. February 2012,12 (2) : 156—160 ;Zhongtao Gai, MifangLiang, Ying Zhang, et.al. Person-to-Person Transmission of Severe Fever WithThrombocytopenia Syndrome Bunyavirus ThroughBlood Contact. Clinical InfectiousDiseases2012 ;54(2) :249-252] 由于該病是一新發(fā)自然疫源性傳染病，疫情不可能短期內(nèi)消失；目前臨床尚無(wú)有效治療策略，無(wú)疫苗供應(yīng)；該病臨床始發(fā)癥狀與普通流感無(wú)異，且病人多集中在農(nóng)村地區(qū)，交通不便，衛(wèi)生醫(yī)療水平薄弱，等到確診，病情大多發(fā)展到病毒血癥、多臟器衰竭，此時(shí)臨床只能采取對(duì)癥治療手段。而作為化學(xué)治療的補(bǔ)充，由抗體介導(dǎo)的預(yù)防和治療病毒感染的措施已顯現(xiàn)良好的效果，其應(yīng)用前景得到專(zhuān)家的認(rèn)同。事實(shí)上，國(guó)內(nèi)首個(gè)用于治療漢坦病毒感染的抗體藥物已完成III期臨床試驗(yàn)，準(zhǔn)備上市?？贵w作為人體內(nèi)一種最重要的抗病毒免疫介質(zhì)，抗體分子可以通過(guò)阻斷病毒顆粒與其受體的結(jié)合、激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等殺傷細(xì)胞、激活補(bǔ)體等多種機(jī)制來(lái)殺傷、清除病毒顆粒及受感染細(xì)胞?？贵w制劑不僅可以中和病人體內(nèi)大量的病毒，降低荷載，轉(zhuǎn)歸病情，對(duì)病人的密切接觸者，如陪護(hù)、醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行緊急被動(dòng)免疫，防止二代、三代感染者的出現(xiàn)。研究表明，臨床上使用病毒特異性的康復(fù)人血漿，可有效中和病毒，防止病毒在體內(nèi)各器官擴(kuò)散，避免發(fā)生致死性的多臟器衰竭，對(duì)病人病程的轉(zhuǎn)歸也起了重要作用。但多抗血漿不僅來(lái)源有限，同時(shí)其臨床應(yīng)用也受到諸如難以質(zhì)控、供受體血型不匹配、潛在的傳染性因子等條件的限制。鼠源單抗制備簡(jiǎn)單，治療機(jī)理明確，但是其異源性阻礙了在人體內(nèi)的應(yīng)用。而人源單克隆抗體可有效克服上述問(wèn)題。本研究采用噬菌體展示抗體文庫(kù)技術(shù)，以純化的SFTSV病毒為靶標(biāo)，篩選人源抗體單鏈抗體片段(single chain variable fragment, scFv),獲得一株具有廣譜中和活性的人源單克隆抗體分子，MAb4-5。應(yīng)用分子生物學(xué)手段對(duì)該抗體片段進(jìn)行全分子化基因構(gòu)建，真核表達(dá)了 MAb4-5IgGl。進(jìn)一步的研究表明，該抗體分子結(jié)合的抗原決定簇位于病毒顆粒外膜Gn糖蛋白N末端的一個(gè)結(jié)構(gòu)域,該決定簇呈線(xiàn)性排列。另外,對(duì)MAb4-5中和機(jī)制的研究結(jié)果表明，該抗體通過(guò)阻礙病毒糖蛋白與其易感細(xì)胞膜上受體的結(jié)合而發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用噬菌體展示抗體文庫(kù)技術(shù)，以純化的發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe Febrile and Thrombocytopenic Syndrome Virus, SFTSV)為祀標(biāo)，篩選人源抗體單鏈抗體片段(single chain variable fragment, scFv),獲得一株具有廣譜中和活性的人源單克隆抗體分子，MAb4-5,并應(yīng)用分子生物學(xué)手段對(duì)該抗體片段進(jìn)行全分子化基因構(gòu)建，真核表達(dá)了 MAb4-5 IgGl0進(jìn)一步的研究表明，該抗體分子結(jié)合的抗原決定簇位于病毒顆粒外膜GTn糖蛋白N末端的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，該決定簇呈線(xiàn)性排列。另外，對(duì)MAb 4_5中和機(jī)制的研究結(jié)果表明，該抗體通過(guò)阻礙病毒糖蛋白與其易感細(xì)胞膜上受體的結(jié)合而發(fā)揮作用。本發(fā)明公開(kāi)了一種抗SFTSV的人源單鏈抗體MAb4_5，所述單鏈抗體包括輕鏈和重鏈，其氨基酸可變區(qū)序列分別如序列表中SEQ ID N0U SEQ ID NO :2所示，其編碼基因分別如序列表中SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4所示。本發(fā)明所述的單鏈抗體的輕鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列，分別如序列表中SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7所示。所述單鏈抗體的重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分別如序列表中 SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10 所示。本發(fā)明還公開(kāi)了上述單鏈抗體MAb4-5及其全分子抗體MAb4_5IgG的制備方法，主要包括如下I.抗SFTSV scFv人源抗體文庫(kù)構(gòu)建和篩選首先，獲取5名SFTSV感染康復(fù)者的外周血(經(jīng)專(zhuān)利申請(qǐng)者所在單位倫理委員會(huì)、及相關(guān)獻(xiàn)血者書(shū)面同意)，分離外周淋巴細(xì)胞，抽提總RNA，使用oligo (dT)引物反轉(zhuǎn)合成cDNA，PCR分別擴(kuò)增抗體的重、輕鏈可變區(qū)基因Vh和\，連接成scFv后克隆入載體pComb3Xss,電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue。以純化的SFTSV顆粒包板進(jìn)行親和篩庫(kù)，經(jīng)過(guò)3輪的篩選(吸附-洗脫-擴(kuò)增)，將第3輪洗脫的重組噬菌體感染大腸桿菌XLl-Blue后鋪板，隨機(jī)挑取90個(gè)單菌落，制備重組噬菌體，用ELISA篩選SFTSV特異性噬菌體克隆，共獲得14個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序、去除重復(fù)序列，共獲得6個(gè)特異性抗體克隆，分別是4-5、A5、A9、Al I、B2和D6。2.中和實(shí)驗(yàn)對(duì)于上述的6個(gè)scFv片段在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)、純化，并用純化的scFv片段做中和實(shí)驗(yàn)。將濃度為100 μ g/nL的scFv片段50 μ L與等體積的SFTSV毒株JS-2010-003 (含有100TCID50)混合，37°C作用Ih后，該混合物加入到培養(yǎng)有Vero細(xì)胞單層的96孔板中，于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，每天觀察細(xì)胞病變(Cytopathic effect, CPE)。對(duì)于能抑制大于90% CPE的單抗被認(rèn)為具有中和活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)抗體中只有4-5具有中和活性。3. MAb4-5抗體克隆全分子化構(gòu)建和真核表達(dá)將MAb4_5抗體的重、輕鏈可變區(qū)基因分別克隆入載體pAc-K_CH3中，應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)全分子抗體(MAb4-5IgGl)并純化。4.MAb4_5IgGl中和活性的測(cè)定利用分離自不同地區(qū)、不同時(shí)間的SFTSV株與MAb4_5IgGl做交叉保護(hù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定該抗體分子的廣譜中和能力。結(jié)果表明，MAb4-5從scFv片段轉(zhuǎn)化成全分子IgGl其親和力大約提高了 20倍，具有較高的中和活性；同時(shí)MAb4-5IgGl對(duì)2010-2012年度分離自不同疫區(qū)的病毒株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的中和能力，顯示出MAb4-5 IgGl具有較廣的中和譜。5.單克隆抗體MAb 4-5輕、重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列的確定用www. expasy. org在線(xiàn)軟件將編碼抗SFTSV抗體MAb 4-5的輕、重鏈可變區(qū)核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列。MAb 4-5的輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2所示。根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)確定輕鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6和SEQ IDNO 7所示。重鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、CDR2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10 所示。本發(fā)明采用噬菌體展示抗體文庫(kù)技術(shù)，成功地篩選出一株對(duì)SFTSV具有中和能力的人源抗體片段，MAb4-5。并闡明了該抗體分子所結(jié)合的抗原決定簇和其對(duì)病毒中和作用的機(jī)制。全分子化的MAb4-5 IgGl表現(xiàn)出了對(duì)SFTSV廣譜性的中和能力，利用該抗體與對(duì)SFTSV的中和作用，將其制成特異性抗體藥物，從而可在臨床上用于預(yù)防和治療由SFTSV感染引起的疾病，具有很強(qiáng)的臨床應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖I分離得到的6株scFv抗體對(duì)JS-2010-003病毒株中和活性的測(cè)定結(jié)果，PC為康復(fù)期病人血清，NC為陰性對(duì)照；圖2 純化后的 MAb4_5IgGl SDS-PAGE 圖；圖3MAb4-5、MAb4_5 IgGl的中和滴度測(cè)定結(jié)果，陰性對(duì)照為抗腸道病毒71的人抗體 IgGl ；圖45 μ g/mL MAb4_5IgGl對(duì)不同SFTSV病毒株的中和活性測(cè)定結(jié)果；圖5Western blot檢測(cè)MAb4_5IgGl與JS-2010-003病毒株的Gn糖蛋白的結(jié)合；圖6免疫熒光檢測(cè)MAb4_5IgGl與JS-2010-003病毒株感染Vero細(xì)胞的結(jié)合，圖A顯示MAb4_5IgGl能結(jié)合JS-2010-003感染的Vero細(xì)胞，圖B為陰性對(duì)照?qǐng)D7免疫電鏡檢測(cè)MAb 4-5 IgGl與JS-2010-003的結(jié)合，圖A顯示MAb 4-5IgGI能與JS-2010-003，圖B為陰性對(duì)照；圖8Western blot檢測(cè)MAb4_5IgGl與Gn糖蛋白膜外結(jié)構(gòu)域結(jié)合；圖9Western blot檢測(cè)MAb 4-5對(duì)Gnl與Vero細(xì)胞膜上的受體結(jié)合的阻斷,對(duì)照為無(wú)中和活性的抗體MAb A5。
具體實(shí)施例方式通過(guò)參閱下述實(shí)施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)施例只是為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例一 JS-2010-003病毒顆粒的純化I.材料病毒株JS-2010-003 :為專(zhuān)利申請(qǐng)者于2010年從江蘇一 SFTSV感染病人血清中分
離獲得。2.方法和結(jié)果將病毒接種Vero細(xì)胞后，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，無(wú)菌吸取病毒培養(yǎng)上清液；使用I : 4000稀釋的β_丙內(nèi)酯(β-propiolactone)于4 滅活24h,5000rpm離心30min去除細(xì)胞碎片；30000rpm，4 °C超速離心2h ;用少量磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)重懸病毒顆粒,用分子篩層析柱 Sepharose 4FF 進(jìn)一步純化病毒。通過(guò)上述步驟收集到了純度較高的JS-2010-003病毒顆粒。所有的病毒操作均在生物安全2級(jí)(BSL-2)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。實(shí)施例二噬菌體展示scFv人源抗體文庫(kù)的構(gòu)建和篩選I.材料引物Vh基因擴(kuò)增引物
上游引物HSCVH1-F，見(jiàn)序列表中SEQ IDNO 11 ;HSCVH2_F，見(jiàn)序列表中 SEQ IDNO 12 ;HSCVH35-F，見(jiàn)序列表中 SEQ IDNO 13 ;HSCVH3a_F 見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO :14，HSCVH4_F見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 15 ;HSCVH4a_F，見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 16 ；下游引物HSCG1234_B，見(jiàn)序列表中SEQ ID NO 17 ；Vk基因擴(kuò)增引物上游引物:HSCK1-F，見(jiàn)序列表中SEQ ID NO 18 ;HSCK24_F，見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 19 ；HSCK3-F 見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 20 ;HSCK5_F，見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 21 ；下游引物HSCJK14o-B，見(jiàn)序列表中SEQ ID NO :22 ;HSCJK2o_B，見(jiàn)序列表中 SEQ IDNO 23 ;HSCJK3o-B，見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 24 ;HSCJK5o_B，見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 25 ；Va基因擴(kuò)增引物上游引物HSCLamla，見(jiàn)序列表中SEQ ID NO :26 ;HSCLamlb，見(jiàn)序列表中SEQ IDNO 27 ;HSCLam2，見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 28 ;HSCLam3，見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 29 ；HSCLam4,見(jiàn)序列表中SEQ ID NO 30 ;HSCLam6，見(jiàn)序列表中SEQ ID NO :31 ;HSCLam78，見(jiàn)序列表中SEQID NO 32 ;HSCLam9，見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 33 ;HSCLamlO，見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 34 ；下游引物HSCJLaml236，見(jiàn)序列表中SEQ ID NO 35 ;HSCJLam4，見(jiàn)序列表中 SEQ IDNO 36 ;HSCJLam57，見(jiàn)序列表中 SEQ ID NO 37 ；scFv基因擴(kuò)增引物上游引物RSC_F，見(jiàn)序列表中SEQ ID NO 38 ；下游引物:RSC_B，見(jiàn)序列表中SEQ ID NO 39 ；2.方法和結(jié)果2. I抗SFTSV特異性噬菌體抗體構(gòu)建(I)外周血淋巴細(xì)胞的分離。取5名SFTSV感染康復(fù)者的外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，4°C，5000rpm離心lOmin，并用生理鹽水或PBS洗滌兩次。將收集到的淋巴細(xì)胞混合后進(jìn)行總RNA提取。(2)總RNA的提取。參照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提淋巴細(xì)胞中的總RNA。并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。(3)逆轉(zhuǎn)錄 cDNA。取含 Ig 總 RNA 的溶液，加入 Oligo (dT) 185 μ L，雙蒸水 9 μ L，70。。水浴IOmin ;取出后迅速置于冰上5min后，再置于室溫IOmin ;依次加入依次加入IOX緩沖液 5 μ LjMgCl2 O. 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP2 μ L, Inhibitor〗μ L，M_MLV4 μ L,混勻后 42°C水浴60min ;產(chǎn)物為cDNA第一鏈，_20°C凍存?zhèn)溆谩?4) PCR擴(kuò)增VH、Vk、Va基因。以上述制備的cDNA為模板，利用前述VH、Vk和Va基因引物，分別擴(kuò)增Vh、Vk和Va基因片段。擴(kuò)增體系如下所示cDNA O. 5 μ g，上游引物60pmol，下游引物 60pmol，10XPCR 緩沖液 lOyL，dNTP8 μ L, MgCl26 μ L, Ex Taq0.5yL，加水至 100 μ L。PCR 反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 15s，50°C 30s, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°CIOmin0 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察所擴(kuò)增片段的大小。切下目的條帶，使用DNA片段純化劑盒回收。(5) scFv基因的擴(kuò)增等摩爾比混合Vh和Vk，Vh和Va基因片段，利用overlap-PCR擴(kuò)增scFv基因，擴(kuò)增體系如下VH I 卩11101，￥1;(￥;^)1 11101，1 (-卩60 11101，1 (-860 11101，10\ 0 緩沖液1(^1^dNTP8y L,MgCl26y L,Ex TaqO. 5 μ L，加水至 100 μ L。PCR 反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 15s,56°C 30s, 72°C lmin，25個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。I %瓊脂糖凝膠電泳觀察所擴(kuò)增片段的大小。切下目的條帶，使用DNA片段純化劑盒回收。(6) scFv基因酶切及與載體連接。將上述制備的scFv回收產(chǎn)物及載體質(zhì)粒pComb3XSS用紫外分光光度計(jì)測(cè)核酸濃度后進(jìn)行酶切。取scFv基因或載體pComb3XSS10y g，加入SfiI酶40u，IOX緩沖液Μ40μ L，加水到200yL，50°C酶切20h。I %瓊脂糖凝膠電泳切下目的條帶，進(jìn)行膠回收，方法同前。取酶切后的scFvO. 7yg，酶切后的載體pCombSXSSljyg，T4連接酶40u，5X連接緩沖液40μ L，16°C連接過(guò)夜。(6)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。將連接產(chǎn)物置于65°C水浴lOmin，滅活T4DNA連接酶。經(jīng)乙醇沉淀后加入ddH20溶解連接產(chǎn)物。用0. 2cm電轉(zhuǎn)杯，25 μ F，2. 5kV，200Q的電轉(zhuǎn)條件轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XLl-Blue。迅速將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入5mL SOC培養(yǎng)基中，300rpm，37°C振搖培養(yǎng)lh，用預(yù)熱的SB培養(yǎng)基(含20 μ g/mL Amp和10 μ g/mL四環(huán)素)10倍梯度稀釋將菌液涂布于LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。次日計(jì)數(shù)細(xì)菌克隆數(shù)計(jì)算庫(kù)容。將電轉(zhuǎn)化后的菌液加入輔助噬菌體VCSM13超感染，加入SB培養(yǎng)基(含20 μ g/mLAmp和10 μ g/mL四環(huán)素)37°C振搖培養(yǎng)I. 5h，加卡那霉素到終濃度70 μ g/mL, 37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。離心沉淀菌體，收集上清，加入PEG8000/NaCl冰上沉淀噬菌體lh，15000rpm, 4°C離心15min,棄上清,干燥后用2mL含I % BSA的PBS重懸。15000rpm, 4°C離心5min,將上清用0. 22 μ m過(guò)濾，即得到卩遼菌體展示scFv抗體庫(kù)。2. 2抗SFTSV特異性噬菌體抗體富集篩選(I)用純化的SFTSV顆粒包被ELISA板I μ f/孔L，洗滌加封閉液，洗滌，加噬菌體抗體庫(kù)，洗去未結(jié)合的噬菌體，感染增殖，加輔助噬菌體VCSM13超感染；重復(fù)以上篩選步驟，共進(jìn)行三輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”富集篩選；(2)將最后一輪篩選并增殖得到的噬菌體稀釋后鋪于培養(yǎng)板上，培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取90個(gè)單菌落于細(xì)胞培養(yǎng)板中，振搖培養(yǎng)過(guò)夜；從第一塊板各孔中分別轉(zhuǎn)移5 μ L菌液至第二塊板，振搖培養(yǎng)；加輔助噬菌體VCSM13超感染，振搖培養(yǎng)；離心，培養(yǎng)基重懸沉淀，振搖培養(yǎng)過(guò)夜，離心取出上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)(SFTSV顆粒包被ELISA板濃度為I μ g/孔)，當(dāng)P/N值(Positive/Negative)大于2. I時(shí),該菌株為陽(yáng)性單克隆曬菌體株；共得到14株陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆經(jīng)核酸序列分析后，發(fā)現(xiàn)有6株不同序列scFv，分別是4-5、Α5、Α9、Α11、Β2和D6。實(shí)施例三scFv抗體中和活性篩選I.材料用于實(shí)驗(yàn)的SFTSV毒株如下表所示。
權(quán)利要求
1.一種抗SFTSV的人源單克隆抗體或其片段，包括輕鏈⑶R1-3和重鏈⑶R1-3，其特征在于，所述輕鏈CDR1-3的氨基酸序列為CDRl :如序列表中SEQ ID NO 5所示；CDR2 :如序列表中SEQ ID NO 6所示；CDR3 :如序列表中SEQ ID NO 7所示；所述重鏈⑶R1-3的氨基酸序列為CDRl :如序列表中SEQ ID NO 8所示；CDR2 :如序列表中SEQ ID NO 9所示；CDR3 :如序列表中SEQ ID NO 10所示。
2.如權(quán)利要求I所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.如權(quán)利要求1-2任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的核甘酸序列如序列表中SEQ ID NO :3所示，所述重鏈可變區(qū)的核甘酸序列如序列表中SEQ ID NO 4 所示。
4.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其片段在制備檢測(cè)SFTSV病毒的試劑、藥劑或試劑盒中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑、藥劑或試劑盒，其特征在于，所述抗體或其片段帶有生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記，所述生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記為突光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記。
6.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其片段在制備治療和/或預(yù)防SFTSV感染藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其片段在制備檢測(cè)SFTSV的抗原或抗體的工具中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗SFTSV的人源抗體，該抗體的核苷酸序列，其中輕鏈核苷酸序列見(jiàn)SEQ ID NO.5，重鏈核苷酸序列見(jiàn)SEQ ID NO.6，本發(fā)明公開(kāi)了制備上述抗體的方法。本發(fā)明的抗體特異性識(shí)別SFTSV病毒顆粒。利用該抗體與對(duì)SFTSV的中和作用，將其制成特異性抗體藥物，從而可在臨床上用于預(yù)防和治療由SFTSV感染引起的疾病。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102942629SQ20121047378
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者焦永軍, 張黎, 曾曉燕, 郭喜玲, 史智揚(yáng), 崔侖標(biāo), 周明浩 申請(qǐng)人:江蘇省疾病預(yù)防控制中心