專利名稱：用于人類和/或動物的營養(yǎng)的組合物、它們的應(yīng)用和酵母菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類和/或動物營養(yǎng)和健康領(lǐng)域。本發(fā)明更具體地涉及新的酵母菌菌株和從新菌株中獲得的新的酵母菌。這些酵母 菌對于消化道的舒適和/或預(yù)防和/或治療人類或動物消化道紊亂特別有用。
背景技術(shù)：
在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了許多微生物在人類消化道中的有益應(yīng)用，以及它們營養(yǎng)的益 處，例如，在WO 2006/021965中所描述的。然后通常依據(jù)益生菌的范圍指定這些微生物，益生菌對應(yīng)于當(dāng)施用充分量的微 生物時，能夠?yàn)樗拗魈峁┙】岛锰幍幕畹奈⑸?結(jié)合FA0/WH0 Expert Consultation Probiotics in food, FAO Food and nutritionpaper Nr85, ISBN 92-5-105513-0)。由口服施用微生物產(chǎn)生的好處非常廣泛地依賴于所使用的微生物菌株，但也依賴 于它的施用形式。在同一種中，根據(jù)使用的菌株，觀察到的效果確實(shí)是上下起伏，有時候有 益，有時候無益或中性，例如在大腸桿菌種中可能既找到致病菌株(例如產(chǎn)腸毒素或腸出 血類型)，又找到有益菌株例如 Nissle 1917 菌株(M. de Vrese ；P. R. Marteau. Probiotics andPrebiotics =Effects on Diarrhea,2007, J. Nutr. ,137(3 Suppl. 2)，803S-811S)。因 此，目前不可能預(yù)測對于給定菌株是否可以計算施用這個菌株在人類健康方面的益處，或 甚至不可能預(yù)測它的可能的益處或它的強(qiáng)度的性質(zhì)。一些數(shù)量的微生物菌株，特別是在酵母菌和乳酸菌中，已經(jīng)鑒別了對胃腸道的一 些有益的效果。然而，要獲得對于胃腸道的完全的有益作用，通常需要伴隨施用幾種不同 t^MW^tt (I. Goktepe ；V. K. Juneja ；M. Ahmedna (eds.) Probioti cs in Food Safety and Human Health 2006, CRCTaylor & Francis, ISBN 1-57444-514-6)。此外，已經(jīng)觀察到很多微生物，特別是乳酸菌，具有促炎作用。該促炎作用可以證 明是特別地有害和不需要的，例如在自身免疫性疾病或免疫缺陷中。已經(jīng)描述了酵母菌的一些片段和/或酵母菌的一些衍生物對消化道的有益效果。因此，已經(jīng)描述了源于酵母菌的甘露糖蛋白抑制病原體粘附的效果。同樣，已經(jīng)描 述了酵母菌壁的纖維效果。但是存在許多釀酒酵母菌菌株，并且它們沒有有益的效果或相 同的效果。此外，根據(jù)使用的菌株和施用的酵母菌形式，所述的效果可能同樣非常不同。同樣，存在對微生物新菌株的需要，微生物新菌株可能發(fā)揮對健康的關(guān)于特定的 病狀或功能紊亂或不是的預(yù)防和/或治療的有益效果，或?qū)ι眢w和精神通常的健康狀態(tài)的 有益效果。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是保藏在國家微生物培養(yǎng)物保藏中心(CollectionNationalede Cultures de Microorganismes)的CNCM 1-3856號的釀酒酵母菌新菌株，和保藏在國家 微生物培養(yǎng)物保藏中心的CNCM 1-3799號的釀酒酵母var. boulardii新菌株。它的目的同樣是從保藏在國家微生物培養(yǎng)物保藏中心的CNCMI-3856號菌株獲得 的釀酒酵母菌，和從保藏在國家微生物培養(yǎng)物保藏中心的CNCM 1-3799號菌株獲得的釀酒 酵母var. boulardii酵母菌。本發(fā)明的另一個目的是一種組合物，該組合物包括從保藏在國家微生物培養(yǎng)物保 藏中心的CNCM 1-3856號菌株獲得的釀酒酵母菌和/或從保藏在國家微生物培養(yǎng)物保藏中 心的CNCM 1-3799號菌株中獲得的釀酒酵母var. boulardii酵母菌和/或至少一種選自酵 母提取物、壁衍生物、壁葡聚糖、壁甘露糖蛋白、酵母脂質(zhì)片段、酵母菌核酸(RNA、DNA)片段 的釀酒酵母菌衍生物。根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以下優(yōu)勢-特別是以它的干燥的形式，通過胃屏障時的抵抗和存活能力，允許了它對胃腸道 效果的最優(yōu)化；-抗炎作用；-沒有任何促炎效果或非常小的效果；-減輕腸內(nèi)疼痛的能力，以及最后-預(yù)防或減少致病菌和/或具有胃腸道入侵性的那些細(xì)菌的吸附和增殖的能力， 特別是小腸和結(jié)腸入侵性的細(xì)菌。這樣具有上述特征的組合的新組合物，還沒有被描述或鑒別。因此，它具有異常的重要性。本發(fā)明的另一個目的是前述組合物用于制備食品增補(bǔ)劑和/或益生菌和/或功能 食品和/或營養(yǎng)品和/或功能成分和/或美容品和/或藥物有效成分的應(yīng)用，意欲用于人 類和/或動物。此外，本發(fā)明涉及前述組合物用于食品組合物的制備的應(yīng)用，食品組合物意欲改 善胃腸道舒適和/或改進(jìn)腸菌類。本發(fā)明的目的同樣是前述組合物用于制備藥物的應(yīng)用，藥物意欲用于和/或預(yù)防 腸內(nèi)紊亂、腸功能紊亂或胃腸疾病。本發(fā)明的一個目的是前述組合物用于制備藥物的應(yīng)用，藥物意欲用于治療和/或 預(yù)防由痛覺過敏癥狀顯示的腸內(nèi)病狀或紊亂。最后，本發(fā)明最后一個目的是包括以適于口服施用形式的前述至少一種酵母菌和 /或至少一種酵母菌衍生物的試劑盒。申請人:根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在國家微生物培養(yǎng)物保藏中心(巴斯德研究所，巴 黎)的CNCM 1-3856號菌株，出于簡明的目的將被稱為“ScProl”。申請人:同樣根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在國家微生物培養(yǎng)物保藏中心(巴斯德研究 所，巴黎)的CNCM 1-3799號菌株，出于簡明的目的將被指定為“SCB1”。最后，出于簡明的目的，選自酵母菌提取物、壁衍生物、壁多聚糖、壁甘露糖蛋白、 酵母菌脂質(zhì)片段、酵母菌核酸(RNA、DNA)片段和它們的混合物的釀酒酵母菌衍生物將被指 定為“衍生物”。有益菌有意指定為活的微生物，其中它們以足夠量合并，發(fā)揮對于健康狀態(tài)、舒適和健康的超過傳統(tǒng)營養(yǎng)效果的積極效果。營養(yǎng)食品或營養(yǎng)品或功能食品或藥妝品意思是含有對健康具有有益效果或能夠 改善生理機(jī)能的成分的食品。食品增補(bǔ)劑意思是具有完成標(biāo)準(zhǔn)食品飲食目的的食品。當(dāng)營養(yǎng)物或其它具有營養(yǎng) 或生理效應(yīng)的物質(zhì)被獨(dú)自使用或以小量作為一種組合時，食品增補(bǔ)劑是它們的濃縮來源。意欲用于特定給食的食品(DDAP)的意思是具有特定營養(yǎng)目的、意欲用于明確定 義的人群組的食品，如嬰兒、初學(xué)走路的孩子、運(yùn)動員。在本發(fā)明中提及的食品組合物可以是食品增補(bǔ)劑或DDAP。本發(fā)明的菌株已經(jīng)由申請人詳細(xì)說明了它們許多優(yōu)勢和特別顯著地它們對人類 消化道、特別是小腸和結(jié)腸產(chǎn)生有益效果的能力，通常也對身體起作用。事實(shí)上，可以觀察到，令人驚訝地，酵母菌ScProl和/或SCBl和/或衍生物能夠 誘導(dǎo)抗炎作用，不同于許多酵母菌菌株，并且沒有任何促炎作用。事實(shí)上，ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物引起涉及抗炎信號中的白細(xì)胞介 素IL-IO的分泌。此外，不同于乳酸菌類型的益生細(xì)菌的作用，ScProl和/或SCBl菌株和 /或衍生物不誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-12的合成。同樣，相對于細(xì)菌益生菌，TNFa和IFNy 促炎細(xì)胞因子的生產(chǎn)顯著降低。此外，試驗(yàn)已經(jīng)證明了酵母菌ScProl的體內(nèi)抗炎效果，顯 著地大腸的炎癥降低了 一半，腸內(nèi)壞死減少了三分之一。此外，ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物，以它們干燥的形式，能夠橫過胃 屏障而對它的存活或它的完整性沒有任何負(fù)面影響，并且該酵母菌不在結(jié)腸環(huán)境中駐留。本申請人第一次并特別令人驚奇地證明，ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生 物能夠增加對疼痛的抵抗，顯著地對體內(nèi)大鼠模型。除這些有益效果之外，ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物能夠抑制致病微 生物和/或在腸內(nèi)具有入侵性的那些的增殖和/或入侵。施用所述酵母菌引起結(jié)腸中腸道 菌的減少和耐抗生素的腸菌類的減少。具體地，它已經(jīng)顯示了抗白色念珠菌的腸內(nèi)增殖和該病菌引起并保持的炎癥的預(yù) 防和治療能力。此外，所述酵母菌具有對致病菌株和/或具有大腸桿菌致病類型的入侵性 的那些的吸附和入侵能力的抑制效果，大腸桿菌致病類型從感染有克羅恩病的病患的回腸 活檢樣品中分離得到。根據(jù)本發(fā)明，ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物可以以活的或可生存的形 式施用，優(yōu)選地口服地。根據(jù)本發(fā)明，“活的形式”或“活的”的意思是酵母菌，它的新陳代謝是活躍的或起 作用的或能夠繁殖的。顯著地以酵母菌干燥形式或新鮮形式。典型地，新鮮形式的酵母菌看起來是壓制的或弄碎的酵母菌。它也可能看起來是 懸浮在水相中的酵母菌，因而它被指定為液體酵母菌。在這種情況下，所述酵母菌優(yōu)選被封 裝。封裝方法和不同類型的膠囊是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在干燥的酵母菌形式中，酵母菌可以是瞬間干燥形式或活性干燥形式。干燥的酵 母菌意思是具有干物質(zhì)水平超過90%的任何酵母菌，優(yōu)選地在大約92% -96%范圍內(nèi)。在干燥的酵母菌中，酵母菌可以進(jìn)一步是中濕度的，深度冷凍的或非深度冷凍的。瞬間干燥的酵母菌主要意欲供產(chǎn)業(yè)工人和熟練的面包師使用。其它的應(yīng)用和途徑基于食品參考系統(tǒng)是可能的(藥劑學(xué)，酒精發(fā)酵)。該干燥的酵母菌的特性是在融合進(jìn)面粉 前，它不需要再水化。它源于通過熱風(fēng)梯度作用的酵母菌的脫水，熱風(fēng)梯度作用使得糊狀產(chǎn)物(加壓的 或液體酵母菌)轉(zhuǎn)變成薄的干燥的蠕蟲而仍然保持活性。對于它保持穩(wěn)定，所述產(chǎn)物然后 應(yīng)當(dāng)缺氧保存?；钚缘母山湍甘腔畹慕湍?，在低溫下被干燥，為了保持它的發(fā)酵能力并擁有長期 的保存。它看起來是小球。這個酵母菌源于所述酵母菌的脫水，通過熱和機(jī)械行為的共同的作用，使得糊狀 形式的酵母菌轉(zhuǎn)化成干燥產(chǎn)物，而保留它的生存能力。選擇的活性酵母菌通過擠出獲得，并在生物量流動床中干燥(活的酵母菌細(xì)胞)。 這個活性的干燥的酵母菌，即，具有高含量的活酵母細(xì)胞的干酵母菌看上去如同小顆粒，通 常具有0. 1 μ m-2. 5mm的直徑，和按質(zhì)量計4_8%的水含量。這些干燥形式與新鮮形式比較，具有提供更好的胃抗性的優(yōu)勢和根據(jù)本發(fā)明的酵 母菌的優(yōu)化的有益效果。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的酵母菌將優(yōu)選地以活性干酵母的形式。通常公認(rèn)促炎細(xì)胞因子刺激炎癥機(jī)制，然后可能造成大量的臨床問題，特別是在 自身免疫疾病或免疫缺陷的情況中。因此，根據(jù)本發(fā)明的酵母菌可以用于預(yù)防和/或治療腸內(nèi)疾病或發(fā)炎引起的紊 亂，不管它們是慢性的還是急性的，可能與腹瀉或便秘關(guān)聯(lián)或不關(guān)聯(lián)。在第一個實(shí)施方式中，所述紊亂和疾病與腹瀉關(guān)聯(lián)或不關(guān)聯(lián)。在第二個實(shí)施方式中，所述紊亂和疾病與腹瀉不關(guān)聯(lián)。顯著地，ScProl和/或SCBl 酵母菌和/或衍生物可以用于預(yù)防或治療實(shí)質(zhì)上特點(diǎn)是結(jié)腸發(fā)炎的大腸炎。具體地，所述酵母菌非常適合預(yù)防和/或治療慢性炎癥腸道疾病(CIBD)，特別地 潰瘍性結(jié)腸炎、出血性直腸結(jié)腸炎、腹腔疾病或克羅恩病。這些疾病的顯著特點(diǎn)是惡化的免疫反應(yīng)，其中包括多樣的炎性層級。因此，在用益 生菌和/或藥物食品和/或功能食品和/或營養(yǎng)品和/或藥妝品預(yù)防或治療這些疾病的范 圍內(nèi)，促炎效果盡可能的弱是重要的。因此根據(jù)本發(fā)明的ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物最適于這些應(yīng)用。所 述酵母菌具有幾個額外的優(yōu)勢。第一個是它具有增加對疼痛抗性的能力。第二個是，特別對于克羅恩病，所述酵母 菌能夠顯著地抑制大腸桿菌致病菌株和/或來自患有所述疾病的病患的具有入侵性的那 些致病菌株的吸附和入侵能力。炎癥反應(yīng)可能特別地歸咎于所有致病微生物的入侵。因此，根據(jù)本發(fā)明的ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物顯示了預(yù)防或治療胃 腸紊亂或疾病的有益效果，胃腸紊亂或疾病歸咎于致病微生物和/或具有入侵性的那些， 原核生物、如細(xì)菌，或真核生物、如真菌的腸內(nèi)增殖。胃腸紊亂或疾病可以是腸內(nèi)慢性炎癥疾病如潰瘍性結(jié)腸炎、腹腔疾病、克羅恩病 和出血性結(jié)腸直腸病。此外，ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物使得對疼痛的抵抗的增加，它同樣 在特點(diǎn)是痛覺過敏的情形的腸病狀或紊亂的預(yù)防或醫(yī)療治療中具有優(yōu)勢。這些腸病狀或紊亂可能特別地是功能性腸紊亂、慢性炎癥性腸道疾病(CIBD)或特點(diǎn)是慢性內(nèi)臟疼痛的食 物不耐受(過敏、條件作用等)。它顯著地適合痛覺過敏和特別地不論形式的腸道易激綜合癥(IBS)(便秘、腹瀉 或兩個的結(jié)合)的預(yù)防或醫(yī)療治療，但同樣適合不在IBS范圍內(nèi)的慢性內(nèi)臟疼痛，如沒有任 何排泄物排除紊亂的功能性腹痛(FAPS:功能性腹痛)和與食品不耐受和腹部疾病相關(guān)的疼痛。ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物或包括它的任何組合物因此可以預(yù)防性 地使用在對這類紊亂或疾病具有易患體質(zhì)或敏感性的主體中，或醫(yī)療性地，例如在一段時 間期間或經(jīng)歷比較久的周期。本發(fā)明的組合物和方法可以減少主體的痛苦，減輕這些紊亂 的癥狀或原因。根據(jù)本發(fā)明的酵母菌和/或衍生物對疼痛、炎癥和致病微生物和/或具有入侵性 的那些微生物的效果的聯(lián)合的確引起健康、健康狀態(tài)和/或人類或動物胃腸道的舒適的改善 ο根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包括ScProl和/或SCBl酵母菌和/或至少一種選自酵 母提取物、壁衍生物、壁葡聚糖、壁甘露糖蛋白、酵母菌脂質(zhì)片段、酵母菌核酸(RNA、DNA)片 段的釀酒酵母衍生物，以在大約IO7和6. IOltlCFU之間的量，優(yōu)選地在IO8和2. IOltlCFU之間， 或者，在Img和IOg之間，優(yōu)選地在Img和Ig之間。這個量可以每日的量，一次服用或在一 天內(nèi)幾次服用。優(yōu)選地，ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物用在治療性或非治療性的應(yīng)用 中，日劑量包括IO7和6. IO10CFU(克隆形成單位)之間，優(yōu)選地在IO8和2. IO10CFU之間。當(dāng)酵母菌和/或衍生物是活的形式但不能生存的情況時，在治療或非治療應(yīng)用中 的有用的日劑量將優(yōu)選地包括Img和IOg之間，優(yōu)選地Img和1 g之間。有效日劑量可以以 一次、兩次、三次或四次施用。根據(jù)本發(fā)明的酵母菌和/或衍生物或包括它的組合物優(yōu)選地口服施用。可能以治 療上有效量給藥，這意味著至少一種癥狀被減輕或抑制。ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物可以包括在人類或動物的食品組合物中 和/或與適于口服施用的賦形劑或載體一起施用。意欲用于人類食品的組合物可以是液體、糊團(tuán)或固體。特別地，組合物可以是乳 制品如干酪、黃油、酸奶酪或奶油，基于水果的產(chǎn)品如果汁、糖漬水果或果凍，飲料或固體食 品，如小吃、餅干或其它食品。因此，所述組合物包括ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍 生物和食品或飲料的成分。ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物同樣可以包括在藥物組合物中。所述藥 物組合物適合口服施用。它因此包括ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物以及選自批 準(zhǔn)用于藥物制劑制備的賦形劑的適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)載體。它可以被制成液體，如糖漿或藥水，或制 成藥片、明膠膠囊、小袋、膠囊或粉末或其它合適的醫(yī)學(xué)形式。ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物可以進(jìn)一步與其它益生菌和/或其它功 能性成分一起給藥，特別是顯著地用于更完善的預(yù)防作用的益生細(xì)菌。作為一個例子，可以是乳酸菌屬(Lactobacillus)乳酸菌、雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium)、小球菌屬(Pediococcus) ^MStffliiM (Propionibacterium)或明串
8珠菌屬(Leuconostoc)。ScProl和/或SCBl酵母菌和/或衍生物同樣可以與其它活性成分一起施用，如抗 生素、止痛劑、抗腹瀉劑、輕瀉劑或它們的混合物。


本發(fā)明現(xiàn)在將用以下的實(shí)施例和圖片說明，以圖片的形式給出，沒有任何的限制， 其中-圖1說明了模擬人類結(jié)腸的人工消化系統(tǒng)中ScProl酵母菌的存活的監(jiān)測，根據(jù) 實(shí)施例2 ；-圖2說明了ScProl酵母菌對結(jié)腸菌群的作用，根據(jù)實(shí)施例2 ；-圖3和圖4說明了實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)1和2的小鼠糞便中白色念珠菌的細(xì)胞數(shù)的 發(fā)展，相應(yīng)于預(yù)防模型(圖3)和治療模型(圖4)；-圖5說明了依賴于預(yù)培養(yǎng)的ScProl酵母菌的量的大腸桿菌AIECLF82細(xì)胞對人類腸內(nèi)上皮細(xì)胞的殘余粘附的百分比；所述酵母菌細(xì)胞與腸內(nèi)上 皮細(xì)胞一起培養(yǎng)一個小時。在ScProl酵母菌存在時用AIEC LF82菌株對細(xì)胞進(jìn)行感染，根 據(jù)實(shí)施例6 ；-圖6說明了依賴于共培養(yǎng)的ScProl的量的大腸桿菌AIECLF82對人類腸內(nèi)上 皮細(xì)胞的殘余的粘附的百分比；酵母菌細(xì)胞和大腸桿菌細(xì)胞同時與腸內(nèi)上皮細(xì)胞培養(yǎng)1小 時，根據(jù)實(shí)施例6 ；-圖7說明了施用ScProl和SCBl酵母菌后，根據(jù)肉眼可見的華萊士分值，對小鼠 腸內(nèi)的炎癥強(qiáng)度的估計，根據(jù)實(shí)施例4 ；-圖8說明施用ScProl和SCBl酵母菌后，根據(jù)組織學(xué)Ameho分值，對小鼠腸內(nèi)上 皮細(xì)胞的炎癥強(qiáng)度的估計，根據(jù)實(shí)施例4 ；-圖9說明單獨(dú)或組合施用ScProl和SCBl酵母菌后，根據(jù)肉眼可見的華萊士分 值，對小鼠腸內(nèi)的炎癥強(qiáng)度的估計，根據(jù)實(shí)施例4 ；-圖10說明單獨(dú)或組合施用ScProl和SCBl酵母菌后，根據(jù)組織學(xué)Ameho分值，對 小鼠腸內(nèi)上皮細(xì)胞的炎癥強(qiáng)度的估計，根據(jù)實(shí)施例4 ；-圖11說明將根據(jù)本發(fā)明的酵母菌或衍生物與人類腸內(nèi)上皮細(xì)胞接觸1小時和3 小時后，編碼IL-IO蛋白的基因的mRNA表達(dá)水平，根據(jù)實(shí)施例7 ；-圖12說明將根據(jù)本發(fā)明的酵母菌或衍生物與人類腸內(nèi)上皮細(xì)胞接觸1小時和3 小時后，編碼核受體PPAR α的基因的mRNA表達(dá)水平，根據(jù)實(shí)施例7 ；-圖13說明將根據(jù)本發(fā)明的酵母衍生物與人類腸內(nèi)上皮細(xì)胞接觸1小時和3小時 后，編碼IL-IO蛋白的基因的mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，根據(jù)實(shí)施例7 ；-圖14說明施用根據(jù)本發(fā)明的酵母菌和/或衍生物后，編碼IL-IO蛋白的基因在 小鼠腸內(nèi)上皮細(xì)胞中的表達(dá)(實(shí)施例4)；-圖15說明施用根據(jù)本發(fā)明的酵母菌和/或衍生物后，編碼核受體PPARa的基因 在小鼠腸內(nèi)上皮細(xì)胞中的表達(dá)(實(shí)施例4)；以及-圖16顯示在將它們與根據(jù)本發(fā)明的酵母菌和衍生物接觸后，來自患有克羅恩 病或不患有克羅恩病的病患的活檢樣品的腸細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-IO的量，以pg/ml計(實(shí)施例8)；-圖17顯示在將它們與根據(jù)本發(fā)明的酵母菌和/或衍生物接觸后，來自患有克羅 恩病或不患有克羅恩病的病患的活檢樣品的腸細(xì)胞分泌的TNF-α細(xì)胞因子的量，以pg/ml 計(實(shí)施例8)；-圖18顯示測量ScProl酵母菌的甘露糖蛋白片段(EL05和EL06)與I類纖毛的 結(jié)合能力試驗(yàn)的結(jié)果；-圖19A和19B分別顯示在與增加酵母菌濃度的共培養(yǎng)中，AIECLF82菌株相對于 T84細(xì)胞的平均殘余入侵和粘附百分比(實(shí)施例6)-*p < 0. 05，< 0.01 ；-圖20A和20B分別顯示在與增加EL05酵母菌甘露糖蛋白濃度的共培養(yǎng)中，AIEC LF82菌株相對于T84細(xì)胞的平均入侵和粘附百分比_(實(shí)施例6)；-圖21A和21B分別顯示在與增加濃度的酵母菌預(yù)培養(yǎng)中，AIECLF82菌株相對于 T84細(xì)胞的平均殘余入侵和粘附百分比(實(shí)施例6)-*p < 0. 05，和< 0.01 ；-圖22A和22B分別顯示在與增加濃度的EL05酵母菌甘露糖蛋白的預(yù)培養(yǎng)中， AIEC LF82菌株相對于T84細(xì)胞的平均入侵和粘附百分比(實(shí)施例6)-*p < 0. 05，和**p < 0. 01 ；-圖23顯示在與增加濃度的瞬間干燥的ScProl酵母菌預(yù)培養(yǎng)中，AIECLF82菌 株相對于CHO-Kl和CHO-K1/CEACAM6細(xì)胞的殘余的粘附百分比(實(shí)施例6)-*p < 0. 05，和
氺氺ρ < 0. 01 ；-圖24顯示AIECLF82菌株或無纖毛的LF82- δ fimH突變體對患有克羅恩病的細(xì) 胞的3個樣品的腸上皮細(xì)胞的刷狀緣的粘附(實(shí)施例6)；-圖25顯示在健康的大鼠上相對于不同的酵母菌的痛覺閾的測量值(以mm汞柱 計)(實(shí)施例9)；以及-圖26顯示了在具有內(nèi)臟超敏性的大鼠上相對于不同的酵母菌的痛覺閾的測量 值(以mm汞柱計)(實(shí)施例9)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 =ScProl和/或SCBl酵母菌在模擬人類腸的人工消化環(huán)境中的存活ScProl和/或SCBl酵母菌在胃腸運(yùn)輸中的結(jié)局的研究在模擬人類消化的人工消化環(huán)境中體內(nèi)檢測和研究ScProl和/或SCBl酵母菌， 特別地通過研究在胃腸運(yùn)輸中被測試的活酵母菌的存活?；钚愿山湍感问降腟cProl的兩個樣品和活性干酵母形式的SCBl的兩個樣品被檢 測。兩個樣品通過在室溫下真空中保存的時間而區(qū)分少于6個月陳化或2年陳化。 實(shí)驗(yàn)條件:消化在被稱為TlMl的系統(tǒng)(胃+小腸)中進(jìn)行，根據(jù)從文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)確定的實(shí)驗(yàn) 條件，并再制造液體食品(水)在具有空的胃的健康成年人中的消化，通過透析和吸收去除 消化產(chǎn)物。每一次消化超過5個小時。所有的消化在同樣的普通的操作條件下進(jìn)行，即溫度溫度是37°C。
胃排空參數(shù)胃排空遵循Elashoff等(1982)定義的規(guī)則，規(guī)定為F = t. 2e{-(l/T)b}其中F說明了遞送的膳食片段，t是時間，T是排空一半食物的時間，b是描述曲線 方面的參數(shù)。所述參數(shù)是T = 15分鐘，b = l?；啬c排空參數(shù)回腸排空參數(shù)遵循修改的Elashoff規(guī)則(引進(jìn)參數(shù)d，使得排空在消化結(jié)尾時慢 下來，F(xiàn)m = F+d*t3)。所述參數(shù)是=T = 150分鐘，b = 2. 4，d = _10」(參照圖2)。pH給定值胃(分鐘 /pH) 0/6. 0,10/3. 2,20/2. 4,40/1. 8,60/1. 6,90/1. 5,300/1. 5十二指腸6.4空腸6.9回腸7.2胃分泌物HCl胃蛋白酶脂肪酶腸分泌物在小腸三個部分的NaHCO3在十二指腸中的膽汁提取物在十二指腸中的胰腺提取物透析和/吸收腸內(nèi)半流體消化物的“小”分子的移除在具有人造腎臟的兩個水平的TlMl (空腸 和回腸)中進(jìn)行。腸內(nèi)半流體消化物的透析在抗鹽溶液中持續(xù)進(jìn)行，其成分與血漿的成分 接近。透析液收集在透析袋中。在消化時在不同水平的消化道中提出樣品以監(jiān)控被檢測的酵母菌的存活。酵母菌的計數(shù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)微生物方法學(xué)實(shí)行，并在10、20、30和45分鐘的胃中、累積 超過一小時周期的回腸出口和最后的殘?jiān)刑崛〉臉悠分型瓿?。計?shù)方法如下每一個樣品快速地用滅菌的生理鹽水(NaCl 8. 5g/L)以1 10連續(xù)稀釋。然后 取0. Iml每一種稀釋液并涂布在分布在培養(yǎng)皿中的瓊脂糖培養(yǎng)基的表面上(每種稀釋液兩 個平皿)。平皿在35°C下培養(yǎng)48小時，然后接著計算“克隆形成單位”(CFU)。計算的結(jié)果以CFU/ml (原始數(shù)據(jù))表示，以及活酵母細(xì)胞相對于最初引進(jìn)的酵母 菌數(shù)量的百分比，以測定酵母菌在胃中和脫離小腸時的存活率。下表總結(jié)了理論的(如果100%生存)和每一菌株在胃中、消化5個小時后在全部 的回腸出口中以及消化5個小時后在全部的系統(tǒng)中的實(shí)際存活率?！そY(jié)果
消化的產(chǎn)物引進(jìn)的酵母 菌，以CFU胃出口， T = 45分鐘回腸出口， T = 5小時全部的存活， T = 5小時ScProl 第一批3. 5101089%100%106%ScProl 第二批2. OlO1088%95%106%SCB 11.5101083%76%81%SCB 21.5101085%69%76%·結(jié)論這些結(jié)果實(shí)際上證明了 ScProl和SCBl酵母菌極好的胃腸存活。t施例2 在Itffl人類腸的人工消化環(huán):It中的ScProl酵母菌的存活tf.^m^m^ ScProl酵母菌的存活禾口它們對腸內(nèi)菌群的影Π向的研究在模擬人類消化的人工消化環(huán)境中體外檢測和研究活性干燥形式的ScProl酵母 菌，并特別地通過研究在結(jié)腸發(fā)酵中被檢測的活酵母的結(jié)局和環(huán)境效果。結(jié)腸發(fā)酵涉及順次補(bǔ)充培養(yǎng)基以保持菌群的連續(xù)發(fā)酵。所述培養(yǎng)基主要包含復(fù)雜 的碳水化合物，在消化道上部不消化的(淀粉、膠質(zhì)、纖維素等)，或多或少水解的蛋白化合 物和粘液素。結(jié)腸培養(yǎng)基同樣以順次方式從發(fā)酵桶中移除。所述培養(yǎng)基由透析系統(tǒng)覆蓋，使得 連續(xù)地移除可溶性的發(fā)酵產(chǎn)物。收集透析液以分析短鏈脂肪酸(SCFA)。所述培養(yǎng)基在由特定的發(fā)酵氣體產(chǎn)生的缺 氧條件下保持并且它具有小于_300mV的氧化還原勢。最終，控制PH值在給定的點(diǎn)值6。每一種消化包括在結(jié)腸中播種后穩(wěn)定化處理菌群2-3天的時期，至少每日添加 產(chǎn)物的處理時期(至少3天)，和停止處理3天的時期。在每一次實(shí)驗(yàn)中，遵循和/或記錄以下參數(shù)-酵母菌的生存能力；-不同的需氧和厭氧細(xì)菌群的發(fā)展；-主要發(fā)酵產(chǎn)物(SCFA和氣體)的發(fā)展；-標(biāo)準(zhǔn)酶活性的探測；和_溫度、pH和氧化還原勢。在60ml的青霉素瓶、以褶皺隔膜密封、在30ml的結(jié)腸培養(yǎng)基(培養(yǎng)基加新鮮的排 泄物菌群)中進(jìn)行。所述的酵母菌樣品添加至30ml的培養(yǎng)基中。由微生物懸浮液組成的結(jié)腸培養(yǎng)基同樣用于培養(yǎng)人工結(jié)腸中的結(jié)腸菌群，其中微 生物懸浮液源于在磷酸緩沖液中的典型食品的新鮮糞便。
在混合結(jié)腸培養(yǎng)基與被檢測的產(chǎn)物后，瓶子被塞緊并壓褶。所有的這些操作都在厭氧罩中進(jìn)行(沒有氧氣的氣體混合物)。瓶子放置在旋轉(zhuǎn) 培養(yǎng)箱(37°C -200rpm)中24小時。對于每一個產(chǎn)物，檢測都是一式兩份。此外，在同樣的條件下準(zhǔn)備4個對照的瓶子 (沒有任何產(chǎn)物)。兩個瓶子立即處理(初始時間)，兩個瓶子如檢測瓶一樣培養(yǎng)。24小時之后停止發(fā)酵，然后處理瓶子。發(fā)酵氣體的產(chǎn)生由發(fā)酵產(chǎn)生的氣體的體積依靠馬里奧特系統(tǒng)測定(基于通過包 含在青霉素瓶中的加壓氣體排出水的排水量的測量原理)。在瓶中存在的氣體的分析然后 通過 GPC 實(shí)現(xiàn)(H2、CO2、CH4、O2)。短鏈脂肪酸的生產(chǎn)進(jìn)行結(jié)腸內(nèi)含物的第一次取樣。然后將它冷凍，或直接處理以 測定培養(yǎng)物上清液的SCFA濃度(不穩(wěn)定的短鏈脂肪酸)。這個分析通過GPC實(shí)現(xiàn)。要尋找 的代謝物是乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、異己酸和庚酸。微生物分析進(jìn)行結(jié)腸內(nèi)含物的第二次取樣并立即處理(在減少的稀釋培養(yǎng)基中 連續(xù)稀釋至十分之一)以計算總的厭氧菌群、可選擇的需氧-厭氧菌群和真菌菌群。涉及ScProl酵母菌存活的結(jié)果在圖1中說明。在這個圖中，每一個垂直箭頭象征 ScProl酵母菌的施用。可以注意到，ScProl酵母菌顯示在施用后第三天良好的生存，和在施用期間的第 4和第7天之間強(qiáng)烈的死亡率。這顯示了酵母菌沒有植入至結(jié)腸環(huán)境中。微生物分析的結(jié)果在圖2中說明。它們顯示了在ScProl酵母菌存在時腸桿菌的 減少及在停止施用酵母菌后的升高。在施用ScProl酵母菌期間，同樣可以注意到抵抗抗生 素(氯霉素、慶大霉素)的菌群明顯地減少。涉及ScProl酵母菌對不穩(wěn)定的短鏈脂肪酸(SCFA)的生產(chǎn)的影響的結(jié)果總結(jié)在下 面的表中(在結(jié)腸培養(yǎng)基中表示為mM)。
在處理中，注意到部分有利于丙酸鹽的乙酸鹽的減少，暗示產(chǎn)乙酸菌群活性的降 低。在其它監(jiān)測的參數(shù)中，沒有觀察到處理的公認(rèn)的效果，關(guān)于V氣體生產(chǎn)(總量和比例)；V總的和單糖的濃度(隨時間而穩(wěn)定)；以及V酶活性。實(shí)施例3 =ScProUSCBl酵母菌對細(xì)胞因子的牛產(chǎn)的誘導(dǎo)的影響的研究研究活的ScProl和SCBl酵母菌對人類外周血單個核細(xì)胞(PBMC)上的細(xì)胞因子 的生產(chǎn)的誘導(dǎo)的影響。以它們瞬間干燥形式和活的干燥形式檢測ScProl和SCBl酵母菌誘導(dǎo)人類PBMC 中的IL-10、ILK_12、TNFa、TNF δ細(xì)胞因子生產(chǎn)的能力。人類外周血單個核細(xì)胞的制備在輸血中心從健康的實(shí)驗(yàn)者中獲的新鮮的人類血液，用PBS-Ca(GIBCO)稀釋兩 次，用菲可(Ficoll)密度梯度(GIBCO)純化。在20°C，400x g離心30分鐘后，外周血單個 核細(xì)胞(PBMC)在血清中形成環(huán)形層。仔細(xì)地吸取PBMC，使用PBS-Ca懸浮在50ml終體積 中，用同樣的緩沖溶液清洗三次，20°C，350x g離心10分鐘。PBMC然后通過使用完全RPMI 培養(yǎng)基(GIBCO)重懸浮，富含10% w/v胎牛血清(56°C下滅活30分鐘)，1 % w/v的L-谷氨 酰胺(GIBCO)和慶大霉素(150 μ g/ml) (GIBCO)。用顯微鏡計算PBMCjf PBMC至2X IO6 細(xì)胞/ml濃度，并分布(在Iml等分溶液中)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司)上。微牛物制備過夜培養(yǎng)的乳酸菌、乳球菌和大腸桿菌(對照菌株)的培養(yǎng)物用pH7. 2的PBS緩 沖液清洗兩遍，然后用PBS重懸至2. 109CFU/ml的濃度。在第一個實(shí)驗(yàn)中使用的酵母菌的濃度是2. 108CFU/ml。對于初始劑量比較研究，可 以進(jìn)行10至10的連續(xù)稀釋以比較2. 107CFU/ml、2. 108CFU/ml和2. 109CFU/ml的效果。人類外周血單個核細(xì)胞的培養(yǎng)10 μ L的這些工作懸浮液被轉(zhuǎn)移至含有PBMC的平板的孔中，設(shè)定在37°C的由5% 的CO2和95%的空氣組成的氣體混合物中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，吸取上清液，在2，OOOrpm 下離心(Eppendorf模型)，移除并保存在_20°C。對照由革蘭氏陽性菌(乳酸菌和乳球菌)、革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和沒有任何 酵母菌的緩沖液組成。細(xì)胞因子的量化通過ELISA測定細(xì)胞因子的表達(dá)水平。ELISA板用抗體覆蓋(一夜)，所述抗體用 PBS/1% BSA(胎牛血清蛋白)浸透。用已知濃度的細(xì)胞因子制備標(biāo)度，其檢測閾從15.62 至2，000pg/ml (過夜培養(yǎng))?？辜?xì)胞因子的檢索和量化通過使用TMB底物(四甲基聯(lián)苯 胺，Pharmingen2)測量鏈霉親和素活性實(shí)現(xiàn)。商業(yè)的Pharmingen試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商的說明使用。4個細(xì)胞因子選自3個促炎細(xì)胞因子(TNF α、INF γ、IL-12)和1個抗炎細(xì)胞因 子(IL-10)。MM4個細(xì)胞因子在5個不同的捐獻(xiàn)者上的反應(yīng)在1/1，酵母菌/PBMC比例下評估。在培養(yǎng)物上清液中的4個分泌的細(xì)胞因子的劑量結(jié)果總結(jié)在下面的表A中。數(shù)據(jù) 以5個捐獻(xiàn)者的劑量的平均值(Avg)表示。所述表同樣給出了平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差的值(Sem)。 表 A1)對于酵母菌ScProl和SCB1，不同于參考的細(xì)菌，觀察到由PBMC誘導(dǎo)的非常小 量或無法覺察量的IL-12的生產(chǎn)。2)對于兩個活的酵母菌均觀察到IL-10的真實(shí)水平，暗示SCBl具有比ScProl更 好的結(jié)果。3)至于INFy和TNFa，在ScProl和SCBl酵母菌的作用下分泌的量與不同的檢 測的益生菌比較明顯地較少。結(jié)論-清楚地顯示在PBMC存在下ScProl和SCBl酵母菌不誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-12， 不同于通常在益生乳酸菌中觀察到的。-在PBMC存在下ScProl和SCBl酵母菌誘導(dǎo)真實(shí)水平的IL-10(抗炎性)。-在ScProl和SCBl酵母菌存在下經(jīng)PBMC的IFN-γ和TNF- α的分泌量明顯比益 生菌小。t施例4 在鼠化學(xué)i秀草型(TNBS) Φ ScProl和SCBl酵母菌對大腸炎呆護(hù)效 果的評估目前使用假定的動物模型以適應(yīng)于測量酵母菌的抗炎效果。6周大的Balb/c小鼠在這個檢測中使用。在實(shí)驗(yàn)前使小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件一周， 隨意提供水和食物。每一個樣品在一組10個小鼠中檢測。大腸炎通過隨意分配含有5%
15(w/v-1)的TNBS的飲用水7天的循環(huán)而誘導(dǎo)。通過每天一次強(qiáng)制喂入口服給藥酵母菌，在 由TNBS開始誘導(dǎo)大腸炎3天前和在TNBS處理的過程中(7天)。除了兩個檢測組之外，對照組(陰性對照)被采取僅使用生理鹽溶液。處理后的檢測參數(shù)如下-腸炎的肉眼可見的評估(華萊士評分)。在顯微鏡下檢查解剖的每一只小鼠的 結(jié)腸(放大倍率，x5)以根據(jù)華萊士評分系統(tǒng)評估肉眼可見的損害；其中華萊士評分系統(tǒng)范 圍在0-10，依賴于揭示炎癥的嚴(yán)重性的評價標(biāo)準(zhǔn)，如充血、結(jié)腸壁的厚度和潰瘍的范圍。-炎癥的組織學(xué)評價(Ameho評分)。從肛門通道2cm處精確取樣結(jié)腸片段，用于 根據(jù)Ameho評分進(jìn)行組織學(xué)評價；其中Ameho評分范圍在0_6，依賴于炎癥的滲透度，侵蝕、 潰瘍或壞死的存在，和損害的深度以及表面的范圍。通過2個獨(dú)立的操作者完成腸內(nèi)損害 和降解的量化。-編碼IL-IO和PPARα的基因的表達(dá)的量化。為了做這個，通過RNeasy試劑盒 (Macherey Nagel, Hoerdt，法國)根據(jù)生產(chǎn)商的說明從結(jié)腸組織中分離總RNA。信使RNA 的量化通過使用分光光度計實(shí)現(xiàn)。在37°C下，用20-50單位的無RNase的DNase I處理30 分鐘后(羅氏診斷公司，印第安納波利斯，印第安納州，美國)，寡聚DT引物(羅氏診斷公 司，印第安納波利斯，印第安納州，美國)被用于合成環(huán)狀單鏈DNA。信使RNA用SYBR綠色 Master Mix (Applera, Courtaboeuf，法國)和體外研究使用的特定人類寡核苷酸(見下面 的表 B)定量，通過裝置 GeneAmp Abiprism 700(Applera, Courtaboeuf，法國)。校準(zhǔn)或非 校準(zhǔn)的對照包括在每一個檢測中。每一個樣品被測量3次。綠色SYBR的顏色強(qiáng)度使用軟 件包Abiprism 7000SDS分析(Applera，Courtaboeuf，法國)。所有的結(jié)果將被相對于編碼 β-肌動蛋白的基因標(biāo)準(zhǔn)化。 ^B在上面描述的標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)防性模型中檢測ScProl和SCBl酵母菌。在誘導(dǎo)大腸炎之 前的動物重量監(jiān)測顯示對小鼠施用的酵母菌制品非常好的忍受。通過華萊士評分的腸炎，與陽性對照比較，使用ScProl酵母菌(活的干酵母，Img/天)和SCBl酵母菌減少了 60%。SCB1酵母菌同樣誘導(dǎo)了炎癥的減少。同樣，通過Ameho評分 評估的腸內(nèi)壞死，與陽性對照比較，使用ScProl酵母菌(瞬間干燥酵母菌，Img或100 μ g/ 天)減少了三分之一。ScProl和SCBl酵母菌，單獨(dú)或一起施用，增加了編碼抗炎白細(xì)胞介素IL-IO和核 受體PPARa基因的表達(dá)水平。圖7-10充分地說明了以不同日劑量的ScProl和SCBl酵母菌的卓越的肉眼可見 的華萊士和Amebo評分值。瞬間干燥形式的ScProl和SCBl酵母菌的肉眼可見的華萊士和組織學(xué)Ameho分 值，采用10μ g和Img的日劑量，分別在圖7和圖8中說明。圖7和圖8的圖表的每一縱列的數(shù)值代表以下元素1代表單獨(dú)的TNBS，2 代表 TNBS+ScPro 1 (Img),3 代表 TNBS+ScProl(100y g)，4 代表 TNBS+SCB1 (Img),5 代表 TNBS+SCB1 (IOOyg)。可以注意的是瞬間干燥的ScProl酵母菌，劑量為100 μ g/天，明顯地降低了肉眼 可見和組織學(xué)水平的損害。ScProl和SCBl酵母菌的肉眼可見的華萊士評分和組織學(xué)Ameho評分，單獨(dú)或組合 采用，以瞬間干燥或活的干燥形式，采用ΙΟΟμ g和Img的日劑量，分別在圖9和圖10中說明。圖14和圖15分別顯示了編碼抗炎性白細(xì)胞介素和腸內(nèi)細(xì)胞的PPARa核受體的 基因的表達(dá)水平。圖9、10、14和15的圖表的每一縱列的數(shù)值代表以下元素1代表單獨(dú)的TNBS，2 代表 TNBS+ 瞬間干燥的 ScProl (100 μ g)，3 代表 TNBS+ 活的干燥的 ScProl (10 μ g)，4 代表 TNBS+ 活的干燥的 SCBl (100 μ g)，5 代表 TNBS+ 活的干燥的 ScProl (lug),6 代表 TNBS+ 活的干燥的 ScProl (100 μ g)，7 代表 TNBS+ 活的干燥的 ScProl (100 μ g) +SCBl (100 μ g)。結(jié)論可以注意到活的干燥形式的ScProl明顯降低了肉眼可見水平的損害，以及在肉 眼可見水平和組織學(xué)水平上的由ScProl和SCBl的聯(lián)合的協(xié)同抗炎效應(yīng)。在100 μ g劑量時，ScProl和SCBl已經(jīng)分別增加了 2. 9倍和3. 1倍的編碼抗炎細(xì) 胞因子IL-IO的基因的表達(dá)水平。組合的ScProl+SCBl (柱狀圖第7號)增加了 2. 7倍該 表達(dá)水平(圖14)。在100 μ g劑量時，ScProl和SCBl已經(jīng)分別增加了 1. 5和1. 6倍的編碼PPARa 核受體基因的表達(dá)水平。組合的ScProl+SCBl (柱狀圖第7號)增加了 1. 7倍該表達(dá)水平 (圖 15)。
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5 在化學(xué)i秀導(dǎo)炎癥的鼠It型中，ScProl和SCBl酵母菌對腸中白盧,念珠菌 的增殖的影響的研究所述研究針對在化學(xué)誘導(dǎo)大腸炎鼠模型中，測定益生菌類型的ScProl和SCBl酵 母菌的施用對致病酵母菌白色念珠菌的腸內(nèi)增殖的影響和對炎癥的潛在的作用。被檢測的酵母菌是瞬間干燥的形式?！?shí)驗(yàn)條件Balb/C菌株的雌鼠是4-6周大。從第O天到第14天，動物接受含有1. 5% DSS (葡 聚糖硫酸鈉)的飲用水，用于炎癥的化學(xué)誘導(dǎo)。執(zhí)行3個實(shí)驗(yàn)。在第一個實(shí)驗(yàn)中，在第5天，通過套管對小鼠強(qiáng)制喂入含有5. IO7ScProl酵母菌細(xì) 胞的200 μ L的PVS (磷酸緩沖液)。這個操作每天重復(fù)，共19天。在第O天，通過套管對小 鼠強(qiáng)制喂入含有5 X IO7酵母菌細(xì)胞的白色念珠菌SC5314菌株的200 μ L的PBS。在第二個實(shí)驗(yàn)中，在第O天，通過套管對小鼠強(qiáng)制喂入含有5. IO7酵母菌細(xì)胞的白 色念珠菌SC5314菌株的200 μ L的PBS。4天后，一批小鼠被強(qiáng)制喂入含有5. IO7ScProl酵 母菌細(xì)胞的200 μ L的PBS。這個操作每天重復(fù)，共14天。在第三個實(shí)驗(yàn)中，在第0天，通過套管對小鼠強(qiáng)制喂入含有5. IO7酵母菌細(xì)胞 的白色念珠菌SC5314菌株的200 μ L的PBS。一個小時以后，一批小鼠被強(qiáng)制喂入含有 5. IO7ScProl酵母菌細(xì)胞的200 μ L的PBS。這個操作每天重復(fù)，共14天。每天監(jiān)測這些動物(實(shí)驗(yàn)1、2和3中)的涉及以下要點(diǎn)-糞便硬度、肛門出血、它們的身體質(zhì)量(臨床分值)；-Ig勻質(zhì)化的糞便在ImlPBS中的再分離培養(yǎng)系，每種10 μ L接種在Candi選擇培 養(yǎng)基上；37°C培養(yǎng)24小時后，計算白色念珠菌(藍(lán)色)和釀酒酵母(綠色)的CFU;_在檢查的最后捐獻(xiàn)出動物。通過心臟穿刺立即取血樣，在室溫移入其它容器，通 過離心收獲血清，并保存在-80°C ；對結(jié)腸取樣并分成4個片段，它們中的3個被深度冷凍， 1個置于固定器中(4% PFA)用于組織學(xué)研究?！そY(jié)果如在圖3可以見到，在第一個實(shí)驗(yàn)中(預(yù)防效果測試)，在化學(xué)誘導(dǎo)大腸炎的 模型中可以觀察到，從第四天DSS給藥明顯增加了白色念珠菌引起的腸內(nèi)黏膜的增殖 (DSS+Ca)。非常有趣地，可以看出19天給藥ScProl益生酵母菌明顯降低由DSS誘導(dǎo)的白 色念珠菌的增殖。如在圖4中所示的，在第二個實(shí)驗(yàn)中(治療測試)，觀察到ScProl或SCBl益生酵 母菌的給藥減少了由DSS誘導(dǎo)的增殖。此外，ScProl酵母菌的效果是顯著的，甚至在停止 用DSS治療后第14天?！そY(jié)論它顯現(xiàn)出ScProl酵母菌或SCPl酵母菌的給藥明顯減少了白色念珠菌的增殖，既 在預(yù)防條件下，也在治療條件下。應(yīng)當(dāng)注意到這個預(yù)防的效果持續(xù)甚至到停止治療。實(shí)施例6 =ScProl或SCBl酵母菌或衍生物對大腸桿菌致病菌株的粘附性和入侵能 力白勺抑泡丨效果 惱開窮大腸桿Iflt病If株從患、有克羅周、病的病患、的回腸活檢樣品Φ分 K
研究活酵母菌、ScProl、SCBl和衍生物的影響，它的對從患有克羅恩病的病患的回 腸活檢樣品中分離的大腸桿菌致病菌株的粘附性和入侵能力的抑制效果。從患有克羅恩病(⑶)的病患的回腸活檢樣品中分離的對于粘附_入侵大腸桿菌 被指定為AIEC的大腸桿菌菌株能夠粘附和侵入腸內(nèi)的上皮細(xì)胞。從患有克羅恩病的病患的慢性回腸損害中分離的LF82大腸桿菌菌株，具有入侵 的細(xì)菌病原體的所有特征。已經(jīng)在大腸桿菌、志賀氏菌和沙門氏菌中記述的LF82菌株的粘 附-入侵表型的特征和入侵遺傳決定因子的缺乏已經(jīng)導(dǎo)致確認(rèn)可能與克羅恩病聯(lián)合的新 的致病組的大腸桿菌的存在，指定為AIEC。在鼠或人的巨噬細(xì)胞的噬菌作用后，AIEC LF82 菌株在大的空泡中存在并繁殖，而保留了宿主細(xì)胞的完整性。在感染之后，巨噬細(xì)胞分泌顯 著速率的TNFa。在患有⑶的病患的回腸損害中，AIEC菌株的流行是36. 4%。細(xì)菌到真核細(xì)胞的粘附過程起因于配基和受體之間的特異的交互作用；其中配基 存在于細(xì)菌表面，稱為粘附素；受體是在宿主的上皮細(xì)胞的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)、糖蛋白或 糖脂類受體。至于細(xì)菌，顯示出I類纖毛的FimH粘附素包括在AIEC細(xì)菌至腸內(nèi)上皮細(xì)胞 的粘附中。所述的細(xì)菌FimH粘附素識別CEACAM6腸上皮細(xì)胞受體(同樣指定為CD66c或 NCA)，是富含甘露糖殘基的糖蛋白并且在90%的患有CD的病患中在回腸水平不正常的過 量表達(dá)。實(shí)驗(yàn)條件特征在于對培養(yǎng)的腸內(nèi)上皮細(xì)胞的粘附性和入侵能力的菌株AIECLF82被用作原 型菌株。這個研究擴(kuò)大至10個從患有⑶的病患中分離的AIEC菌株以確定由AIEC LF82 菌株獲得的結(jié)果。DAEC (擴(kuò)散粘附性大腸桿菌)C1845大腸桿菌菌株，其通過獨(dú)立于甘露糖的機(jī)制 (Afa/Dr粘附素)粘附上皮細(xì)胞，被用作陰性對照。凝集試驗(yàn)用活的ScProl和SCBl酵母菌，在存在AIEC細(xì)菌時，或在存在根據(jù)在Boudeau 等描述的程序從AIEC LF82菌株中制備的純化的I類纖毛提取物時實(shí)現(xiàn)定量凝集試驗(yàn)。 (2001Mol. Microbiol. 39 1272-84)。凝集指數(shù)用指定酵母菌濃度和細(xì)菌或純化的I類纖毛 的可變濃度測定。在沒有觀察到凝集的甘露糖蛋白的酵母菌片段的情況下，I類纖毛的結(jié)合能力的 測量通過ELISA技術(shù)完成。這些試驗(yàn)通常在微孔板中執(zhí)行。所述的酵母菌片段固定在微孔板上。純化的I類 纖毛的不同稀釋液與酵母菌片段接觸。清洗后，I類纖毛利用在兔子中獲得的I類抗纖毛 抗體顯示(Boudeau等，2001)。清洗后，使用連有過氧化物酶的二抗。使用過氧化物酶底物 (H2O2)和發(fā)色試劑(四甲基聯(lián)苯胺)并通過讀450納米光密度的微孔板完成量化。通過ScProl和SCBl酵母菌抑制AIEC細(xì)菌和在腸內(nèi)上皮細(xì)胞的表面表達(dá)的 CEACAM6受體的交互作用的試驗(yàn)使用的細(xì)胞對于體外抑制試驗(yàn)(培養(yǎng)前或共培養(yǎng))，保留強(qiáng)烈表達(dá)受體CEACAM6的未分化的 T84腸內(nèi)上皮細(xì)胞。所述的T84細(xì)胞在37°C、5%的CO2下，在DMEM(Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有50%的Ham-F12(生命科技)和通過加 熱補(bǔ)充10%的胎牛血清。對于這個培養(yǎng)基，向MEM(最小必要培養(yǎng)基)培養(yǎng)基(生命科技) 添加非必需氨基酸(生命科技)、1%的谷氨酰胺(生命科技)、200U/L的青霉素、50mg/ L的鏈霉素、0. 25mg/L的兩性霉素B和1 %的X-100維他命混合物。按每ml每孔4. 105個 細(xì)胞接種細(xì)胞，并在37°C、5%的CO2下培養(yǎng)48小時。T84細(xì)胞毯然后用PBS清洗，然后Iml 的感染的培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%的FCS)添加至每一個孔中。從AIEC LF82菌株在37°C下 在Luria-Bertani肉湯(LB)里的過夜培養(yǎng)物中，制備在PBS中0D620為0. 1的細(xì)菌懸浮 液。通過在0D620為0. 1的感染培養(yǎng)基中添加25 μ L細(xì)菌懸浮液，對Τ84細(xì)胞感染1個細(xì) 胞有10個細(xì)菌的感染多樣性(MOI)。37°C時，在富含CO2的空氣下，將24孔平板培養(yǎng)3小 時。細(xì)菌的粘附和殘余的入侵如后面描述的完成。使用采用不表達(dá)CEACAM6的CHO-Kl細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定表達(dá)CEACAM6的這些同樣遺 傳改良的細(xì)胞(CH0-K1/CEACAM6)。在DMEM/F12培養(yǎng)基、5%的胎牛細(xì)胞血清、的L-谷氨 酰胺、200U/L的青霉素、50mg/L的鏈霉素和0. 25mg/L的兩性霉素B中培養(yǎng)細(xì)胞。所述細(xì)胞 接種在24孔板中，2. IO5細(xì)胞/孔。在37°C下培養(yǎng)7-8小時后，用添加有5mM 丁酸鈉的新 的培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基，以減少CEACAM6的表達(dá)。實(shí)施免疫印跡以監(jiān)測由轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的 CEACAM6蛋白的表達(dá)。在37°C下培養(yǎng)20-24小時后，所述細(xì)胞與增加濃度的瞬間干燥的ScProl酵母菌菌 株一起培養(yǎng)1小時(預(yù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn))，然后用20的MOI感染它們(4. IO6細(xì)菌/孔)，以觀察 之前在操作T84細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)菌/酵母菌比率。在37°C下培養(yǎng)3個小時后，在如下 描述的存在或不存在酵母菌時計算粘附的細(xì)菌。另一個實(shí)驗(yàn)使用來自疾病患者的活體的部分。來自患有克羅恩病的3個病患的回 腸活檢樣品的腸上皮細(xì)胞在PBS中清洗，然后在2ml的Oppendorf管中預(yù)培養(yǎng)，管中有Iml 的DMEM培養(yǎng)基，20%的胎牛血清，含有0、1. 25,2. 5或5mg/ml的瞬間干燥的ScProl酵母菌 菌株。通過37°C下旋轉(zhuǎn)15分鐘使管子攪拌，然后所述腸上皮細(xì)胞用含有酵母菌的50 μ L的 AIEC LF82菌株的過夜LB培養(yǎng)物感染。攪拌培養(yǎng)3小時。在PBS中清洗腸上皮細(xì)胞兩次， 然后放置在載玻片和薄片之間，在相襯顯微鏡中觀察。在存在或不存在酵母菌時完成粘附 腸上皮細(xì)胞的刷狀緣的細(xì)菌計數(shù)。這個實(shí)驗(yàn)同樣用無毛突變體LF82-delta fimH操作，以 測定不發(fā)揮CEACAM6受體上的I類纖毛的識別的AIEC細(xì)菌的基礎(chǔ)粘附水平。同樣，在存在 抗CEACAM6抗體時操作粘附抑制實(shí)驗(yàn)。隨后的用于測量細(xì)菌對腸內(nèi)上皮細(xì)胞T84的粘附和殘余入侵的過程用Iml的PBS清洗細(xì)胞毯4次，然后通過用500 μ L的1 %的蒸餾水中的Triton X-100在室溫培養(yǎng)5分鐘溶解細(xì)胞。稀釋溶解物然后平鋪在LB-瓊脂糖上以測定CFU的數(shù)， 相應(yīng)于粘附細(xì)菌的數(shù)。為計算入侵細(xì)菌，在感染后3小時用PBS清洗所述的細(xì)胞毯，然后用Iml含有 100μ g/ml慶大霉素的感染培養(yǎng)基培養(yǎng)1小時，以破壞胞外細(xì)菌。在細(xì)胞溶解、連續(xù)稀釋和 平鋪在LB-瓊脂糖上后計算入侵細(xì)菌。與被沒有經(jīng)歷任何酵母菌或酵母菌衍生物處理的AIEC LF82菌株感染的細(xì)胞比較 分析AIEC LF82菌株的粘附和入侵水平。根據(jù)速率R表示所有的結(jié)果
R =存在ScProl酵母菌時粘附或入侵細(xì)菌數(shù)/沒有任何處理的粘附或入侵細(xì)菌數(shù)。稈序1 共培養(yǎng)樽型如上面在粘附和入侵試驗(yàn)中所描述的，制備所述的T84細(xì)胞和細(xì)菌懸浮液。酵母 菌或酵母菌衍生物在PBS中懸浮至設(shè)定的濃度，然后25 μ L這種懸浮液加入至Τ84細(xì)胞的 感染培養(yǎng)基中(1ml)。所述細(xì)胞然后迅速地用細(xì)菌菌株感染至MOI = 10。將含有細(xì)胞的細(xì) 菌/培養(yǎng)的酵母菌的懸浮液勻質(zhì)化，24孔板在37°C下培養(yǎng)3小時。如上面描述的測定細(xì)菌 菌株的粘附和入侵水平，并且這在感染期間不含有或含有酵母菌或酵母菌提取物。在不含 有酵母菌時細(xì)菌的粘附或入侵水平(100%)和含有酵母菌時細(xì)菌的粘附或入侵水平之間 的比率代表了細(xì)菌的殘余的粘附和入侵水平。稈序2 預(yù)培養(yǎng)樽型如上面在粘附和入侵試驗(yàn)中所描述的，制備所述的T84細(xì)胞和細(xì)菌懸浮液。向T84 細(xì)胞的感染培養(yǎng)基(Iml)中加入25 μ L體積的酵母菌或酵母菌提取物的懸浮液。將酵母菌 懸浮液勻質(zhì)化，并在37°C下培養(yǎng)24孔板細(xì)胞1小時。這個培養(yǎng)之后，所述的T84細(xì)胞用細(xì) 菌菌株感染，MOI = 10，含有酵母菌，在37°C下感染3小時。在含有或不含有酵母菌時，如 上面所述的計算粘附的和入侵的細(xì)菌，以測定殘余的粘附或入侵百分比，其中100%代表不 含有酵母菌時的粘附或入侵。-CEACAM6的表汰的確認(rèn)對每一批培養(yǎng)的細(xì)胞執(zhí)行免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)注，以確認(rèn)CEACAM6的存在和估計 CEACAM6的表達(dá)量。所述細(xì)胞培養(yǎng)在滅菌玻璃薄片上。用PBS清洗細(xì)胞毯，然后在室溫用 3%的多聚甲醛在pH7. 4時混合10分鐘。所述細(xì)胞用抗CECAM6單克隆抗體(克隆9A7， Genovac)在潮濕的空氣中培養(yǎng)1個小時，抗CECAM6單克隆抗體在PBS_5%馬血清中稀釋 至1/100。用PBS清洗后，所述細(xì)胞與連接熒光染料的二抗在潮濕的空氣中(FITC-抗鼠， Zymed)接觸1小時，連接熒光染料的二抗在PBS_5%馬血清中稀釋至1/500。玻璃薄片固定 在含有Moewiol的載玻片上，然后用熒光顯微鏡觀察。_檢杳細(xì)胞毒性的缺乏由不同劑量的酵母菌誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的缺乏通過在酵母菌/細(xì)胞或FDL/細(xì)胞培 養(yǎng)基中定量提供乳酸脫氫酶(LDH) (Glasser等，2001)檢測。結(jié)果LF82的凝集實(shí)驗(yàn)從含有培養(yǎng)的(=新鮮形式)或干燥形式(瞬間干燥形式或冷凍干燥形式)的 ScProl或SCBl酵母菌的LF82中獲得的凝集滴定量總結(jié)在下表中，這是3_5個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 完全地，好的LF82的凝集結(jié)果從干的酵母菌、瞬間干燥的ScProl和瞬間干燥的 SCBl中獲得。對于這些酵母菌，顯示了方法的有利影響的重要性，特別是關(guān)于它的凝集潛能的 干燥方法的重要性。純化的纖毛的凝集試驗(yàn)在含有培養(yǎng)的ScProl酵母菌(=新鮮形式)或瞬間干燥形式的酵母菌和含有(干 的)SCBl酵母菌的純化的纖毛中獲得的凝集滴定度總結(jié)在下表中 這個實(shí)驗(yàn)確定了對于凝集，實(shí)際上需要纖毛_酵母菌的交互作用。由于纖毛具有 識別甘露糖結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，后者是在酵母菌上被識別的并包含在觀察到的凝集現(xiàn)象中。最好 的結(jié)果從瞬間干燥的ScProl酵母菌中獲得。測W"I mm^i ScProl酵母If的甘白片段的結(jié)合能力的i式驗(yàn)的結(jié)果圖18清楚地顯示了菌株AIEC LF82中的純化的I類纖毛特異地結(jié)合酵母甘露糖 蛋白。注意到，這些甘露糖蛋白(EL05和EL06)的制備方法(熱法或酶法)對纖毛的結(jié)合 常數(shù)具有輕微的影響。AIEC細(xì)菌與在上皮細(xì)胞表面表達(dá)的CEACAM6受體的交互作用的抑制的結(jié)果1、在共培養(yǎng)模型中篩選酵母菌或酵母菌衍生物樣品的抑制AIECLF82菌株對T84 腸內(nèi)上皮細(xì)胞的粘附和入侵能力的結(jié)果。研究了瞬間干燥的ScProl酵母菌(3. 09. IO7酵母菌/mg)、干的ScProl酵母菌 (1. 86. IO7酵母菌/mg)和瞬間干燥的SCBl酵母菌(5. 83. IO7酵母菌/mg)，以及EL05酵母 菌(干的形式)的甘露糖蛋白。
作為比較，添加了Ultra-levure (具有 2. 054. IO7 酵母菌 /mg 的 Biocodex)。在共培養(yǎng)模型中具有同樣的酵母菌數(shù)的酵母菌抑制能力的比較。在用PBS清洗和在7，500rpm離心15分鐘之后，所述的酵母菌樣品在PBS中重懸 至4. IO8酵母菌/ml的濃度。在PBS中的酵母菌的稀釋為1/2、l/10th、l/20th和l/100th。通過使用程序1操作三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。圖19A和19B中的結(jié)果(殘余的粘附和殘 余的入侵)被顯示為殘余的粘附和入侵比率和相應(yīng)的平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差誤差棒(Error bar) 的方式。圖19A和19B使得獲得以下的數(shù)據(jù)粘附-瞬間干燥的ScProl和干燥的ScProl酵母菌以劑量依賴的方式強(qiáng)烈地抑制了菌 株LF82對T84細(xì)胞的粘附。抑制是明顯的，對于瞬間干燥的ScProl酵母菌是5. IO5酵母 菌/ml，對于干燥的ScProl酵母菌是5. IO6酵母菌/ml。-瞬間干燥的SCBl酵母菌比其它2個酵母菌樣品較少強(qiáng)烈地抑制粘附，在1.IO7 酵母菌/ml時具有45. 7%的殘余粘附，而對于瞬間干燥的ScProl菌株和干燥的ScProl菌 株分別為18. 7%和8%的殘余粘附。入侵-瞬間干燥的ScProl酵母菌從1.IO5酵母菌/ml開始明顯抑制AIECLF82菌株入 侵T84細(xì)胞。在1. IO7酵母菌/ml時，殘余粘附比率是16. 3%。-對于干燥的ScProl和瞬間干燥的SCBl酵母菌，抑制效果是更加延后的，分別從 1. IO6酵母菌/ml和5. IO6酵母菌/ml開始。在共培養(yǎng)模型中EL05甘露糖蛋白的抑制試驗(yàn)EL05酵母菌甘露糖蛋白在PBS中懸浮至160mg/ml的濃度。在PBS中完成系列稀 釋1/2、1/4、1/8、1/40，25 μ L的每種甘露糖蛋白懸浮液被添加至感染培養(yǎng)基中，其中使用 程序1。操作3個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。由圖20Α和20Β說明的結(jié)果(殘余粘附和殘余入侵)被顯 示為殘余的粘附比率和相應(yīng)的平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差誤差棒的方式。這些圖顯示了在共培養(yǎng)模型中，EL05酵母菌甘露糖蛋白具有以依賴劑量方式的抑 制AIEC LF82菌株對Τ84細(xì)胞的粘附和入侵的能力。2、在預(yù)培養(yǎng)模型中篩選酵母菌或酵母菌產(chǎn)物的樣品的抑制AIECLF82菌株對Τ84 腸內(nèi)上皮細(xì)胞的粘附和入侵能力。在共培養(yǎng)模型中使用的相同的酵母或它們的片段的樣品用在這個預(yù)培養(yǎng)模型中。在預(yù)培養(yǎng)模型中，具有同樣的酵母菌數(shù)的酵母菌抑制能力的比較在用PBS清洗和在7，500rpm離心15分鐘之后，所述的酵母菌樣品在PBS中重懸 至4. IO8酵母菌/ml的濃度。在PBS中的酵母菌的稀釋為1/2、1/10、1/20和1/100。通過 使用程序2操作三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。由圖21A和21B說明的結(jié)果(殘余粘附和殘余入侵)被顯示為殘余的粘附和入侵 比率和相應(yīng)的平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差誤差棒的方式。通過用酵母菌預(yù)處理T84細(xì)胞，對于瞬間干燥的ScProl和干燥的ScProl菌株，從5. IO6酵母菌/ml劑量開始，可能獲得LF82菌株的粘附的明顯抑制。但是，在這個劑量，沒 有觀察到瞬間干燥的ScBl酵母菌的明顯抑制。通過用酵母菌預(yù)處理T84細(xì)胞，對于干燥的ScProl酵母菌菌株，從1. IO5酵母菌/ ml劑量開始，可能獲得LF82菌株的入侵的抑制。從5. IO5酵母菌/ml劑量開始，所述的3個酵母菌樣品誘導(dǎo)了 LF82菌株的入侵的 明顯減少。在預(yù)培養(yǎng)模型中，EL05甘露糖蛋白的抑制試驗(yàn)EL05酵母菌的甘露糖蛋白在PBS中懸浮成160mg/ml的濃度。在PBS中完成系列 稀釋1/2、1/4、1/8和1/40，25 μ L的每種甘露糖蛋白懸浮液被添加至感染培養(yǎng)基中，其中 使用程序2。操作3個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。由圖22Α和22Β的結(jié)果(殘余粘附和殘余入侵)被顯 示為殘余的粘附比率和相應(yīng)的平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差誤差棒的方式。EL05甘露糖蛋白使得從2mg/ml的濃度開始，LF82菌株的粘附和入侵的以劑量依 賴方式的抑制。酵母菌對在預(yù)培養(yǎng)模型中，AIEC LF82菌株對表達(dá)CEACAM6受體或不表達(dá)該受體 的CHO-Kl細(xì)胞的粘附的抑制試驗(yàn)的結(jié)果操作5個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，使用之前提及的程序2。圖23顯示了 AIEC LF82菌株的粘附的明顯抑制，從具有25 μ g/ml酵母菌的預(yù)培 養(yǎng)中的CEACAM6/CH0細(xì)胞觀察到的。在這些細(xì)胞中觀察到劑量依賴的抑制效果。同樣觀察到AIEC LF82菌株對CHO-Kl細(xì)胞的粘附，毫無疑問地由于在這些細(xì)胞表 面上表達(dá)的糖基化蛋白的表達(dá)。但是，LF82菌株與瞬間干燥的ScProl酵母菌的預(yù)培養(yǎng)沒 有使得對非感染細(xì)胞的粘附的非常明顯的抑制。因此，這確定了所述的酵母菌干涉LF82菌株對由這些細(xì)胞表達(dá)的CEACAM6受體的 粘附。在預(yù)培養(yǎng)模型中，AIEC LF82菌株在患有克羅恩病的病患的腸上皮的刷狀緣上的 粘附的抑制結(jié)果。圖24顯示了在實(shí)驗(yàn)中獲得的平均粘附指數(shù)，并在存在或不存在增加濃度的瞬間 干燥的ScProl酵母菌(mg/ml)或在存在抗CEACAM6抗體時計算它們。根據(jù)這幅圖的結(jié)果， 當(dāng)存在瞬間干燥的ScProl酵母菌菌株時，AIEC LF82菌株的明顯的和劑量依賴的減少在病 患的腸上皮細(xì)胞的刷狀緣上被報導(dǎo)。在5mg/ml的酵母菌菌株劑量時，AIEC LF82菌株的殘 余的粘附與存在抗CEACAM6抗體中觀察到的或?qū)]有任何I類纖毛的突變體觀察到的相 似。結(jié)論從這個研究，它顯示了-ScProl和SCBl酵母菌，特別是瞬間干燥形式，具有對于LF82菌株的凝聚的強(qiáng)烈 的能力。-ScProl和SCBl酵母菌能夠以劑量依賴方式體外抑制大腸桿菌對人類上皮細(xì)胞 (T84，回腸活檢樣品腸上皮細(xì)胞)和表達(dá)人類CEACAM6受體的CHO細(xì)胞的粘附和入侵。-甘露糖蛋白能夠以劑量依賴方式體外抑制大腸桿菌對人類上皮細(xì)胞(T84，回腸 活檢腸上皮細(xì)胞)和表達(dá)人類CEACAM6受體的CHO細(xì)胞的粘附和入侵。
-在體外，所述的ScProl酵母菌能夠在高濃度下部分保護(hù)大約80%的細(xì)胞免于細(xì) 菌感染。實(shí)施例7 在體外培養(yǎng)的人類腸內(nèi)hit細(xì)胞,中，ScProK SCBl酵母菌，和酵母菌衍 牛物關(guān)干編碼IL-IO和PPARa某因的表汰的調(diào)節(jié)作用的研究研究了 ScProl和SCBl酵母菌的益生性，采用單獨(dú)或以組合的方式，和/或酵母菌 片段，和它們抑制由與特定的腸內(nèi)受體交互作用弓丨發(fā)炎癥的能力。體外試騎 根據(jù)本發(fā)明的酵母菌和酵母菌衍生物的效果特別地在不同的腸內(nèi)上皮細(xì)胞受體 上研究，通過體外分析兩個結(jié)腸癌細(xì)胞系CaCo-2 (ATCCHTB-37)和HT-29 (ATCC HTB-38)。對于這個，根據(jù)以下方法，通過提取RNA實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄分析。所述細(xì)胞在Trizol中裂解。關(guān)于可溶解的片段，通過添加含有IOU的核糖核酸酶 抑制劑和IOU的脫氧核糖核酸酶的200 μ L溶液完成脫氧核糖核酸酶步驟。在存在200U的逆轉(zhuǎn)錄酶、二硫蘇糖醇、寡聚dT15和脫氧核苷酸時，逆轉(zhuǎn)錄10 μ g 的 RNA。通過已知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)擴(kuò)增cDNA，同時通過使用特定的正義和反 義引物作為競爭者，特別是以下基因IL-10和PPARa。在含有1. 25U的Ampli Taq Gold 5000時操作40個循環(huán)，并將不同的樣品轉(zhuǎn)移到 3%瓊脂糖凝膠上后，通過圖像分析儀測定條帶的亮度。所述的結(jié)果表示成相對IO5個分子的內(nèi)標(biāo)β -肌動蛋白，mRNA分子的數(shù)。這些結(jié)果，聚集在圖11中，包括將酵母菌或衍生物置于與編碼抗炎性蛋白IL-10 的基因的腸內(nèi)上皮細(xì)胞接觸后1個小時(參考A)和3個小時(參考B)后的mRNA的表達(dá)值。在圖11中，下面的參考指定了檢測的酵母菌/酵母菌衍生物，檢測的酵母菌/酵 母菌衍生物已經(jīng)顯示了好于4倍的參考信號的早期的表達(dá)水平3指定釀酒酵母，5指定本發(fā)明的ScProl酵母，6指定釀酒酵母提取物，以及12指定釀酒酵母的RNA片段。這些結(jié)果實(shí)際上顯示了酵母菌和釀酒酵母提取物，根據(jù)本發(fā)明，在一個小時后，誘 導(dǎo)了編碼抗炎性細(xì)胞因子IL-10基因的早期表達(dá)。事實(shí)上，與未處理的對照比較，根據(jù)本發(fā)明的酵母菌和衍生物的mRNA表達(dá)在縱坐 標(biāo)軸上大于4，這個值已經(jīng)完全符合極好的早期表達(dá)水平。其它的結(jié)果聚集在圖13中。這幅圖顯示了依賴于提供的酵母菌衍生物的量，編碼 IL-10蛋白的基因的mRNA的表達(dá)的調(diào)節(jié)。在這個圖13中，在1小時和3小時后測量表達(dá)?？梢钥吹礁鶕?jù)本發(fā)明的酵母菌和 釀酒酵母提取物的表達(dá)，根據(jù)如下參考指定5指定根據(jù)本發(fā)明的ScProl酵母菌，6指定釀酒酵母提取物，8指定釀酒酵母的壁β-葡聚糖，
9指定釀酒酵母的壁甘露糖蛋白，11指定釀酒酵母的DNA片段，以及12指定釀酒酵母的RNA片段。用不同濃度的酵母和/或衍生物測量表達(dá)。在圖13中，柱的顏色越黑，酵母菌/衍生物的濃度越高。圖13的結(jié)果顯示了根據(jù)本發(fā)明的釀酒酵母提取物過早地誘導(dǎo)抗炎性細(xì)胞因子 (IL-10)的 mRNA。聚集在圖12的結(jié)果包括將酵母菌或衍生物置于與腸內(nèi)上皮細(xì)胞接觸1小時(參 考A)和3小時(參考B)后，編碼核受體PPAR α的基因的mRNA表達(dá)值。在這個圖12中，以下的參考指定了被檢測的酵母菌/酵母提取物，其已經(jīng)顯示了 高于3倍參考信號的延遲的表達(dá)水平1指定活性干燥形式的根據(jù)本發(fā)明的釀酒酵母ScProl酵母菌，4指定釀酒酵母，5指定活性干燥形式的根據(jù)本發(fā)明的釀酒酵母ScProl酵母菌，8指定釀酒酵母壁的片段，9指定釀酒酵母壁β -葡聚糖的片段，10指定釀酒酵母壁甘露糖蛋白的片段，11指定釀酒酵母DNA片段，以及12指定釀酒酵母的RNA片段。這些結(jié)果實(shí)際上顯示了根據(jù)本發(fā)明的酵母菌和釀酒酵母衍生物在3個小時后以 延遲的方式誘導(dǎo)編碼核受體PPARα的基因的表達(dá)。事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明的酵母菌和衍生物的mRNA表達(dá)在縱坐標(biāo)軸上大于3，這個值 已經(jīng)相應(yīng)于極好的延遲的表達(dá)信號。實(shí)施例8 在從含有克羅恩病的病患的活檢樣品中分離的人類腸內(nèi)上皮細(xì)胞中， 酵母菌和酵母衍生物對編碼IL-10和TNF-α的基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)作用的體外研究酵母菌和/或酵母衍生物對細(xì)胞因子分泌物，IL-10 (抗炎)和TNF- α (促炎)的 影響，在患有克羅恩病或不患有克羅恩病的病患的活檢樣品中被體外研究。在患有或不患有克羅恩病的患者中取樣腸內(nèi)活檢樣品，然后放置在補(bǔ)充有青霉素 和鏈霉素的HBSS-CMF培養(yǎng)基中24小時，置于37°C下、含有5% CO2的空氣中。在清洗之后， 將活檢樣品與酵母菌或酵母衍生物在RPMI 1640培養(yǎng)基中接觸4小時。收獲上清液用于 ELISA分析。然后裂解活檢樣品以使得抽出mRNA或總蛋白。細(xì)胞因子分泌物的確認(rèn)通過細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液的免疫學(xué)分析和由ELISA提出 的蛋白的免疫學(xué)分析完成。在沉積緩沖液中(體積/體積；75mM Tris pH 6.8;5%甘油； 0. 25%溴酚藍(lán)；2%SDS，5% β-巰基乙醇)在95°C下變性5分鐘的蛋白被沉淀(50 μ g)并 在10%的聚丙烯酰胺凝膠上分解。在移動后，所述的蛋白被轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(Hybond-P， AmershamPharmacia Biotech, Orsay,法國)，通過 16V 下半干電轉(zhuǎn)移(Hoefer TE77, Amersham Pharmacia Biotech, Or say, ) 1 小時。PPARa 禾口 IL—10 通過人類抗 PPARa 和抗IL-10兔多克隆抗血清的方式顯示，稀釋至1/500并通過在Biomax-MR膜(柯達(dá))上的 化學(xué)發(fā)光(E. C. L. AmershamPharmacia Biotech，Orsay，法國)與軟件包Gel Analyst (CLARA
26VISION,巴黎，法國)定量。圖16和17顯示了分別對IL-10和TNF- α獲得的結(jié)果?？v坐標(biāo)軸顯示了以pg/ml 計的細(xì)胞因子的量。每一個點(diǎn)對應(yīng)于患有急性狀態(tài)的克羅恩病的病患的活檢樣品的測量值 (黑色環(huán))，處于克羅恩病好轉(zhuǎn)期的病患活檢樣品的測量值(灰色環(huán))和健康病患的活檢樣 品的測量值(白色環(huán))。棒表示測量值的平均值。在這些圖中-1指定活性干燥形式的根據(jù)本發(fā)明的釀酒酵母ScProl酵母菌，-3指定釀酒酵母，-8指定釀酒酵母菌壁的片段，-11指定釀酒酵母DNA片段，以及-12指定釀酒酵母的RNA片段。在圖16中，根據(jù)本發(fā)明的ScProl酵母菌增加2倍抗炎細(xì)胞因子，IL-10的分泌，通 過患有克羅恩病的病患的上皮細(xì)胞或處于好轉(zhuǎn)期的病患的上皮細(xì)胞，與健康的病患比較， 以及與相應(yīng)于在僅存在生理鹽實(shí)行的測量值的陰性對照㈠比較。圖17顯示了根據(jù)本發(fā)明的ScProl酵母菌不引起由腸內(nèi)細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子， TNF-α的分泌的任何增加，腸內(nèi)細(xì)胞從患有克羅恩病的病患或處于克羅恩病好轉(zhuǎn)期的病 患的活檢樣品中分離。ScProl，或任何其它的被檢測的酵母菌或酵母菌衍生物都不誘導(dǎo) TNF-α的任何分泌。實(shí)施例9 在鼠結(jié)腸盲腸擴(kuò)張樽型中，酵母菌和酵母菌衍牛物的Ih痛件質(zhì)的研究在健康的大鼠中1、設(shè)備和方法在這些實(shí)驗(yàn)中使用重量在175和200g之間的雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River, 1' Arbresle, France) 0在實(shí)驗(yàn)前一周，使大鼠對動物房的環(huán)境適應(yīng)。它們在每籠 5只動物下喂養(yǎng)，隨意地喂水和食物。所有的這些試驗(yàn)根據(jù)研究和倫理出版痛覺研究國際 聯(lián)合會的委員會(Committeefor Research and Ethical Issues of the International Association for the Studyof Pain) [6]的建議操作。2、結(jié)腸敏感性評估通過測量誘導(dǎo)行為反應(yīng)必須的結(jié)腸內(nèi)壓力來估計動物的疼痛。這個壓力由結(jié)腸直 腸擴(kuò)張產(chǎn)生，結(jié)腸直腸擴(kuò)張通過引進(jìn)結(jié)腸的氣囊的脹大的方式。所述的行為反應(yīng)的特點(diǎn)是 動物身體的背后部分的升高和符合劇烈收縮的明顯可見的腹部收縮[7-9]。大鼠用可揮發(fā) 性麻醉劑(2%異氟醚)麻醉，所述氣囊(根據(jù)Bourdu描述的程序制備[8])通過直腸內(nèi)路 徑以盡可能少入侵的方式插入在距肛門7cm處。導(dǎo)尿管用膠帶粘在尾部的底部。5分鐘后， 將所述大鼠置于樹脂玻璃盒的中間，導(dǎo)尿管與電子恒壓器連接(Distender Series IIRTM， G & J Electronics) 0持續(xù)地使用增加的壓力，直到引發(fā)疼痛反射或達(dá)到限制的80mm汞柱 的壓力。3、施用的組合物通過強(qiáng)制喂入地施用酵母菌，每天一次，共15天。以lmg/kg的劑量腹膜內(nèi)注射的嗎啡被用作陽性對照，在結(jié)腸直腸膨脹前30分鐘。研究了 8組大鼠
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-10只接受PBS的對照鼠，-10只接受瞬間干燥的ScProl (100 μ g/d)，參考1)-10只接受活性干燥的ScProl菌株(100 μ g/d)，(參考2)-10 只接受 SCBl 菌株(100 μ g/d)，(參考 3)-10只接受瞬間干燥的ScProl (50 μ g/d) +瞬間干燥的SCBl (50 μ g/d)菌株(參考 4)-10只接受一次嗎啡注射(lmg/kg，膨脹前30分鐘)(參考5)。4、結(jié)果圖26顯示了一方面ScProl酵母菌以瞬間干燥的形式，單獨(dú)施用(參考1)或與 SCBl菌株聯(lián)合(參考4)，和另一方面以它的活性干燥形式(參考2)增加了痛覺閾，因此與 沒有施用任何物質(zhì)的大鼠比較，明顯減輕了內(nèi)臟疼痛的感覺。以下的結(jié)果與對照比較以mm汞柱給出-對于瞬間干燥的ScProl 菌株，74. 5 士3. 07vs. 53. 6士3. 9，ρ = 0. 07_(參考 1)-對于瞬間干燥的ScProl 和 SCBl 菌株的組合，66. 5士3. 36vs. 53. 6士3. 9，ρ = 0. 04-(參考 4)，-對于瞬間干燥的菌株，72士2.59vs. 53. 6士3. 9，ρ < 0. 01_(參考 2)。另一方面，這個效果與由嗎啡誘導(dǎo)的結(jié)果比較-參考5-使用的劑量是lmg/kg，痛 閾是72 士 2. 59mm汞柱。所述的瞬間干燥的SCBl菌株同樣誘導(dǎo)了在健康大鼠中的止痛效果，70. 6士3. IOmm 汞柱，p = 0. 026。在具有內(nèi)臟超敏性的大鼠中1、設(shè)備和方法使用重量在175和200克之間的雌性Sprague Dawley大鼠(CharlesRiver， L'Arbresle，法國)。在實(shí)驗(yàn)前一周，使大鼠對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境適應(yīng)。它們在每籠5只動物下喂 養(yǎng)，隨意地喂水和食物。所有的試驗(yàn)根據(jù)研究和倫理出版痛覺研究國際聯(lián)合會的委員會[6] 的建議操作。對生活環(huán)境采取重大防范以避免或最小化動物的不適。2、通過丁酸鹽清洗的結(jié)腸超敏性感應(yīng)對于每一次清洗，將導(dǎo)尿管(2mm導(dǎo)管)引進(jìn)結(jié)腸內(nèi)距肛門7cm處，所述的動物接 受Iml的200mM的具有中性pH(pH6. 9)的丁酸鈉溶液，一天兩次，共3天?！敖】档摹眲游锝?br> 受鹽溶液。3、用根據(jù)本發(fā)明的酵母菌的動物的治療使用10組具有內(nèi)臟超敏性的動物(每組n= 10)。治療的動物通過胃強(qiáng)制喂入接 受IOOyg的酵母菌，每天一次，共15天。對照動物接受根據(jù)之前的同樣的程序的PBS。所 述酵母菌在PBS溶液中懸浮。在第一次強(qiáng)制喂入的7天后，開始輸入丁酸鹽或鹽溶液，共3 天。在通過口服途徑治療開始的14天后測量結(jié)腸超敏性，即結(jié)腸輸入的7天前。4、研究的動物組研究了幾組大鼠。數(shù)字參考對應(yīng)于圖26。-10只大鼠接受PBS (對照)，-10只大鼠接受瞬間干燥的ScProl干燥的酵母菌(100 μ g/d)-(參考1)，
-10只大鼠接受活性干燥的ScProl干燥的酵母菌(100 μ g/d)_ (參考2)，-10只大鼠接受瞬間干燥的ScProl酵母菌(100 μ g/d)_ (參考3)，-10只大鼠接受瞬間干燥的ScProl (50 μ g/d)和瞬間干燥的SCBl (50 μ g/d)_ (參 考4)，-10只接受嗎啡_ (參考5)，-10只接受貝特_(參考6)。5、結(jié)果首先應(yīng)當(dāng)注意到對于對照的大鼠，在實(shí)驗(yàn)中的痛閾，超敏的大鼠低于健康的大鼠。瞬間干燥的ScProl酵母菌，單獨(dú)采用或與SCBl酵母菌聯(lián)合，在模型中顯示了有趣 的止痛效果。所述的數(shù)值如下參考mm萊柱156. 5 士 4· 27p = 0. 03459 士 4· 33p = 0. 02根據(jù)本發(fā)明的酵母菌使得與在健康的大鼠中觀察到的一致的疼痛感知水平恢復(fù)。 由酵母菌誘導(dǎo)的止痛效果與由嗎啡誘導(dǎo)的止痛效果相等。此外圖26顯示了非諾貝特強(qiáng)烈的止痛效果，其在具有內(nèi)臟超敏性的大鼠中增長 了系數(shù) 2 的痛覺閾(70 士 4. 48p = 0. 001)。這個結(jié)果確定了在內(nèi)臟疼痛調(diào)節(jié)中PPARa受體的作用。
權(quán)利要求
保藏在國家微生物培養(yǎng)物保藏中心的CNCM I 3856號釀酒酵母菌株。
2.保藏在國家微生物培養(yǎng)物保藏中心的CNCM1-3799號釀酒酵母var. boulardii菌株。
3.從保藏在國家微生物培養(yǎng)物保藏中心的CNCM1-3856號菌株中獲得的釀酒酵母菌。
4.從保藏在國家微生物培養(yǎng)物保藏中心的CNCM1-3799號菌株中獲得的釀酒酵母 var. boulardii ο
5.一種組合物，其特征是，它包括根據(jù)權(quán)利要求3的酵母菌和/或根據(jù)權(quán)利要求4的酵 母菌和/或至少一種選自酵母提取物、壁衍生物、壁葡聚糖、壁甘露糖蛋白、脂質(zhì)酵母片段、 酵母菌核酸(RNA、DNA)片段的釀酒酵母菌衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征是，所述酵母菌是干燥形式或新鮮形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其特征是，所述酵母菌是瞬間干燥形式或活性干燥 形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任何一項(xiàng)所述的組合物，其特征是，它包括IO7和6.IOltlCFU之間， 優(yōu)選地IO8和2. IO10CFU之間的根據(jù)權(quán)利要求3的酵母菌和/或根據(jù)權(quán)利要求4的酵母菌 和/或至少一種選自酵母提取物、壁衍生物、壁葡聚糖、壁甘露糖蛋白、脂質(zhì)酵母片段、酵母 菌核酸(RNA、DNA)片段的釀酒酵母菌衍生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-7任何一項(xiàng)所述的組合物，其特征是，它包括Img和IOg之間，優(yōu)選 地Img和Ig之間的根據(jù)權(quán)利要求3的酵母菌和/或根據(jù)權(quán)利要求4的酵母菌和/或至少一 種選自酵母提取物、壁衍生物、壁葡聚糖、壁甘露糖蛋白、脂質(zhì)酵母片段、酵母菌核酸(RNA、 DNA)片段的釀酒酵母菌衍生物。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物的應(yīng)用，用于制備食品增補(bǔ)劑和/或益生菌 和/或藥物食品和/或營養(yǎng)品和/或功能性成分和/或藥妝品和/或藥物活性成分，意欲 供人類和/或動物使用。
11.根據(jù)權(quán)利要求5-9任何一項(xiàng)的組合物的應(yīng)用，用于制備意欲改善胃腸舒適和/或改 善腸菌群的食品組合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求5-9任何一項(xiàng)的組合物的應(yīng)用，用于制備意欲治療和/或預(yù)防腸紊 亂、腸功能紊亂或胃腸疾病的藥物。
13.根據(jù)權(quán)利要求5-9任何一項(xiàng)的組合物的應(yīng)用，用于制備意欲治療和/或預(yù)防由痛覺 超敏癥狀指示的腸的病狀或紊亂。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13任何一項(xiàng)的組合物的應(yīng)用，其特征在于，所述酵母菌是干燥形 式或新鮮形式。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的應(yīng)用，其特征在于，所述的酵母菌是瞬間干燥形式或活性干燥 形式。
16.根據(jù)權(quán)利要求10-13任何一項(xiàng)的組合物的應(yīng)用，所述酵母菌和/或酵母菌衍生物以 IO7和6. IO10CFU之間，優(yōu)選地IO8和2. IO10CFU之間的日劑量。
17.根據(jù)權(quán)利要求10-13任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，所述酵母菌和/或酵母菌衍生物以包括 Img和IOg之間，優(yōu)選地Img和Ig之間的日劑量。
18.—種試劑盒，包括適于口服給藥形式的根據(jù)權(quán)利要求3的酵母菌和/或根據(jù)權(quán)利要 求4的酵母菌和/或至少一種選自酵母提取物、壁衍生物、壁葡聚糖、壁甘露糖蛋白、脂質(zhì)酵母片段、酵母菌核酸(RNA、DNA)片段的釀酒酵母菌衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的酵母菌菌株、從這些菌株中獲得的酵母菌、含有至少一種釀酒酵母菌和/或特別感興趣的酵母菌衍生物的組合物，該組合物作為食品添加劑和/或益生菌和/或功能食品和/或營養(yǎng)品和/或功能成分和/或藥妝品和/或藥物活性試劑。本發(fā)明同樣涉及同樣的物質(zhì)在人類和/或動物營養(yǎng)中的應(yīng)用，或用于炎性疾病的治療或預(yù)防。
文檔編號A61K36/064GK101918536SQ200880122812
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者喬治·皮涅德, 帕斯卡爾·范德克爾克奧韋, 皮埃爾·德勒莫, 讓-呂克·西蒙, 達(dá)尼埃爾·普蘭, 阿德琳·西維尼恩, 阿萊特·達(dá)爾弗耶-米肖 申請人:勒薩弗爾公司;奧維涅克萊蒙弗朗第1大學(xué);里爾法律與醫(yī)藥第2大學(xué)