專利名稱：將疫苗抗原指向抗原呈遞細(xì)胞的融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于融合蛋白合成來將疫苗抗原指向抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述融合 蛋白包括具有識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面上存在的表位的區(qū)域的多肽，和作為目的疫苗抗原 的另一種多肽
背景技術(shù)：
在不同表達(dá)系統(tǒng)，諸如細(xì)菌、真菌、酵母、植物、昆蟲細(xì)胞和幼蟲、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等 中獲得疫苗意義的重組產(chǎn)物已經(jīng)已知一段時(shí)間。在這些系統(tǒng)中，植物與其他表達(dá)系統(tǒng)相比， 提供許多優(yōu)勢(shì)，因?yàn)?，通常，它們代表?jīng)濟(jì)、安全且易得的在不需要昂貴的發(fā)酵系統(tǒng)的條件 下獲得潛在有藥物意義的蛋白，例如，重組亞單位疫苗的方法。然而，在所有系統(tǒng)中，由病原體的重組亞單元獲得疫苗中的主要限制是獲得的重 組產(chǎn)物的低免疫原性；結(jié)果，為了與使用常規(guī)免疫原(完全失活的病原體)獲得的免疫應(yīng) 答相等，通常需要非常高的、重復(fù)的疫苗劑量。這種情形使得重組亞單位疫苗與常規(guī)疫苗相 比，生產(chǎn)成本非常高，并且因此它們中的許多目前沒有上市。為了提高重組亞單位疫苗的免疫原性，已經(jīng)進(jìn)行了不同的改變。其中之一基 于CTLA4-型和L-選擇蛋白-型分子將疫苗抗原指向小鼠抗原呈遞細(xì)胞的應(yīng)用[Boyle J. S.等’ Enhanced responses to a DNA vaccine encoding afusion antigen that is directed to sites of immune induction(針對(duì)編碼被指引到免疫誘導(dǎo)位點(diǎn)的融合抗原的 DNA疫苗的增強(qiáng)的反應(yīng)).Nature (自然).1998年3月26日；392 (6674) =408-411] 0然而， 這些策略尚未在除鼠科物種以外的其他物種中證明同等有效，這使得需要搜索基于在其他 物種，特別在人類物種中將疫苗抗原指向負(fù)責(zé)抗原呈遞的細(xì)胞的其他備選方案。發(fā)明概述本發(fā)明涉及作為現(xiàn)有技術(shù)中存在的那些方式的備選方案的一種方法，該方法在重 組亞單位疫苗應(yīng)用于不同物種，一般地動(dòng)物和具體地人二者時(shí)，增加其效力。利用本發(fā)明基 于將抗原指向其呈遞細(xì)胞的方法，可能增強(qiáng)宿主介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，同時(shí)減小應(yīng)用的疫苗劑 量，從而引起等于或超過由應(yīng)用常規(guī)疫苗獲得的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提議的用于將疫苗抗原指向抗原呈遞細(xì)胞的系統(tǒng)包括融合蛋白，所 述融合蛋白包括至少一種多肽(A)，其具有識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面上存在的表位的區(qū)域，和 另一種多肽(B)，即目的疫苗抗原，其負(fù)責(zé)觸發(fā)宿主中的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，多肽㈧包括識(shí)別II型DR抗原β鏈的區(qū)域(區(qū)域 D)。所述多肽是單鏈(scFv)重組APCHl ( “抗原呈遞細(xì)胞歸巢1”)抗體，其特征在于SEQ ID N0:1，源自單克隆抗體1F12。因此，多肽㈧由單克隆抗體1F12的重鏈(VH)可變區(qū)， 通過柔性肽與單克隆抗體1F12的輕鏈(VL)可變區(qū)融合而形成。單克隆抗體1F12在大量 物種中識(shí)別II型DR抗原的β鏈；因此，其應(yīng)該適合于多種物種，包括人類。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，肽(B)(目的疫苗抗原)是針對(duì)犬細(xì)小病毒 (CPV)疫苗肽，稱為2L21(SEQ ID NO :21)，來自牛病毒性腹瀉病毒的蛋白E2T (SEQ ID N0 23)或E2，來自兔出血癥病毒的蛋白VP60，來自輪狀病毒的蛋白VP6或來自流感病毒的血細(xì)胞凝集素蛋白。 2L21由遠(yuǎn)離來自CPV衣殼的蛋白VP2的氨基端區(qū)域的2個(gè)抗原亞位點(diǎn)形成， 且以前作為第一合成疫苗肽公開(L0pez de Turiso, J. Α.，Cortes, Ε.，Martinez, C.， Ruiz de Ybanez, R. , Simarro, I. , Vela, C. , Casal, I. (1992) J. Virol.(病毒學(xué)雜志)66 2748-2753)。與APCHl融合的肽2L21已經(jīng)植物中表達(dá)。此外，所述肽2L21已經(jīng)在植物中 未融合地表達(dá)，或融合于從免疫原觀點(diǎn)來看無關(guān)的蛋白(β_葡糖醛酸糖苷酶，GUS)，其中 的表達(dá)已經(jīng)在此前成功地在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行(Gil F. ,Brun A. ,Wigdorovitz Α.， Martinez-Torrecuadra J. L. , CatalaR. ,Casal I. ,Salinas J. ,Borca Μ. V.禾口 Escribano J. Μ. .FEBS Letters (FEBS 快報(bào))488 13-17，2001)。融合蛋白 2L21-GUS 是非常穩(wěn)定的蛋 白，其具有低降解率且優(yōu)選適合在植物中表達(dá)。因此，本發(fā)明提供將疫苗抗原指向其呈遞細(xì)胞的方法，其包括融合蛋白，諸如例如 APCH1-2L21或APCH1-E2T，其包括分別與疫苗肽2L21或E2T融合的APCH1。如下解釋地，融 合蛋白APCH1-2L21在植物中表達(dá)，由此導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidposis thaliana)植物， 且融合蛋白APCH1-E2T在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。而且，證明融合蛋白APCH1-2L21保持肽2L21的抗原性和免疫原性特征，包括 由口服途徑以及腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑免疫的動(dòng)物組中特異性抗體的高效價(jià) (title)，其比由單獨(dú)的合成肽2L21或與GUS融合的合成肽2L21 (2L21-GUS)誘導(dǎo)的效價(jià)高 得多。這些結(jié)果顯示融合蛋白APCH1-2L21增強(qiáng)動(dòng)物中的免疫應(yīng)答，這驗(yàn)證疫苗抗原通過借 助于具有識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面上存在的表位的區(qū)域(A)的多肽將其指向抗原呈遞細(xì)胞 而引起疫苗抗原免疫原性增加的假說。由本發(fā)明提供的指導(dǎo)疫苗抗原的系統(tǒng)表現(xiàn)出許多優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠涫沟每赡苤笇?dǎo)融合 的疫苗抗原靠近抗原呈遞細(xì)胞，由此促進(jìn)疫苗抗原的捕獲和增強(qiáng)免疫應(yīng)答。這減小待施用 的來自病原體的重組亞單位疫苗的劑量，從而在動(dòng)物和人二者中，獲得等于或大于使用來 自完整病原體的常規(guī)疫苗獲得的免疫應(yīng)答的免疫應(yīng)答。


圖1是質(zhì)粒pBI APCH1-2L21的基因表達(dá)構(gòu)建體的示意圖。圖IA 示意性顯示在擬南芥核基因組中整合的基因表達(dá)構(gòu)建體，其包括APCHl的 核苷酸序列，其由花椰菜花葉病毒的35S組成型啟動(dòng)子(CaMV35S)引導(dǎo)[LB 左邊緣；RB 右 邊緣；APCHl-肽2L21 編碼融合蛋白APCH1-2L21的融合；NOS-Ter 受胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子 控制的聚腺苷酸化序列(NOS-Pro) ； NPT 11 (Kan R)卡那霉素抗性基因。圖IB 顯示關(guān)于融合蛋白APCH1-2L21預(yù)期的三維結(jié)構(gòu)，其獲自“Swiss-蛋白 (Swiss-protein) ”，其中可以觀察到2個(gè)獨(dú)立的折疊球狀結(jié)構(gòu)域(VH和VL)。圖2圖示與scFv APCHl融合的抗原2L21在一些表達(dá)所述融合蛋白(APCH1-2L21) 的品系中表達(dá)的分析。圖2A 顯示Northern印跡法分析轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中融合基因(APCH1-2L21)轉(zhuǎn) 錄的結(jié)果，5 μ g總RNA/植物品系，使用以32P作為探針標(biāo)記的APCH1-2L21融合的完整DNA 序列雜交。圖2B 顯示W(wǎng)estern印跡法分析由通過Northern印跡法分析的擬南芥不同轉(zhuǎn)基因品系的新鮮葉片提取的蛋白提取物(40yg總可溶性蛋白)的結(jié)果。圖3顯示用過氧化物酶(I)和用熒光標(biāo)記(II)特異性標(biāo)記豬塵細(xì)胞表面的結(jié)果。圖I (a)用植物提取物溫育的巨噬細(xì)胞(陰性對(duì)照)；(b)標(biāo)記用抗體1F12獲得 的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞表面；(c)使用總可溶性蛋白提取物(其包含融合蛋白APCH1-2L21)獲 得的標(biāo)記。圖II 使用對(duì)照提取物(1)，抗體1F 12(2)和表達(dá)融合蛋白APCH1-2L21的植物 提取物(3)溫育的細(xì)胞的低倍放大圖。(b和c)分別用單克隆抗體1F12和用融合蛋白 APCH1-2L21獲得的細(xì)胞標(biāo)記的高倍放大圖的細(xì)節(jié)。圖4顯示分析使用多種來自CPV的肽2L21的制劑獲得免疫應(yīng)答的結(jié)果的柱 形圖，具體地，通過使用肽2L21本身(2L21)，與抗體APCHl融合(APCH1-2L21)或與 β -GUS(2L21-GUS)蛋白融合免疫小鼠獲得的特異性抗體免疫應(yīng)答。圖5生產(chǎn)表達(dá)APCH1-E2T和E2T的穩(wěn)定CHOKl (哺乳動(dòng)物卵巢細(xì)胞)細(xì)胞系。該 圖的更詳細(xì)解釋可以參見實(shí)施例2第2. 4點(diǎn)。圖6評(píng)估形成的細(xì)胞系上清液中重組蛋白的生產(chǎn)。該測定針對(duì)每組一式兩份地進(jìn) 行，其在有和無DMSO的培養(yǎng)瓶(T75)中，和在有和無DMSO的瓶(滾筒)中進(jìn)行。在T75情 形中，在時(shí)間0接種3X 106個(gè)細(xì)胞，而滾筒以16X 106個(gè)細(xì)胞開始，由此保持二者之間的細(xì) 胞/體積比。每24h提取lml，且它們保存在-20°C直至進(jìn)行ELISA。該附圖的更詳細(xì)解釋 可以參見實(shí)施例2的第2. 8點(diǎn)。圖6A 組織培養(yǎng)瓶(T75)中的細(xì)胞系生長。圖6B “滾筒”瓶中的細(xì)胞系生長。圖7用考馬斯染色和APCH1-E2T和E2T的Western印跡法。該附圖的更詳細(xì)解釋 可以參見實(shí)施例2的第2.9點(diǎn)。圖8APCH1-E2T對(duì)單核細(xì)胞的MHCII (主要組織相容性復(fù)合物)的識(shí)別。MHCII是 編碼參與抗原呈遞和加工至T淋巴細(xì)胞的機(jī)制的某些質(zhì)膜糖蛋白、以及細(xì)胞因子和補(bǔ)體系 統(tǒng)蛋白(其在免疫學(xué)反應(yīng)中是相關(guān)的)的基因家族。圖9使用實(shí)驗(yàn)分子免疫的豚鼠中的免疫應(yīng)答。Lac-z基因編碼β-半乳糖苷酶，即 將乳糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和半乳糖的酶，并用作陰性對(duì)照。位于該附圖中的DPV術(shù)語指接種疫 苗后的天數(shù)。圖10用表達(dá)蛋白APCH1-E2T和Ε2Τ的培養(yǎng)上清免疫的牛中的免疫應(yīng)答。圖IOA 用 1 μ gAPCHl-E2T 或 E2T 免疫的牛。圖IOB 用 0. 2 μ g APCH1-E2T 或 E2T 免疫的牛。圖11用0. 2 μ g APCH1-E2T或E2T接種疫苗的牛中的抗體的效價(jià)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及DNA構(gòu)建體，即下文中的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體，其包括直接或間接地操 作性結(jié)合的至少a) 一個(gè)核酸序列(A),其編碼包括識(shí)別抗原旱遞細(xì)胞表面上存在的表位的區(qū)域的 多肽；和b) 一個(gè)核酸序列(B)，其包括編碼目的疫苗抗原的核苷酸序列，其負(fù)責(zé)觸發(fā)宿主 中的免疫應(yīng)答。
核酸序列(A)編碼包括識(shí)別抗原旱.遞細(xì)胞表面上存在的表位的區(qū)域的多肽。實(shí)際 上，包括識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面上存在的表位的區(qū)域的任何多肽可以用于本發(fā)明中，諸如， 例如，采用其單鏈(scFv)、雙功能性(雙抗體)或完整(Fab+Fc)形式的單克隆抗體，或其 片段。然而，在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，核酸序列(A)編碼APCHl多肽(SEQ ID NO :1)， 其包括識(shí)別II型DR抗原的表位(鏈β)的區(qū)域。II型在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中作為表面多肽 表達(dá)且包括HLAD抗原(人白細(xì)胞抗原D)，進(jìn)一步分類為DR(DRA和DRB)，DQ和DP。所述多 肽是單鏈重組抗體，其源自單克隆抗體1F12，包括單克隆抗體1F12的重鏈(VH)可變區(qū)，其 通過柔性肽(接頭或鉸合部)與單克隆抗體1F12的輕鏈(VL)可變區(qū)融合。VL編碼序列 的3’末端與所述接頭的編碼序列的5’末端結(jié)合且編碼所述接頭的核苷酸序列的3’末端 與VL編碼序列的5’末端結(jié)合。scFv APCHl以這樣的方式設(shè)計(jì)，即可以在VL的3’末端處 添加一個(gè)或多個(gè)限制序列，從而能夠進(jìn)行與待測定抗原的不同融合，且其在VH的5’末端處 包含限制序列(XbaI)，這使其可能從它們所在的質(zhì)粒容易地獲得融合并將它們運(yùn)送至植物 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。 單克隆抗體1F12在大量動(dòng)物物種中識(shí)別II型DR抗原的β鏈并因此可以應(yīng)用于 多種物種，包括人類。由于其特性，采用其任何形式(scFv、雙功能性或完整)的所述抗體可 以指導(dǎo)與其融合的疫苗肽靠近在表面上表現(xiàn)出此類分子的抗原呈遞細(xì)胞，由此促進(jìn)抗原的 捕獲和增強(qiáng)反應(yīng)，因?yàn)榇蟛糠直磉_(dá)的蛋白應(yīng)該在降解前到達(dá)其目的地。由此，可能補(bǔ)償由轉(zhuǎn) 基因植物或動(dòng)物呈遞的低異種蛋白(病原體的重組亞單位疫苗)累積水平，或補(bǔ)償其他系 統(tǒng)中的生產(chǎn)成本。核酸序列(B)編碼目的疫苗抗原，不考虎其來源(真核，原核，病毒等)，實(shí)際上 其可以是易于以重組形式表達(dá)和易于誘導(dǎo)宿主中免疫應(yīng)答的任何肽或蛋白，無論是一般地 動(dòng)物或具體地人類。以下，我們提供許多可以起目的疫苗抗原作用的實(shí)例來自CPV的肽 2L21，來自兔出血癥病毒(RHDV)的蛋白VP60，來自輪狀病毒的蛋白VP6，來自牛病毒性腹瀉 病毒的蛋白E2或E2T，針對(duì)腫瘤和腫瘤細(xì)胞的疫苗抗原，等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸序列(A)不是直接融合于核酸序列(B)，而代替地，其 有利地在核酸序列(A)的3’末端和核酸序列(B)的5’末端之間引入間隔肽(接頭)。因 此，如果需要，則本發(fā)明的DNA構(gòu)津體可以另外地包含核酸序列(C),其包含編碼位于所述 核酸序列㈧和⑶之間的間隔肽的核苷酸序列，其中所述核酸序列(C)的5’末端結(jié)合所 述核酸序列(A)的3’末端且述核酸序列(C)的3’末端結(jié)合所述核酸序列(B)的5’末端。 有利地，所述間隔肽(C)是具有結(jié)構(gòu)柔性的肽。實(shí)際上，可以使用任何具有結(jié)構(gòu)柔性的肽。 為了舉例說明的目的，所述柔性肽可以包含氨基酸殘基，具體地Gly和Ser殘基的重復(fù)序 列，或任何其他合適氨基酸殘基的重復(fù)序列。在具體的實(shí)施方案中，所述柔性間隔肽選自序 列 SEQ IDNO :2 或 SEQ ID NO :3。為了促進(jìn)由本發(fā)明的方法獲得的融合肽或蛋白的分離和純化，本發(fā)明的DNA構(gòu)建 體可以包含，如果需要，編碼易于用于分離或純化融合肽或蛋白目的的肽的核酸序列。因 此,在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)津體包括，如果需要，核酸序列(D),其包含編碼 易于用于分離或純化目的的肽的核苷酸序列。所述核酸序列(D)可以位于任何不改變包括 識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面上存在的表位的區(qū)域的多肽或目的多肽功能性的位置。為了舉例說 明的目的，所述核酸序列(D)可以位于所述核酸序列(B)的3’末端的下游。
實(shí)際上，可以使用容許分離或純化所述融合肽或蛋白的任何肽或肽序列；例如， 多組氨酸序列，易于被可以起通過免疫親合層析法純化由此產(chǎn)生的融合蛋白作用的單克 隆抗體識(shí)別的肽序列，諸如標(biāo)簽肽，等；例如，源自流感病毒的血細(xì)胞凝集素蛋白的表位或 C-myc表位,等。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以利用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)來獲得[Sambrook等， "Molecular cloning, a Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)，N. Y.，1989，卷 1-3]。所述本 發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以整合，操作性結(jié)合，編碼一 個(gè)或多個(gè)目的產(chǎn)物的核苷酸序列的表達(dá) 調(diào)節(jié)序列，由此構(gòu)成基因表達(dá)構(gòu)建體。如本說明書中所使用地，表述“操作性結(jié)合”意指一 個(gè)或多個(gè)目的產(chǎn)物在表達(dá)調(diào)節(jié)或控制序列的控制下在正確讀框中表達(dá)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因構(gòu)建體包括，操作性結(jié)合的編碼本發(fā) 明的融合蛋白的核苷酸序列的表達(dá)控制序列。控制序列是控制和調(diào)節(jié)所述融合蛋白的轉(zhuǎn) 錄和，如果適合，翻譯的序列，且包括啟動(dòng)子序列、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的序列，核糖體結(jié)合序列 (RBS)和/或轉(zhuǎn)錄終止序列。在具體的實(shí)施方案中，所述表達(dá)控制序列在原核細(xì)胞和生物 體，例如，細(xì)菌等中具有功能，而在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)控制序列在真核細(xì)胞 和生物體，例如，昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等中具有功能。由本發(fā)明提供的基因表 達(dá)構(gòu)建體中可以存在的啟動(dòng)子的示范性實(shí)例包括植物的CaMV 35S啟動(dòng)子，桿狀病毒系統(tǒng) 的多角體蛋白啟動(dòng)子或PlO蛋白，DNA疫苗的早期巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，合成早期/完全痘病 毒啟動(dòng)子，等。有利地，所述基因表達(dá)構(gòu)建體另外包括標(biāo)記物或基因，其編碼容許選擇由所述基 因表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的基序或表型。本發(fā)明的基因表達(dá)構(gòu)建體中可以存在的所述 標(biāo)記物的示范性實(shí)例包括抗生素抗性基因，賦予針對(duì)毒性化合物的抗性的基因，且一般地， 使可能選擇遺傳轉(zhuǎn)化的植物的所有那些。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體，或由本發(fā)明提供的基因表達(dá)構(gòu)建體，可以插入到適合的載 體中。因此，本發(fā)明的另一方面涉及載體，諸如表達(dá)載體，其包括所述DNA構(gòu)建體。所述載 體的選擇應(yīng)該取決于其將隨后引入的宿主細(xì)胞。為了舉例說明的目的，其中引入所述DNA 序列的載體可以是質(zhì)?；蜻@樣的載體，即其在引入宿主細(xì)胞時(shí)，整合或不整合到所述細(xì)胞 的基因組中。所述載體可以通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得[Sambrook等， 1989，引用見上]。在具體的實(shí)施方案中，所述重組載體是有效用于轉(zhuǎn)化或被插入植物細(xì) 胞或動(dòng)物細(xì)胞的載體。因此，本發(fā)明的載體可以是，例如，根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或能夠感染或被表達(dá)在動(dòng)物細(xì)胞(諸如例如，哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞)或 植物細(xì)胞中的病毒載體。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所用的病毒載體是桿狀病毒 (Baculovirus) 0所述載體可以用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染易于由此被轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。因此， 本發(fā)明的另一方面涉及用本發(fā)明提供的病毒載體感染的細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，所述 感染的細(xì)胞是用合適病毒載體感染的植物細(xì)胞，所述感染的植物細(xì)胞能夠表達(dá)由本發(fā)明提 供的融合蛋白。用重組病毒載體感染的植物細(xì)胞可以遵從使用所述重組病毒載體對(duì)植物的 感染來獲得。因此，植物感染性病毒載體可以用于在植物中表達(dá)動(dòng)物病原體或腫瘤細(xì)胞的 表位，從而生產(chǎn)抗所述病原體或腫瘤細(xì)胞的可食用疫苗。
另外，由本發(fā)明提供的重組載體可以用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。因此， 本發(fā)明的另一方面涉及轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其包括所述重組載體，或由本發(fā)明提供的所述 DNA構(gòu)建體，或由本發(fā)明提供的所述基因表達(dá)構(gòu)建體。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域中 技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得[Sambrook等，1989，引用見上]。 在具體的實(shí)施方案中，所述重組載體是病毒載體。本發(fā)明的重組載體能夠感染或 被表達(dá)在植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中，優(yōu)選在昆蟲細(xì)胞或昆蟲幼蟲細(xì)胞中。因此，本發(fā)明的另一方面涉及轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其至少包括，本發(fā)明的DNA構(gòu) 建體，或由本發(fā)明提供的重組載體，或由本發(fā)明提供的基因表達(dá)構(gòu)建體。本發(fā)明的另一方面涉及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其包括，插入其基因組中的至少一個(gè)本發(fā)明 的DNA構(gòu)建體。在具體的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞來自植物細(xì)胞，且包括，插入其基因 組中或葉綠體的基因組中的，至少一個(gè)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體。轉(zhuǎn)基因植物可以獲自所述轉(zhuǎn) 基因植物細(xì)胞或獲自轉(zhuǎn)基因植物材料。因此，本發(fā)明的另一方面涉及轉(zhuǎn)基因植物，其至少包 括一種由本發(fā)明提供的植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。如公知地，轉(zhuǎn)基因植物的潛在目的應(yīng)用是在植物 中表達(dá)動(dòng)物病原體的或腫瘤細(xì)胞的蛋白或表位，由此生產(chǎn)針對(duì)所述病原體或腫瘤細(xì)胞的可 食用疫苗。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選來自哺乳 動(dòng)物或昆蟲，且更優(yōu)選，來自昆蟲幼蟲。因此，本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，具體地，以高 產(chǎn)率表達(dá)目的肽或目的蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物、昆蟲或昆蟲幼蟲。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以用于生產(chǎn)在本發(fā)明中描述的融合蛋白。因此，本發(fā)明的 另一方面涉及生產(chǎn)所述融合蛋白的方法，其包括在容許生產(chǎn)所述融合蛋白的條件下培養(yǎng)由 本發(fā)明提供的細(xì)胞或生物體。用于最優(yōu)化所述細(xì)胞或生物體培養(yǎng)的條件應(yīng)該取決于所用的 細(xì)胞或生物體。如果需要，由本發(fā)明提供的生產(chǎn)目的產(chǎn)物的方法還包括分離和純化所述融
合蛋白ο本發(fā)明的另一方面還提供在植物中表達(dá)編碼由本發(fā)明提供的融合蛋白的基因的 方法，其包括用至少一種由本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述植物。來自植物組織的細(xì)胞 的轉(zhuǎn)化可以通過常規(guī)方法進(jìn)行。關(guān)于基因轉(zhuǎn)移至植物，包括載體，DNA轉(zhuǎn)移方法等的綜述，參 見例如，標(biāo)題為 “Ingenieriagen6tica y transferencia genica" [Genetic Engineering and Gene Transfer (遺傳工程和基因轉(zhuǎn)移)]，Marta Izquierdo，Ed. Pircimide (1999)的書， 具體地第9章，標(biāo)題為“基因轉(zhuǎn)移至植物”，第283-316頁。本發(fā)明的另一方面涉及可以通過表達(dá)由本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建體中包含的核苷 酸序列獲得的融合蛋白。更特別地，本發(fā)明提供融合蛋白，其包括(A)具有識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面上存在的表位的區(qū)域的多肽，和(B)目的疫苗抗原。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供融合蛋白，其包括(A)選自由以下各項(xiàng)形成的組的多肽完整單克隆抗體1F12 ；單克隆抗體1F12 片段，其包含識(shí)別II型DR抗原的β鏈的區(qū)域；采用雙功能性形式的單克隆抗體1F12 和重組scFv，其包含單克隆抗體1F12的重鏈(VH)可變區(qū)，其通過柔性肽與單克隆抗體 1F12 (APCHl)的輕鏈(VL)可變區(qū)融合；和(B)目的疫苗抗原。
由本發(fā)明提供的融合蛋白可以還包含，如果需要，在包括識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面 上存在的表位的區(qū)域的多肽和目的多肽之間的間隔肽；和/或設(shè)計(jì)用于促進(jìn)所述融合蛋白 的分離或純化的肽一般地，由本發(fā)明提供的融合蛋白，具體地，當(dāng)包括識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面上存在 的表位的區(qū)域的多肽是scFv時(shí)，其是相對(duì)的小分子且通常保持該包括識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞 表面上存在的表位的區(qū)域的多肽源自的原始抗體的結(jié)合特異性，并且不需要完整抗體的復(fù) 雜裝配過程。另一方面，由于其小尺寸，它們具有更大的組織滲透性。本發(fā)明的另一方面涉及重組疫苗，其包括由本發(fā)明提供的融合蛋白和，任選地，藥 用賦形劑。進(jìn)行的測定(見實(shí)施例)顯示由本發(fā)明提供的融合蛋白增強(qiáng)動(dòng)物中的免疫應(yīng)答， 因?yàn)槠湔T導(dǎo)比使用疫苗肽本身或與無關(guān)蛋白融合的疫苗肽獲得的大得多的抗體效價(jià)，由此 驗(yàn)證疫苗肽通過使用多肽將其指向抗原呈遞細(xì)胞而增加免疫原性的假說，所述多肽包括識(shí) 別抗原呈遞細(xì)胞表面上存在的表位的區(qū)域，諸如scFv APCHl。因此，由于其指導(dǎo)融合的疫苗抗原靠近在其表面上表現(xiàn)出相應(yīng)表位的抗原呈遞細(xì) 胞，所以由本發(fā)明提供的指導(dǎo)疫苗抗原的系統(tǒng)促進(jìn)疫苗抗原的捕獲且增強(qiáng)免疫應(yīng)答，因?yàn)?大部分表達(dá)的蛋白在被降解前到達(dá)其目的地；此外，這防止疫苗抗原在受到負(fù)責(zé)將其呈遞 至免疫系統(tǒng)并因此產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的細(xì)胞處理前，被從血流中消除。由于將疫苗抗原 指向抗原呈遞細(xì)胞，其大部分正確呈遞至免疫系統(tǒng)；結(jié)果是強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答，其根據(jù)具體 的情形，應(yīng)該是，通過疫苗抗原本身獲得的至少50倍(在特異性抗體的效價(jià)方面)。因此， 該發(fā)明通過免疫學(xué)改進(jìn)在任何系統(tǒng)中生成的重組亞單位疫苗。生物材料的保藏質(zhì)粒pBIAPCHl-2L21 于12. 12. 2003，保藏在西班牙典型培養(yǎng)物中心(CECT)， Burjassot,巴倫西亞，保藏號(hào)為CECT :5857。質(zhì)粒pcDNAAPCHl-E2T 于05. 03. 2008，保藏在西班牙典型培養(yǎng)物中心(CECT)， Burjassot,巴倫西亞，保藏號(hào)為CECT :7387。以下提供的實(shí)施例起舉例說明本發(fā)明的作用且不應(yīng)該被認(rèn)為限制其范圍。 實(shí)施例實(shí)施例1.將疫苗抗原指向抗原呈遞細(xì)胞以增強(qiáng)動(dòng)物中的免疫應(yīng)答。單鏈重組抗 體APCHl (SEQ ID NO=D與肽2L21的融合及其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)1. 1植物材料使用的模型植物是擬南芥，哥倫比亞生態(tài)型。擬南芥屬屬于十字花科 (Brassicaceae Cruciferae) 01.2使用的細(xì)菌菌株1. 2. 1 大腸桿菌(Escherichia coli)大腸桿菌的菌株DH5-a和T0P_10 (Clontech)，其表現(xiàn)出以下特征，用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn) 化和生長
權(quán)利要求
基因構(gòu)建體，其包括操作性結(jié)合的至少以下各項(xiàng)a)一個(gè)核苷酸序列(A)，其編碼具有SEQ ID NO1的多肽，所述多肽具有識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面上存在的II型DR抗原的β鏈的區(qū)域；和b)一個(gè)核苷酸序列(B)，其編碼目的疫苗抗原，所述目的疫苗抗原易于在其被引入的宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
2.如權(quán)利要求1所述的基因構(gòu)建體，其中所述目的疫苗抗原選自下組來自犬細(xì)小病 毒的肽2L21，來自兔出血癥病毒的蛋白VP60，來自輪狀病毒的蛋白VP6，來自牛病毒性腹瀉 病毒的蛋白E2或E2T，或來自流感病毒的血細(xì)胞凝集素蛋白。
3.如權(quán)利要求1或2所述的基因構(gòu)建體PBIAPCH1-2L21，其特征在于所述構(gòu)建體包括 編碼SEQ ID NO 1的核苷酸序列㈧和編碼SEQ IDNO 21的核苷酸序列(B)，所述SEQ ID NO :21對(duì)應(yīng)于所述犬細(xì)小病毒的疫苗抗原2L21。
4.如權(quán)利要求1或2所述的基因構(gòu)建體pcDNAAPCHl-E2T，其特征在于所述構(gòu)建體包括 編碼SEQ ID NO 1的核苷酸序列㈧和編碼SEQ IDNO 23的核苷酸序列(B)，所述SEQ ID NO 23對(duì)應(yīng)于所述牛病毒性腹瀉病毒的疫苗抗原E2T。
5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的基因構(gòu)建體，其特征在于所述構(gòu)建體另外包括編碼間 隔肽的核酸序列(C)。
6.如權(quán)利要求5所述的基因構(gòu)建體，其特征在于所述間隔肽選自SEQIDN0:2和/或 SEQ ID NO :3。
7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的基因構(gòu)建體，其特征在于所述構(gòu)建體另外包括編碼易 被用于分離或純化目的的肽的核酸序列(D)，其位于所述核苷酸序列(B)的3’末端的下游。
8.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的基因構(gòu)建體，其特征在于所述構(gòu)建體另外包括啟動(dòng)子 序列、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的序列、核糖體結(jié)合序列(RBS)和/或轉(zhuǎn)錄終止序列。
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的基因構(gòu)建體，其特征在于所述構(gòu)建體另外包括選自抗 生素抗性基因和/或賦予針對(duì)毒性化合物的抗性的基因的標(biāo)記物。
10.重組表達(dá)載體，其有效用于轉(zhuǎn)化一般地植物或動(dòng)物細(xì)胞和具體地人細(xì)胞，所述重組 表達(dá)載體的特征在于它包括權(quán)利要求1-9的任一基因構(gòu)建體。
11.如權(quán)利要求10所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是根癌土壤桿 菌(Agrobacterium tumefaciens)0
12.如權(quán)利要求10所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是病毒，優(yōu)選 桿狀病毒(Baculovirus)。
13.用權(quán)利要求10-12的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞在其基因組中 包括權(quán)利要求1-9的任一基因構(gòu)建體。
14.用權(quán)利要求10或11的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物 在其基因組中包括權(quán)利要求1-9的任一基因構(gòu)建體。
15.用權(quán)利要求10或12的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物細(xì)胞在其基因組中包括權(quán)利要求1-9的任一基因構(gòu)建體。
16.由權(quán)利要求1-9的基因構(gòu)建體編碼的融合蛋白，所述融合蛋白能夠在引入其的宿 主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
17.如權(quán)利要求16所述的融合蛋白APCH1-2L21，其特征在于所述融合蛋白APCH1-2L21包括氨基酸序列SEQ ID NO :1 (A)和氨基酸序列SEQID NO 21 (B)，所述SEQ ID NO 21對(duì)應(yīng) 于犬細(xì)小病毒的疫苗抗原2L21。
18.如權(quán)利要求16所述的融合蛋白APCH1-E2T，其特征在于所述融合蛋白APCH1-E2T 包括氨基酸序列SEQ ID NO :1 (A)和氨基酸序列SEQID NO 23 (B)，所述SEQ ID NO :23對(duì)應(yīng) 于牛病毒性腹瀉病毒的疫苗抗原E2T。
19.疫苗，其包括權(quán)利要求16-18的任一融合蛋白和任選地藥用賦形劑。
20.一種設(shè)計(jì)用于治療或預(yù)防疾病的方法，所述方法包括將藥用量的權(quán)利要求19的疫 苗施用于個(gè)體或動(dòng)物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述施用是通過口服、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi) 或靜脈內(nèi)途徑來進(jìn)行。
全文摘要
將疫苗抗原指向抗原呈遞細(xì)胞的融合蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及基因構(gòu)建體，其包括操作性結(jié)合的至少一個(gè)編碼具有SEQ ID NO1的多肽的核苷酸序列(A)，所述多肽具有識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面上存在的II型DR抗原的β鏈的區(qū)域；和一個(gè)編碼目的疫苗抗原的核苷酸序列(B)。另外，本發(fā)明涉及有效用于表達(dá)本發(fā)明的基因構(gòu)建體的重組載體，用所述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和植物，由本發(fā)明的基因構(gòu)建體編碼的融合蛋白和包含所述融合蛋白的疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/12GK101970666SQ200880127999
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日
發(fā)明者何塞·安赫爾·馬丁內(nèi)斯埃斯克里瓦諾, 卡門·努內(nèi)茲塞拉諾, 奧格斯坦·奧斯塔查克, 安德烈斯·威格多羅維茲, 瑪里亞·何塞·杜斯桑托斯, 科瓦東加·阿隆索馬蒂, 耶維爾·多明格斯, 費(fèi)利克斯·希爾多內(nèi)斯, 馬里亞諾·菲爾曼拉佩雷斯 申請(qǐng)人:西班牙食品與飲料技術(shù)國家研究所;交替基因表達(dá)有限公司