專(zhuān)利名稱(chēng)：促造血的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)造血的藥物組合物以及制備該藥物組合物的方法。本發(fā)明還涉及該藥物組合物在制備用于治療造血功能受損狀態(tài)的藥劑中的用途。

背景技術(shù)：
造血是人體生命活動(dòng)的重要部分。成年動(dòng)物的造血組織主要位于骨髓中。在生理?xiàng)l件下，造血過(guò)程是造血干細(xì)胞(HSC)經(jīng)增殖、分化、直至形成各種成熟血細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程。臨床上多種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)疾病，例如再生障礙性貧血、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合癥等，以及放療和化療引起的骨髓損傷都會(huì)導(dǎo)致骨髓造血功能受到抑制或衰竭，給機(jī)體健康帶來(lái)嚴(yán)重危害。
造血干細(xì)胞移植(HSCT)能夠促進(jìn)造血重建，在一定程度上恢復(fù)骨髓的造血功能，已經(jīng)成為諸如白血病、多發(fā)性骨髓瘤、再生障礙型貧血及一些遺傳性貧血等血液系統(tǒng)疾病的重要治療手段。近年來(lái)，HSCT還被逐漸用于乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌等癌癥放療或化療后的支持治療。已知其他一些電離輻射損傷，比如急性放射病造成的骨髓抑制也可通過(guò)造血干細(xì)胞移植來(lái)治療。本發(fā)明人先前的研究表明給患急性放射病的動(dòng)物移植轉(zhuǎn)染了細(xì)胞因子基因的造血干細(xì)胞能有效地促進(jìn)骨髓造血重建[張勇等人，“中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志”第28卷，第14-17頁(yè)]。
但是，由于細(xì)胞擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染效率、體內(nèi)移植活力等問(wèn)題的影響，單純的造血干細(xì)胞移植對(duì)骨髓造血障礙的治療效果并不令人滿(mǎn)意。
中藥制劑由于其較高的安全性，也被用于治療一些血液系統(tǒng)疾病。其中使用較多的中藥成分為皂礬。皂礬的主要成分是硫酸亞鐵，還含有銅、砷、鈷等刺激骨髓造血的微量元素。以皂礬為主藥的皂礬復(fù)方丸常用于輔助治療某些造血障礙型疾病，對(duì)輻射損傷動(dòng)物的造血功能也有一定的改善作用[肖揚(yáng)等人，“中藥新藥與臨床藥理”，第15卷，第387-389頁(yè)]，但存在緩解慢、起效慢、治愈率低的缺點(diǎn)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種藥物組合物，該組合物包含造血干細(xì)胞和皂礬以及藥學(xué)上可接受的介質(zhì)，具有顯著促進(jìn)造血重建、恢復(fù)骨髓造血功能的作用。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種藥物組合物的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種藥物組合物在制備治療造血功能受損狀態(tài)的藥劑中的用途。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞為CD34+造血干細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，該CD34+干細(xì)胞為CD34+臍帶血干細(xì)胞。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞可以是導(dǎo)入了表達(dá)載體的造血干細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體攜帶至少一種細(xì)胞因子基因。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體攜帶的細(xì)胞因子選自Flt3配體(Flt3 ligand，F(xiàn)L)、白介素-3(IL-3)或其組合。更優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為pIRES2-EGFP-IL-3、pIRES2-EGFP-FL或其組合或pIRES2-EGFP-FL-IL-3。最優(yōu)選地，所述載體為pIRES2-EGFP-FL-IL-3。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物中的藥學(xué)上可接受的介質(zhì)選自緩沖液、生理鹽水、細(xì)胞培養(yǎng)基、平衡鹽溶液或其組合。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物的制備方法包括分離純化造血干細(xì)胞并將其重懸在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將皂礬溶于藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將上述細(xì)胞重懸液與皂礬溶液混合。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物的制備方法包括分離純化造血干細(xì)胞；將攜帶細(xì)胞因子的表達(dá)載體導(dǎo)入所述干細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞；將所述轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞重懸在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將皂礬溶于藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；然后將上述細(xì)胞重懸液與皂礬溶液混合。
在本發(fā)明提供的藥物組合物中，造血干細(xì)胞和皂礬具有協(xié)同促進(jìn)造血的作用，使該藥物組合物在造血重建中具有起效快、有效率高、治愈率高的優(yōu)點(diǎn)。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述藥物組合物與單純的造血干細(xì)胞移植或單獨(dú)給予皂礬相比，顯著提高了個(gè)體的生存率及外周血細(xì)胞的數(shù)量，顯示了本發(fā)明的組合物在治療造血功能受損狀態(tài)中的優(yōu)勢(shì)。尤其是，本發(fā)明的pIRES2-EGFP-FL-IL-3比單獨(dú)使用pIRES2-EGFP-IL-3、pIRES2-EGFP-FL或其組合顯示出更好的效果。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示IL-3的PCR產(chǎn)物電泳圖。第1泳道為分子量標(biāo)志物，第2、3泳道為IL-3的PCR產(chǎn)物。
圖2顯示重組體pIRES2-EGFP-IL-3的酶切結(jié)果。第1泳道為分子量標(biāo)志物；第2泳道為未經(jīng)酶切的重組體pIRES2-EGFP-IL-3；第3泳道是經(jīng)HindIII單酶切的重組體pIRES2-EGFP-IL-3；第4泳道是經(jīng)BglII+Xmal雙酶切的重組體pIRES2-EGFP-IL-3。
圖3顯示重組體pIRES2-EGFP-FL的酶切結(jié)果。第1泳道為分子量標(biāo)志物(DL2000)；第2泳道為經(jīng)SalI和BglII雙酶切的pUMVC3-hFL(3.9kb+0.8kb)；第3泳道是未經(jīng)酶切的重組體pIRES2-EGFP-FL(6.0kb)；第4泳道是經(jīng)NheI+XhoI雙酶切的重組體pIRES2-EGFP-FL(5.25kb+0.75kb)。
圖4顯示重組體pIRES2-EGFP-FL-IL-3的酶切結(jié)果。第1泳道為分子量標(biāo)志物(DL2000)；第2泳道為重組體pIRES2-EGFP-IL-3(7.5kb)；第3泳道是重組體pIRES2-EGFP-FL(6.0kb)；第4泳道是IL-3片段(2.5kb)；第5泳道是重組體pIRES2-EGFP-FL-IL-3(8.2kb)；第6泳道是經(jīng)XmalI+XhoI雙酶切的pIRES2-EGFP-FL-IL-3(6.0kb+2.2kb)；第7泳道是經(jīng)NheI+KpnI雙酶切的pIRES2-EGFP-FL-IL-3(4.7kb+3.5kb)。
圖5通過(guò)半定量RT-PCR分別檢測(cè)IL-3、FL在導(dǎo)入了pIRES2-EGFP-IL-3、pIRES2-EGFP-FL載體的CD34+細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。A，第1泳道為分子量標(biāo)志物，第2泳道為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，第3泳道是用PBS代替模板得到的PCR產(chǎn)物，第4、5泳道是轉(zhuǎn)染了IL-3的CD34+細(xì)胞；B，第1泳道為分子量標(biāo)志物，第2泳道為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，第3-5泳道是轉(zhuǎn)染了FL的CD34+細(xì)胞。
圖6顯示在導(dǎo)入了pIRES2-EGFP-IL-3、pIRES2-EGFP-FL或pIRES2-EGFP-FL-IL-3載體的CD34+細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)L及IL-3的蛋白表達(dá)。A，在導(dǎo)入pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL兩種載體的CD34+細(xì)胞中，IL-3的蛋白表達(dá)，第1泳道為對(duì)照，第2泳道為雙載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；B，在導(dǎo)入pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL兩種載體的CD34+細(xì)胞中，F(xiàn)L的蛋白表達(dá)，第1泳道為對(duì)照，第2泳道為雙載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；C，在導(dǎo)入pIRES2-EGFP-FL-IL-3載體的CD34+細(xì)胞中，IL-3的蛋白表達(dá)，第1泳道為對(duì)照，第2泳道為共表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；D，在導(dǎo)入pIRES2-EGFP-FL-IL-3載體的CD34+細(xì)胞中，F(xiàn)L的蛋白表達(dá)，第1泳道為對(duì)照，第2泳道為共表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明的一方面提供了促進(jìn)造血的藥物組合物，該藥物組合物包含造血干細(xì)胞和皂礬以及藥學(xué)上可接受的介質(zhì)。
本發(fā)明所述的“造血干細(xì)胞”可以是骨髓造血干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞，優(yōu)選臍帶血干細(xì)胞。臍帶血干細(xì)胞免疫細(xì)胞的抗原性較弱，與移植有關(guān)的移植物抗宿主病的發(fā)生相對(duì)骨髓和外周血少而輕，且采集保存容易，對(duì)供者無(wú)任何傷害。因此，臍帶血被認(rèn)為是理想的造血干細(xì)胞來(lái)源。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞為CD34+造血干細(xì)胞。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，該CD34+干細(xì)胞為CD34+臍帶血干細(xì)胞。
“CD34”是指高度糖基化的I型跨膜蛋白，其選擇性分布在造血干細(xì)胞表面，隨著造血細(xì)胞的不斷分化成熟，其表達(dá)也逐漸減少直至消失。研究者通常把CD34+細(xì)胞作為進(jìn)行HSC生物學(xué)特性研究與臨床應(yīng)用的源細(xì)胞。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，造血干細(xì)胞可以是導(dǎo)入了表達(dá)載體的造血干細(xì)胞，其中所述表達(dá)攜帶至少一種細(xì)胞因子基因。
本發(fā)明所述的“表達(dá)載體”是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其具有一系列允許特定的核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的特異性核酸元件。本發(fā)明的表達(dá)載體可以是諸如pI RES2-EGFP、pcDNA3.1、pCI-neo、pDC516、pVAC、pcDNA4.0、pGEM-T、pDC315的質(zhì)粒載體，或者是諸如腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、semliki森林病毒(sFv)載體的病毒載體。病毒載體因其易整合到靶細(xì)胞染色體內(nèi)，導(dǎo)致安全性差。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體為質(zhì)粒載體，優(yōu)選pIRES2-EGFP載體，因?yàn)楹笳甙僭鰪?qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)，易于與目的基因融合以及便于檢測(cè)；②含有SV40ori復(fù)制元件，有可能隨宿主細(xì)胞分裂，跟隨胞漿遺傳給子代細(xì)胞，可以在一定程度上保證目的基因穩(wěn)定傳遞；③含有IRES，能夠增強(qiáng)目的基因翻譯水平的表達(dá)。
本發(fā)明所述的“細(xì)胞因子”是指對(duì)造血干細(xì)胞的生存、調(diào)亡、增殖和分化起著重要調(diào)控作用的蛋白質(zhì)家族。細(xì)胞因子通常是通過(guò)在其靶細(xì)胞表面結(jié)合特異的受體以激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。所述細(xì)胞因子的實(shí)例包括，但不限于，諸如FL、IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)和干細(xì)胞因子(SCF)等作用于G0期的細(xì)胞因子，例如IL-3、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4等作用于分化狀態(tài)的HSC的細(xì)胞因子，以及例如促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和IL-5等作用于分化后期的細(xì)胞因子。其中FL是新近發(fā)現(xiàn)的，能夠刺激早期造血的細(xì)胞因子，其能夠調(diào)節(jié)最原始的造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化，可與多種細(xì)胞因子協(xié)同作用，提高造血功能。IL-3又稱(chēng)多系集落刺激因子，它主要由激活的T淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生，對(duì)造血細(xì)胞具有廣譜的刺激分裂和分化的作用。IL-3在FL或SCF存在下，能夠有效擴(kuò)增有核細(xì)胞總數(shù)，是增強(qiáng)造血及集落形成細(xì)胞的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體攜帶的細(xì)胞因子選自IL-3、FL或其組合。
本發(fā)明所述的“藥學(xué)上可接收的介質(zhì)”是指不干擾活性成分的生物活性有效性的載體。本發(fā)明的介質(zhì)包括但不限于細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖液、生理鹽水和平衡鹽溶液。細(xì)胞培養(yǎng)基的實(shí)例包括BME、MEM、DMEM、IMEM、HAM F12、PRMI1640、M199等。緩沖液的實(shí)例包括磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽以及碳酸鹽。所述介質(zhì)還可進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、佐劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等的一種或多種成分。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述介質(zhì)為等滲緩沖液，優(yōu)選為等滲磷酸鹽緩沖液(PBS)。
本發(fā)明的另一方面提供了促造血的藥物組合物的制備方法，它包括分離純化造血干細(xì)胞并將其重懸在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將皂礬溶于藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將上述細(xì)胞重懸液與皂礬溶液混合。
本發(fā)明的另一方面提供了促造血的藥物組合物的制備方法，其包括分離純化造血干細(xì)胞；將攜帶細(xì)胞因子的表達(dá)載體導(dǎo)入所述干細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞；將所述轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞重懸在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將皂礬溶于藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將上述細(xì)胞重懸液與皂礬溶液混合。
在本發(fā)明中，重懸細(xì)胞的介質(zhì)與溶解皂礬的介質(zhì)可以相同或不同。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，重懸細(xì)胞的介質(zhì)與溶解皂礬的介質(zhì)相同，且為等滲磷酸鹽緩沖液。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，造血干細(xì)胞的重懸濃度為5×104/ml至1×107/ml，優(yōu)選為5×105/ml至5×106/ml，最優(yōu)選為2.5×106/ml。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，皂礬的溶解濃度為0.5mg/ml至50mg/ml，優(yōu)選為2mg/ml至10mg/ml，最優(yōu)選為5mg/ml。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，細(xì)胞重懸液與皂礬溶液的混合體積比為1:2至3:1，優(yōu)選體積比為1:1至2:1，最優(yōu)選為2:1。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體可以是質(zhì)粒載體或病毒載體，優(yōu)選是質(zhì)粒載體，且最優(yōu)選為pIRES2-EGFP質(zhì)粒載體。所述“轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞”是指成功導(dǎo)入了表達(dá)載體的細(xì)胞。所述表達(dá)載體攜帶促造血細(xì)胞因子的基因，在干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)細(xì)胞因子。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將攜帶細(xì)胞因子基因的表達(dá)載體導(dǎo)入分離純化的干細(xì)胞，優(yōu)選CD34+干細(xì)胞，最優(yōu)選CD34+臍帶血干細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供了促造血的藥物組合物在制備治療造血功能受損狀態(tài)的藥劑中的用途。
本發(fā)明所述的造血干細(xì)胞與皂礬的“協(xié)同”作用是指包含造血干細(xì)胞和皂礬的藥物組合物對(duì)造血重建的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于單純的造血干細(xì)胞移植或單獨(dú)的皂礬的作用。
本發(fā)明所述的“造血功能受損狀態(tài)”是指骨髓造血功能受到抑制，導(dǎo)致一種或多種血細(xì)胞的生成數(shù)量降低到危害機(jī)體健康的狀態(tài)。本發(fā)明的造血功能受損狀態(tài)包括但不限于再生障礙性貧血、白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、放療和化療引起的骨髓損傷以及諸如急性放射病的其他電離輻射損傷導(dǎo)致的骨髓造血障礙?！凹毙苑派洳　笔侵溉矶虝r(shí)間內(nèi)受到1戈瑞(Gy)以上照射后發(fā)生的全身性疾病，主要表現(xiàn)為造血功能障礙。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在幾分鐘內(nèi)給予嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠2.0-8.0Gy的照射，復(fù)制急性輻射損傷的動(dòng)物模型；骨髓病理結(jié)果顯示，骨髓造血功能衰竭程度與輻射劑量呈正相關(guān)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，給予SCID小鼠8.0Gy(劑量率為1.07Gy/min)的照射，以便更好地觀(guān)察本發(fā)明藥物組合物的效果。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將藥物組合物給予個(gè)體的方法可以是靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴，優(yōu)選靜脈注射。
本發(fā)明所述的“個(gè)體”，是指哺乳動(dòng)物，包括但不限于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓以及諸如大鼠和小鼠的嚙齒類(lèi)動(dòng)物。
上述公開(kāi)內(nèi)容總體上描述了本發(fā)明，通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)一步示例本發(fā)明。描述這些實(shí)施例僅為說(shuō)明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。盡管本文中使用了特殊的術(shù)語(yǔ)和值，這些術(shù)語(yǔ)和值同樣被理解為示例性的，并不限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 分離與純化臍帶血干細(xì)胞，獲取CD34+細(xì)胞 無(wú)菌采取正常足月順產(chǎn)男性新生兒臍帶血(由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院提供)，用肝素抗凝，經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077g/ml)分離單個(gè)核細(xì)胞，以含有10％胎牛血清的IMDM洗滌2次，重懸于300μl含有0.5％BSA和2mmol/L EDTA的PBS溶液中，用免疫磁珠分選系統(tǒng)(mini-MACS)從單個(gè)核細(xì)胞中分離出CD34+細(xì)胞。具體方法如下在上述細(xì)胞重懸液中分別加入100μl封閉液(3％羊血清)和抗CD34單抗，混勻，4℃放置15min。用10ml上述PBS緩沖液離心洗滌后，加入100μl羊抗鼠IgG免疫磁珠，4℃放置15min。將細(xì)胞用上述方法洗滌后重懸于1ml PBS緩沖液中，滴加到置于磁場(chǎng)的分離柱中，使細(xì)胞懸液自然流出。用所述緩沖液洗柱4次，每次0.5ml。將分離柱移出磁場(chǎng)，加入1ml緩沖液，使用分離柱針芯將細(xì)胞推出。所得細(xì)胞主要為CD34+細(xì)胞。
分別取篩選前及篩選后的1×105個(gè)單個(gè)核細(xì)胞與藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗CD34單抗于4℃下孵育30min。將細(xì)胞用緩沖液洗滌后，用300μl的2％多聚甲醛固定30min。棄去多聚甲醛，將細(xì)胞用緩沖液洗滌后，再用常規(guī)免疫組化的方法測(cè)定CD34+細(xì)胞百分率。
結(jié)果篩選前的單個(gè)核細(xì)胞中，CD34+細(xì)胞僅為0.62％-9.05％，平均為3.24％±0.46％(x±sx)。篩選后的單個(gè)核細(xì)胞中，CD34+細(xì)胞為46.42％-95.61％，平均為79.35％±5.24％(x±sx)。篩選純化前后CD34+細(xì)胞濃度平均增加了24.49倍。
實(shí)施例2 IL-3、FL及共表達(dá)FL和IL-3雙順?lè)醋诱婧溯d體的構(gòu)建 真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP購(gòu)自Clontech公司產(chǎn)品。大腸桿菌DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。含全長(zhǎng)鼠IL-3cDNA(2.5kb)質(zhì)粒MXIL-3neo由瑞士巴塞爾大學(xué)Moroni教授惠贈(zèng)；含全長(zhǎng)人FL cDNA(0.8kb)質(zhì)粒pUMVC3-hFL購(gòu)自美國(guó)Michigan大學(xué)基因治療中心。
1.pIRES2-EGFP-IL-3的構(gòu)建 1)IL-3目的片段的擴(kuò)增利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物如下 上游5-GGAATTCCCTGTGGCTTCTTCA-3(SEQ ID NO1)(含EcoRI位點(diǎn))； 下游5-TCCCCGCGGGGAAAACCCATTTGTTC-3(SEQ ID NO2)(含SacII位點(diǎn))。
以MXIL-3neo質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃變性5min(1個(gè)循環(huán))；94℃變性30sec，56℃退火1min，72℃延伸3min(30個(gè)循環(huán))；最后72℃延伸10min。結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增得到2501bp的IL-3片段(圖1)。
2)將IL-3片段定向克隆至pIRES2-EGFP載體分別利用EcoRI、SacII雙酶切PCR產(chǎn)物IL-3片段和pIRES2-EGFP，回收后連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從卡那抗性平板上挑取數(shù)個(gè)單菌落提取質(zhì)粒DNA。分別用HindIII單酶切和BglII+Xmal雙酶切重組體進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行DNA測(cè)序證實(shí)。陽(yáng)性重組體命名為pIRES2-EGFP-IL-3。
重組體pIRES2-EGFP-IL-3酶切結(jié)果如圖2所示，HindIII單酶切在pIRES2-EGFP的623、892bp處和IL-3片段的801bp處有HindIII位點(diǎn)，因此陽(yáng)性重組體經(jīng)該酶切后出現(xiàn)0.8kb、1.7kb和5.0kb的三個(gè)片段。BglII+Xmal雙酶切在pIRES2-EGFP的621、657bp處分別有BglII、Xmal位點(diǎn)，因此陽(yáng)性重組體經(jīng)該雙酶切后出現(xiàn)2.2kb和5.3kb二個(gè)片段。DNA序列測(cè)定表明IL-3基因的核苷酸序列與GenebankK03233的完全一致。
2.pIRES2-EGFP-FL真核表達(dá)載體構(gòu)建 1)FL目的片段的擴(kuò)增利用Primer5.0設(shè)計(jì)引物如下 上游5-ATTGTGGCTTACCCTTGGTCTTCA-3(SEQ ID NO3)； 下游5-GTTGCGGGGAACTCCCCATTTGTTC-3(SEQ ID NO4)。以PUMVC3-hFL質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為94℃變性5min(1個(gè)循環(huán))；94℃變性30sec，56℃退火1min，72℃延伸3min(30個(gè)循環(huán))；最后72℃延伸10min。
2)FL雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體構(gòu)建SalI和BglII雙酶切pUMVC3-hFL，得到全長(zhǎng)人FL序列(0.8kb)，兩端抹平后克隆至pIRES2-EGFP載體的BglII位點(diǎn)。NheI和XhoI酶切鑒定后，將正向連接的重組體命名為pIRES2-EGFP-FL。
酶切結(jié)果如圖3所示，pUMVC3-hFL經(jīng)SalI+BglII酶切后得到3.9kb+0.8kb片段，重組體pIRES2-EGFP-FL經(jīng)NheI+XhoI酶切后得到5.25kb+0.75kb片段。DNA序列測(cè)定表明FL基因的核苷酸序列與GenebankK03233的完全一致。
3.pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表達(dá)載體構(gòu)建 利用EcoRI和SacII位點(diǎn)雙酶切已構(gòu)建成功的pIRES2-EGFP-IL-3，回收IL-3目的片段后克隆至pIRES2-EGFP-FL的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)。分別使用XhoI和XmalI雙酶切、NheI和KpnI雙酶切鑒定，將陽(yáng)性重組體命名為pIRES2-EGFP-FL-IL-3。
酶切結(jié)果如圖4所示，經(jīng)XmalI+XhoI酶切后，該重組體出現(xiàn)6.0kb和2.2kb兩個(gè)片段；經(jīng)NheI+KpnI酶切后，出現(xiàn)4.7kb和3.5kb兩個(gè)片段。DNA測(cè)序表明結(jié)果正確，無(wú)移碼等錯(cuò)誤。
實(shí)施例3 基因轉(zhuǎn)染 取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的經(jīng)分離純化的臍帶血CD34+細(xì)胞，當(dāng)其融合至60-80％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將5μl質(zhì)粒載體DNA(53μg/ml)加入20μl轉(zhuǎn)染緩沖液(20mmol/L HEPES，150mmol/L NaCl，pH7.4)中混勻，得到A液；將15μl DOTAP脂質(zhì)體加入35μl上述轉(zhuǎn)染緩沖液中混勻，得到B液；室溫下將A液和B液輕輕混均，1,200rpm離心30sec，靜置15min，將之緩慢配入含10％胎牛血清的IMDM中。將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸棄，用0.01mol/L PBS洗1次細(xì)胞，然后將含有轉(zhuǎn)染體系的培養(yǎng)液加入培養(yǎng)瓶中，于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)溫育24h，之后換液。將G418按800μg/ml濃度加入培養(yǎng)瓶中約1月，半月?lián)Q1次液，維持G418濃度不變。將篩選后的細(xì)胞擴(kuò)增備用。
實(shí)施例4 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的鑒定 1.檢測(cè)EGFP的綠色熒光 將普通蓋玻片泡酸、洗凈、烘干后，放入直徑6cm培養(yǎng)皿中，經(jīng)60Coγ-射線(xiàn)常規(guī)照射消毒。用0.25％胰酶消化轉(zhuǎn)染了細(xì)胞因子基因的細(xì)胞，然后將細(xì)胞以約1×105/ml的濃度，接種于上述照射消毒的培養(yǎng)皿中。24h后棄去培養(yǎng)液，用0.01mol/L的PBS洗滌細(xì)胞2次。然后取出蓋玻片，置于載玻片上，在488nm的藍(lán)色激光激發(fā)下，用熒光顯微鏡觀(guān)察EGFP的綠色熒光。
結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞的胞體均發(fā)出綠色熒光，表明質(zhì)粒成功導(dǎo)入CD34+細(xì)胞中。
2.半定量RT-PCR檢測(cè)FL及IL-3的表達(dá) ①利用Invitrogen公司的一步法總RNA提取試劑盒，提取實(shí)施例3中的經(jīng)轉(zhuǎn)染篩選并擴(kuò)增的細(xì)胞的總RNA。
②引物的設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物如下， IL-3上游(P1)5-TGTTTCCACTCCGTCCAT-3(SEQ ID NO5)； 下游(P2)5-CCAAAGCAGGGCTCTTAC-3(SEQ ID NO6)。(Tm53℃；30個(gè)循環(huán)；585bp)； FLP15-CTGGAGCCCAACAACCTATC-3(SEQ ID NO7)； P25-TCTGGACGAAGCGAAGACA-3(SEQ ID NO8)。(Tm 57℃；27個(gè)循環(huán)；353bp)。
③RT-PCR采用兩步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄42℃ 30分鐘，99℃ 5分鐘，5℃ 5分鐘，1個(gè)循環(huán)。PCR94℃預(yù)變性4分鐘；然后94℃變性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘補(bǔ)齊末端。
結(jié)果如圖5所示，以正常未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照，轉(zhuǎn)染后CD34+細(xì)胞的IL-3(圖5A)和FL表達(dá)(圖5B)均明顯上調(diào)。
3.Western blot檢測(cè)FL及IL-3的蛋白表達(dá)情況 提取實(shí)施例3中經(jīng)轉(zhuǎn)染篩選并擴(kuò)增的細(xì)胞的總蛋白，用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將膜用TBST(TBS，0.05％Tween20)稀釋的封閉液(5％脫脂奶粉)室溫封閉1小時(shí)后，用1:800的IL-3一抗(Sigma)稀釋液(稀釋于TBST中)或1:500的FL一抗(Sigma)稀釋液4℃孵育過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后，用TBST洗膜3次，每次10分鐘。再分別用1:300的對(duì)應(yīng)的二抗(兔抗人)稀釋液(稀釋于TBST中)于37℃孵育1h。然后用TBST洗膜3次，每次l0分鐘。接著將膜在TBST稀釋的1:500的辣根酶鏈親合素三抗稀釋液中于37℃孵育1h。最后用DAB顯色，將顯色清晰條帶的PVDF膜置于Gel Doc2000凝膠掃描系統(tǒng)上分析，以樣本掃描值/對(duì)照掃描值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果如圖6所示，同時(shí)導(dǎo)入pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL兩種載體的CD34+細(xì)胞中，IL-3蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組(圖6A)，F(xiàn)L蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組(圖6B)；導(dǎo)入pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表達(dá)載體的CD34+細(xì)胞中，表達(dá)的IL-3和FL蛋白也均高于對(duì)照組(圖6C，6D)。
實(shí)施例5 包含CD34+臍帶血干細(xì)胞的藥物組合物的制備 皂礬購(gòu)自陜西郝其軍制藥有限公司；CD34+臍帶血干細(xì)胞由實(shí)施例1獲得。制備步驟如下 (1)將來(lái)自實(shí)施例1的5×105個(gè)CD34+臍帶血干細(xì)胞重懸在200μl等滲磷酸鹽緩沖液(0.03mol/L，pH 7.4)中，得到濃度為2.5×106/ml的干細(xì)胞懸液。
(2)將500μg皂礬溶于100μl上述磷酸鹽緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的皂礬溶液。
(3)將上述干細(xì)胞懸液與皂礬溶液混合，即得到藥物組合物注射液。
實(shí)施例6 包含導(dǎo)入了表達(dá)載體的CD34+臍帶血干細(xì)胞的藥物組合物的制備 皂礬購(gòu)自陜西郝其軍制藥有限公司；導(dǎo)入了表達(dá)載體的CD34+臍帶血干細(xì)胞來(lái)自實(shí)施例3。
1.包含同時(shí)導(dǎo)入了pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL兩種載體的CD34+臍帶血干細(xì)胞的藥物組合物的制備 如實(shí)施例5的制備方法，將5×105個(gè)導(dǎo)入了pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL表達(dá)載體的CD34+臍帶血干細(xì)胞重懸在200μl等滲磷酸鹽緩沖液(0.03mol/L，pH 7.4)中，得到濃度為2.5×106/ml的轉(zhuǎn)染了IL-3基因的細(xì)胞懸液；將500μg皂礬溶于100μl上述磷酸鹽緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的皂礬溶液；將上述兩種液體混合，得到300μl藥物組合物注射液。
2.包含導(dǎo)入了pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表達(dá)載體的CD34+臍帶血干細(xì)胞的藥物組合物的制備 與上面的制備方法基本相同，不同之處在于CD34+臍帶血干細(xì)胞導(dǎo)入的是pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表達(dá)載體。
實(shí)施例7 觀(guān)測(cè)來(lái)自實(shí)施例5的本發(fā)明的藥物組合物的療效 實(shí)驗(yàn)對(duì)象48只4-6周齡，體重18-20g的SCID雌性小鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物所提供)。
實(shí)驗(yàn)方法小鼠飼養(yǎng)于無(wú)菌層流柜中。飼料經(jīng)60Co照射，飲用水及墊料均經(jīng)高壓消毒無(wú)菌處理，給藥前3天開(kāi)始飲用經(jīng)高壓消毒酸化后加入二性霉素B(80mg/L)和環(huán)丙沙星(80mg/L)的水。對(duì)小鼠的所有操作均在無(wú)菌層流條件下進(jìn)行。小鼠置于無(wú)菌透氣的塑料盒中，外罩無(wú)菌消毒巾，用60Coγ射線(xiàn)一次全身性照射2.0-8.0Gy(劑量率為1.07Gy/min)，復(fù)制輻射損傷的動(dòng)物模型。在輻射后4小時(shí)內(nèi)通過(guò)尾靜脈注射給藥，此后維持抗生素飼服。
實(shí)驗(yàn)分組經(jīng)過(guò)照射的48只小鼠隨機(jī)分為空白組、CD34+臍帶血干細(xì)胞組(CD34組)、皂礬組、藥物組合物組，每組12只動(dòng)物。其中CD34組的每只小鼠給予300μl細(xì)胞懸液，含有5×105個(gè)來(lái)自實(shí)施1的CD34+臍帶血干細(xì)胞；皂礬組的每只小鼠給予300μl皂礬溶液(含皂礬500μg)；藥物組合物組的每只小鼠給予300μl來(lái)自實(shí)施例5的藥物組合物，即包含皂礬和CD34+臍帶血干細(xì)胞的組合物。
觀(guān)測(cè)指標(biāo)觀(guān)察小鼠生存情況；給藥后第2周、4周和6周尾靜脈取血進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以x±s表示，SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，小鼠存活率用χ2檢驗(yàn)，其余數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各組小鼠存活率如表1所示，空白組小鼠在2周內(nèi)因造血功能衰竭而全部死亡；CD34+組和皂礬組的存活率隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低；藥物組合物組的存活率顯著高于同期各組。
外周血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果如表2所示，空白組因全部死亡沒(méi)有相關(guān)數(shù)據(jù)；第2周和第4周時(shí)，藥物組合物組的白細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞數(shù)量及血小板數(shù)量顯著高于CD34組和皂礬組(p<0.05)，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第6周時(shí)除空白組外的其余組的各指標(biāo)之間無(wú)明顯區(qū)別，這可能是因?yàn)槊拷M能夠存活到6周的小鼠的造血恢復(fù)程度都較理想。
這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的藥物組合物與CD34+臍帶血干細(xì)胞和皂礬相比，對(duì)輻射損傷導(dǎo)致的造血功能受損狀態(tài)具有明顯的治療作用。
表1 各組小鼠存活數(shù)量及存活率
注與對(duì)照組比較，aP<0.01；與CD34組比較，bP<0.05；dP<0.01；與皂礬組比較，cP<0.01 表2 各組小鼠外周血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(x±s)
注藥物組合物組ab表示對(duì)于第2周和第4周的各指標(biāo)，藥物組合物組與CD34組相比，aP<0.05；與皂礬組相比，bP<0.01。
實(shí)施例8 觀(guān)測(cè)來(lái)自實(shí)施例6的本發(fā)明的藥物組合物的療效 實(shí)驗(yàn)對(duì)象80只4-6周齡，體重18-20g的SCID雌性小鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物所提供)。
實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例7相同。
實(shí)驗(yàn)分組經(jīng)過(guò)照射的80只小鼠隨機(jī)分為導(dǎo)入雙載體的CD34+臍帶血干細(xì)胞組(A組)、導(dǎo)入pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表達(dá)載體的干細(xì)胞組(B組)、皂礬組(C組)、包含皂礬以及導(dǎo)入了雙載體的干細(xì)胞的藥物組合物組(D組)、包含皂礬和導(dǎo)入了共表達(dá)載體的干細(xì)胞的藥物組合物組(E組)，每組16只動(dòng)物。因?yàn)椴唤?jīng)治療的小鼠兩周內(nèi)全部死亡，故未設(shè)空白對(duì)照組。5個(gè)組的每只小鼠都通過(guò)尾靜脈給予300μl注射液，其中A組的小鼠給予細(xì)胞懸液，其含有5×105個(gè)導(dǎo)入了pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL兩種載體的CD34+臍帶血干細(xì)胞；B組小鼠也給予細(xì)胞懸液，其含有5×105個(gè)導(dǎo)入了pIRES2-EGFP-FL-IL-3表達(dá)載體的CD34+臍帶血干細(xì)胞；C組小鼠給予皂礬溶液(含皂礬500μg)；D組給予藥物組合物，其包含皂礬和導(dǎo)入了pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL兩種載體的CD34+臍帶血干細(xì)胞；E組小鼠也給予藥物組合物，該組合物包含皂礬和導(dǎo)入了pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表達(dá)載體的CD34+臍帶血干細(xì)胞。
觀(guān)測(cè)指標(biāo)與實(shí)施例7相同。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與實(shí)施例7相同。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各組小鼠存活率如表3所示，E組的存活率在第2、4和6周均顯著高于A、B、C組(p<0.05)；D組的存活率在不同時(shí)期均高于A、B、C組，但低于同期的E組的存活率。
外周血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)表4，第2周和第4周時(shí)，E組的白細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞數(shù)量及血小板數(shù)量均高于A、B、C和D組(p<0.05)，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D組中的各指標(biāo)高于A、B和C組，但均低于同期的E組。
該結(jié)果表明，本發(fā)明的藥物組合物與單獨(dú)轉(zhuǎn)染了細(xì)胞因子基因的CD34+臍帶血干細(xì)胞相比，能夠顯著提高輻射損傷動(dòng)物的存活率，對(duì)造血重建具有明顯的促進(jìn)作用。同時(shí)該結(jié)果也表明，皂礬與pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表達(dá)載體的協(xié)同作用比皂礬與pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL質(zhì)粒載體的協(xié)同作用更為突出。
表3 各組小鼠存活數(shù)量及存活率
表4 各組小鼠外周血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(x±s)
可以理解，盡管本發(fā)明以某種形式被說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于本說(shuō)明書(shū)中所顯示和描述的內(nèi)容。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在不偏離本發(fā)明的范圍的前提下還可做出各種變化。這些變化都在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
序列表
<110>第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院血液科
張勇
杜宏偉
郭朝華
董世武
<120>促造血的藥物組合物及其制備方法
<130>08C11137CN
<160>8
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>1
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>2
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>3
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>4
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>5
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>6
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>7
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>8
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，它包含造血干細(xì)胞和皂礬，以及藥學(xué)上可接受的介質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述造血干細(xì)胞為CD34+造血干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于所述造血干細(xì)胞是導(dǎo)入了表達(dá)載體的造血干細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體攜帶至少一種細(xì)胞因子基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中所述細(xì)胞因子選自Flt3配體、白介素-3或其組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中所述表達(dá)載體為同時(shí)表達(dá)Flt3配體、白介素-3的pIRES2-EGFP-FL-IL-3。
6.制備權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的藥物組合物的方法，其包括分離純化造血干細(xì)胞并將其重懸在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將皂礬溶于藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將上述細(xì)胞重懸液與皂礬溶液混合。
7.制備權(quán)利要求6所述的藥物組合物的方法，其還包括將攜帶細(xì)胞因子基因的表達(dá)載體導(dǎo)入所述干細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備治療造血功能受損狀態(tài)的藥劑中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述藥物組合物中的皂礬和造血干細(xì)胞具有協(xié)同促進(jìn)造血的作用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述造血功能受損狀態(tài)選自再生障礙性貧血、白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤以及電離輻射損傷、化療引起的造血障礙。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)造血的藥物組合物，其包含造血干細(xì)胞和皂礬，其中所述造血干細(xì)胞優(yōu)選為導(dǎo)入了攜帶細(xì)胞因子基因的表達(dá)載體的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及該藥物組合物的制備方法以及在制備用于治療造血功能受損狀態(tài)的藥劑中的用途，其中造血干細(xì)胞和皂礬具有協(xié)同促進(jìn)造血的作用。
文檔編號(hào)A61K35/14GK101530427SQ200910006209
公開(kāi)日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2009年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月3日
發(fā)明者勇 張, 杜宏偉, 郭朝華, 董世武 申請(qǐng)人:重慶西南醫(yī)院