專利名稱：：齊多夫定脂質(zhì)衍生物在治療與病毒有關(guān)疾病藥品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及齊多夫定脂質(zhì)衍生物在治療與病毒有關(guān)疾病藥品中的應(yīng)用，其中齊多夫定脂質(zhì)衍生物包括膽固醇基膦酰齊多夫定和膽固醇基磷酰齊多夫定。
背景技術(shù)：
：病毒是危害人類健康的一種重要病原體，具有高度傳染性，是許多其他疾病(如腫瘤)的病因。大力開發(fā)研制安全有效的抗病毒藥物是一個(gè)十分艱巨的任務(wù)。抗病毒藥物的重要標(biāo)準(zhǔn)是對病毒有抑制作用，而對細(xì)胞的正常代謝無影響。由于病毒結(jié)構(gòu)和生活過程簡單，不易與宿主細(xì)胞區(qū)別，因而大多數(shù)抗病毒藥在作用過程中，對人體毒性較大或抗病毒作用較低。這是抗病毒藥研究遲緩的原因之一。目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)抗病毒藥物主要通過影響病毒復(fù)制周期的某個(gè)環(huán)節(jié)而實(shí)現(xiàn)。病毒性肝炎是由肝炎病毒(HepatitisVirus)引起的疾病，其傳染性極強(qiáng)，對人體造成極大的危害和痛苦。引起肝炎的病毒有七種類型，分為甲型肝炎病毒(HepatitisAvirus,HAV)、乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)、丙型肝炎病毒(H印atitisCvirus,HCV)、丁型肝炎病毒(HepatitisDvirus,HDV)、戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)、庚型肝炎病毒(H印atitisGvirus,HGV)以及TTA(即輸血傳播病毒性肝炎)，分別能夠引起甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、庚型和TTA肝炎癥狀。甲型肝炎主要是經(jīng)糞-口傳播而傳染，是由甲型肝炎病毒污染了水源、水產(chǎn)品、蔬菜而成流行，是全球性傳染性很強(qiáng)的疾病。1988年上海甲肝流行，正是由于人們吃了被甲型肝炎病毒污染的毛蚶，31余萬人感染，死亡47人。乙肝是世界性傳染病，慢性化程度高，危害性大。我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，堪稱"肝炎大國"。根據(jù)衛(wèi)生部2002年統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國乙肝的現(xiàn)患病率為277/萬，是美國的40多倍，年發(fā)病率為95/萬。在法定傳染病中，其發(fā)病率僅次于感染性腹瀉與流行性感冒而居第三位。流行病學(xué)調(diào)查表明，我國至少有8億人感染過乙型肝炎，而我國人群中的乙肝表面抗原的攜帶率高達(dá)10.34%，也就是說，約有1.3億人為乙肝病毒攜帶者，幾乎占全世界總數(shù)的一半，他們中的四分之一最終將發(fā)展成慢性肝炎、肝硬變或原發(fā)性肝癌。此外，全國還有1200多萬慢性肝炎病人，每年死于肝病者達(dá)30萬之多，其中約半數(shù)為肝癌。更為嚴(yán)重的是，有40%攜帶乙肝表面抗原的母親，將通過母嬰垂直傳播，使80%90%的新生兒(每年約80萬90萬人)成為慢性乙肝病毒攜帶者。乙肝不僅嚴(yán)重影響人體健康，而且給家庭、社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，我國每年用于肝炎和肝病的醫(yī)療、保健費(fèi)用高達(dá)1000多億元。丙型肝炎主要通過血液和血液制品傳播，國外發(fā)現(xiàn)90%因輸血而感染的肝炎都是丙型肝炎。急性丙型肝炎臨床經(jīng)過較輕，多感染成人，無季節(jié)性，零散發(fā)生。病情雖輕，但發(fā)展成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的比例比乙型肝炎要高，后果嚴(yán)重，治療費(fèi)用高。丁型肝炎的傳播很廣泛，呈全球性分布。病毒存在于急性及慢性丁型肝炎病人的血液中，但是丁型肝炎病毒是不完整的，有缺陷的病毒，不能單獨(dú)存在，只有在感染了乙肝的機(jī)體內(nèi)才可復(fù)制。戊型肝炎與甲型肝炎一樣，傳播途徑都是糞-口傳染，因?yàn)樗幢晃廴径鸫笮捅l(fā)及流行。1986年至1988年在我國新疆南部、遼寧就曾因水源被污染而造成戊型肝炎的流行。庚型肝炎病毒是1995年發(fā)現(xiàn)的一種肝炎病原病毒，同丙型肝炎病毒同屬于黃病毒科，主要在肝內(nèi)復(fù)制，主要通過血源性、靜脈注射毒品、性接觸及母嬰垂直傳播，同丙型肝炎相似，是胃腸道外傳播。艾滋病(AIDS)是一種由艾滋病毒，即人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,簡稱HIV)侵入人體后破壞人體免疫功能，使人體發(fā)生多種不可治愈的感染和腫瘤，最后導(dǎo)致被感染者死亡的一種嚴(yán)重傳染病。自80年代初發(fā)現(xiàn)首例以來，它驚人的傳染速度和死亡率，被稱為"當(dāng)代瘟疫"和"超級癌癥"。艾滋病己引起世界衛(wèi)生組織(WHO)及各國政府的高度重視，無論是人員和經(jīng)費(fèi)的投入均放在首位，我國已將其列入乙類法定傳染病，并為國境衛(wèi)生監(jiān)測傳染病之一。然而，到目前為止，尚無可以治愈該病的有效藥物。使得切實(shí)有效的艾滋病防治藥物的研究引起了各國醫(yī)藥學(xué)界和政府部門的高度重視。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的重要組成，人體感染病毒后，單核巨噬細(xì)胞會(huì)吞噬和殺滅病毒，但有時(shí)病毒不能很快被殺死，潛伏在單核巨噬細(xì)胞內(nèi)，后者成為病毒的宿主，并攜帶病毒轉(zhuǎn)移到其他正常組織，引起新的感染。巨噬細(xì)胞(Macrophages)是fflV體內(nèi)主要寄生處，是AIDS發(fā)病機(jī)制中的病毒源，是病毒擴(kuò)散的攜帶者。目前大部分抗HIV藥物體內(nèi)半衰期較短、細(xì)胞膜滲透性較差，所以臨床上往往給藥劑量較大，給藥次數(shù)頻繁。且它們并不能趨向地分布于巨噬細(xì)胞來發(fā)揮抗病毒作用。因此亟需找到靶向兼控釋的抗HIV藥物傳遞系統(tǒng)。傳統(tǒng)的靶向傳遞系統(tǒng)也能夠靶向單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS),比如有人將抗HIV藥物包裹于脂質(zhì)體(DesormeauxA,BergeronMGLiposomesasdrugdeliverysystem:astrategicapproachforthetreatmentofHIVinfection.JDrugTarget,1998，6:1-15;DipaliSR,etal.Pharmacokineticsandtissuedistributionofalongcirculatingliposomalformulationof29,39-dideoxyinosine.IntJPharm,1997,152:89-97)，或納米粒(BenderAR，etal.Efficiencyofnanoparticlesasacarriersystemforantiviralagentsinhumanimmunodeficiencyvirus-infectedhumanmonocytes/macrophagesinvitro.AntimicrobAgentChemother,1996,40:1467-1471)。雖然可以耙向巨噬細(xì)胞，但這些微粒傳遞系統(tǒng)存在著藥物包裹率低、穩(wěn)定性差、載藥量有限等問題。目前廣泛使用的治療病毒感染的藥物包括核苷類似物。核苷類似物抗病毒藥的作用機(jī)制是通過與合成病毒DNA必需的核苷酸競爭DNA聚合酶上的結(jié)合部位而抑制病毒DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，摻入病毒DNA鏈中使其合成終止，從而發(fā)揮抗病毒作用。核苷類抗病毒藥物必須活化成磷酸酯后才能抑制病毒復(fù)制。目前所用的很多核苷類抗病毒藥物脂溶性差，很難滲透進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部需借助膜上載體的作用，故存在著競爭和抑制現(xiàn)象，從而影響到生物利用度和藥效的發(fā)揮，導(dǎo)致許多抗病毒藥物用藥劑量很大，療效不夠理想(FauldsD，BrogdenRN.Didanosine:areviewofitsantiviralactivity,pharmacokineticpropertiesandtherapeuticpotentialinhumanimmunodeficiencyvirusinfection.Drugs,1992，44:94-116)。特別是在巨噬細(xì)胞內(nèi)難以獲得足夠濃度，不能有效殺滅細(xì)胞內(nèi)病毒。雖然核苷類藥物可以通過親脂結(jié)構(gòu)改造，使其具備合適的油/水分配系數(shù)，從而容易透過生物膜。目前已有很多關(guān)于此類藥物的脂肪酸、甘油酯、磷脂衍生物的報(bào)道(KonstantineKM,etal.Lymphatictargetingofanti-fflVnucleosides:distributionof2'，3'畫dideoxyinosineafterintravenousandoraladministrationofdipalmitoylphosphatidylprodruginmice.AntiviralRe,1997，34:91-99;DavidCB,etal.Synthesisandevaluationof5'alkylesterprodrugsofzidovudinefordirectedlymphaticdelivery.IntJPharn^1996，144:61-70;ClaptionSD,etal.Effectofmono-anddi-acylationontheoculardispositionofganciclovir:Physicochemicalproperties,ocularbioreversion,andantiviralactivityofshortchainesterprodrugs.JPharmSci，2002,91:660-668)，但脂質(zhì)前藥難溶于水，給藥困難；并且前藥分子在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)之前，會(huì)遭受各種酯酶和蛋白等的作用，導(dǎo)致前藥降解和蛋白結(jié)合，從而失去了前藥制備的意義。金義光等提出并發(fā)展的自組裝藥物傳遞系統(tǒng)技術(shù)(Self-assembleddrugdeliverysystems,SADDS)(JinY.Nanotechnologyinpharmaceuticalmanufacturing,in:(ShayneCoxGad,ed.)PharmaceuticalManufacturingHandbook:ProductionandProcesses.JohnWileyandSons,Inc，2008:1249-1288;YiguangJin，etal.Self-assembleddrugdeliverysystems.1.Propertiesandinvitro/invivobehaviorofacyclovirself-assemblednanoparticles(SAN).InternationalJournalofPharmaceutics,2006,309(1-2):199-207)較好地解決了脂質(zhì)前藥給藥的問題。SADDS是指兩親性藥物或前藥在水溶液中自組裝成膠束、泡囊、六角相、立方相、納米粒等高度分散的有序聚集體。前藥到達(dá)靶部位后通過水解等作用釋放出藥物或藥物中間體而發(fā)揮作用。自組裝藥物傳遞系統(tǒng)的兩親性使其對生物膜有很好的親和性和滲透性，納米微粒分散特性使其在體內(nèi)有靶向性和粘附性。因此自組裝藥物傳遞系統(tǒng)可以高效地將藥物傳遞到靶器官、組織和細(xì)胞中。它和傳統(tǒng)TDDS的根本區(qū)別是其全部或大部分組裝成分為兩親性藥物或前藥分子，載藥量和穩(wěn)定性大大增加，不存在藥物包裹率和滲漏的問題。齊多夫定(Zidovudine,AZT)，是脫氧胸腺嘧啶核苷類似物，是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，是被美國FDA批準(zhǔn)上市的第一個(gè)抗HIV藥物，目前作為治療晚期HIV感染的一線藥物之一。其半衰期短(0.81.2h)，靶向性差(腦中分布很少)，因此需加大劑量和頻繁給藥以維持治療劑量。長期使用會(huì)造成劑量依賴性，增加劑量又會(huì)導(dǎo)致骨髓毒性。核苷類似物藥物必須在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化成磷酸酯，才能摻入病毒或腫瘤細(xì)胞等的核酸(DNA或RNA)合成過程中，干擾其代謝過程，從而發(fā)揮藥理活性(陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學(xué).第15版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2004年)。但許多核苷類似物藥物經(jīng)過一段治療后，往往會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生抗藥性或耐藥性，原因是病毒或腫瘤細(xì)胞的核苷激酶不再對核苷類似物產(chǎn)生磷酸化(KimberlinDW,etal.Molecularmechanismsofantiviralresistance.AntiviralRes，1995,26:369-401)。有些研究嘗試將核苷類似物藥物先與膦?；蛄柞；B接，從而克服了耐藥性(KriseJP，StellaVJ.Prodrugsofphosphates,phosphonates,andphosphinates.AdvDrugDelRev,1996,19:287-310;DeClercqE.Acyclicnucleosidephosphonates:Past,presentandfliturebridgingchemistrytoHIV,HBV,HCV,HPV,adeno國,herpes-,andpoxvirusinfections:Thephosphonatebridge.BiochemPharmacol,2007，73:911-922)。在我們前面的發(fā)明中，已經(jīng)獲得了兩種齊多夫定脂質(zhì)衍生物，包括膽固醇基磷酰齊多夫定(CN100462103)和膽固醇基膦酰齊多夫定(CN101244036)化合物和它們的高度分散劑型，包括自組裝藥物傳遞系統(tǒng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，膽固醇基磷酰齊多夫定和膽固醇基膦酰齊多夫定的高度分散劑型，特別是自組裝藥傳遞系統(tǒng)，相當(dāng)于原藥齊多夫定，有很強(qiáng)的抗HIV作用。因此本發(fā)明人設(shè)計(jì)了本發(fā)明。本發(fā)明的膽固醇基磷酰齊多夫定和膽固醇基膦酰齊多夫定可以作為新的抗病毒藥物特別是抗艾滋病藥物進(jìn)行開發(fā)，為治療病毒性疾病特別是艾滋病提供了一種新的途徑和手段。本發(fā)明公開了膽固醇基膦酰齊多夫定和膽固醇基磷酰齊多夫定在制備用于治療與病毒有關(guān)疾病藥品中的應(yīng)用。膽固醇基膦酰齊多夫定的分子式如下:膽固醇基磷酰齊多夫定的分子式如下:本發(fā)明所述的含有膽固醇基膦酰齊多夫定或膽固醇基磷酰齊多夫定的用于治療與病毒有關(guān)疾病藥品的劑型可以是可能應(yīng)用的各種劑型，具體選自片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑和高度分散劑型，優(yōu)選的是高度分散劑型。高度分散劑型又選自脂質(zhì)體、非離子表面活性劑泡囊、微粒、納米粒、乳劑、膠束、納米凝膠、樹枝狀聚合物或自組裝傳遞系統(tǒng)，優(yōu)選的是自組裝傳遞系統(tǒng)。它們的制備方式可參考相關(guān)專業(yè)書籍和前述發(fā)明(CN100462103，CN101244036)。本發(fā)明中的膽固醇基膦酰齊多夫定或膽固醇基膦酰齊多夫定還可與其他抗病毒的藥物制成復(fù)方制劑。本發(fā)明中的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。本發(fā)明中注射給藥給藥方式包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和穴為了將膽固醇基膦酰齊多夫定或膽固醇基磷酰齊多夫定的給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用藥物制劑領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、交聯(lián)聚維酮、氧化鈣、預(yù)凝膠淀粉、硅酸鋁鈣、氯化轉(zhuǎn)、氯化鋁、碳酸鈣等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、西黃芪膠、卡波姆、黃原膠、聚乙烯吡咯垸酮、羥丙基甲基纖維素等；崩解劑，例如羧甲基淀粉鈉、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚維酮、微晶纖維素、十二烷基硫酸鈉、甲基纖維素、海藻酸鈉、聚山梨醇酯-80、碳酸氫鈉與枸櫞酸等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉、環(huán)糊精、乙二胺四乙酸二鈉等；潤滑劑及助流劑，例如滑石粉、硬脂酸鹽、微粉硅膠、玉米淀粉、聚乙二醇、液體石蠟、二甲硅油、甘油、硅酸鹽等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將膽固醇基膦酰齊多夫定或膽固醇基磷酰齊多夫定制備成膠囊劑，可將有效成分與上述的各種載體混合，直接或經(jīng)過制?；蚪?jīng)過擠出-滾圓制備微丸后，置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。將本發(fā)明化合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自注射用水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料都是藥物制劑領(lǐng)域常用的。此外，如需要，也可以向藥物劑型中添加著色劑、防腐劑、矯味劑、甜味劑或其他藥物制劑輔料。為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物可以使用任何公知的藥物制劑輔料，也可用任何公知的給藥方法給藥。高度分散劑型在體內(nèi)會(huì)表現(xiàn)出促吸收、增強(qiáng)生物利用度、靶向、緩釋或控釋等作用。本發(fā)明涉及的病毒并不受到限制，優(yōu)選自人類肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒。人類肝炎病毒選自人類甲型肝炎病毒、人類乙型肝炎病毒、人類丙型肝炎病毒、人類丁型肝炎病毒、人類戊型肝炎病毒、人類庚型肝炎病毒。以下通過實(shí)驗(yàn)例說明膽固醇基膦酰齊多夫定和膽固醇基磷酰齊多夫定的抗病毒作用。實(shí)驗(yàn)例l:膽固醇基膦酰齊多夫定體外抗HIV活性膽固醇基膦酰齊多夫定在體外對HIV-1IIIB病毒有較強(qiáng)的抑制活性，并且細(xì)胞毒性較低。材料與方法采用細(xì)胞和mv病毒實(shí)驗(yàn)常規(guī)儀器設(shè)備試劑，在P3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。齊多夫定原料藥從藥廠購進(jìn)。膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)的制備參考前述專利(CN101244036),平均粒徑107納米，穩(wěn)定。fflV-lIIIB病毒引自美國；MT4細(xì)胞株引自日本。高效液相色譜法測得齊多夫定水溶液、自制的膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)的濃度分別為3.74mol'L"、3.03mol'U1，將二者均用超純水稀釋至約50nmol.L;1，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，三種藥物進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別得到濃度為50xl03、5xl03、500、50、5、0.5nmol丄'1的齊多夫定水溶液、膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)藥液。將MT4細(xì)胞2xl(^mL"接種于96孔板中，每孔為60pL，加入40pL不同濃度梯度的三種藥物，每個(gè)濃度梯度設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，再加入稀釋1000倍的fflV-lIIIB病毒100pL。此時(shí)藥物的終濃度梯度依次為10xl03、lxl03、100、10、1、O.lnmol丄"。每塊96孔板同時(shí)設(shè)對照組三個(gè)復(fù)孔(超純水40pL+MT4細(xì)胞60pL+病毒100^L)。將96孔板置于37。C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)。CPE判定標(biāo)準(zhǔn)無合胞體形成"一"，無合胞體形成但細(xì)胞不規(guī)則"±"，有合胞體形成"+"。EC5Q(抑制合胞體形成50%時(shí)的化合物濃度，halfofeffectiveconcentration)的判定(1)只1孔為"+"，另兩孔為"一"或"一"與"±"，此藥物濃度可視為EC5。。(2)3孔分別為"+，，、"一"與"±"，此藥物濃度可視為EC50。(3)3孔均為"±"，此藥物濃度可視為EC50。(4)3孔均為"+"，下一個(gè)濃度作用下的3孔均為"一"，兩個(gè)濃度的中間值可視為EC50。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，第一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)加入細(xì)胞、藥物和病毒；第二次實(shí)驗(yàn)先加入細(xì)胞和藥物室溫放置1小時(shí)后再加入病毒。自制的膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)對MT4細(xì)胞毒性采用MTT法測定。在96孔細(xì)胞養(yǎng)板中，對自制的膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)藥液用培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，然后每孔加入2X105MT4細(xì)胞懸液，每個(gè)梯度設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不含藥物的陰性對照孔和含AZT的藥物對照孔。每4天換同濃度藥液，8天觀察結(jié)果。傾去培養(yǎng)液，每孔加入MTT培養(yǎng)液(400嗎'ml/1)，每孔lOOpL,37°C，5%<:02孵育4小時(shí)，可見黃黑色甲瓚顆粒，棄去上清，加DMSO100pL溶解，待甲瓚顆粒完全溶解后，用酶標(biāo)儀570nm波長測定OD值。計(jì)算出CC5o值(halfofcytotoxicconcentration),即對50%的細(xì)胞產(chǎn)生毒性時(shí)的化合物濃度。13結(jié)果與討論表i.兩種方式加入齊多夫定、膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)對fflv導(dǎo)致的細(xì)胞病變的抑制作用加入方式藥物EC50(nmol.L-1)同時(shí)加入細(xì)胞、齊多夫定藥物和病毒膽固醇基藤i酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)1加入細(xì)胞和藥齊多夫定物放置l小時(shí)后再加入病毒膽固醇基照爭酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)1齊多夫定的EC5o為5nmol丄'1，與文獻(xiàn)報(bào)道的10nmol*L—1相似。兩種加入方式膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)的ECso相同，并且比原藥齊多夫定的抗fflV效果強(qiáng)5倍。膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)及陽性對照藥齊多夫定的細(xì)胞毒性較小，CC5o值均為5000nmoH/1(見表2)。但抗HIV活性膽固醇基膦酰齊多夫定>齊多夫定，因此選擇指數(shù)(SI)膽固醇基膦酰齊多夫定〉〉齊多夫定，說明膽固醇基膦酰齊多夫定抗HIV作用比陽性對照藥AZT的作用強(qiáng)，并且毒性小。表2.膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)及對照藥齊多夫定在HIV-1/MT4培養(yǎng)系對HIV-1誘導(dǎo)細(xì)胞病變作用評價(jià)藥物EC50(nmol.L")CC50(nmol丄.1)SI齊多夫定50001000膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳150005000遞系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)例2:膽固醇基磷酰齊多夫定體外抗HIV活性膽固醇基磷酰齊多夫定在體外對Hiv-iniB病毒有較強(qiáng)的抑制活性，并且細(xì)胞毒性較低。材料與方法與實(shí)驗(yàn)例i相近，膽固醇基磷酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)的制備參考前述專利(CN100462103),平均粒徑123納米，穩(wěn)定。高效液相色譜法測得齊多夫定水溶液、膽固醇基磷酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)的濃度分別為3.74mol'L"、2.22mol'L",將二者均用超純水稀釋至約50KimoH/1，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，三種藥物進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別得到濃度為50xl03、5xl03、500、50、5、0.5nmoH/1的齊多夫定水溶液、膽固醇基磷酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)藥液。抗病毒藥效和細(xì)胞毒性測定方法同實(shí)驗(yàn)例1。結(jié)果與討論<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>齊多夫定的￡(:5()為51111101丄-1，與文獻(xiàn)報(bào)道的10nmol丄—i相似。膽固醇基磷酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)兩種加入方式的結(jié)果不同，但都顯示出非常強(qiáng)的抗病毒效果，比原藥齊多夫定藥效強(qiáng)10倍和50倍。同時(shí)加入病毒得到的EC5Q比先將藥物和細(xì)胞孵育1小時(shí)后再加病毒得到的ECs。大5倍。先加入細(xì)胞和藥物放置1小時(shí)后再加入病毒可以使膽固醇基磷酰齊多夫定有較充分的時(shí)間進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并解離出磷酰齊多夫定，從而發(fā)揮更強(qiáng)的抗病毒藥效。膽固醇基磷酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)及陽性對照藥齊多夫定的細(xì)胞毒性較小，CQo值均為5000nmol丄—1(見表2)。但抗HIV活性膽固醇基磷酰齊多夫定〉〉齊多夫定，因此選擇指數(shù)(SI)膽固醇基磷酰齊多夫定〉〉齊多夫定，說明膽固醇基磷酰齊多夫定抗HIV作用比陽性對照藥AZT的作用強(qiáng)，并且毒性小。表2.膽固醇基磷酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)及對照藥齊多夫定在HIV-1/MT4培養(yǎng)系對HIV-1誘導(dǎo)細(xì)胞病變作用評價(jià)藥物EC5。(歸ol.L")CC5。(nmol丄")SI齊多夫定50001000膽固醇基磷酰齊多夫定自組裝傳0.55000畫OO遞系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)例3:膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)靜脈注射后的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)經(jīng)靜脈注射給大鼠后，可快速從血液循環(huán)中清除，靶向分布至肝肺脾等單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中，有很強(qiáng)的巨噬細(xì)胞靶向性，為高效清除單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)的病毒提供了基礎(chǔ)。材料與方法膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)，濃縮至約20mg/ml，經(jīng)0.22pm無菌濾膜過濾滅菌后給藥。給藥前樣品均用HPLC法準(zhǔn)確測定藥物含量。其16余為常規(guī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作試劑和設(shè)備。健康雄性Sprague-Dawley成年大鼠。尾靜脈注射單次給藥(膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng))，給藥劑量為40mg/kg。給藥前取空白血樣，給藥后分別于l、3、5、8、10、20、30、40、50、60、90、120、240、480、960、1440min尾靜脈斷尾取血約0.30ml于1%肝素鈉溶液抗凝的離心管中，立即3000rpm離心5min分離血漿，取血漿50nl加乙腈100nl，渦旋混合3min，5000xg離心10min，取上清依設(shè)計(jì)好的HPLC體內(nèi)分析方法分別測定膽固醇基膦酰齊多夫定和齊多夫定的含量，進(jìn)樣20^1。另取大鼠，尾靜脈注射膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)，分別于設(shè)計(jì)的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)0.5、2、5、10、24h取出動(dòng)物，通過乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠，立刻進(jìn)行解剖。取出心、肝、脾、肺、腎、腦和睪丸，其中心、肝、脾、肺、腎、腦在生理鹽水中洗涮，然后稱量記錄組織濕重。取部分組織稱重后加入等量蒸餾水進(jìn)行組織勻漿。剩余組織放-2(TC冰箱中保存。取組織勻漿液50pl加乙腈100nl，渦旋混合3min，5000xg離心10min，取上清依設(shè)計(jì)好的HPLC體內(nèi)分析方法分別測定膽固醇基膦酰齊多夫定和齊多夫定的含量，進(jìn)樣20W。結(jié)果與討論膽固醇基膦酰齊多夫定從血液循環(huán)中迅速清除，其分布相半衰期(0-8min)為4.2min，組織分布證明膽固醇基膦酰齊多夫定集中分布于肝肺脾中，在其他器官分布非常少，體現(xiàn)出很強(qiáng)的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)靶向性。具體請參見附圖1、圖2。實(shí)驗(yàn)例4:膽固醇基磷酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)靜脈注射后的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布膽固醇基磷酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)經(jīng)靜脈注射給小鼠后，可快速從血液循環(huán)中清除，靶向分布至肝肺脾等單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中，有很強(qiáng)的巨噬細(xì)胞靶向性，為高效清除單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)的病毒提供了基礎(chǔ)。材料與方法膽固醇基磷酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)，濃縮至約20mg/ml，同實(shí)驗(yàn)例3處理。其余操作同實(shí)驗(yàn)例3。結(jié)果與討論膽固醇基磷酰齊多夫定從血液循環(huán)中迅速清除，組織分布證明膽固醇基膦酰齊多夫定集中分布于肝肺脾中，在其他器官分布很少，體現(xiàn)出很強(qiáng)的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)靶向性。圖1膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)大鼠靜脈注射藥時(shí)曲線，圖2膽固醇基膦酰齊多夫定自組裝傳遞系統(tǒng)大鼠靜脈注射組織分布。權(quán)利要求1.膽固醇基膦酰齊多夫定在制備用于治療與病毒有關(guān)疾病藥品中的應(yīng)用。該化合物的分子式如下2.膽固醇基磷酰齊多夫定在制備用于治療與病毒有關(guān)疾病藥品中的應(yīng)用。該化合物的分子式如下-3.如權(quán)利要求1所述的膽固醇基膦酰齊多夫定和權(quán)利要求2所述的膽固醇基磷酰齊多夫定，它們應(yīng)用的劑型是高度分散劑型。4.如權(quán)利要求3所述的膽固醇基膦酰齊多夫定和膽固醇基磷酰齊多夫定，它們應(yīng)用的劑型是自組裝傳遞系統(tǒng)。5.如權(quán)利要求1和2中所述的病毒，選自人類肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒。6.如權(quán)利要求1和2中所述的病毒，是人類肝炎病毒，并且選自人類甲型肝炎病毒、人類乙型肝炎病毒、人類丙型肝炎病毒、人類丁型肝炎病毒、人類戊型肝炎病毒、人類庚型肝炎病毒。7.如權(quán)利要求1和2中所述的病毒，是人類免疫缺陷病毒。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽固醇基膦酰齊多夫定和權(quán)利要求2所述的膽固醇基磷酰齊多夫定在制備用于治療與病毒有關(guān)疾病藥品中的應(yīng)用，其特征在于膽固醇基膦酰齊多夫定或膽固醇基膦酰齊多夫定與其他抗病毒藥物制成復(fù)方制劑。全文摘要本發(fā)明公開了齊多夫定脂質(zhì)衍生物在治療與病毒有關(guān)疾病藥品中的應(yīng)用。齊多夫定脂質(zhì)衍生物包括膽固醇基膦酰齊多夫定和膽固醇基磷酰齊多夫定，是齊多夫定的兩親性脂質(zhì)衍生物，能在水中形成納米級分散的自組裝傳遞系統(tǒng)，體外有很強(qiáng)的抗艾滋病毒作用，比齊多夫定藥效強(qiáng)5到50倍，體內(nèi)給藥后主要分布于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，對治療巨噬細(xì)胞內(nèi)病毒感染非常有用。文檔編號A61P31/14GK101590073SQ200910087699公開日2009年12月2日申請日期2009年7月3日優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日發(fā)明者淼李,瑛田,董俊興,磊邢,金義光申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所